(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

(12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP 22601 B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. C12N 1/113 (.01) A61K 31/7088 (06.01) C12Q 1/68 (06.01) A61P 1/16 (06.01) A61P 9/00 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert 13..07 (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet 13.0.29 (86) Europeisk søknadsnr 09714079.2 (86) Europeisk innleveringsdag 09.02.26 (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato.12.1 () Prioritet 08.02.27, EP, 0800370 08.02.27, US, 3183 P 08.03.03, US, 33340 P 09.02.19, WO, PCT/EP09/01986 (84) Utpekte stater Utpekte samarbeidende stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR AL BA RS (73) Innehaver Julius-Maximilians-Universität Würzburg, Sanderring 2, 97070 Würzburg, Tyskland (72) Oppfinner THUM, Thomas, Leutfresserweg 24, 97082 Würzburg, Tyskland BAUERSACHS, Johann, Zürnstrasse 1, 97074 Würzburg, Tyskland ENGELHARDT, Stefan, Winterleitenweg 33, 97082 Würzburg, Tyskland GROSS, Carina, Huttenstr.24a, 97072 Würzburg, Tyskland (74) Fullmektig Tandbergs Patentkontor AS, Postboks 170 Vika, 0118 OSLO, Norge (4) Benevnelse MikroRNA (mirna) for diagnostiske og terapeutiske formål (6) Anførte publikasjoner WO-A-06/014 WO-A-08/04321 CHENG YUNHUI ET AL: "MicroRNAs are aberrantly expressed in hypertrophic heart - Do they play a role in cardiac hypertrophy?" AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY, PHILADELPHIA, PA, US, vol. 170, no. 6, 1 June 07 (07-06-01), pages 1831-1840, XP0090988 ISSN: 0002-9440 SAYED DANISH ET AL: "MicroRNAs play an essential role in the development of cardiac hypertrophy" CIRCULATION RESEARCH, GRUNE AND STRATTON, BALTIMORE, US, vol. 0, no. 3, 1 February 07 (07-02-01), pages 416-424, XP00246744 ISSN: 0009-73 TATSUGUCHI ET AL: "Expression of micrornas is dynamically regulated during cardiomyocyte hypertrophy" JOURNAL OF MOLECULAR AND CELLULAR CARDIOLOGY, XX, XX, vol. 42, no. 6, 1 June 07 (07-06-01), pages 1137-1141, XP022 ISSN: 0022-2828 THUM THOMAS ET AL: "MicroRNAs in the human heart - A clue to fetal gene reprogramming in heart failure" CIRCULATION, AMERICAN HEART ASSOCIATION, DALLAS, TX, vol. 116, no. 3, 1 July 07 (07-07-01), pages 28-267, XP002477098 ISSN: 0009-7322 cited in the application

1 1 2 3 Beskrivelse OPPFINNELSENS OMRÅDE [0001] Den foreliggende oppfinnelsen gjelder området mikrorna (mirna), nærmere bestemt mir-21 og dettes nedstrøms mål, for diagnose, forebyggelse og/eller behandling av fibrose og andre sykdommer. Den foreliggende oppfinnelsen gjelder videre sammensetninger, fremgangsmåter og anvendelser for behandling av fibrose. Slike fremgangsmåter omfatter modulering og inhibering av aktiviteten av et mirna i et individ med fibrose. OPPFINNELSENS BAKGRUNN [0002] MikroRNA er en bred klasse av små, ikke-kodende RNA som kontrollerer forskjellige biologiske prosesser, blant annet viktige signalveier, ved å regulere ekspresjonen av komplementere mål-mrna (Ambros, 04). Feilregulering av mikrorna i forskjellige sykdomstilstander skyldes endringer i genomet (Mi et al., 07), differensiell ekspresjon eller virusinfeksjoner som i noen tilfeller endrer mikrorna-funksjonen til å bli tumorsuppressorer eller onkogener. MikroRNA ble nylig vist å delta i reguleringen av forskjellige hjertefunksjoner i en serie elegante genetiske undersøkelser (Care et al., 07, Yang et al., 07). Cheng et al. viser at modulering av ekspresjonen av mir-21 ved hjelp av antisense-formidlet fjerning hadde en signifikant negativ virkning på hypertrofi av kardiomyocytter (American Journal of Pathology, bind 170, s. 1831-1840). Tatsuguchi et al. viser at inhibering av endogent mir-21 eller mir-18b gir økt hypertrofisk vekst (Journal of Molecular and Cellular Cardiology, bind 42, s. 1137-1141). Selv om disse undersøkelsene bidrar til å beskrive rollene for mikrorna i hjertets fysiologi, vekst og morfogenese, er de detaljerte molekylære mekanismene for mikrorna i sykdomsveier in vivo lite forstått. Enkelttrådede oligonukleotider som antagoniserer mikrorna har blitt vist å skru av endogene mikrorna in vitro og in vivo med resulterende virkninger på mål-mrna og proteinnivå og -metabolisme (Kruetzfeldt et al., 0, Esau et al., 06). Disse funnene fremhevet anvendelsen av mikrorna-antagonister for in vivo-validering av funksjonen av mikrorna, og kanskje viktigere, som en ny terapeutisk modalitet. OPPSUMMERING [0003] Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenbundne nukleosider, hvor det modifiserte oligonukleotid har en nukleobasesekvens som er komplementær til mir-21 eller en forløper for dette, for anvendelse ved behandling, forebyggelse eller diagnose av fibrose i et individ. [0004] Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenbundne nukleosider, hvor

2 1 2 3 nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotid er komplementær til mir-21 eller en forløper for dette, for anvendelse ved behandling av en fibroproliferativ forstyrrelse. [000] Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en in vitro-fremgangsmåte for diagnose av fibrose som omfatter trinnene: a. tilveiebringelse av en prøve erholdt fra en pasient som antas å lide av fibrose, b. måling av ekspresjonen av mir-21. hvor et forhøyet nivå av mir-21 sammenlignet med en kontrollprøve viser fibrose eller predisposisjon for fibrose. [0006] Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en in vitro-fremgangsmåte for screening av en farmasøytisk aktiv forbindelse for behandling og/eller forebyggelse av fibrose eller predisposisjon for fibrose som omfatter trinnene: a. å tilveiebringe en prøve som inneholder mir-21, b. å sette en kandidatforbindelse i kontakt med prøven, c. å bestemme virkningen av kandidatforbindelsen på prøven, hvor en endring i mir-21 indikerer en farmasøytisk aktiv forbindelse. [0007] Den foreliggende beskrivelse gjelder et promoterområde for et mikrorna, anvendelse av et mikrorna, nærmere bestemt mir-21, og beslektede elementer for diagnose og for fremstilling av et medikament for behandling og/eller forebyggelse av fibrose og/eller fibroserelaterte sykdommer. I tillegg gjelder beskrivelse forskjellige antisense-oligonukleotider mot mål for mir-21. En celle som mangler mir-21, promoterområdet og mål for mir-21 og en knockout-organisme for mir-21 omfattes også. Endelig er beskrivelsen rettet mot en fremgangsmåte for diagnose av fibrose eller fibroserelaterte sykdommer og mot en fremgangsmåte for screening av en farmasøytisk aktiv forbindelse for behandling av fibrose og/eller fibroserelaterte sykdommer. [0008] Heri tilveiebringes fremgangsmåter for behandling av fibrose som omfatter tilførsel til et individ som har eller mistenkes å ha fibrose av en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider og som har en nukleobasesekvens som er komplementær til et mirna. [0009] Heri tilveiebringes fremgangsmåter som omfatter identifisering av et individ som har eller mistenkes å ha fibrose, og tilførsel til individet av en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider, hvor nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotid er komplementær til et mirna eller en mirna-forløper. [00] Heri tilveiebringes fremgangsmåter som omfatter tilførsel til et individ med risiko for utvikling av fibrose av en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider og som har en nukleobasesekvens som er komplementær til et mirna eller en mirna-forløper, hvorved fibrose forhindres. I visse utførelser er fibrosen leverfibrose. I visse utførelser er

