(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (51) Int Cl. C12N 9/10 ( ) C12N 15/54 ( ) C12P 7/64 ( ) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato (30) Prioritet , US, P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver E. I. Du Pont de Nemours and Company, 1007 Market Street, Wilmington, DE 19898, US-USA (72) Oppfinner DAMUDE, Howard, Glenn, 4 Kenwick Road, Hockessin, DE 19707, US-USA ZHU, Quinn, Qun, 544 Revere Road, West Chester, PA 19382, US-USA (74) Fullmektig Tandbergs Patentkontor AS, Postboks 1570 Vika, 0118 OSLO, Norge (54) Benevnelse Delta-9-forlengelser og anvendelse av disse ved fremstilling av polyumettede fettsyrer (56) Anførte publikasjoner US-A , WO-A-02/077213, WO-A-2005/083093, WO-A-2007/ WO-A-2007/061845, WO-A1-2009/046231, WO-A2-2008/100545, WO-A2-2008/ WO-A2-2008/ QI B. ET AL: 'Identification of a cdna encoding a novel C18-DELTA9 polyuns aturated fatty acidspecific elongating activity from the docosahexaenoic acid (DHA)-producing microalga, Isochrysis galbana1' FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL vol. 510, no. 3, 16 January 2002, pages , XP DOI: DOI: /S (01) ISSN: ROST B: "Enzyme Function Less Conserved than Anticipated", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, LONDON, GB, vol. 318, no. 2, 26 April 2002 ( ), pages , XP , ISSN: , DOI: DOI: /S (02) SHEVELEVA ELENA V ET AL: "Identification and comparative analysis of the chloroplast alphasubunit gene of DNA-dependent RNA polymerase from seven Euglena species" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 30, no. 5, 1 March 2002 ( ), pages , XP ISSN: TIAN W ET AL: "How Well is Enzyme Function Conserved as a Function of Pairwise Sequence Identity?", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, LONDON, GB, vol. 333, no. 4, 31 October 2003 ( ), pages , XP , ISSN: , DOI: DOI: /J.JMB

2 Beskrivelse OPPFINNELSENS OMRÅDE [0001] Denne oppfinnelsen er innen området bioteknologi. Mer spesifikt angår oppfinnelsen identifiseringen av polynukleotidsekvenser som koder for Δ9- fettsyreforlengelser og anvendelsen av disse forlengelsene ved fremstilling av langkjedete polyumettede fettsyrer (PUFA-er). OPPFINNELSENS BAKGRUNN [0002] I dag undersøkes en rekke forskjellige verter inkludert planter, alger, sopp, stramenopiler og gjær som midler for kommersiell PUFA-fremstilling. Genteknologi har vist at de naturlige egenskapene til noen verter (selv de som nativt er begrenset til linolsyre (LA; 18:2 ω-6) og α-linolensyre (ALA; 18:3 ω-3) fettsyrefremstilling) kan i det vesentlige endres for å resultere i høynivåfremstilling av forskjellige langkjedede ω-3/ω-6 PUFA-er. Hvorvidt dette er et resultat av naturlige egenskaper eller rekombinant teknologi, kan fremstilling av arakidonsyre (ARA, 20:4 ω-6), eikosapentaensyre (EPA; 20:5 ω-3) og dokosaheksaensyre (DHA; 22:6 ω-3) kreve ekspresjon av en Δ9-forlengelse. [0003] De fleste Δ9-forlengelseenzymer som er identifisert så langt har evnen til å omdanne henholdsvis både LA til eikosadiensyre (EDA; 20:2 ω-6) og ALA til eikosatriensyre (ETrA; 20:03 ω-3) (hvori dihomo-γ-linolensyre (DGLA; 20:3 ω-6) og eikosatetraensyre (ETA; 20:4 ω-3) blir deretter syntetisert fra henholdsvis EDA og ETrA, etter omsetning med en Δ8-desaturase; ARA og EPA syntetiseres deretter fra henholdsvis DGLA og ETA, etterfulgt av omsetning med en Δ5-desaturase, og DHAsyntese krever etterfølgende ekspresjon av en ytterligere C 20/22 -forlengelse og en Δ4- desaturase). En nukleinsyre som koder for et enzym med Δ8-desaturaseaktivitet har blitt identifisert og vist seg å være effektiv i fremstilling av langkjedede polyumettede fettsyrer når denne uttrykkes i mikroorganismer, slik som gjær (US 2005/ ). [0004] Til tross for behovet for nye fremgangsmåter for fremstilling av ARA, EPA og DHA, har få Δ9-forlengelseenzymer blitt identifisert. En Δ9-forlengelse fra [0005] Isochrysis galbana er offentlig tilgjengelig (beskrevet i GenBank tiltredelsesnr. AAL37626, så vel som PCT-publikasjonsnr. WO 02/077213, nr. WO 2005/083093, nr. WO 2005/ og nr. WO 2004/057001). PCT-publikasjonsnr. WO 2007/ og WO 2007/ (søkers oppdragstakers co-løpende søknader), beskriver Δ9-forlengelser fra Euglena gracilis og Eutreptiella sp. CCMP389, samt Δ9-forlengelsemotiver. [0006] Det er derfor behov for identifisering og isolering av ytterligere gener som koder for Δ9-forlengelser som vil være egnet for heterolog ekspresjon i forskjellige vertsorganismer for anvendelse i fremstilling av ω-3/ω-6-fettsyrer.

3 2 [0007] Søkerne har løst det oppgitte problemet ved å isolere gener som koder for Δ9-fettsyreforlengelser fra Euglena anabaena OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN [0008] Den foreliggende oppfinnelsen vedrører nye genetiske konstruksjoner som koder for polypeptider som har Δ9-forlengelseaktivitet, og deres anvendelse i alger, bakterier, gjær, euglenoider, stramenopiler og sopp for fremstilling av PUFA-er. Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen en transformert mikrobiell vertscelle omfattende et ikke-nativt gen omfattende et isolert polynukleotid omfattende: (a) en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid med Δ9- forlengelseaktivitet, hvori polypeptidet har minst 90 % aminosyreidentitet, basert på Clustal V-oppstillingsmetoden, sammenlignet med en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NR: 13 eller SEQ ID NR: 14; (b) en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid med Δ9- forlengelseaktivitet, hvori nukleotidsekvensen har minst 90 % sekvensidentitet, basert på BLASTN-oppstillingsmetoden, sammenlignet med en nukleotidsekvens som fremsatt i SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12 eller SEQ ID NR: 26; eller (c) et komplement av nukleotidsekvensen av (a) eller (b), hvori komplementog nukleotidsekvensen består av det samme antall nukleotider og er 100% komplementære, hvori det ikke-native genet som omfatter det isolerte polynukleotidet er blitt innsatt inn i den mikrobielle vertscellen. [0009] I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av eikosadiensyre omfattende: a) tilveiebringelse av en mikrobiell vertscelle omfattende: (i) et rekombinant nukleotidmolekyl som koder for et Δ9- forlengelsepolypeptid med minst 90 % aminosyreidentitet, basert på Clustal V-oppstillingsmetoden, sammenlignet med en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NR: 13 eller SEQ ID NR: 14 og (ii) en linolsyrekilde; b) dyrking av den mikrobielle vertscellen fra trinn (a) under betingelser hvori nukleinsyrefragmentet som koder for Δ9-forlengelsepolypeptidet uttrykkes og linolensyren omdannes til eikosadiensyre; og, c) eventuelt utvinning av eikosadiensyren fra trinn (b). [0010] I en ytterligere utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av eikosatriensyre omfattende: a) å tilveiebringe en mikrobiell vertscelle omfattende:

