Assistert befruktning i laboratoriet

Transkript

1 Assistert befruktning i laboratoriet Assistert befruktning i Norge Mette Haug Stensen Senior klinisk embryolog Oslo 2010: > ART barn født 1994: 1/100 barn 2009: 2.9/100 barn Medisinsk sregister (MFR) Assistert befruktning i Norge Assistert befruktning i Norge Medisinsk sregister (MFR) Medisinsk sregister (MFR) 50% IVF 40% ICSI 10% andre (PESA/TESA, sæddonasjon,tin, IUI) Flerlingeraten er redusert fra ca 42% (2002) til ca 20% (2008) pga single embryo transfer (SET)

2 Historien om ART ART metoder i Norge 1959: kaniner født IVF 1965: humane oocytter fertilisert in vitro 1978: naturlig syklus IVF (Louise Brown) 1983: med donerte oocytter 1983: frys/tin 1983: modning og fertilisering av umodne oocytter dyrket frem in vitro (IVM) 1986: PESA 1989: PGD for kjønnsbundet sykdom 1990: vitrifisering av embryo 1992: ICSI 1993: TESA 2005: ovarialvev transplantasjon 2014: livmor transplantasjon Intrauterin inseminering (IUI) In vitro fertilisering (IVF) Intracytoplasmisk spermie injeksjon (ICSI) Kryopreservering (frys): oocytter, sæd og embryo Uthenting av sædceller fra testiklene (PESA/TESA/TESE) Sæddonasjon (mannlig faktor og lesbiske par) Kryopreservering av ovarialvev In vitro modning (IVM) Preimplantasjons genetisk screening (PGD) i utlandet Lovverket Lov om humanmedisinsk bruk av bioteknologi m.m. (Bioteknologiloven) Godkjent virksomhet rapporteres årlig til Helsedirektoratet Ufrivillig barnløse som lever i et langvarig parforhold (2 år eller mer) ICSI: tillatt i en prøveperiode fra høsten 1995 PESA/TESA/TESE: prøveordning fra 2004 Sæddonasjon tillatt (men ikke lenger anonym sæddonor siden 2005) Lesbiske par kan behandles (siden 2009) Oppbevaring av frosne embryo i opptil 5 år (tidligere 3 år) PGD nemd Eggdonasjon, surrogati, behandling av enslige og preimplanatasjons genetisk screening (PGS) forbudt Assistert befruktning +

3 MEIOSEN Bare i eggstokken (oocyttene) og i testikkelen (spermiene) Fullføring av meiosen kan ta mange år (opptil 50 år) En runde med DNA replikasjon og to celledelinger Fire haploide datterceller som er genetisk forskjellig fra morcellen OOGENESEN Mitose i tidlig fosterstadiet Meiose I: begynner i fjerde mnd i fosterstadiet, stanser i Profase I ved 20 uker Pause i opptil 50 år Etter puberteten: LH, fullføring av meiose I, 1. pollegme (oocytt modning) Meiose II: fullføring av meiose II (og bare ) fertilisering av en spermie (oocytt aktivering), 2.pollegeme SPERMATOGENESEN 1. Spermatocytogenesen: spermatogonia til spermatocytt 2. Meiose: spermatocytt til spermatid 3. Spermiogenese: spermatid til spermatozoa: -Spermatozoa frigis inn i tubuli lumen SPERMIOGENESE - Spermiemodningen forts i epididymis i 2 uker Spermatocytogenese + spermiogenese = spermatogenese ( 74 days)

4 Behandlingsforsøk IVF/ICSI Dag 0: sædanalyse, sædpreparering, egguttak (ovum pick up = OPU), inseminering (IVF/ICSI) Dag 1: bedømmelse av befruktning Dag 2 5: vurdering av embryokvalitet og utvelgelse av embryo til tilbakesetting av livmor (ET) Dag 2 5: ET Dag 0 5: Kryopreservering (frys) av egg (oocytter), befruktede egg (zygoter), embryo, blastocyster Bioteknologirådet DAG 0: SÆDANALYSE SÆDPREPARERING Swim up Analyserer konsentrasjon og motilitet Preparerer sædprøver med bevegelige spermier Swim up: sæd på bunnen av reagensglass med medium over i varmeskap (37 C) ca 45min - 1 time Beste svømmerne øverst, de døde på bunnen Naturlig Fjerne sædplasma - hindrer kapasitering samt fjerning av prostaglandiner som kan forårsake kontraksjoner i livmor DAG 0: SÆDPREPARERING gradient sentrifugering Sæd på toppen Sentrifugeres gjennom flere lag medium med ulik tetthet Beste sædcellene på bunnen Grums og andre celler over Sædprøver med få sædceller Kapasitering Kapasitering Kapasitet til å bindes til og penitrere oocytten Økning i membranens fluiditet Hyperaktiv bevegelse Ca 6 timer, C Fjerner epididymale og seminal plasma proteiner rundt spermiene Follikkelvæsken kan forårsake kapasitering Akrosomreaksjon: 1) ytre akrosomale membraner smelter sammen med plasmamembranen på hodet til spermien 2) Akrosomale granuler brytes ned; frigir lysiner 3) Plasmamembranen på spermiehodet og oocyttens plasmamembran fusjonerer