3 1 2 3 fibrosen lungefibrose. I visse utførelser er fibrosen hudfibrose. I visse utførelser er fibrosen aldersrelatert fibrose. I visse utførelser er fibrosen hjertefibrose. I visse utførelse er fibrosen nyrefibrose. I visse utførelser er fibrosen miltfibrose. [0011] Heri tilveiebringes fremgangsmåter som omfatter tilførsel til et individ som har eller mistenkes å ha fibrose av en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider og som har en nukleobasesekvens som er komplementær til et mirna eller en mirna-forløper, hvor individet har minst én hjertesykdom eller -tilstand. [0012] Heri tilveiebringes fremgangsmåter som omfatter identifisering av et individ som har eller mistenkes å ha fibrose, hvori individet har minst én hjertesykdom eller -tilstand, og tilførsel til individet av en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider, hvor nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotid er komplementær til et mirna eller en mirna-forløper. [0013] I visse utførelser er hjertesykdommen eller -tilstanden utvalgt fra gruppen som består av hjertehypertrofi, hypertensiv hjertesvikt. diastolisk hjertesvikt, systolisk hjertesvikt, hjerterelatert lagringssykdom, kardiomyopati, konstriktiv perikarditt, kransarteriesykdom, akutt myokardinfarkt, kronisk myokardinfarkt, høyresidig hjertesvikt, hjertearytmier, myokardrelatert fibrose og hjerteklaffsykdom. I visse utførelser er kardiomyopatien utvalgt fra gruppen som består av dilaterende kardiomyopati, hypertrofisk kardiomyopati med obstruksjon, hypertrofisk kardiomyopati uten obstruksjon, restriktiv kardiomyopati, arytmogen høyre ventrikkel-kardiomyopati og diabetisk kardiomyopati. [0014] I visse utførelser er hjerteklaffsykdommen utvalgt fra gruppen som består av mitralklaffstenose, aortaklaffstenose, trikuspidalstenose og lungeklaffstenose. [001] I visse utførelser er hjerteklaffsykdommen utvalgt fra gruppen som består av mitralklaffinsuffisiens, aortaklaffinsuffisiens, trikuspidalklaffinsuffisiens og lungeklaffinsuffisiens. [0016] I visse utførelser omfatter fremgangsmåtene som tilveiebringes heri videre tilførsel av et eller flere andre farmasøytiske midler. [0017] I visse utførelser reduserer tilførselen økning av hjertevekten, dilasjon av venstre ventrikkel eller svekket fraksjonell forkortning. [0018] I visse utførelser forhindrer tilførselen økning av hjertevekten, dilasjon av venstre ventrikkel eller svekket fraksjonell forkortning. [0019] I visse utførelser forbedrer tilførselen hjertefunksjonen. [00] I visse utførelser omfatter tilførselen intravenøs tilførsel, subkutan tilførsel, intraarteriell tilførsel eller intrakardiell tilførsel. [0021] Heri tilveiebringes fremgangsmåter for behandling av fibrose som omfatter tilførsel til et individ som har eller mistenkes å ha fibrose av en forbindelse som

4 1 2 3 omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider og som har en nukleobasesekvens som er komplementær til et mirna eller en mirna-forløper, hvor individet har minst én leversykdom eller -tilstand. [0022] Heri tilveiebringes fremgangsmåter som omfatter identifisering av et individ som har eller mistenkes å ha fibrose, hvor individet har minst én leversykdom eller - tilstand, og tilførsel til individet av en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider og som har en nukleobasesekvens som er komplementær til et mirna eller en mirna-forløper. I visse utførelser er den minst ene leversykdommen eller -tilstanden kronisk leverskade. I visse utførelser er den minst ene leversykdommen eller -tilstanden hepatittvirusinfeksjon. I visse utførelser er hepatittvirusinfeksjonen hepatitt C-virusinfeksjon. I visse utførelser er den minst ene leversykdommen eller -tilstanden ikke-alkoholisk steatohepatitt. I visse utførelser omfatter tilførselen intravenøs tilførsel eller subkutan tilførsel. I visse utførelser er den minst ene leversykdommen eller -tilstanden cirrhose. I visse utførelser forbedrer tilførselen leverfunksjonen. [0023] Heri tilveiebringes fremgangsmåter for behandling av fibrose som omfatter tilførsel til et individ som har eller mistenkes å ha fibrose av en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider og som har en nukleobasesekvens som er komplementær til et mirna eller en mirna-forløper, hvor individet har minst én lungesykdom eller -tilstand. [0024] Heri tilveiebringes fremgangsmåter som omfatter identifisering av et individ som har eller mistenkes å ha fibrose, hvor individet har minst én lungesykdom eller - tilstand, og tilførsel til individet av en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider og som har en nukleobasesekvens som er komplementær til et mirna eller en mirna-forløper. I visse utførelser er den minst ene lungesykdommen eller -tilstanden kronisk obstruktiv lungesykdom. I visse utførelser omfatter tilførselen pulmonal tilførsel. [002] Heri tilveiebringes fremgangsmåter for behandling av fibrose som omfatter tilførsel til et individ som har eller mistenkes å ha fibrose av en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider og som har en nukleobasesekvens som er komplementær til et mirna eller en mirna-forløper, hvor individet har minst én annen sykdom eller -tilstand. [0026] Heri tilveiebringes fremgangsmåter som omfatter identifisering av et individ som har eller mistenkes å ha fibrose, hvor individet har minst én annen sykdom eller - tilstand, og tilførsel til individet av en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider og som har en nukleobasesekvens som er komplementær til et mirna eller en mirna-forløper. I visse utførelser er den minst ene andre sykdommen eller tilstanden pulmonal hypertensjon. I visse utførelser er den minst ene andre sykdommen eller tilstanden en