4 (i) et rekombinant nukleotidmolekyl som koder for et nukleotid-δ9- forlengelsepolypeptid med minst 90 % aminosyreidentitet, basert på Clustal V-oppstillingsmetoden sammenlignet med en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NR: 13 eller SEQ ID NR: 14; og, (ii) en α-linolensyrekilde; b) dyrking av den mikrobielle vertscellen fra trinn (a) under betingelser hvori nukleinsyrefragmentet som koder for Δ9-forlengelsespolypeptidet uttrykkes og α-linolensyren omdannes til eikosatriensyre, og, c) eventuelt utvinne eikosatriensyren fra trinn (b). [0011] I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et isolert nukleinsyremolekyl som koder for en Δ9-forlengelse som angitt i SEQ ID NR: 26, hvori minst 98 kodoner er kodonoptimalisert for ekspresjon i Yarrowia sp. KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE OG SEKVENSLISTENE [0012] FIG. 1 er en representativ ω-3- og ω-6-fettsyrebiosyntetisk reaksjonsvei som tilveiebringer omdanningen av myristinsyre gjennom forskjellige mellomprodukter til DHA. FIG. 2 viser et kromatogram av lipidprofilen til et Euglena anabaenacelleekstrakt som beskrevet i eksemplene. FIG. 3 tilveiebringer plasmidkart for de følgende: (A) py115 (SEQ ID NR: 19), (B) py159 (SEQ ID NR: 23); (C) py173 (SEQ ID NR: 24); og (D) py174 (SEQ ID NR: 25). FIG. 4A og 4B viser en sammenligning av nukleotidsekvensene til EaD9Elo (SEQ ID NR: 11) og EaD9ES (SEQ ID NR: 26). FIG. 5 tilveiebringer plasmidkart for det følgende: (A) pead9es (SEQ ID NR: 28), og (B) pzufmead9es (SEQ ID NR: 29). [0013] Oppfinnelsen kan forstås mer fullstendig fra den følgende detaljerte beskrivelsen og de vedlagte sekvensbeskrivelene, som utgjør en del av denne søknaden. [0014] SEQ ID NR:1-4, 9-19 og er ORF-er som koder for gener eller proteiner (eller deler av disse), eller plasmider, som identifisert i tabell 1. 35

5 4 Tabell 1 Oppsummering av nukleinsyre og protein SEQ ID-tall Beskrivelse og forkortelse Nukleinsyre SEQ ID NR. Protein SEQ ID NR. Euglena anabaena Δ9-1 (1129 bp) -- forlengelse cdna-sekvens ("EaD9Elo1") Euglena anabaena Δ9-2 (1145 bp) -- forlengelse cdna-sekvens ("EaD9Elo2") Euglena gracilis Δ9-3 (774 bp) 4 (258 AA) forlengelse kodende sekvens ("EgD9e") Plasmid plf (3668 bp) -- Plasmid plf (3684 bp) -- Euglena anabaena Δ9-11 (774 bp) 13 (258 AA) forlengelse kodende sekvens ("EaD8Des1 CDS" eller "EaD9Elo1", respektivt) Euglena anabaena Δ9-12 (774 bp) 14 (258 AA) forlengelse kodende sekvens ("EaD8Des2 CDS" eller "EaD9Elo2", respektivt) Plasmid pkr (4311 bp) -- Isochrysis galbana Δ (263 AA) forlengelse (IgD9e) Plasmid pdmw (9472 bp) -- Plasmid pdmw (7879 bp) -- Plasmid py (7783 bp) -- Plasmid py (6992 bp) -- Plasmid py (8707 bp) -- Plasmid py (8219 bp) -- Plasmid py (8235 bp) Syntetisk Δ9-forlengelse, avledet fra Euglena anabaena, kodonoptimalisert for ekspresjon i Yarrowia lipolytica ("EaD9eS") 26 (774 bp) 27 (258 AA)

6 5 Oppsummering av nukleinsyre og protein SEQ ID-tall Beskrivelse og forkortelse Nukleinsyre SEQ ID NR. Protein SEQ ID NR. Plasmid pead9es 28 (3497 bp) Plasmid pzufmead9es 29 (7769 bp) [0015] SEQ ID NR: 5 og 6 svarer til henholdsvis oligonukleotidene oeugel1-1 og oeugel1-2, anvendt for amplifisering av Euglena gracilis Δ9-forlengelse. [0016] SEQ ID NR: 7 og 8 tilsvarer henholdsvis M13F-universalprimeren og primeren M13-28Rev, anvendt til ende-sekvensering av Euglena anabaena-dna-innsettinger. [0017] SEQ ID NR: 20 og 21 tilsvarer henholdsvis primerne oyfba1 og oyfba1-6, anvendt til å forsterke FBAINm-promotoren fra plasmid py115. DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN [0018] Nye Euglena anabaena Δ9-forlengelseenzymer og gener som koder for det samme som kan anvendes for manipulering av biokjemiske reaksjonsveier for fremstillingen av sunne PUFA-er er beskrevet heri. [0019] PUFA-er, eller derivater derav, anvendes som kosttilskuddserstatninger, eller supplementer, særlig morsmelkerstatninger, for pasienter som gjennomgår intravenøs fôring eller for å forebygge eller behandle underernæring. Alternativt kan de rensede PUFA-ene (eller derivater derav) inkorporeres i matoljer, fett eller margariner formulert slik at mottakeren mottar den ønskede mengden av kosttilskudd i normal anvendelse. PUFA-ene kan også inkorporeres i morsmelkerstatninger, kosttilskuddserstatninger eller andre næringsprodukter og kan finne anvendelse som anti-inflammatoriske eller kolesterolsenkende midler. Eventuelt kan sammensetningene anvendes for farmasøytisk anvendelse (human eller veterinær). Definisjoner [0020] I sammenheng med denne beskrivelsen anvendes en rekke begreper og forkortelser. De følgende definisjonene er gitt. [0021] "Åpen leseramme" er forkortet ORF. [0022] "Polymerasekjedereaksjon" er forkortet PCR. [0023] "American Type Culture Collection" er forkortet ATCC. [0024] "Polyumettet fettsyre(r)"er forkortet PUFA(r). [0025] "Triacylglyceroler" er forkortet TAG-er. [0026] Begrepet "oppfinnelse" eller "foreliggende oppfinnelse" som anvendt heri er ikke ment å være begrensende for noen bestemt utførelsesform av oppfinnelsen, men gjelder generelt for en hvilken som helst og alle utførelsesformer ifølge oppfinnelsen som faller innenfor omfanget av de vedlagte kravene som beskrevet i kravene og beskrivelsen.

