Hvordan sikres god match av organer mellom giver og mottager? Jan Peder Amundrød (Bioingeniør) Avdeling for immunologi og transfusjonsmedisin, Seksjon for transplantasjonsimmunologi, Enhet for HLA-typing (IMMI)
Arbeidsområder Transplantasjonsimmunologisk utredning Vevstyping (HLA typing) Pasienter og LD ved nyre-transplantasjon Pasienter og DD ved nyre-, pankreas (øycelle), lever-, hjerte-, og lunge,-transplantasjon (Pasienter og potensielle givere for stamcelletransplantasjon.) Undersøke for HLA-spesifikke antistoffer Crossmatch mellom pasient og giver
Ikke tema i dag, men vi gjør også Sykdomsdiagnostikk HLA-B27 ved Bechterew`s sykdom HLA-DQ6 ved narkolepsi HLA-DQ2/8 ved cøliaki HLA-B*5701 hypersensitivitetsreaksjon på Abacavir HLA-A29 Birdshot retinopati HLA-B51 ved Behcets sykdom, HLA-B*1502, Acarbamazepine til asiatere og andre henvendelser vurderes av lege.
Platetransfusjonsproblemer -HLA-A og -B typing -Undersøke for HLA-A og B antistoffer
HLA = Humane leukocytt-antigener Oppdaget i 1958 at pasienter som hadde fått mange blodtransfusjoner, dannet antistoffer mot antigener på overflaten av leukocytter. Derav navnet Human leukocytt antigens. Artsuavhengig fellesbetegnelse: Major Histocompability complex (MHC). De er viktige vevsforlikelighetsmolekyler som bestemmer om vev eller celler blir akseptert av mottaker etter transplantasjon.
Genene for HLA ligger på kromosom 6 Fordi det er en entydig sammenheng når vi går fra gensekvens til aminosyresekvens, gjøres HLA-typing på gennivå (HLA-gener). Det finnes to hovedtyper av HLAmolekyler. HLA klasse I består av seriene (genene) HLA-A, HLA-B og HLA-C. HLA klasse II består av HLA- DR, HLA-DQ og HLA-DP. HLA-molekylene er hetrodimerer og består av en α- og en β-kjede. (HLA klasse I molekylenes β-kjede kodes av et gen på kromosom 15.) Veldig stor grad av genetisk polymorfisme. Det finnes mange ulike alleliske varianter innen et locus HLA-genene tett koplet og nedarves under ett fra hver av foreldrene som en pakke betegnet haplotype. Overkrysning i HLA-genområdet i bare ca 1 % av meiosene.
Kjennetegn ved immunforsvaret: 1. Spesifisitet for enkeltstrukturer kunne skille fremmed fra eget unngå autoimmunitet. 2. Hukommelse
Biologisk funksjon HLA HLA klasse I og II binder ulike peptider og forflytter seg ut til cellens overflate. HLA-molekylet presenterer peptid bundet i HLA-gropen for T-lymfocytter som i thymus er selektert for å binde eget HLA passe sterkt. - Positiv seleksjon for å fjerne ubrukelige T- celler som ikke binder seg til egne HLAmolekyler. - Negativ seleksjon for å fjerne autoreaktive T-celler.
HLA molekylene inndeles i to klasser Klasse I finnes i nesten alle kjerneholdige celler og inndeles i A, B og C seriene. Presenterer peptider fra intracellulære proteiner til CD8 + T celler. Klasse II finnes finnes bare på antigenpresenterende celler (dentrittiske celler, monocytter osv) og inneles i DR, DQ og DP seriene. Presenterer peptider tatt opp fra det ekstracellulære rom for CD4 + T celler.
CD4+ CD8+ HLA klasse II (DR, DQ, DP) TCR TCR HLA klasse I (A, B, C) Endocytose av proteiner Endolysosom HLA-DM Cytosolproteiner Ii HLA II HLA I Endoplasmatisk retikulum TAP
Biologisk funksjon: Binde proteinfragmenter (peptider), transportere peptidfragmentene til celleoverflaten og presentere dem for T- lymfocyttene. Dermed kan T lymfocyttene overvåke om en celle blir infisert ved at de oppdager fremmede proteiner fra virus og bakterier.