1 2 3 blodkar-relatert sykdom. I visse utførelser er den blodkar-relaterte sykdommen utvalgt fra gruppen som består av arteriell stivhet, mediasklerose og arteriosklerose. I visse utførelser er den minst ene andre sykdommen eller tilstanden tarmsklerose. I visse utførelser er den minst ene andre sykdommen eller tilstanden systemisk sklerose. I visse utførelser er den minst ene andre sykdommen eller tilstanden utvalgt fra gruppen som består av retroperitoneal fibrose, proliferativ fibrose, neoplastisk fibrose, nefrogen systemisk fibrose, injeksjonsfibrose, mediastinal fibrose, myelofibrose, postvasektomisk smertesyndrom, reumatoid artritt. [0027] I visse utførelser lindrer tilførselen fibrosen. I visse utførelser reduserer tilførselen videre utvikling av fibrosen. I visse utførelser stanser tilførselen videre utvikling av fibrosen. I visse utførelser reduserer tilførselen fibrosen. I visse utførelser reduserer tilførselen kollageninnholdet. [0028] Heri tilveiebringes fremgangsmåter for behandling av en fibroproliferativ sykdom som omfatter tilførsel til et individ som har eller mistenkes å ha en fibroproliferativ sykdom av en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider og som har en nukleobasesekvens som er komplementær til et mirna eller en mirna-forløper, hvorved den fibroproliferative sykdommen behandles. [0029] I visse utførelser omfatter tilførselen intravenøs tilførsel, subkutan tilførsel, pulmonal tilførsel, intraarteriell tilførsel eller intrakardiell tilførsel. [00] Heri tilveiebringes fremgangsmåter for inhibering av fibroblastproliferasjon som omfatter å sette en fibroblast i forbindelse med en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider og som har en nukleobasesekvens som er komplementær til et mirna eller en mirnaforløper, hvorved fibroblastproliferasjon inhiberes. [0031] Heri tilveiebringes fremgangsmåter for stimulering av fibroblastapoptose som omfatter å sette en fibroblast i forbindelse med en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider og som har en nukleobasesekvens som er komplementær til et mirna eller en mirnaforløper, hvorved fibroblastapoptose stimuleres. [0032] Heri tilveiebringes fremgangsmåter for økning av Sprouty 1-protein i en fibroblast som omfatter å sette fibroblasten i forbindelse med en forbindelse som omfatter et modifisert oligonukleotid som består av 12 til sammenkoblede nukleosider og som har en nukleobasesekvens som er komplementær til et mirna eller en mirna-forløper, hvorved ekspresjon av Sprouty 1-protein stimuleres. [0033] Heri tilveiebringes sammensetninger for inhibering av mikrorna. I visse utførelser er det angjeldende mirna mir-21. I visse utførelser har det modifiserte oligonukleotidet en nukleobasesekvens som er komplementær til en nukleobasesekvens som er minst 80 % identisk med mir-21 eller en mir-21-forløper. I visse utførelser har

6 1 2 3 mir-21 nukleobasesekvensen som er beskrevet som SEKV.ID. nr. 1. I visse utførelser har mir-21-forløperen nukleobasesekvensen som er beskrevet som SEKV.ID. nr. 11. [0034] I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av 12 til sammenkoblede nukleosider. I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av 12 sammenkoblede nukleosider. I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av 13 sammenkoblede nukleosider. I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av 14 sammenkoblede nukleosider. I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av 1 til 24 sammenkoblede nukleosider. I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av 1 sammenkoblede nukleosider. I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av 16 sammenkoblede nukleosider. I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av 17 sammenkoblede nukleosider. I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av 18 sammenkoblede nukleosider. I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av 19 sammenkoblede nukleosider. I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av sammenkoblede nukleosider. I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av 21 sammenkoblede nukleosider. I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av 22 sammenkoblede nukleosider. I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av 23 sammenkoblede nukleosider. I visse utførelser består det modifiserte oligonukleotidet av 24 sammenkoblede nukleosider. [003] I visse utførelser har nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet ikke mer enn to feiltilpasninger til nukleobasesekvensen til mir-21 eller en mir-21- forløper. I visse utførelser har nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet ikke mer enn en feiltilpasning til nukleobasesekvensen til mir-21 eller en mir-21- forløper. I visse utførelser har nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet ingen feiltilpasninger til nukleobasesekvensen til mir-21 eller en mir-21-forløper. [0036] I visse utførelser omfatter nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet minst 1 på hverandre følgende nukleobaser fra nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr. 12. I visse utførelser omfatter nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet minst 16 på hverandre følgende nukleobaser fra nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr. 12. I visse utførelser omfatter nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet minst 17 på hverandre følgende nukleobaser fra nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr. 12. I visse utførelser omfatter nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet minst 18 på hverandre følgende nukleobaser fra nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr. 12. I visse utførelser omfatter nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet minst 19 på hverandre følgende nukleobaser fra nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr. 12. I visse utførelser omfatter nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet minst på hverandre følgende nukleobaser fra nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr. 12. I visse utførelser omfatter nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet minst 21 på

7 hverandre følgende nukleobaser fra nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr. 12. I visse utførelser omfatter nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet minst 22 på hverandre følgende nukleobaser fra nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr. 12. [0037] I visse utførelser består nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet av nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr. 12. [0038] I visse utførelser omfatter forbindelsen et modifisert oligonukleotid konjugert til en ligand. I visse utførelser har strukturen (III) (') QxQz 1 (Qy) n Q 2 2 Q 2 3 Qz 4 Q-L (3') (III) hvori [0039] Hver Q uavhengig av de andre er et 2'-O-metylmodifisert nukleosid, x er 1 [0040] En av A og B er S mens den andre er O, y er [0041] z 1, z 2, z 3 og z 4 er alle uavhengig av hverandre x eller y, n=6-17 L er 2 [0042] hvori: X er N(CO)R 7 eller NR 7, R 1, R 3 og R 9 uavhengig av hverandre er H, OH eller -CH 2 OR b, forutsatt at minst én av R 1, R 3 og R 9 er -CH 2 OR b, R 7 er R d eller C 1 -C alkyl som er substituert med NR c R d eller NHC(O)R d, R c er H eller C 1 -C 6 alkyl, R d er et karbohydratradikal, eller et steroidradikal som om ønskelig er koblet til minst ett karbohydratradikal, og

