Oogonese. Assistert befruktning i laboratoriet. Spermatogenese. Sperm. Sædanalyse, WHO. Sædanalyse ved forsamtale. Formål:

Transkript

1 Oogonese Infertilitet fra diagnose til behandling i laboratoriet PGM Oogonium migrerer til gonadane tidleg i fosterlivet Mitose Meiose I Startar og sluttar 3-8 mnd. ut i fosterlivet. Forblir i profase 1 til puberteten Siren Skrede Siv. Ing., Sr. klin. embr., Seksjonsleiar Seksjon for assistert befruktning, Kvinneklinikken, Haukeland Universitetssjukehus, Helse Bergen Frå puberteten blir meiose I regelmessig fullført - sekundære oocyttar, 1. pollegeme Meiose II Fullført dersom fertilsering - 2. pollegeme Molecular Biology of the Cell; Chapter 21: Sexual Reproduction: Meiosis, Germ Cells, and Fertilization, Figure The stages of oogenesis. Spermatogenese PGM Spermatogonium migrerer til gonadane tidleg i fosterlivet Mitose startar først ved puberteten - stamcelle spermatogonium - modnande spermatogonium Meiose I Primære spermatocyttar (diploide) Sekundære spermatocyttar (haploide) Meiose II Spermatider (haploide) Sperm Tettpakka, effektiv transportør av DNA. Flagell som driv cella framover. Mitokondrier forsyner flagellen med energi (ATP) og degenereres i zygoten. Akrosomal vesikkel: sekretorisk vesikkel med hydrolytiske enzym Centrioler lokalisert mellom hode og midtstykket organiserer den første mitotiske spindelen i zygoyten. Spermatocyttar Molecular Biology of the Cell; Chapter 21: Sexual Reproduction: Meiosis, Germ Cells, and Fertilization, Figure The stages of spermatogenesis Formål: Sædanalyse ved forsamtale Planlegge fertiliseringsmetode Avdekke eventuelle prestasjonsproblem Sædanalyse, WHO 2-7 dagar frå førre sædavgang Analyse innan 1 time ved romtemperatur (20-37 C) Likvifisering Komplett? Volum Viskositet Mikroskopi, fasekontrast, 100x forstørring Konsentrasjon Motilitet Aggregering eller agglutinering Rundceller (leukocyttar og umodne spermiar) Morfologi

2 Sædanalyse, referanseområder WHO, 5. utgåve, 2010 Analyse WHO referanseverdi 2010 Volum Spermiekonsentrasjon Totalt antall spermiar 1,5 ml 15 mill/ml 39 mill Totalt motile spermiar 40 % Progressivt motile spermiar 32 % Vitalitet 58 % Rundceller < 6 mill/ml Morfologi 4 % Prepareringsmetodar ejakulat Swim up/mini swim up/indirekte swim up Gradientsentrifugering Retrograd ejakulasjon Cryopreserverte prøvar HOS-test (immotile, men levande) TESA-preparering Testikulær spermie aspirasjon - TESA Skyl kanalane fleire gonger for å fjerna evet. restar av blod og overfører til μl store dråper medium. Stryk kanalane ved hjelp av 2 sondar og mikroskoperer. Overfører til stjernedråpar, inkuberer i 1 2 timar og mikroskoperer igjen. Preparerings- og behandlingsmetodar v/hus Sædprøvekvalitet Prepareringsmetode Bruksløysing Fertiliseringsmetode Normal/lett redusert Swim up/mini swim up Suspensjon IVF (ICSI) IUI Viskøs Indirekte swim up Suspensjon IVF (ICSI) IUI Spreidde motile i råsæd/sentrifugert prøve Vask + sentrifugering Gradientsentrifugering Suspensjon/ pellet i stjernedråpar - ICSI Retrograd ejakulasjon (OBS ph) Vask/sentrifugering/swim up/(gradientsentrifugering) Suspensjon/ pellet i stjernedråpar IVF ICSI TESA Skyl/stryk/dråpar under olje Stjernedråpar - ICSI Avgjerande for val av fertiliseringsmetode: * Talet på raskt motile etter preparering * Fertiliseringsrate i tidlegare behandlingar 9 Frå egguttak til tilbakeføring; OPU - ET Lab; førebuing til egguttak (OPU) Gjennomgang av stimulasjonsprotokoll Tidlegare sædprøve Monitorerte folliklar (> 9 mm) Eventuelle notat Tidlegare behandlingar Tillaging av medier, skåler, utstyr Merking, inkubering, varming Illustrasjon: Sigrid Thoresen/Bioteknologirådet