En karakteristisk egenskap ved HLA (MHC) systemet er at det finnes svært mange genetisk varianter av HLA-molekyler. Dette gjør at ulike HLA-molekyler kan binde peptider med ulik struktur. Mangfoldet av HLA (MHC)-molekyler øker sannsynlighetene for at det alltid skal finnes noen individer som skal kunne presentere fremmede proteiner til T-lymfocytter. Dermed kan ikke smittestoffene «lure seg unna» ved å utvikle proteiner som ikke bindes til HLA-molekyler. Dermed oppnår man en risikospredning, slik at noen individer innen en art vil overleve uansett hvilke epidemier som skulle oppstå.
HLA molekyler er forskjellige i den peptidbindende gropen - presenterer ulike sett av peptider HLA-A2 HLA-B27 HLA-B40
God match for å redusere rejeksjon HLA-molekylene er også sterke transplantasjonsantigener eller vevstyper. Ved transplantasjon induseres avstøtningsreaksjoner særlig mot giverens fremmede HLA-molekyler Avstøtningsreaksjoner blir svakere og sjeldnere når giver og mottaker har de samme eller deler mange HLA molekyler (hovedantigen A, B og DRB1). Unngå DSA (splittnivå og på alle loci) Ikke repeat mismatcher = gjenntatt uforlik for HLA-A, B og DRB1 (hovedantigen)
Allogen organtransplantasjon Typing for HLA-A, -B, C, DRB1, DQB1 og DQA1 (avdød donor, nyrer og BM også på DRB3, DRB4, DRB5, DPB1 og DPA1) Matches på hovedantigen HLA-A, -B og DRB1 Matchgrad (egentlig mismatch) angis i rejeksjonsretning (HvG) og avhenger av hovedantigener: separat for klasse-i og II, fra 0-0 (I-II) til 4-2 0-0: Ingen mismatch for HLA-A/B eller -DRB1 4-2: 4 antigeners mismatch for HLA-A/B, 2 for -DRB1 Splitter er viktige dersom HLA-spesifikke antistoffer er påvist og ved gjentatte transplantasjoner
Hvordan oppnå best mulig match? Lete etter en familiegiver (nyre og BM) 25 % av søsken deler begge haplotyper.
Vanskelig finne HLA forlikelig ubeslektet donor. Lettere med større pool av donorer og givere: Samarbeid mellom flere land som for eksempel Scandiatransplant.
Hvordan oppnå best mulig match? God vevstyping (~typing for HLA) av både donorer og pasient Genomisk; SSO, NGS, RT-PCR Undersøkelse for HLA-antistoffer av pasientene. Screening, PRA-prosent (B-screening) Spesifisitetsundersøkelse (Luminex)
Deteksjon av HLA antistoffer B-screening CDC (complement dependent cytotoxicity Bestemme PRA = Panelreaktive antistoffer Luminex Mer sensitiv Egner seg bedre for å bestemme spesifisitet og finne om eventuelle donorspesifikke antistoffer. Men er egentlig ikke en god kvantitativ metode selv om vi bruker MFI (i beste fall semi-kvantitativ).
PRA/screening PRA = panelreaktive antistoffer Tester serum med CDC teknikk mot B celler fra et bredt panel av donorer (hos oss ca 20 personer i labben) Resultatet gis som 0-20-40-60-80% positiv reaksjon (PRA prosent) Sier noe om sannsynligheten for å få en positiv CDC crossmatch (panelet bør være representativt for befolkningen). F. eks er HLA-A2 tilstede på ca. 50% av etnisk norske individer. Antistoffer mot HLA-A2 alene bør således gi en PRA på 50% ved test på panelet PRA prosent kan også bestemmes vha Luminex teknikk Hos oss testes serum fra pasienter på tx ventelisten hver 3. måned (vekselvis CDC og Luminex teknikk).