7 [0027] Som anvendt heri og i de vedlagte kravene inkluderer entallsformene "en", "et" og "den" flere referanser med mindre sammenhengen klart tilsier noe annet. Derfor inkluderer for eksempel referanse til "en plante" flere slike planter, referanse til "en celle" inkluder en én eller flere celler og ekvivalenter derav som er kjent for fagfolk innen teknikken, og så videre. [0028] Begrepet "fettsyrer" refererer til langkjedede alifatiske syrer (alkansyrer) av varierende kjedelengder, fra omtrent C 12 til C 22 (selv om både lengre og kortere kjedelengdesyrer er kjent). De dominerende kjedelengdene er mellom C 16 og C 22. Ytterligere detaljer vedrørende differensieringen mellom "mettede fettsyrer" versus "umettede fettsyrer", "enumettede fettsyrer" versus "flerumettede fettsyrer" (eller "PUFA-er"), og "omega-6-fettsyrer" (ω-6 eller n-6) versus "omega-3-fettsyrer" (ω-3 eller n-3) er tilveiebrakt i US patent [0029] Fettsyrer er beskrevet heri med et enkelt forkortelsessystem med "X:Y", der X er det totale antallet karbon (C) atomer i den spesielle fettsyren og Y er antallet dobbeltbindinger. Antallet etter fettsyrebetegnelsen indikerer posisjonen av dobbeltbindingen fra karboksylenden av fettsyren med "c"-festet for ciskonfigurasjonen av dobbeltbindingen (f.eks. palmitinsyre (16:0), stearinsyre (18:0), oleinsyre (18:1, 9c), petroselinsyre (18:1, 6c), LA (18:2, 9c, 12c), GLA (18:3, 6c, 9c, 12c) og ALA (18:3, 9c, 12c, 15c)). Med mindre annet er spesifisert refererer 18:1, 18:2 og 18:3 til henholdsvis oleinsyre, LA- og ALA-fettsyrer. Dersom ikke noe annet er spesielt skrevet er dobbeltbindinger ment å være i cis-konfigurasjon. For eksempel vil dobbeltbindingene i 18:2 (9,12) vurderes å være i cis-konfigurasjon. [0030] Nomenklaturen anvendt for å beskrive PUFA i den foreliggende beskrivelsen er vist i tabell 2 nedenfor. I kolonnen med tittelen "Forkortet betegnelse" er omegareferansesystemet anvendt for å indikere antallet karbonatomer, antallet dobbeltbindinger og plasseringen av dobbeltbindingen nærmest omegakarbonet, regnet fra omegakarbonet (som er nummerert 1 for dette formålet). Resten av tabellen oppsummerer de vanlige navnene på ω-3- og ω-6 fettsyrer og deres forløpere, forkortelser som skal anvendes gjennom resten av beskrivelsen og hver forbindelses ' kjemiske navn. Tabell 2 Nomenklatur for flerumettede fettsyrer og forløpere Vanlig navn Forkortelse Kjemisk navn Forkortet betegnelse Myristin -- tetradekanoisk 14:0 Palmitin PA eller heksadekanoisk 16:0 palmitat Palmitololein (eng.: palmitoleic) -- 9-heksadecenoisk 16:1

8 7 Vanlig navn Forkortelse Kjemisk navn Forkortet betegnelse Stearin -- oktadekanoisk 18:0 Olein -- cis-9-oktadecenoisk 18:1 Linoleisk LA cis-9,12- oktadecadienoisk 18:2 ω-6 γ-linolenisk GLA cis-6,9,12- oktadekatrienoisk 18:3 ω-6 Eikosadienoisk EDA cis-11,14- eikosadienoisk 20:2 ω-6 Dihomo-γ-linolenisk DGLA cis-8,11,14- eikosatrienoisk 20:3 ω-6 Sciadonisk SCI cis-5,11,14- eikosatrienoisk 20:3b ω-6 Arakidonisk ARA cis-5,8,11,14- eicosatetraenoisk 20:4 ω-6 α-linolenisk ALA cis-9,12,15- oktadekatrienoisk 18:3 ω-3 Stearidonisk STA cis-6,9,12,15- oktadekatetraenoisk 18:4 ω-3 Eikosatrienoisk ETrA or ERA cis-11,14,17- eikosatrienoisk 20:3 ω-3 Eikosatetraenoisk ETA cis-8,11,14,17- eikosatetraenoisk 20:4 ω-3 Juniperonisk JUP cis-5,11,14,17- eikosatrienoisk 20:4b ω-3 Eikosapentaenoisk EPA cis-5,8,11,14,17- eikosapentaenoisk 20:5 ω-3 Dokosatrienoisk DRA cis-10,13,16- dokosatrienoisk 22:3 ω-6 Dokosatetraenoisk DTA cis-7,10,13,16- dokosatetraenoisk 22:4 ω-6 Dokosapentaenoisk DPAn-6 cis-4,7,10,13,16- dokosapentaenoisk 22:5 ω-6 Dokosapentaenoisk DPA cis-7,10,13,16,19- dokosapentaenoisk 22:5 ω-3 Dokosaheksaenoisk DHA cis- 4,7,10,13,16,19-22:6 ω-3

9 8 Vanlig navn Forkortelse Kjemisk navn Forkortet betegnelse dokosaheksaenoisk [0031] Begrepene "triacylglycerol", "olje" og "TAG-er" henviser til nøytrale lipider som består av tre fettasylrester esterifisert til et glyserolmolekyl (og slike begreper vil anvendes om hverandre gjennom den foreliggende beskrivelsen heri). Slike oljer kan inneholde langkjedede PUFA-er, samt kortere mettede og umettede fettsyrer og lengre mettede fettsyrekjeder. Dermed refererer "oljebiosynteser" generelt til syntesen av TAG i cellen. [0032] "Prosent (%) PUFA i de totale lipid- og oljefraksjonene" refererer til prosentandelen av PUFA i forhold til de totale fettsyrene i disse fraksjonene. Begrepet "total lipidfraksjon" eller "lipidfraksjon" refererer begge til summen av alle lipidene (dvs. nøytrale og polare) innenfor en oljeformig organisme, dermed inkluderer disse lipidene som er plassert i den fosfatidylkolin (PC)-fraksjonen fosfatidyletanolamin (PE)-fraksjon og triacylglycerol (TAG eller olje) fraksjon. Imidlertid vil begrepene "lipid" og "olje" anvendes om hverandre i hele beskrivelsen. [0033] En metabolsk reaksjonsvei eller biosyntetisk reaksjonsvei, i en biokjemisk forstand, kan betraktes som en serie av kjemiske reaksjoner som forekommer i en celle, katalysert av enzymer, for å oppnå enten dannelsen av et metabolsk produkt som skal anvendes eller lagres av cellen, eller initiering av en annen metabolsk reaksjonsvei (da kalt et strømgenererende trinn). Mange av disse reaksjonsveiene er utdypet og involverer en trinnvis endring av det innledningsvise stoffet for å forme dette til et produkt som har den eksakte kjemiske ønskede strukturen. [0034] Begrepet "PUFA biosyntetisk reaksjonsvei" refererer til en metabolsk prosess som omdanner oleinsyre til ω-6-fettsyrer som for eksempel LA, EDA, GLA, DGLA, ARA, DRA, DTA og DPAn-6 og ω-3-fettsyrer slik som ALA, STA, ETrA, ETA, EPA, DPA og DHA. Denne prosessen er godt beskrevet i litteraturen (se f.eks. PCTpublikasjon nr. WO 2006/052870). Denne prosessen involverer enkelt forlengelse av karbonkjeden ved tilsetningen av karbonatomer og desaturering av molekylet ved tilsetningen av dobbeltbindinger, via en rekke spesielle desaturerings- og forlengelsesenzymer (dvs."pufa-biosyntetiske reaksjonsveienzymer") til stede i membranen i endoplasmisk retikulim. Mer spesifikt refererer "PUFA-biosyntetisk reaksjonsveienzym" til et hvilken som helst av de følgende enzymene (og gener som koder for enzymene) forbundet med biosyntesen av et PUFA, inkludert: en Δ9- forlengelse, en C 14/16 -forlengelse, en C 16/18 -forlengelse, en C 18/20 -forlengelse, en C 20/22 - forlengelse, en Δ4-desaturase, en Δ5-desaturase, en Δ6-desaturase, en Δ12-desaturase, en A15-desaturase, en Δ17-desaturase, en Δ9-desaturase og/eller en Δ8-desaturase.