8 R d er hvor en av A og B er S mens den andre er O. [0043] I visse utførelser er R kolesterol. I visse utførelser er hver av z 1, z 2, z 3 og z 4 1 2 hvor en av A og B er S mens den andre er O. [0044] I visse utførelser er R 1 -CH 2 OR b. I visse utførelser er R 9 OH. I visse utførelser er R 1 og R 9 trans. I visse utførelser er R 1 og R 3 trans. I visse utførelser er R 3 -CH 2 OR b. I visse utførelser er R 1 OH. I visse utførelser er R 1 og R 3 trans. I visse utførelser er R 1 og R 9 trans. I visse utførelser er R 9 -CH 2 OR b. I visse utførelser er X NC(O)R 7. I visse utførelser er R 7 - CH 2 (CH 2 ) 3 CH 2 NHC(O)R d. [004] I visse utførelser er minst én internukleosidbinding en modifisert internukleosidbinding. I visse utførelser er alle internukleosidbindinger modifiserte internukleosidbindinger. I visse utførelser er minst én internukleosidbinding en fosforotioat-internukleosidbinding. I visse utførelser er alle internukleosidbindinger fosforotioat-internukleosidbindinger. I visse utførelser omfatter minst ett nukleosid et modifisert sukker. I visse utførelser omfatter flere nukleosider et modifisert sukker. I visse utførelser omfatter alle nukleosider et modifisert sukker. I visse utførelser omfatter hvert nukleosid et 2'-O-metoksyetylsukker. I visse utførelser omfatter et antall nukleosider et 2'-O-metoksyetylsukker og et antall nukleosider omfatter et 2'-fluorsukker. I visse utførelser er alle modifiserte sukkere uavhengig av hverandre utvalgt blant et 2'-O-metoksyetylsukker, et 2'-fluorsukker, et 2'-O-metylsukker eller en bisyklisk sukkerrest. I visse utførelser omfatter minst ett nukleosid en modifisert nukleobase. I visse utførelser er den modifiserte nukleobasen -metylcytosin. I visse utførelser omfatter minst ett nukleosid et cytosin, hvor cytosinet er -metylcytosin. I visse utførelser er alle cytosiner -metylcytosin. [0046] I visse utførelser er nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet minst 90 % komplementær til nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr 1. I visse utførelser er nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet minst 9 % komplementær til nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr 1. I visse utførelser er nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet 0 % komplementær til nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr 1. I visse utførelser har nukleobasesekvensen

9 1 2 3 til det modifiserte oligonukleotidet fullengde-komplementaritet til nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr 1. I visse utførelser er nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet minst 90 % komplementær til nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr 11. I visse utførelser er nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet minst 9 % komplementær til nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr 11. I visse utførelser er nukleobasesekvensen til det modifiserte oligonukleotidet 0 % komplementær til nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr 11. I visse utførelser består mir-21-nukleobasesekvensen av nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr. 1. I visse utførelser består forløper-nukleobasesekvensen av nukleobasesekvensen med SEKV.ID. nr. 11. [0047] I visse utførelser er forbindelsen som omfatter det modifiserte oligonukleotid fremstilt som en farmasøytisk sammensetning. I visse utførelser er det modifiserte oligonukleotidet fremstilt som en farmasøytisk sammensetning. [0048] I visse utførelser består forbindelsen av et modifisert oligonukleotid. I visse utførelser er det modifiserte oligonukleotidet et enkelttrådet modifisert oligonukleotid. I visse utførelser er det modifiserte oligonukleotidet et antisense-oligonukleotid. [0049] Heri tilveiebringes sammensetninger for anvendelse i behandling, forebyggelse og/eller lindring av fibrose. Videre tilveiebringes heri forbindelser som omfatter modifiserte oligonukleotider med en nukleobasesekvens som er komplementær til et mirna for avendelse i behandling, forebyggelse og/eller lindring av fibrose. [000] Heri tilveiebringes antisense-oligonukleotider som er komplementære til mir- 21 for fremstilling av et medikament for behandling og/eller forebyggelse av fibrose. [001] Heri tilveiebringes antisense-oligonukleotider som er komplementære til mir- 21 for anvendelse i behandling og/eller forebyggelse av fibrose. [002] Heri tilveiebringes anvendelse av mir-21 og/eller et antisense-oligonukleotid mot mir-21 for behandling av fibrose. [003] Heri tilveiebringes anvendelse av mir-21 og/eller et antisense-oligonukleotid mot mir-21 for diagnose av fibrose. KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE [004] Fig. 1 Feilregulering av mir-21 i hjertesykdom og dominerende ekspresjon i hjertefibroblaster (a) Analyse av mikrorna-ekspresjon med mikromatriser. RNA ble isolert fra myokard fra venstre ventrikkel fra en musemodell for hjertesvikt (ß1AR-TG-mus) i tidlig (tre måneder gammel), moderat (seks måneder gammel) og sent stadium (tolv måneder) av hjertesvikt. Ekspresjonen er gitt som antall gangers regulering sammenlignet med villtype-kontroller, mir-12 er avmerket i rødt. Dataene er fra 3-4 uavhengige hybridiseringer pr. gruppe.

1 2 3 (b) Venstre Northern-blottanalyse av mir-21-ekspresjonen i forskjellige stadier av hjertesvikt i ß1AR-TG-mus. Høyre Kvantitativ analyse av data fra øvre felt. (c) Venstre Northern-blottanalyse av mir-21-ekspresjonen i ikke-sviktende og sviktende myokard fra venstre ventrikkel. Høyre Kvantitativ analyse av den modne formen av mir-21 i ikke-sviktende og sviktende myokard fra venstre ventrikkel. (d) Øverst Neonatale kardiomyocytter farget med 4'-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) og et antistoff rettet mot α-aktinin etter transfeksjon med omstokket mir (kontroll-premir, 0 nm, 72 t), syntetisk mir-21 (pre-mir-21, 0 nm, 72 t) og en mir-21-inhibitor (anti-mir-21, 0 nm, 72 t). Kardiomyocytter ble dyrket under kontrollbetingelser (se Supplementerende fremgangsmåter) eller stimulert med FCS ( %) i 48 t. Nederst Kvantitativ analyse av størrelsen av enkeltvise kardiomyocytter (histogramanalyse). n>0 kardiomyocytter ble analysert i hver gruppe. (e) Øverst Fremstilling av transgene mus som uttrykker mir-21 under kontroll av alfa- MHC-promoteren. Midten Northern-blott av modent mir-21 i villtypedyr (WT) og transgene dyr (TG). Nederst Tverrsnitt av hjerteområder fra villtypemus og mir-21- transgene mus, farget for å vise generell morfologi (HE-farging) og kollagendeponering (Sirius red). (f) mir-21-ekspresjon i hjertefibroblaster og kardiomyocytter. Northern-blottanalyse (Øverst) og kvantitativ sanntids-pcr-analyse (Nederst). Alle feilstolper angir SEM. n=3-6 for a-f. Fig. 2 Inhibering av Sprouty1 via mir-21 gir derepresjon av ERK-signalisering og økt overlevelse av fibroblaster (a) Hjerter fra Spry1LacZ +/- -mus ble farget med X-gal. Makroskopisk (øverst) og mikroskopisk (nederst) analyse viser påvisning av LacZ i hjertefibroblaster. Den korte, sorte stolpen angir 0 m. Den store, sorte stolpen angir m. (b, c) Øverst Påvisning av SPRY1, ERK1/2 og fosfo-erk1/2 i sviktende humane venstre ventrikler (b) og etter transfeksjon av sammendyrkede kardiomyocytter og fibroblaster med omstokket mikrorna ("Pre-miR" negativ kontroll nr. 2, 0 nm, 72 t), syntetisk mir-21 (pre-mir-21, 0 nm, 72 t) eller en mir-21-inhibitor (anti-mir-21, 0 nm, 72 t). Nederst Kvantitativ analyse av western-blottresultater. (d) Øverst Bestemmelse av SPRY1, ERK1/2, fosfo-erk1/2 etter sirna-formidlet knockdown av SPRY1 ( nm, 72 t) eller behandling med omstokket sirna ( nm, 72 t) i de sammendyrkede hjertecellene. Nederst Kvantitativ analyse av westernblottresultater. (e) Øverst FACS-analyse av anneksin V-positive hjertefibroblaster etter behandling med omstokket mikrorna (kontroll-pre-mir, 0 nm, 72 t), syntetisk mir-21 (premir-21, 0 nm, 72 t), mir-21-antagonister (anti-mir-21, 0 nm, 72 t) eller