PRA positive pasienter Assosiert med antistoffmedierte rejeksjoner og tap av transplantatet PRA positive pasienter må ofte vente lenger før de får en nyre (PRA>30% - dobbelt så lang ventetid som gjennomsnittet)
26
Påvisning av donorspesifikke antistoffer Ikke kontraindikasjon for Tx dersom under deteksjonsgrensen for CDC-teknikken (dvs. ved negativ crossmatch) Ønskelig med spesiell forbehandling og oppfølging av pasienten Kan påvises som ledd i rejeksjonsutredning, påvirker valg av behandling
Crossmatch (XM) undersøkelser Sikre at det er forlikelighet mellom resipient og donor ved transplantasjon av solide organer og stamceller. En positiv crossmatch indikerer som regel at pasienten har antistoffer mot donors HLA molekyler Gjøres rett før transplantasjon og ved tidlige avstøtningsreaksjoner. Skal være negativ Patel, R. and Terasaki, P.I (1969) Significance of the positive crossmatch test in kidney transplantation. N.Engl. J. Med. 280, 735-739.
CDC crossmatch undersøkelse 1 Inkuber celler med antistoffer 2 Inkuber med komplement 3 Tilsett farge Positiv reaksjon Negativ reaksjon 1. Inkubering av donor levkocytter med pasient serum (25 min) 2. Inkubering med kaninkomplement (35 min) 3. Inkubering med Acridin Orange/Ethidium Bromide som farger levende celler grønt og døde celler rødt Trinn 2+3 kombineres i praksis, avlesning i fluorescensmikroskop
Negativ crossmatch Positiv crossmatch
CDC crossmatch Fordeler: regnes som gullstandard, det kreves i de aller fleste tilfeller at CDC crossmatch er negativ for at man skal starte en transplantasjon detekterer biologisk relevante antistoffer forhindrer hyperakutt forkastelse Ulemper: for lav sensitivitet? falske positive reaksjoner, autoantistoffer
STAMP ScandiaTransplant Acceptable Mismatch Program Fremmede HLA molekyler pasienten ikke har antistoffer mot = «akseptable mismatcher» Programmet varsler om egnete donorer For pasienter med mye antistoffer (Transplantability score 2%) 33
34
Framtiden epitopematching? Antistoffer binder antigene determinanter (epitoper) på HLA molekyler Epitoper består av polymorfe aminosyrer som er nær hverandre (innen 3.0-3.5Å) Lineære epitoper og diskontinuerlige epitoper
Virtuell CM? Bedre typing (karaterisering) av HLA-typer hos donor og mottager Bedre spesifisitetsundersøkelse av HLA antistoffer med luminex teknologi Kan spare tid hvis donor haster.
Hva gjør IMMI når det er meldt en avdød donor? Donor sykehus kontakter Tx-koordinator som igjen kontakter oss om ankomsttid av blodprøver, hastegrad, pårørende spurt, dødsårsak, ABO, kjønn. Vi drar til lab, sender prøver til virologi og ABO-typing. Vi HLA-typer. Ca 3-4 timer. Kjøre Scandiasøk og tar ut lister. Gir resultater til Tx-koordinator på tlf og fax og kontakter kirurgene på tlf. Finner ut sammen med dem hvem som er aktuelle mottakere og som det skal gjøres crossmatch på. Avhengig av HLA-match, ventetid, alder, hastegrad med mer.
Setter opp aktuelle crossmatcher. Hvis begge nyrer skal beholdes på RH, så setter vi opp 5-6 crossmatcher. 2-4 på hjerte, 2-4 på lunger og 2-4 på lever. Pankreas? Ca 2-3 timer. Gir ut resultatene pr tlf og fax til kirurgene og hører etter hvert med dem eller Tx-posten(e) om hvem som skal kalles inn. Pasienter som er tidligere transplantert, pasienter med DSA(donorspesifikke antistoffer), pasienter som er PRApositive og pasienter som har mottatt blod i løpet av de siste 4 mnd skal det alltid settes opp ny crossmatch i ferskt (innkomst) serum. Opprydning av papirer og på data. (Knytte sammen donor og recipienter)
Hvordan oppnå god match? God typing (epitopematching i framtiden?) Stor pool av donorer og mottagere Scandiatransplant STAMP Scandia Transplant kidney Exchange Programme (STEP) Antistoffundersøkelse som gir spesifisitet (ikke DSA) Ikke repeat hukommelse