10 [0035] Begrepet "ω-3/ω-6 fettsyre biosyntetisk reaksjonsvei" refererer til et sett av gener som, når de uttrykkes under passende betingelser koder for enzymer som katalyserer fremstillingen av hver eller begge ω-3- og ω-6 fettsyrene. Vanligvis koder genene involvert i ω-3/ω-6-fettsyrebiosyntesereaksjonsveien for PUFA-biosyntesereaksjonsveienzymer. En representativ reaksjonsvei er illustrert i FIG. 1 som tilveiebringer omdannelsen av myristinsyre gjennom forskjellige mellomprodukter til DHA, som viser hvordan både ω-3- og ω-6-fettsyrene kan fremstilles fra en felles kilde. Reaksjonsveien er naturlig inndelt i to deler der den ene delen vil generere ω-3- fettsyrer og den andre delen, ω-6-fettsyrer. [0036] Begrepet "funksjonell" som anvendt heri i forbindelse med ω-3/ω-6- fettsyrebiosyntesereaksjonsveien innebærer at noen (eller alle) genene i reaksjonsveien uttrykker aktive enzymer, noe som resulterer i in vivo-katalyse eller substratkonvertering. Det må forstås at "ω-3/ω-6-fettsyrebiosyntetesereaksjonsvei" eller "funksjonell ω-3/ω-6-fettsyrebiosyntesereaksjonsvei" ikke impliserer at alle PUFAbiosyntesereaksjonsveienzymgenene er nødvendig, ettersom en rekke fettsyreprodukter kun vil kreve ekspresjon av et delsett av genene i denne reaksjonsveien. [0037] Begrepet "Δ6-desaturase/Δ6-forlengelsesreaksjonsvei" skal referere til en PUFA-biosyntesereaksjonsvei som minimum inkluderer minst en Δ6-desaturase, og minst en C18/20-forlengelse (også referert til som en Δ6-forlengelse), og dermed muliggjør biosyntesen av DGLA og/eller ETA fra henholdsvis LA og ALA med GLA og/eller STA som mellomliggende fettsyrer. Med ekspresjon av andre desaturaser og forlengelser kan ARA, EPA, DPA og DHA også syntetiseres. [0038] Begrepet "Δ9-forlengelse/Δ8-desaturasereaksjonsvei" skal referere til en PUFA-biosyntetesereaksjonsvei som minimalt inkluderer minst én Δ9-forlengelse og minst én Δ8-desaturase, og dermed muliggjøre biosyntesen av DGLA og/eller ETA fra henholdsvis LA og ALA, med EDA og/eller ETrA som mellomliggende fettsyrer. Med ekspresjon av andre desaturaser og forlengelser kan også ARA, EPA, DPA og DHA syntetiseres. [0039] Begrepet "mellomliggende fettsyre" refererer til en hvilken som helst fettsyre som fremstilles i en fettsyremetabolsk reaksjonsvei som videre kan omdannes til et tilsiktet fettsyreprodukt i denne reaksjonsveien ved virkningen av andre metabolske reaksjonsveienzymer. For eksempel, når EPA fremstilles ved hjelp av Δ9- forlengelse/a8-desaturasereaksjonsveien, kan EDA, ETrA, DGLA, ETA og ARA fremstilles og regnes som "mellomliggende fettsyrer" ettersom disse fettsyrene kan videre omdannes til EPA via virkningen av andre metabolske reaksjonsveienzymer. [0040] Begrepet "biproduktfettsyre" refererer til en hvilken som helst fettsyre som fremstilles i en fettsyremetabolsk reaksjonsvei som ikke er det tiltenkte fettsyreproduktet fra reaksjonsveien og heller ikke en "mellomliggende fettsyre" i

11 reaksjonsveien. For eksempel, når EPA fremstilles ved hjelp av Δ9-forlengelse/Δ8- desaturasereaksjonsveien kan sciadonsyre (SCI) og juniperonsyre (JUP) også fremstilles ved virkningen av en Δ5-desaturase på enten henholdsvis EDA eller ETrA. De anses å være "biproduktfettsyrer" ettersom de verken kan videre omdannes til EPA ved virkning av andre metabolske reaksjonsveienzymer. [0041] Begrepet "desaturase" refererer til et polypeptid som kan desaturere, dvs. innsette en dobbeltbinding i én eller flere fettsyrer for å fremstille en fettsyre eller forløper av interesse. Til tross for anvendelsen av omega-referanse-systemet gjennom beskrivelsen for å referere til spesifikke fettsyrer, er det mer praktisk å indikere aktiviteten av en desaturase ved å telle fra karboksylenden av substratet ved hjelp av deltasystemet. Desaturaser av interesse inkluderer for eksempel: (1) Δ8-desaturaser som desaturater en fettsyre mellom det åttende og niende karbonatomet nummerert fra den karboksylterminale enden av molekylet og som kan, for eksempel, katalysere omdannelsen av EDA til DGLA og/eller ETrA til ETA; (2) Δ5-desaturaser som katalyserer omdannelsen av DGLA til ARA og/eller ETA til EPA; (3) Δ6-desaturaser som katalyserer omdannelsen av LA til GLA og/eller ALA til STA; (4) Δ4-desaturaser som katalyserer omdannelsen av DPA til DHA og/eller DTA til DPAn-6, (5) Δ12-desaturaser som katalyserer omdannelsen av oleinsyre til LA, (6) Δ15-desaturaser som katalyserer omdannelsen av LA til ALA og/eller GLA til STA; (7) Δ17-desaturaser som katalyserer omdannelsen av ARA til EPA og/eller DGLA til ETA; og (8) Δ9-desaturaser som katalyserer omdannelsen av palmitinsyre til palmitoleinsyre (16:1) og/eller stearinsyre til oleinsyre (18:1). I teknikken er Δ15- og Δ17-desaturaser også noen ganger referert til som "omega-3-desaturaser", "w-3-desaturaser" og/eller "ω-3-desaturaser", basert på deres evne til å omdanne ω-6 fettsyrer til deres ω-3 motparter (f.eks. omdanning av henholdsvis LA til ALA og ARA til EPA). I noen utførelsesformer kan det være ønskelig å empirisk bestemme spesifisiteten til et bestemt fettsyredesaturase ved å transformere en egnet vert med genet for fettsyredesaturasegen og bestemme dets virkning på fettsyreprofilen til verten. [0042] For formålene heri vil et enzym som katalyserer den første kondensasjonsreaksjonen (dvs. omdannelse av malonyl-coa og langkjedet acyl-coa til β-ketoacyl- CoA) refereres til generisk som en "forlengelse". Generelt er substratselektiviteten til forlengelser noe bred, men segregeres av både kjedelengde og grad av umettethet. Følgelig kan forlengelser ha forskjellige spesifisiteter. For eksempel vil en C 14/16 - forlengelse anvende et C 14 -substrat (f.eks. myristinsyre), en C 16/18 -forlengelse vil anvende et C 16 -substrat (f.eks. palmitat), en C 18/20 -forlengelse (også kjent som en Δ6- forlengelse ettersom begrepene kan anvendes om hverandre) vil anvende et C 18 - substrat (f.eks. GLA, STA) og en C 20/22 -forlengelse vil anvende et C 20 -substrat (f.eks. ARA, EPA). På samme måte, og av spesiell interesse heri katalyserer en "Δ9-