11 1 2 3 tilsvarende kontroller (0 nm, 72 t). Nederst Kvantitativ analyse av anneksin V- positive celler etter de forskjellige behandlingene. (f) Øverst FGF2-konsentrasjonen i supernatanter fra dyrkede hjertefibroblaster etter behandling med omstokket mikrorna (kontroll-pre-mir, 0 nm, 72 t), syntetisk mir-21 (pre-mir-21, 0 nm, 72 t), mir-21-antagonister (anti-mir-21, 0 nm, 72 t) eller (nederst) etter sirna-formidlet knockdown av SPRY1 ( nm, 72 t) eller behandling med omstokket sirna ( nm, 72 t). Alle feilstolper angir SEM. n=3-6 for a-f. Fig. 3 Terapeutisk avskruing av mir-21 in vivo forhindrer hjertefibrose og hjertesvikt (a) Øverst Fluorescensmikroskopisk påvisning av Cy3- og DAPI-farging i hjertevev fra venstre ventrikkel etter injeksjon av Cy3-merket modifisert oligonukleotid via halsblodåren. Kontrollene ble gitt PBS-injeksjoner. Nederst Mus behandlet med transaortakonstriksjon (TAC) eller narreopererte mus ble injisert med kontroll (PBS, 0 μl) eller antagomir-21 (0 μl, 80 mg/kg/dag) 24 t etter operasjonen på tre på hverandre følgende dager. (b) Øverst Northern-blottanalyse av mir-21-ekspresjonen i ubehandlede (kontroll) og antagomir-21-behandlede mus etter TAC. Nederst Kvantitativ analyse av mir-21- ekspresjonen i hjertet. (c) Øverst Western-blottanalyse av SPRY1, ERK1/2 og fosfo-erk1/2 i mus etter narreoperasjon eller etter TAC, behandlet med enten kontroll eller antagomir-21. Ekspresjonen av G beta ble vist som husholdningsgen-kontroll. Nederst Kvantitativ analyse av western-blottresultater. (d) Hjertesnitt etter Sirius red-farging for deteksjon av myokardfibrose i mus behandlet med kontroll og antagomir-21. (e) Kvantitativ analyse av myokardfibrose (venstre) og hjertevekt/kroppsvekt) (høyre) i mus behandlet med kontroll og antagomir-21. (f) Øverst Global transkriptomanalyse av musegenomet i hjertevev fra mus etter narreoperasjon eller etter TAC, behandlet med kontroll eller antagomir-21. Røde (grønne) bokser viser signifikant (p<0,0) induserte (represserte) gener. Nederst Normalisering av oppregulerte gener som koder for proteiner som deltar i myokardfibrose etter TAC ved behandling med antagomir-21. (g) Ekkokardiografiske analyser. LVD: diameter av venstre ventrikkel, FS: Fraksjonell forkortning. (h) Foreslått mekanisme som ligger til grunn for derepresjonen av ERK-signalisering i hjertet via mir-21-formidlet inhibering av SPRY1. Alle feilstolper angir SEM. n=3-6 for a-g.

12 1 2 3 Fig. 4 Transkripsjonell regulering av mir-21 (a) Konserverte sekvenser i mir-21-promoterområdene fra forskjellige arter, sammenlignet med den humane mir-21-promoteren. Stolper angir konserveringsgrad. (b) Luciferaseaktivitet av humane mir-21-promoterkonstruksjoner. Progressiv forkortning av den native promoteren fører til påvisning av et område på 117 bp som er ansvarlig for ekspresjonen av mir-21. n=3. (c) Luciferase-data fra humane mir-21-promoterkonstruksjoner eller delesjon/- mutasjon av enkeltvise transkripsjonsfaktor-bindingsseter. n=3. Fig. Knockdown av det allesteds uttrykte mir21 induserer en hjerte-fenotype i sebrafisk (a) Venstre Lateralt bilde av MO-kontrollembryoer og mir-21-morfanter ved 80 hpf. A: atrium, V: ventrikkel, mørke piler viser perikardialt ødem. Høyre øverst Kontrollmorfolino (MO-kontroll)-injiserte hjerter viser normal hjertemorfologi 80 timer etter befruktning (hpf). Hjertene er løkkeformede, endokard- og myokardlagene er godt utviklet og ventrikkel (V) og atrium (A) er separert av den atrioventrikulære (AV) ring. Nederst mir-21-morfanter (MO-1-injisert) utvikler perikardialt ødem grunnet tap av ventrikulær kontraktil beskaffenhet og har forkortede haler, mens utviklingen av andre organsystemer forløper normalt. (b) Inhibering av mir-21-funksjon via to forskjellige, morfolino-modifiserte antisenseoligonukleotider (MO-1, n=496 og MO-2, n=460) fører til identiske fenotyper i >90 % av de injiserte embryoene. Resultatene er fra 3 uavhengige injeksjoner pr. gruppe. (c) Myokardfunksjon vist som fraksjonell forkortning (FS) av ventrikkelkammeret i MO-kontroll- (n=6) og mir-21-morfanter injisert med to forskjellige morfolinomolekyler (MO-1, n=8 og MO-2, n=8) ved 48, 72, 96 og 1 hpf. Den ventrikulære FS for mir-21-morfantventrikler avtar drastisk med tiden. Fig. 6 Transfeksjonseffektivitet i dyrkede kardiomyocytter (a) Dyrkede neonatale kardiomyocytter ble transfektert med Cy-3-merket mir-21 (0 nm, 72 t, Ambion, USA) og farget med DAPI (høyre). For sammenligning ble dyrkede kardiomyocytter farget med DAPI alene (venstre). (b) Northern-blottanalyse av mir-21-ekspresjonen i dyrkede kardiomyocytter etter transfeksjon med omstokket mikrorna (kontroll-pre-mir, 0 nm, 72 t), en mir-21- inhibitor (anti-mir-21, 0 nm, 72 t) eller syntetisk mir-21 (pre-mir-21, 0 nm, 72 t). Alle feilstolper angir SEM, n=36 for a) og b). Fig. 7 MikroRNA-bindende seter i 3'-UTR i Spry1-genet Øverst Endret ekspresjon av forskjellige mikrorna med bindingsseter i 3'-UTR i Spry1-genet.