5 Preparert sæd kan benyttes til. Intrauterin inseminering (IUI): Indikasjon: mild mannlig faktor, ukjent årsak til fertilitet In vitro fertilisering (IVF): kvinnelig/ukjent årsak, mild mannlig faktor Intracytoplasmisk spermieinjeksjon (ICSI): mannlig faktor, tidligere forsøk med lav/ingen befruktning IVF IVF/ICSI: DAG 0: egguthenting (OPU = ovum pick up) Forbereder skåler med medium dagen før Follikkelvæske med egg (oocytt) Observeres i et mikroskop av embryolog ca 100 μm i diameter Antall egg (gjennomsnittlig 8 stk) Skylling NB: temperatur! DAG 0: Kvalitet/modenhet oocytter ICSI: Modenhet oocytter Modne oocytter for å fertiliseres IVF: kompaktheten av cumulus celler rundt egget (cumulus oophorus) PV ICSI eggene må vurderes om modne (MII) Fjerne cumuluscellene Oocytt GV 1.PB CYTOPLASMA rundt egget- denudering Legges i HYASE Pipeteres inn og ut Cumulusceller GV = germinal vesikkel MI OOLEMMA MII MII = metafase II av denuderings - pipette MI = metafase I = Zona Pellucida

6 ICSI: OOCYTTKVALITET Cytoplasma (vakuoler, mørkt, lyse flekker) Unormal størrelse Zona pellucida Perivitillin-rommet (PV) 1.pollegeme Modenhet vakuole Stort PV-rom Normal Unormal Dag 0: ICSI = intracytoplasmatisk spermieinjeksjon Modne egg (MII) Immobiliserer en spermie morfologisk normal, svømmer godt Inn i egget, suger ut litt cytoplasma, oolemma breakage Avleverer spermie ved oolemma på motsatt side Unngå å stikke rett under pollegemet Bedømmes dag 1 for befruktning spindel 1.pollegemet = PB Dag 0: IVF Sperm oocytt sammensmelting S til preparerte spermier til hvert egg i fertiliseringsmedium Befrukter egget selv, gjerne i løpet av 1-2 t Må ha cumulusceller Denuderes på dag 1 for å se befruktning Flere proteiner i zona pellucida involvert Avhengig av temperatur, ph og [Ca 2+ ] Endringer i intracellulært Ca 2+ i oocytten fullfører meiose II

7 Kortikal reaksjon Frigjøring av kortikale granuler rett under zona pellucida Indusert av Ca 2+ Hindrer polyspermi ved endringer i zona pellucida (blir hard) Spermiekjernen går inn i oocytten og utvikles til mannlig pronucleus (forkjerne) DAG 1: FERTILISERING - ZYGOTE Sjekker fertilisering timer inseminering/mikroinjeksjon Gjennomsnittlig 60-70% av oocyttene 1PB Nucleolar precursor bodies 2PN 2PB 2PB 1PN Ikke fertilisert 0 pronuclei = PN, 1PB Fertilisert = zygote 2PN, 2PB DAG 1: FERTILISERING 2PB Dag 1/Dag 2: EMBRYOUTVIKLING Early cleavage timer inseminering/mikroinjeksjon: 2 celler økt graviditets og implantasjonsrate (Lundin et al., 2001) Dag 2: timer inseminering: 2 6 celler; 4 celler foretrekkes (Ziebe et al., 1997) 2PB 1PN 3PN PN, 2PB 3 PN, 2PB 2 3

8 Dag 3/dag 4: EMBRYOUTVIKLING Dag 3: timer inseminering: 4 10 celler; 8 celler foretrekkes, morula Dag 4: morula: 16 celler. Kompaksjon: tight junctions og desmosomer holder cellene tett sammen Dag 5: EMBRYOUTVIKLING- BLASTOCYST Dag 5: blastocyst; ca 100 celler, inner cell mass (foster), trophectoderm (placenta) og blastocoel (væskefylt rom). Tynn zona pellucida. Hatching: Trophectoderm cellene kommer ut av zona pellucida ICM BL TE BL Morula TE ICM = inner cell mass TE = trophectoderm BL = blastocoel Hatching ICM EMBRYOMORFOLOGI delingshastighet Antall blastomerer: «Ikke for sent, ikke for raskt» Dag 1: early cleavage Dag 2: 4 celler Dag 3: 8 celler Synkronisert deling (2,4,8,16.) Dag 4: morula Dag 5: blastocyst/ekspandert blastocyst 25 % 20 % 15 % 10 % 5 % 0 % Antall blastomerer dag 2 og dag 3 2 celler 3 celler 4 celler > 4 celler Ziebe et al, Human Reprod., 1997 Implantasjonsrate