12 forlengelse" omdannelsen av LA til EDA og/eller ALA til ETrA. Det er viktig å merke seg at noen forlengelser har bred spesifisitet, og derfor kan et enkelt enzym være i stand til å katalysere flere forlengelsesreaksjoner. Således kan for eksempel en Δ9- forlengelse også fungere som en C 16/18 -forlengelse, C 18/20 -forlengelse og/eller C 20/22 - forlengelse og kan ha alternative, men ikke foretrukne, spesifisiteter for Δ5- og Δ6- fettsyrer som henholdsvis EPA og/eller GLA. I foretrukne utførelsesformer kan det være ønskelig å empirisk bestemme spesifisiteten til en fettsyreforlengelse ved å transformere en egnet vert med genet for fettsyreforlengelsen og bestemme dets virkning på fettsyreprofilen til verten. Forlengelsessystemer omfatter generelt fire enzymer som er ansvarlige for forlengelse av en fettsyrekarbonkjede for å fremstille en fettsyre som er to karbonatomer lenger enn fettsyresubstratet som forlengelsessystemet virker på. Nærmere bestemt oppstår prosessen av forlengelse i forbindelse med fettsyresyntase, hvorved CoA er acylbæreren (Lassner et al., Plant Cell, 8: (1996)). I det første trinnet, som har blitt funnet å være både substrat-spesifikt og også hastighetsbegrensende, blir malonyl-coa kondensert med et langkjedet acyl-coa for å gi karbondioksid (CO 2 ) og et β-ketoacyl-coa (der acyldelen har blitt forlenget med to karbonatomer). Påfølgende reaksjoner inkluderer reduksjon til β-hydroksyacyl-coa, dehydrering til et enoyl-coa og en andre reduksjon for å gi det forlengede acyl-coa. Eksempler på reaksjoner katalysert av forlengelsessystemer er omdannelsen av GLA til DGLA, STA til ETA, LA til EDA, ALA til ETrA, ARA til DTA og EPA til DPA. [0043] For formålene heri refererer begrepet "EaD9Elo1" til et Δ9-forlengelsesenzym (SEQ ID NR: 13), isolert fra Euglena anabaena, kodet av SEQ ID NR: 11 heri. Begrepet "EaD9Elo2" refererer til et Δ9-forlengelsesenzym (SEQ ID NR: 14) isolert fra E. anabaena, kodet av SEQ ID NR: 12 heri. Likeledes refererer begrepet "EaD9eS" til en syntetisk Δ9-forlengelse avledet fra E. anabaena som er kodonoptimalisert for ekspresjon i Yarrowia lipolytica (dvs. SEQ ID NR: 26 og 27). [0044] Begrepene "konversjonseffektivitet" og "prosentvis substratkonvertering" refererer til effektiviteten med hvilket et bestemt enzym (f.eks. en forlengelse) kan omdanne substrat til produkt. Omdannelseseffektiviteten måles i henhold til følgende formel: ([produkt]/[substrat + produkt]) * 100, der 'produkt' inkluderer det umiddelbare produktet og alle produkter i reaksjonsveien avledet fra dette. [0045] Begrepet "oljeaktig" refererer til de organismene som har en tendens til å lagre sin energikilde i form av lipid (Weete, i:. Fungal Lipid Biochemistry, 2. utg., Plenum, 1980). Innenfor oljeholdige mikroorganismer følger den cellulære oljen eller TAGinnholdet vanligvis en sigmoid kurve, hvori konsentrasjonen av lipid øker inntil den når et maksimum ved sen logaritmisk eller tidlig stasjonær vekstfase og avtar deretter gradvis i løpet av den sene stasjonære fasen og dødsfasene (Yongmanitchai og Ward, Appl. Environ. Microbiol., 57: (1991)). Det er ikke uvanlig for oljeholdige

13 mikroorganismer å akkumulere i overkant av omtrent 25 % av deres tørre cellevekt i form av olje. [0046] Begrepet "oljeaktig gjær" refererer til mikroorganismene som er klassifisert som gjær som fremstiller olje. Eksempler på oljeholdig gjær inkluderer, men er slett ikke begrenset til, følgende arter: Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon og Lipomyces. [0047] Begrepet "Euglenophyceae" refererer til en gruppe av encellede fargeløse eller fotosyntetiske flagellater ("euglenoider") funnet levende i ferskvanns-, marine-, jordog parasittomgivelser. Klassen er kjennetegnet av enslige enceller, hvori de fleste er frittsvømmende og har to flageller (hvorav én kan være nonemergent) som stammer fra en anterior invaginasjon kjent som et reservoar. Fotosyntetiske euglenoider inneholder én til mange kloroplaster, som varierer fra minuttdisker til ekspandere plater eller bånd. Fargeløse euglenoider avhenger av osmotrofi eller fagotrofi for næringsassimilering. Omtrent 1000 arter har blitt beskrevet og klassifisert i omtrent 40 slekter og 6 ordener. Eksempler på Euglenophyceae inkluderer, men er på ingen måte begrenset til følgende slekter: Euglena, Eutreptiella og Tetruetreptia. [0048] Som anvendt heri betyr "nukleinsyre" et polynukleotid og inkluderer enkelteller dobbelttrådede polymerer av deoksyribonukleotid- eller ribonukleotidbaser. Nukleinsyrer kan også inkludere fragmenter og modifiserte nukleotider. Således anvendes begrepene "polynukleotid", "nukleinsyresekvens", "nukleotidsekvens" eller "nukleinsyrefragment" om hverandre og refererer til en polymer av RNA eller DNA som er enkelt- eller dobbelttrådet, eventuelt inneholdende syntetiske, ikke-naturlige eller endrede nukleotidbaser. Et polynukleotid i form av en DNA-polymer kan omfatte ett eller flere segmenter av cdna, genomisk DNA, syntetisk DNA, eller blandinger av disse. Nukleotider (vanligvis funnet i sin 5'-monofosfatform) er referert til deres enkeltbokstavbetegnelse som følger: "A" for adenylat eller deoksyadenylat (for henholdsvis RNA eller DNA), "C" for cytidylat eller deoksycytidylat, "G" for guanylat eller deoksyguanylat, "U" for uridylat, "T" for deoksytymidylat, "R" for puriner (A eller G), "Y" for pyrimidiner (C eller T), "K" for G eller T, "H" for A eller C eller T, "I" for inosin, og "N" for ethvert nukleotid. [0049] Begrepet "konservert domene" eller "motiv" betyr et sett av aminosyrer konservert ved bestemte posisjoner langs en innrettet sekvens av evolusjonært relaterte proteiner. Mens aminosyrene i andre posisjoner kan variere mellom homologe proteiner, indikerer aminosyrer som er høyt konservert i spesifikke posisjoner aminosyrer som er essensielle i strukturen, stabiliteten eller aktiviteten av et protein. Ettersom de er identifisert av sin høye grad av konservering i innrettede sekvenser av en familie av proteinhomologer, kan de anvendes som identifikatorer, eller "signaturer", for å bestemme hvorvidt et protein med en nylig bestemt sekvens tilhører en tidligere identifisert proteinfamilie. PCT-publikasjoner nr. WO 2007/ og