13 Nederst mikrorna med bindingsseter i 3'-UTR analysert med mikrorna-mikromatrise er vist i grått. CDS= kodende sekvens. 1 Fig. 8 mir-21 sanntids-pcr-ekspresjonsdata I tillegg til bestemmelse ved northern-blotting ble ekspresjonen av mir-21 analysert ved sanntids-pcr i vev fra venstre ventrikkel fra mus etter narreoperasjon, narreoperasjon+ antagomir-21-behandling, TAC og TAC+antagomir-21-behandling (venstre), så vel som i hjerter fra villtypemus og mir-21-transgene mus (høyre). n=4-6 pr. gruppe. Data ikke vist: [00] Et søk etter teoretiske mir-21-mål viste 22 kjente, mulige målgener, av hvilke 8 ble vist å uttrykkes i hjertevev. En kombinasjon av tre forskjellige målprediksjonsverktøy identifiserte Spry1 (sprouty1) som en svært sannsynlig kandidat. 2 3 Transkripsjonell regulering av mir-21 [006] Det er konservasjon av sekvenser i mir-21-promoterområdene fra forskjellige arter, sammenlignet med den humane mir-21-promoteren. Luciferaseaktivitet av humane mir-21-promoterkonstruksjoner etter delesjon/mutasjon av enkeltvise transkripsjonsfaktorbindende seter ble vist. En progressiv avkortning av den native promoteren fører til identifisering av et område på 117 bp som er ansvarlig for ekspresjonen av mir-21. n=3. Transfeksjonseffektivitet i dyrkede kardiomyocytter [007] Dyrkede neonatale kardiomyocytter ble transfektert med Cy-3-merket mir-21 (0 nm, 72 t, Ambion, USA) og farget med DAPI. For sammenligning ble dyrkede kardiomyocytter farget med DAPI alene. Northern-blotting av mir-21-ekspresjonen i dyrkede kardiomyocytter etter transfeksjon med omstokket mir (kontroll-pre-mir, 0 nm, 72 t), en mir-21-inhibitor (anti-mir-21, 0 nm, 72 t) og syntetisk mir-21 (premir-21, 0 nm, 72 t) ble analysert. MikroRNA-bindende seter i 3'-UTR i Spry1-genet [008] Det er en endring i ekspresjonen av forskjellige mikrorna med bindingsseter i 3'-UTR i Spry1-genet. mikrorna med bindingsseter i 3'-UTR ble analysert med mikrorna-mikromatrise.

14 mir-21 sanntids-pcr-ekspresjonsdata [009] I tillegg til bestemmelse ved northern-blotting ble ekspresjonen av mir-21 analysert ved sanntids-pcr i vev fra venstre ventrikkel fra mus etter narreoperasjon, narreoperasjon+ antagomir-21-behandling, TAC og TAC+antagomir-21-behandling, så vel som i hjerter fra villtypemus og mir-21-transgene mus. 1 2 3 DETALJERT BESKRIVELSE Definisjoner [0060] "Fibrose" betyr dannelse eller utvikling av overskudd av fibrøst bindevev i et organ eller vev. I visse utførelser opptrer fibrose som en reparerende eller reaktiv prosess. I visse utførelser opptrer fibrose som respons på ødeleggelse eller skade. Begrepet "fibrose" skal forstås som dannelse eller utvikling av overskudd av fibrøst bindevev i et organ eller vev som en reparerende eller reaktiv prosess, i motsetning til dannelse av fibrøst vev som en normal bestanddel av et organ eller vev. [0061] Et antisense-oligonukleotid skal forstås som et oligonukleotid som har en viss sekvens-komplementaritet til en annen sekvens, nærmere bestemt en sekvens som er komplementær til mir-21. Et mål for mirm21 kan også forstås å omfatte et nedstrøms mål for mir-21. Det er viktig å merke seg at et inhibering av mir-21, f. eks. via et oligonukleotid med en sekvens som i det minste er komplementær til mir-21, vil føre til derepresjon eller til og med overekspresjon av mål for mir-21, som Sprouty og lignende. [0062] "Individ" betyr et menneske eller et ikke-menneskelig dyr som er utvalgt for behandling eller terapi. [0063] "Individ som mistenkes å ha" betyr et individ som viser en eller flere kliniske indikasjoner på en sykdom eller tilstand. [0064] "Individ som mistenkes å ha fibrose" betyr et individ som viser en eller flere kliniske indikasjoner på fibrose. [006] "Forebygge" eller "forebyggelse" viser til forsinkelse eller avverging av debuten, utviklingen eller progresjonen av en tilstand eller sykdom for et tidsrom som kan omfatte uker, måneder eller år. [0066] "Behandling" eller "behandle" betyr anvendelse av en eller flere spesifikke fremgangsmåter som benyttes for helbredelse eller lindring av en sykdom. I visse utførelser er den spesifikke fremgangsmåten tilførsel av et eller flere farmasøytiske midler. [0067] "Lindring" betyr en reduksjon av omfanget av minst én indikator på en tilstand eller sykdom. I visse utførelser omfatter lindring en forsinkelse eller reduksjon av utviklingen av en eller flere indikatorer på en tilstand eller sykdom. Omfanget av indikatorer kan bestemmes ved subjektive eller objektive mål som er kjente blant fagfolk.