9 EMBRYOMORFOLOGI - fragmentering Økende grad av fragmentering korrelerer med aneuplodi Økende grad av fragmentering korrelerer negativt med graviditets- og implantasjonsrater (Ziebe et al., 1997) Kan inneholde kromosomer (Chavez, et al., 2012) Svært ofte sett i humane embryo (75 %) (Hnida et al., 2004) EMBRYOMORFOLOGI blastomerstørrelse Ujevne blastomerer korrelerer med sannsynlighet for aneuploidi (Hardarson et al, 2001) Ujevne blastomerer har økende grad av multinukleære blastomerer og lavere implantasjonsrate (Hardarson et al., 2001) Kan endres gjennom celleutviklingen EMBRYOMORFOLOGI antall kjerner Èn synlig kjerne i hver blastomer Multinukleære blastomerer: binukleære, multinukleære, mikronukleære nuclei Blastomerer med èn kjerne og multinukleære blastomerer Dess flere blastomerer med èn synlig kjerne, jo høyere graviditetsrate (Palmstierna et al., 1998) Multinuklære blastomerer korrelerer med kromosomale avvik (Hardarson et al., 2001) Embryo med multinukleære blastomerer er assosiert med lavere implantasjons-, graviditets- og srate (Van Royen et al., 2003) nuclei nuclei

10 BLASTOCYSTMORFOLOGI MORFOLOGI- system Størrelse (ekspandert) Inner cell mass (ICM): antall celler og kompaksjon Trophectoderm (TE): struktur og antall celler : tynn TE ICM TE BLASTOCOEL ICM Morfokinetikk Time-lapse + morfologi Innebygd mikroskop i en inkubator (stabil temperatur og ph) Bilde hvert 5-20 min, 6 ulike plan Hele embryoutviklingen fra inseminering til transfer Oppdager dynamiske prosesser (fragmentering, antall kjerner) Oppdager unormale celledelinger (direkte eller reverserte delinger) Ziebe et al., 2003

11 Time lapse Dag 2, 3 eller 5: TRANSFER Embryoet/blastocysten legges i transfer skål med medium Suges opp i et kateter vha sprøyte Sprøytes inn i livmoren Kateteret sjekkes på! Dag 0, 1, 2, 3 eller 5, 6: FRYS Oocytter: MII (medisinsk grunnlag) Zygoter: 2 PN Embryo: dag 2 eller dag 3 Blastocyster: dag 5 eller dag 6 Sæd kreftbehandling/lagring Ovarialvev kreftbehandling (Nasjonalt senter OUS) transplanteres tilbake Slow freeze eller vitrifisering FRYS Fryseprosessen: vann i cellene, øker i størrelse ved isdannelse, cellene sprekker, vann i cellene ut, frysemedium inn som hindrer isdannelse, lagres i strå/ampuller i flytende nitrogen (- 196 C) eller nitrogendamp Slow freeze: sakte nedfrysning, lav konsentrasjon frysemedium, sakte økning i konsentrasjon, toksisk, maskin Vitrifisering: høy konsentrasjon av frysemedium, rask nedfrysning, rett i flytende nitrogen glass-struktur, toksisk, manuelt Embryo/blastocyster kan lagres i opptil 5 år

12 TIN Tineprosessen: frysemedium ut, væske fra mediumet inn i cellene igjen til normal størrelse Minst 50% av et embryos blastomerer (celler) må overleve Oppbygging av livmorslimhinnen Naturlig eller substituert syklus Dag -1 evt Dag 0 : TESA/PESA Ingen spermier i ejakulatet TESA = testikulær sperm aspirasjon PESA = percutanøs epidymal sperm aspirasjon Moser/kutter opp tråder av vev med spermier Bevegelige eller ikke-bevegelige spermier ICSI IVM = in vitro modning Umodne egg (GV) Follikler: 2 10 mm, ledende follikkel 10 mm Dyrkningsmedier til MII befruktning Polycystisk ovarie syndrom (PCOS) Østrogen og progesteron Ikke helt utviklet metode PGD = Preimplantasjons genetisk diagnostikk Alvorlig genetiske sykdommer med stor fare for overføring til eventuelle barn Maternelle og paternelle sykdommer Vevstype stamcelle donor for søsken med alvorlig, arvelig sykdom Blastomerer eller trofektoderm-celler Mosaikker Biopsi genetisk analyse seleksjon og transfer uaffektert embryo/blastocyst PGD-nemd Preimplantasjons genetisk screening (PGS) er forbudt i Norge

13 Framtidsutsikter i laboratoriet Kom gjerne på besøk Nye ikke-invasive metoder til å bedømme embryokvalitet (time-lapse, metabolomics, granulosaceller ) PGS versjon II Fryse alle embryo ET i tin syklus Oocyttfrys på sosialt grunnlag