14 WO 2007/ beskriver sju distinkte motiver som er forbundet med Δ9-forlengelser. [0050] Begrepene "homologi", "homolog", "vesentlig lik" og "tilsvarende i det vesentlige" er anvendt om hverandre heri. De refererer til nukleinsyrefragmenter der endringer i én eller flere nukleotidbaser ikke påvirke evnen til nukleinsyrefragmentet til å mediere genekspresjon eller fremstille en bestemt fenotype. Disse begrepene refererer også til modifikasjoner i nukleinsyrefragmentene ifølge den foreliggende oppfinnelsen, for eksempel sletting eller innsetting av ett eller flere nukleotider som ikke vesentlig endrer de funksjonelle egenskapene til det resulterende nukleinsyrefragmentet relativt til det innledningsvise, umodifiserte fragmentet. Det er således forstått, som fagfolk på området vil forstå at oppfinnelsen omfatter mer enn de spesifikke eksempelvise sekvensene som er angitt i de vedlagte kravene. [0051] Videre erkjenner fagmannen at i det vesentlige like nukleinsyresekvenser beskrevet heri kan defineres ved sin evne til å hybridisere (under moderate stringensbetingelser, f.eks. 0,5 x SSC, 0,1 % SDS, 60 C) med sekvensene som er eksemplifisert heri, eller til en hvilken som helst del av nukleotidsekvensene beskrevet heri og som er funksjonelt ekvivalente med en hvilken som helst av nukleinsyresekvensene beskrevet heri. Stringensbetingelsene kan justeres for å screene med hensyn til moderat lignende fragmenter, slik som homologe sekvenser fra fjernt beslektede organismer, til meget like fragmenter, slik som gener som dupliserer funksjonelle enzymer fra nært beslektede organismer. Post-hybridiseringsvasker bestemmer stringensbetingelsene. [0052] Begrepet "selektivt hybridiserer" inkluderer referanse til hybridisering under stringente hybridiseringsbetingelser, av en nukleinsyresekvens til en bestemt nukleinsyremålsekvens i en påviselig høyere grad (f.eks. minst 2 ganger over bakgrunnen) enn dets hybridisering til ikke-målnukleinsyresekvenser og til den vesentlige utelukkelsen av ikke-målnukleinsyrer. Selektivt hybridiserende sekvenser har vanligvis omtrent minst 80 % sekvensidentitet, eller 90 % sekvensidentitet, opptil og inkludert 100 % sekvensidentitet (dvs. fullstendig komplementære) med hverandre. [0053] Begrepet "strenge betingelser" eller "strenge hybridiseringsbetingelser" inkluderer referanse til tilstander hvorved en sonde vil selektivt hybridisere til dets målsekvens. Strenge betingelser er sekvensavhengige og vil være forskjellig i ulike situasjoner. Ved å kontrollere stringensen av hybridiseringen og/eller vaskebetingelsene, kan målsekvenser identifiseres som er 100 % komplementære til proben (homolog probing). Alternativt kan stringensbetingelsene justeres for å tillate noen mismatching i sekvensene, slik at lavere grad av likhet detekteres (heterolog probing). Vanligvis er en sonde mindre enn omtrent 1000 nukleotider i lengde, eventuelt mindre enn 500 nukleotider i lengde.

15 [0054] Vanligvis vil stringensbetingelser være de hvorved saltkonsentrasjonen er mindre enn omtrent 1,5 M Na-ion, typisk omtrent 0,01 til 1,0 M Na-ionekonsentrasjon (eller andre salter) ved ph 7,0 til 8,3, og temperaturen er minst omtrent 30 C for korte prober (f.eks. 10 og 50 nukleotider) og minst omtrent 60 C for lange prober (f.eks. større enn 50 nukleotider). Stringensbetingelser kan også oppnås ved tilsetning av destabiliserende midler, slik som formamid. Eksempler på lave stringensbetingelser inkluderer hybridisering med en bufferløsning på 30 til 35 % formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (natriumdodecylsulfat) ved 37 C, og en vask i 1 X til 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M trinatriumsitrat) ved 50 til 55 C. Eksempler på moderate stringensbetingelser inkluderer hybridisering i % formamid, 1 M NaCl, 1 % SDS ved 37 C, og en vask i 0,5 X til 1X SSC ved 55 til 60 C. Eksempler på høye stringensbetingelser inkluderer hybridisering i 50 % formamid, 1 M NaCl, 1 % SDS ved 37 C, og en vask i 0,1 X SSC ved C. [0055] Spesifisitet er typisk funksjonen av post-hybridiseringsvasker der de viktige faktorene er ionestyrke og temperatur i den endelige vaskeløsningen. For DNA-DNAhybrider kan T m tilnærmes fra ligningen til Meinkoth et al., Anal. Biochem, 138: (1984):. T m = 81,5 C + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% form) - 500/L; der M er molariteten av monovalente kationer, % GC er prosentandelen av guanosin- og cytosinnukleotider i DNA, % form er prosentandelen for formamid i hybridiseringsløsningen, og L er lengden av hybridet i basepar. T m er temperaturen (under definert ionestyrke og ph) hvorved 50 % av en komplementær målsekvens hybridiserer til en perfekt tilpasset probe. T m reduseres med omtrent 1 C for hver 1 % mismatching, derfor kan T m, hybridiserings- og/eller vaskebetingelsene justeres for å hybridisere til sekvenser med ønsket identitet. For eksempel, hvis sekvenser med 90 % identitet ønskes, kan T m reduseres 10 C. Vanligvis er stringensbetingelser valgt til å være omtrent 5 C lavere enn det termale smeltepunktet (T m ) for den spesifikke sekvensen og dens komplement ved en definert ionestyrke og ph. Imidlertid kan strenge stringensbetingelser anvende en hybridisering og/eller vasking ved 1, 2, 3 eller 4 C lavere enn det termale smeltepunktet (T m ); moderat stringensbetingelser kan anvende en hybridisering og/eller vasking ved 6, 7, 8, 9, eller 10 C lavere enn det termale smeltepunktet (T m ); og lave stringensbetingelser kan anvende en hybridisering og/eller vasking ved 11, 12, 13, 14, 15 eller 20 C lavere enn det termale smeltepunktet (T m ). Ved hjelp av ligningen, hybridisering og vaskepreparater og ønsket T m, vil vanlige fagfolk på området forstå at variasjoner i stringens for hybridisering og/eller vaskeløsninger er i seg selv beskrevet. Hvis den ønskede graden av mismatching resulterer i en T m på mindre enn 45 C (vandig løsning) eller 32 C (formamidløsning), er det foretrukket å øke SSC-konsentrasjonen slik at en høyere temperatur kan anvendes. En omfattende veiledning for hybridisering av nukleinsyrer kan finnes i Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with