1 1 2 3 [0068] "Individ med behov for" bety et individ som har blitt vist å ha behov for terapi eller behandling. [0069] "Tilførsel" betyr levering av et farmasøytisk middel eller en farmasøytisk sammensetning til et individ og omfatter, men er ikke begrenset til, tilførsel utført av medisinsk personell og tilførsel til seg selv. [0070] "Parenteral tilførsel" betyr tilførsel ved injeksjon eller infusjon. [0071] Parenteral tilførsel omfatter, men er ikke begrenset til, subkutan tilførsel, intravenøs tilførsel, intramuskulær tilførsel, intrarteriell tilførsel og intrakraniell tilførsel. [0072] "Subkutan tilførsel" betyr tilførsel like under huden. [0073] "Intravenøs tilførsel" betyr tilførsel inn i en vene. [0074] "Intraarteriell tilførsel" betyr tilførsel inn i en arterie. [007] "Intrakardiell tilførsel" betyr tilførsel inn i hjertet. I visse utførelser skjer intrakardiell tilførsel ved hjelp av et kateter. I visse utførelser skjer intrakardiell tilførsel ved hjelp av åpen hjertekirurgi. [0076] "Pulmonal tilførsel" betyr tilførsel til lungene. [0077] "Forbedrer leverfunksjonen" betyr en endring av leverfunksjonen i retning av normale parametere. I visse utførelser anslås leverfunksjonen ved å måle molekyler som foreligger i et individs blod. For eksempel måles i visse utførelser forbedret leverfunksjon som en reduksjon av nivået av lever-transaminase i blodet. [0078] "Farmasøytisk sammensetning" betyr en blanding av forbindelser som er egnet for tilførsel til et individ som omfatter et farmasøytisk middel. For eksempel kan en farmasøytisk sammensetning omfatte et modifisert oligonukleotid og en steril vandig løsning. [0079] "Farmasøytisk middel" betyr en forbindelse som gir en terapeutisk virkning ved tilførsel til et individ. [0080] "Aktiv farmasøytisk bestanddel" betyr den forbindelse i en farmasøytisk sammensetning som gir en ønsket virkning. [0081] "Mål-nukleinsyre", "mål-rna", "mål-rna-transkript" og "nukleinsyremål" betyr alle enhver nukleinsyre som antisense-forbindelser kan være rettet mot. [0082] "Målstyring" betyr prosessen å utforme og utvelge en nukleobasesekvens som vil hybridisere til en mål-nukleinsyre og indusere en ønsket virkning. [0083] "Rettet mot" betyr å ha en nukleobasesekvens som vil tillate hybridisering til en mål-nukleinsyre for induksjon av en ønsket virkning. I visse utførelser er en ønsket virkning reduksjon av en mål-nukleinsyre. [0084] "Modulering" betyr en forstyrrelse av funksjon eller aktivitet. I visse utførelser betyr modulering en økning av genekspresjon. I visse utførelser betyr modulering en reduksjon av genekspresjon. [008] "Ekspresjon" betyr alle funksjoner og trinn ved hvilke et gens kodede informasjon overføres til strukturer som foreligger og virker i en celle.

16 1 2 3 [0086] "'-målsete" viser til den nukleobase i en mål-nukleinsyre som er komplementær til den ytterste nukleobasen i '-enden av et gitt oligonukleotid. [0087] "3'-målsete" viser til den nukleobase i en mål-nukleinsyre som er komplementær til den ytterste nukleobasen i 3'-enden av et gitt oligonukleotid. [0088] "Område" betyr et delstykke av sammenkoblede nukleosider i en nukleinsyre. I visse utførelser har et modifisert oligonukleotid en nukleobasesekvens som er komplementær til et område i en mål-nukleinsyre. For eksempel er i visse slike utførelser et modifisert oligonukleotid komplementært til et område i en mirnastamme-løkke-sekvens. I visse slike utførelser er et modifisert oligonukleotid 0 % til et område i en mirna-stamme-løkke-sekvens. [0089] "Segment" betyr en mindre del eller underdel av et område. [0090] "Nukleobasesekvens" betyr rekkefølgen av på hverandre følgende nukleobaser i ' til 3' retning, uavhengig av eventuelle sukker-, bindings- og/eller nukleobasemodifikasjoner. [0091] "På hverandre følgende nukleobaser" betyr nukleobaser som ligger umiddelbart i nabostilling til hverandre i en nukleinsyre. [0092] "Nukleobasekomplementaritet" betyr to nukleobasers evne til ikke-kovalent paring via hydrogenbinding. [0093] "Komplementær" betyr at en første nukleobasesekvens er minst 60 %, 6 %, 70 %, 7 %, 80 %, 8 %, 90 %, 9 %, 97 %, 98 % eller 99 % identisk, eller 0 % identisk, med komplementet til en andre nukleobasesekvens over et område på 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2,, 3, 40, 4, 0,, 60, 6, 70, 7, 80, 8, 90, 9, 0 eller flere nukleobaser, eller at de to sekvensene hybridiserer under stringente hybridiseringsbetingelser. I visse utførelser må et modifisert oligonukleotid som er 0 % komplementært til et mirna eller en mirna-forløper ikke nødvendigvis være 0 % komplementært til dette mirna eller til mirna-forløperen over hele lengden av det modifiserte oligonukleotid. [0094] "Komplementaritet" betyr nukleobase-paringsevnen mellom en første nukleinsyre og en andre nukleinsyre. [009] "Fullengde-komplementaritet" betyr at hver nukleobase i en første nukleinsyre er i stand til å basepare med hver nukleobase i en tilsvarende posisjon i en andre nukleinsyre. For eksempel har i visse utførelser et modifisert oligonukleotid hvori hver nukleobase har komplementaritet til en nukleobase i et mirna fullengde-komplementaritet til dette mirna. [0096] "Prosent komplementær" betyr antall komplementære nukleobaser i en nukleinsyre dividert med lengden av nukleinsyren. I visse utførelser betyr prosent komplementaritet av et modifisert oligonukleotid antall nukleobaser som er komplementære til mål-nukleinsyren dividert med antall nukleobaser i det modifiserte oligonukleotid. I visse utførelser betyr prosent komplementaritet av et modifisert

17 1 2 3 oligonukleotid antall nukleobaser som er komplementære til et mirna dividert med antall nukleobaser i det modifiserte oligonukleotid. [0097] "Prosent område bundet" betyr prosentandelen av et område som er komplementær til et oligonukleotidområde. Prosent område bundet beregnes ved å dividere antall nukleobaser i målområdet som er komplementære til oligonukleotidet med lengden av målområdet. I visse utførelser er prosent område bundet minst 80 %, minst 8 %, minst 90 %, minst 9 %, minst 96 %, minst 97 %, minst 98 %, minst 99 % eller 0 %. [0098] "Prosent identitet" betyr antall nukleobaser i en første nukleinsyre som er identiske med nukleobaser i tilsvarende posisjoner i en andre nukleinsyre dividert med det totale antall nukleobaser i den første nukleinsyren. [0099] "I det vesentlige identisk" kan som det anvendes heri bety at en første og en andre nukleobasesekvens er minst 60 %, 6 %, 70 %, 7 %, 80 %, 8 %, 90 %, 9 %, 97 %, 98 % eller 99 % identiske, eller 0 % identiske, over et område på 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2,, 3, 40, 4, 0,, 60, 6, 70,- 7, 80, 8, 90, 9, 0 eller flere nukleobaser. [00] "Hybridisere" betyr den sammenbinding av komplementære nukleinsyrer som opptrer grunnet nukleobase-komplementaritet. [01] "Feilaktig paring" betyr en nukleobase i en første nukleinsyre som ikke kan pare med en nukleobase i tilsvarende posisjon i en andre nukleinsyre. [02] "Ikke-komplementær nukleobase" betyr to nukleobaser som ikke er i stand til å pare via hydrogenbinding. [03] "Identisk" betyr å ha samme nukleobasesekvens. [04] "mirna" eller "mir" betyr et ikke-kodende RNA med lengde mellom 18 og 2 nukleobaser som hybridiserer til og regulerer ekspresjonen av et kodende RNA. I visse utførelser er et mirna produktet som dannes ved spalting av et pre-mirna utført av enzymet Dicer. Eksempler på mirna finnes i mirna-databasen som kalles mirbase (http//microrna.sanger.ac.uk/). [0] "Pre-miRNA" eller "pre-mir" betyr et ikke-kodende RNA med hårnålstruktur som inneholder et mirna. I visse utførelser er et pre-mirna produktet som dannes ved spalting av et pri-mir utført av den dobbelttrådet RNA-spesifikke ribonukleasen som betegnes Drosha. [06] "Stamme-løkke-sekvens" betyr et RNA som har en hårnålstruktur og som inneholder en moden mirna-sekvens. Pre-miRNA-sekvenser og stamme-løkkesekvenser kan overlappe. Eksempler på stamme-løkke-sekvenser finnes i mirnadatabasen som betegnes mirbase (http//microrna.sanger.ac.uk/). [07] "Pri-miRNA" eller "pri-mir" betyr et ikke-kodende RNA med hårnålstruktur som er et substrat for den dobbelttrådet RNA-spesifikke ribonukleasen Drosha.

18 1 2 3 [08] "mirna-forløper" betyr et transkript som stammer fra et genomisk DNA og som omfatter et ikke-kodende, strukturert RNA som omfatter en eller flere mirnasekvenser. For eksempel er i visse utførelser en mirna-forløper et pre-mirna. I visse utførelser er en mirna-forløper et pri-mirna. [09] "Monocistronisk transkript" betyr en mirna-forløper som inneholder en enkelt mirna-sekvens. [01] "Polycistronisk transkript" betyr en mirna-forløper som inneholder to eller flere mirna-sekvenser. [0111] "Kimområde" (seed region) betyr nukleotidene 2 til 6 eller 2 til 7 fra '-enden av en moden mirna-sekvens. [0112] "Oligomer forbindelse" betyr en forbindelse som omfatter en polymer av sammenbundne monomere subenheter. [0113] "Oligonukleotid" betyr en polymer av sammenbundne nukleosider, hvor hvert enket av disse kan være modifisert eller ikke-modifisert, uavhengig av hverandre. [0114] "Naturlig forekommende internukleosidbinding" betyr en 3' til ' fosfodiesterbinding mellom nukleosider. [011] "Naturlig sukker" betyr et sukker som finnes i DNA (2'-H) eller RNA (2'-OH). [0116] "Naturlig nukleobase" betyr en nukleobase som er ikke-modifisert relativt til den naturlig forekommende form. [0117] "Internukleosidbinding" betyr en kovalent binding mellom nabo-nukleosider. [0118] "Sammenbundne nukleosider" betyr nukleosider som er bundet sammen via en kovalent binding. [0119] "Nukleobase" betyr en heterosyklisk gruppe som kan pare ikke-kovalent med en annen nukleobase. [01] "Nukleosid" betyr en nukleobase bundet til et sukker. [0121] "Nukleotid" betyr et nukleosid som har en fosfatgruppe kovalent bundet til sukkerdelen av et nukleosid. [0122] "mir-antagonist" betyr et modifisert oligonukleotid som er komplementært til et mirna eller en mirna-forløper. For eksempel betyr "mir-x-antagonist" et modifisert oligonukleotid med nukleobase-komplementaritet til mir-x. I visse utførelser er en antagonist en mir-21-antagonist. [0123] "Modifisert oligonukleotid" betyr et oligonukleotid som har en eller flere modifikasjoner sammenlignet med et normalt forekommende sukker og/eller en normalt forekommende ende, nukleobase og/eller internukleosidbinding. [0124] "Enkelttrådet modifisert oligonukleotid" betyr et modifisert oligonukleotid som ikke er hybridisert til en komplementær tråd. [012] "Modifisert internukleosidbinding" betyr enhver endring fra en naturlig forekommende internukleosidbinding.

19 1 2 3 [0126] "Fosforotioat-internukleosidbinding" betyr en binding mellom nukleosider hvor et av de ikke-brodannende atomene er et svovelatom. [0127] "Modifisert sukker" betyr substitusjon og/eller enhver endring fra et naturlig sukker. [0128] "Modifisert nukleobase" betyr enhver substitusjon og/eller endring fra en naturlig nukleobase. [0129] "-metylcytosin" betyr en cytosin som er modifisert med en metylgruppe festet i '-posisjon. [01] "2'-O-metylsukker" eller "2'-OMe-sukker" betyr et sukker som har en O- metylmodifikasjon i 2'-posisjon. [0131] "2'-O-metoksyetylsukker" eller "2'-MOE-sukker" betyr et sukker som har en O-metoksyetylmodifikasjon i 2'-posisjon. [0132] "2'-O-fluorsukker" eller "2'-F-sukker" betyr et sukker som har en fluormodifikasjon i 2'-posisjon. [0133] "Bisyklisk sukkergruppe" betyr et sukker som er modifisert ved brodannelse mellom to ikke-geminale ringatomer. [0134] "2'-O-metoksyetylnukleosid" betyr et 2'-modifisert nukleosid med en 2'-Ometoksyetyl-sukkermodifikasjon. [013] "2'-fluornukleosid" betyr et 2'-modifisert nukleosid med en 2'-fluor-sukkermodifikasjon. [0136] "2'-O-metyl"-nukleosid betyr et 2'-modifisert nukleosid med en 2'-O-metylsukkermodifikasjon. [0137] "Bisyklisk nukleosid" betyr et 2'-modifisert nukleosid med en bisyklisk sukkergruppe. [0138] "Motiv" betyr et mønster av modifiserte og/eller ikke-modifiserte nukleobaser, sukkere og/eller internukleosidbindinger i et oligonukleotid. [0139] Et "fullstendig modifisert oligonukleotid" betyr at hver nukleobase, hvert sukker og/eller hver internukleosidbinding er modifisert. [0140] Et "uniformt modifisert oligonukleotid betyr at hver nukleobase, hvert sukker og/eller hver internukleosidbinding har den samme modifikasjonen i hele det modifiserte oligonukleotidet. [0141] En "stabiliserende modifikasjon" betyr en modifikasjon av et nukleosid som gir et modifisert oligonukleotid økt stabilitet i nærvær av nukleaser, sammenlignet med stabiliteten som oppnås med 2'-deoksynukleosider sammenbundet med fosfodiesterinternukleosidbindinger. For eksempel er i visse utførelser en stabiliserende modifikasjon en stabiliserende nukleosidmodifikasjon. I visse utførelser er en stabiliserende modifikasjon en internukleosidbinding-modifikasjon. [0142] Et "stabiliserende nukleosid" betyr et nukleosid som er modifisert slik at det gir økt nukleasestabilitet til et oligonukleotid, sammenlignet med stabiliteten som oppnås