16 Nucleic Acid Probes, del I, kapittel 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); og Current Protocols in Molecular Biology, kapittel 2, Ausubel et al., utg., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995). Hybridiserings- og/eller vaskebetingelser kan anvendes i minst 10, 30, 60, 90, 120 eller 240 minutter. [0056] "Sekvensidentitet" eller "identitet" i sammenheng med nukleinsyre eller polypeptidsekvenser refererer til nukleinsyrebaser eller aminosyrerester i to sekvenser som er de samme når de innrettes for maksimal korrespondanse over et spesifisert sammenligningsvindu. [0057] Således refererer "prosentandel sekvensidentitet" til den verdien som er bestemt ved å sammenligne to optimalt innrettede sekvenser over et sammenligningsvindu, hvori delen av polynukleotidet eller polypeptidsekvensen i sammenligningsvinduet kan omfatte tilføyelser eller delesjoner (dvs. åpninger) sammenlignet med referansesekvensen (som ikke omfatter tilføyelser eller delesjoner) for optimal innretting av de to sekvensene. Prosentandelen beregnes ved å bestemme antallet posisjoner hvorved den identiske nukleinsyrebasen eller aminosyreresten forekommer i begge sekvenser, for å gi antallet matchede posisjoner, å dividere antallet matchede posisjoner med det totale antallet posisjoner i vinduet for sammenligning og multiplisere resultatene med 100 for å gi prosentandelen sekvensidentitet. Nyttige eksempler på prosentvise sekvensidentiteter inkluderer, men er ikke begrenset til, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % eller 95 %, eller et hvilken som helst helt tall fra 50 % til 100 %. Disse identitetene kan bestemmes ved hjelp av et hvilket som helst av programmene som er beskrevet heri. [0058] Sekvensinnrettinger og prosentvis identitet eller likhetsberegninger kan bestemmes ved hjelp av en rekke sammenligningsmetoder utviklet for å detektere homologe sekvenser inkludert, men ikke begrenset til, MegAlign -programmet til LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, WI). Innenfor omfanget av denne søknaden vil det bli forstått at når sekvensanalyseprogramvare anvendes for analyse, vil resultatene fra analysen være basert på "standardverdier" til programmet det henvises til, med mindre noe annet er angitt. Som anvendt heri betyr "standardverdier" ethvert sett med verdier eller parametere som opprinnelig var innsatt i programvaren når den først var initialisert. [0059] "Clustal V-oppstillingsmetoden" tilsvarer oppstillingsmetoden merket Clustal V (beskrevet av Higgins og Sharp, CABIOS, 5: (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8: (1992)) og finnes i MegAlign -programmet til LASERGENE bioinformatics computing suite (supra). For flere innretninger tilsvarer standardverdiene GAP PENALTY=10 og GAP LENGTH PENALTY=10. Standardparametere for parvise innretninger og beregning av prosentvis identitet av proteinsekvenser ved hjelp av Clustal V-metoden er KTUPLE=1, GAP PENALTY=3,

17 WINDOW=5 og DIAGONALS SAVED=5. For nukleinsyrer er disse parameterne KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 og DIAGONALS SAVED=4. Etter innretning av sekvensene ved hjelp av Clustal V-programmet er det mulig å oppnå en "prosentvis identitet", ved å vise "sekvensavstand"-tabellen i samme program. [0060] "BLASTN-oppstillingsmetoden" er en algoritme tilveiebrakt av National Center for Biotechnology Information (NCBI) for å sammenligne nukleotidsekvenser ved anvendelse av standardparametere. [0061] Det er godt forstått av en fagperson på området at mange nivåer av sekvensidentitet er anvendbare for identifisering av polypeptider, fra andre arter, hvori slike polypeptider har den samme eller lignende funksjon eller aktivitet. Nyttige eksempler på prosentvise identiteter inkluderer, men er ikke begrenset til, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % eller 95 %, eller en hvilken som helst heltallprosent fra 50 % til 100 %. Faktisk kan en hvilken som helst heltallaminosyreidentitet fra 90 % til 100 % være nyttig for å beskrive den foreliggende oppfinnelsen, slik som 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 %. Også av interesse er enhver fullengde eller delvis komplement av dette isolerte nukleotidfragmentet. [0062] "Kodondegenerasjon" refererer til arten i den genetiske koden som tillater variasjon av nukleotidsekvensen uten å bevirke aminosyresekvensen til et kodet polypeptid. Følgelig vedrører den foreliggende oppfinnelsen ethvert nukleinsyrefragment som koder for alle eller en vesentlig del av aminosyresekvensen som koder for de øyeblikkelige euglenoide polypeptidene som angitt i SEQ ID NR: 13 og SEQ ID NR: 14 som beskrevet heri. Fagpersonen på området er godt kjent med "kodonskjevhet" vist av en bestemt vertscelle ved anvendelse av nukleotidkodoner for å spesifisere en gitt aminosyre. Derfor, ved syntetisering av et gen for forbedret ekspresjon i en vertscelle, er det ønskelig å utforme genet slik at dets frekvens av kodonbruk nærmer seg frekvensen av den foretrukne kodonbruken i vertscellen. [0063] "Syntetiske gener" kan settes sammen fra oligonukleotidbyggeklosser som er kjemisk syntetisert ved anvendelse av prosedyrer kjent for fagfolk innen teknikken. Disse byggeklossene er ligert og annealt for å danne gensegmenter som deretter er enzymatisk satt sammen for å konstruere hele genet. Følgelig kan genene skreddersys for optimal genekspresjon basert på optimalisering av nukleotidsekvens for å reflektere kodonskjevheten i vertscellen. Fagmannen er klar over sannsynligheten for vellykket genekspresjon hvis kodonbruken er skjev mot de kodonene som foretrekkes av verten. Bestemmelse av foretrukne kodoner kan baseres på en undersøkelse av gener avledet fra vertscellen der sekvensinformasjon er tilgjengelig. [0064] "Gen" viser til et nukleinsyrefragment som uttrykker et spesifikt protein, og som kan referere til det kodende området alene, eller kan inkludere regulatoriske sekvenser som ligger foran (5' ikke-kodende sekvenser) og etterfølgende (3' ikkekodende sekvenser) for den kodende sekvensen. "Nativt gen" refererer til et gen som

18 finnes i naturen med sine egne regulatoriske sekvenser. "Kimerisk gen" refererer til et hvilken som helst gen som ikke er et nativt gen, omfattende regulerende og kodende sekvenser som ikke er funnet sammen i naturen. Følgelig kan et kimært gen omfatte regulatoriske sekvenser og kodende sekvenser som er avledet fra forskjellige kilder, eller regulatoriske sekvenser og kodende sekvenser avledet fra den samme kilden, men anordnet på en annen måte enn den som finnes i naturen. "Endogent gen" refererer til et nativt gen i dets naturlige plassering i genomet til en organisme. Et "fremmed"-gen refererer til et gen som ikke normalt finnes i vertsorganismen, men som er introdusert inn i vertsorganismen ved hjelp av genoverføring. Fremmede gener kan omfatte native gener satt inn i en ikke-nativ organisme eller kimære gener. Et "transgen" er et gen som er blitt innsatt i genomet av en transformasjonsprosedyre. Et "kodonoptimalisert gen" er et gen som har sin kodonfrekvens utformet for å etterligne hyppigheten av foretrukket kodonanvendelse av vertscellen. [0065] "Kodende sekvens" refererer til en DNA-sekvens som koder for en spesifikk aminosyresekvens. "Regulatoriske sekvenser" refererer til nukleotidsekvenser lokalisert oppstrøms (5' ikke-kodende sekvenser), inne i eller nedstrøms (3' ikke-kodende sekvenser) for en kodende sekvens, og som påvirker transkripsjon, RNA-prosessering eller stabilitet, eller translasjon av den tilhørende kodende sekvensen. Regulatoriske sekvenser kan inkludere, men er ikke begrenset til: promotorer, translasjonsledersekvenser, introner, polyadenyleringsgjenkjennelsessekvenser, RNA-prosesseringsseter, effektorbindingsseter og hårnålsstrukturer. [0066] "Promotor" refererer til en DNA-sekvens i stand til å kontrollere ekspresjonen av en kodende sekvens eller funksjonelt RNA. Generelt er en kodende sekvens lokalisert 3' for promotorsekvensen. Promotorer kan avledes i sin helhet fra et nativt gen, eller være sammensatt av forskjellige elementer avledet fra forskjellige promotorer funnet i naturen, eller til og med omfatte syntetiske DNA-segmenter. Det vil forstås av fagfolk på området at forskjellige promotorer kan dirigere ekspresjonen av et gen i forskjellige vev eller celletyper, eller i forskjellige utviklingsstadier, eller i respons på forskjellige miljøforhold. Promotorer som forårsaker et gen til å uttrykkes i nesten alle utviklingsstadier, blir ofte referert til som "konstitutive promotorer". Det erkjennes videre at ettersom i de fleste tilfeller de nøyaktige grensene for regulatoriske sekvenser, særlig i dets 5' ende ikke enda er fullstendig definert, kan DNA-fragmenter av noen variasjon ha identisk promotoraktivitet. [0067] En promotorsekvens kan bestå av proksimale og flere distale oppstrømselementer, de sistnevnte elementene refereres ofte til som forsterkere og/eller lyddempere. Følgelig kan en "forsterker" være en DNA-sekvens som kan stimulere promotoraktivitet, og kan være et iboende element av promotoren eller et heterologt element satt inn for å øke nivået eller stadium-spesifikk aktivitet til en promotor. En

19 "silencer" er en DNA-sekvens som kan undertrykke promotoraktivitet, og kan være et iboende element av promotoren eller et heterologt element satt inn for å fortrenge nivået eller stadium-spesifikk aktivitet av en promotor. [0068] "Translasjonsledersekvens" refererer til en polynukleotidsekvens som ligger mellom transkripsjonsstartsetet til et gen, og den kodende sekvensen. Translasjonsledersekvensen er til stede i fullt ut prosessert mrna oppstrøms for translasjonsstartsekvensen. Translasjonsledersekvensen kan påvirke prosessering av det primære transkriptet til mrna, mrna-stabilitet eller translasjonseffektivitet. Eksempler på translasjonsledersekvenser har blitt beskrevet (Turner, R. and Foster, G. D., Mol. Biotechnol., 3: (1995)). [0069] Begrepene "3' ikke-kodende sekvenser", "transkripsjonsterminator" og "termineringssekvenser" refererer til DNA-sekvenser beliggende nedstrøms for en kodende sekvens. Dette inkluderer polyadenyleringsgjenkjennelsessekvenser og andre sekvenser som koder for regulatoriske signaler i stand til å påvirke mrna-prosessering eller genekspresjon. Polyadenyleringssignalet er vanligvis kjennetegnet ved å påvirke tilsetningen av polyadenylsyrespor til 3'-enden av mrna-forløperen. 3'-området kan påvirke transkripsjonen, RNA-prosessering eller stabilitet, eller translasjon av den tilhørende kodende sekvensen. [0070] "RNA-transkript" refererer til produktet som er resultat av RNA-polymerasekatalysert transkripsjon av en DNA-sekvens. Når RNA-transkriptet er en perfekt komplementær kopi av DNA-sekvensen, er denne referert til som det primære transkriptet. Et RNA-transkript er referert til som det modne RNA-et når det er en RNA-sekvens avledet fra post-transkripsjonell bearbeiding av det primære transkriptet. "Messenger-RNA" eller "mrna" refererer til RNA som er uten introner, og som kan bli translatert til protein av cellen. "cdna" refererer til et DNA som er komplementært til, og syntetiseres fra et mrna-templat ved anvendelse av enzymet reverstranskriptase. CDNA-et kan være enkelt-trådet eller omdannet til dobbelt-trådet form ved anvendelse av Klenow-fragmentet til DNA-polymerase I. "Sense" RNA refererer til RNA-transkript som inkluderer mrna og kan translateres til protein i en celle, eller in vitro. "Antisense RNA" refererer til et RNA-transkript som er komplementært til hele eller en del av et målprimært transkript eller mrna, og som blokkerer ekspresjonen av målgenet (US-patent ). Komplementariteten av en antisense- RNA kan være med en hvilken som helst del av det spesifikke gentranskriptet, dvs. i den 5' ikke-kodende sekvensen, 3' ikke-kodende sekvensen, introner, eller den kodende sekvensen. "Funksjonelt RNA" refererer til antisense RNA, ribozym RNA eller annet RNA som kanskje ikke kan translateres men likevel har en effekt på cellulære prosesser. Begrepene "komplement" og "revers komplement" anvendes om hverandre heri med hensyn til mrna-transkripter, og er ment å definere antisense RNA av meldingen.

20 [0071] Begrepet "operativt bundet" refererer til assosiasjonen av nukleinsyresekvenser på et enkelt nukleinsyrefragment slik at funksjonen av ett påvirkes av det andre. For eksempel er en promotor operativt forbundet med en kodende sekvens når den er i stand til å påvirke ekspresjonen av den kodende sekvensen (dvs. den kodende sekvensen er under den transkripsjonelle kontrollen av promotoren). Kodende sekvenser kan være operativt bundet til regulatoriske sekvenser i en sense eller antisense orientering. [0072] Begrepet "rekombinant" refererer til et kunstig kombinasjon av to ellers adskilte segmenter av sekvensen, for eksempel, ved kjemisk syntese eller ved manipulering av isolerte segmenter av nukleinsyrer ved genteknologiske teknikker. [0073] Begrepet "ekspresjon", som anvendt heri refererer til transkripsjon og stabil akkumulering av sense (mrna) eller antisense RNA avledet fra nukleinsyrefragmentene beskrevet heri. Ekspresjon kan også referere til translasjon av mrna til et protein (enten forløper eller modent). [0074] "Modent" protein refererer til et post-translasjonelt prosessert polypeptid (dvs. et fra hvilket ethvert pre- eller propeptid til stede i det primære translasjonsproduktet er blitt fjernet). "Forløper"-protein refererer til det primære produktet fra translasjon av mrna (dvs. med pre- og propeptider fortsatt til stede). Pre- og propeptider kan være, men er ikke begrenset til intracellulære lokaliseringssignaler. [0075] Begrepene "plasmid" og "vektor" refererer til et ekstra kromosomalt element ofte bærende gener som ikke er del av den sentrale metabolismen i cellen, og vanligvis i form av sirkulære dobbelt-trådede DNA-fragmenter. Slike elementer kan være autonomt replikerende sekvenser, genomintegrerende sekvenser, fag eller nukleotidsekvenser, lineære eller sirkulære, fra et enkelt- eller dobbelttrådet DNA eller RNA, avledet fra en hvilken som helst kilde, hvorved flere nukleotidsekvenser er blitt forenet eller rekombinert til en unik konstruksjon som er i stand til å innsette en ekspresjonskassett(er) inn i en celle. [0076] Begrepet "ekspresjonskassett" refererer til et DNA-fragment som omfatter den kodende sekvensen til et utvalgt gen og regulatoriske sekvenser foran (5 ' ikke-kodende sekvenser) og etter (3' ikke-kodende sekvenser) den kodende sekvensen som er nødvendig for ekspresjon av det valgte genproduktet. Således er en ekspresjonskassett typisk satt sammen av: (1) en promotorsekvens; (2) en kodende sekvens (dvs. ORF); og (3) et 3'-ikke-translatert område (dvs. en terminator) som, i eukaryoter, vanligvis inneholder et polyadenyleringssete. Ekspresjonskassetten(e) er vanligvis inkludert i en vektor, for å fremme kloning og transformasjon. Forskjellige ekspresjonskassetter kan omdannes til forskjellige organismer inkludert bakterier, gjær, planter og pattedyrceller, så lenge de riktige regulatoriske sekvensene anvendes for hver vert. [0077] En "rekombinant DNA-konstruksjon" (også referert til om hverandre heri som en "ekspresjonskonstruksjon" og "konstruksjon") omfatter en kunstig kombinasjon av