3 OPU - Dag 0 Sædanalyse og preparering Mannen avlegg prøve heime eller ved avdelingen Analyse og preparering Normale til reduserte prøvar: Bruksløysing = Suspensjon IVF; konsentrasjon 1000 spermier/μl, 25 μl dråper (ca per oocytt) OPU, operasjonsstove GU-benk m/pumpe (OBS flow) Varmt utstyr (oppretthalde 37 C) rør, varmekolber ICSI; konsentrasjon spermier/μl 1 μl per PVP-dråpe Svært reduserte prøvar, spredte motile i pellett: ICSI; Sentrifugering, pellett i stjernedråper OPU, lab Humane oocyttar er sensitive for nedkjøling Irreversibel skade på meiotisk spindel IVF oocyttar, høg andel abnormale kromosom Kontroll av temperatur gjennom heile prosessen Sterilbenk, mikroskop, skåler, utstyr Dyrke under olje Hindra avdamping Seinke gassdiffusjon Hindrar svingingar i temperatur, ph og osmolaritet i mediet OPU, lab Screene follikkelvæske, gje tilbakemelding til lege ved aspirasjon.: Antall egg versus tømte folliklar Modning/utsjånad oocytt-cumulus Follikkelvæske; granulosa, cystevæske, endometriose, mm Skylje og overføre oocyttar til dyrkingsskåler Jobbe raskt OPU, Dag 0: Befruktning, IVF Vurdere/score modning: Cumulus-oocytt-kompleks Binær gradering OPU, Dag 0; Befruktning, ICSI Denudering, hyaluronidase/pipette: Fjerner cumulusmassen enzymatisk og mekanisk Vurderer modningsfase ICSI kun på modne oocyttar; MII - fase GV MI MII Sperm 25μl dråper Ca spermier Dyrkes over natt v/ 37 C, 5-6 % CO2 og 5 20 % O2 Reint dyrkingsmedium - til denudering på dag 1 og vurdering av fertilisering 1. PB Kan/bør ikkje nytta: - Umodne oocyttar: Germinal vesikkel (GV) eller M1 - Smooth Endoplasmatic Reticulum (SER) - Store oocyttar, oocyttar med stort pollegeme eller med store vakuolar

4 ICSI injesering av MII oocytt Tidspunkt og forventa utvikling Istanbul konsensus Oocytt- og embryoscoring Type of observation Timing (hours post insemination) Expected stage of development Fertilization check 17 ± 1 Pronuclear stage ( 2PN/2PB ) Syngamy check 23 ± 1 Expect 50 % to be in syngamy (up to 20 % may be at the 2- cell stage) Early cleavage 26 ± 1 post-icsi 2 cell stage check 28 ± 1 post- IVF Day 2 assessment 44 ± 1 4 cell stage Day 3 assessment 68 ± 1 8 cell stage Day 4 assessment 92 ± 2 Morula Day 5 assessment 116 ± 2 Blastocyst Vurdering av fertilisering, dag 1 PN/PB (17 +/- 1 time) 60-70% fertilisert Syngami/Early Cleavage ( time) 2 cell (ca. 20%) = graviditets- og implantasjonsrate Early Cleavage (26 ± 1 post-icsi, 28 ± 1 post- IVF) Istanbul konsensus, tabell IV 2 PN/2PB 3 PN, 2 PB 2 - cell Scoringssystem for embryo i delingsfase Dag 2-4 Stage spesific cell stages Grade Rating Description 1 Good < 10% fragmentering Stage-spesific cell size No multinucleation 2 Fair % fragmentering Stage-spesific cell size for majority of cells No evidence of multinucleation 3 Poor Severe fragmentation Cell size not stage-spesific Evidence of multinucleation Istanbul konsensus, tabell VI:

5 Stage of development Scoringssystem for blastocystar Dag 5-6 Grade Rating Description 1 Early Blastocyst 2 Blastocyst 3 Expanded 4 Hatched/Hatching Inner Cell Mass (ICM) 1 Good Prominent, easily discernible, with many cells that are compacted and tightly adhered together 2 Fair Easily discernible, with many cells that are loosely grouped together 3 Poor Difficult to discern, with few cells Trophectoderm (TE) 1 Good Many cells forming a cohesive epithelium 2 Fair Few cells forming a loose epithelium 3 Poor Very few cells Time-lapse system (TLS) Kontinuerlig evaluering av tidleg embryoutvikling Bilete kvart min. ved stabile dyrkingstilhøve Mindre manuell handtering Verkar lovande som seleksjonsverktøy og kan bidra til å utvikle betre prognostiske verktøy, men Cochrane review 2015 (3 studiar, ca par (>90% ICSI)) Samanlikna TLS og konvensjonell inkubasjon Ikkje tilstrekkeleg vist at TLS gjev betring av kliniske graviditetar og levande fødte eller reduksjon av spontanabortar og dødfødslar Fleire studiar må gjennomførast Early blastocyst Blastocyst Expanded blastocyst Hatching blastocyst Embryo transfer, dag 2-5 Selekterer embryoet/blastocysten med best implantasjonspotensiale Morfologi/delingshastigheit Overfører til livmora via eit tynt, mjukt plastkateter. Ultralydguida Kontrollerer kateteret etter overføring Overtallige embryo m/god kvalitet blir kryopreservert Kryopreservering av embryo Mål: Hindre danning av iskrystallar ved nedfrysing Kryoprotektantar; PROH, DMSO, Glyserol, Sukrose Lagring ved 196 C : Maskinell metode Lave konsentrasjonar kryoprotektantar Programmert nedfrysingshastigheit/trinn Manuell induksjon av iskrystallar ved 7 C Nedfrysingsrate ( 0,3 15 C/min) Vitrifisering: Manuell metode Minimalt volum med høgkonsentrert kryoprotektant Ultrarask nedfrysing (nedfrysingsrate C/min) Kryopreservering Materiale Årsak Metode Lagringstid Oocytt (MII) Vitrifisering forsvarleg Zygote (2PN) Embryo Dag 2-3 Blastocyst Dag 5-6 Sæd Vitrifisering Vitrifisering Vitrifisering - Maskinell - Manuell 5 år 5 år 5 år 10 år (+ 10 år) Aldersgrense Destrueres ved død Tining av embryo Stimulert eller naturleg syklus Tining, reverserer fryseprosessen Fjerning av kryoprotektant ved trinnvis fortynning 50% overleving av blastomerar Vidare dyrking Embryotransfer Ovarialvev forsvarleg

6 Tilgjengelege behandlingsval/metodar per i dag IVF ICSI Ejakulat, TESA/PESA, Cryosæd Kryopreservering Embryo, sæd, oocyttar, ovarialvev, IUI (Intra Uterin Inseminasjon) Sæddonasjon Offentleg: 2 klinikkar, norske donorar Privat: Importerer hv.sakleg frå Danmark In Vitro Modning = IVM Pre Implantasjons Diagnostikk = PGD nemnd, utanlandsbehandling Framtidige behandlingsval/metodar? Totalfrys, tineinnsettingar i normal syklus Time lapse Mitokondriedonasjon CRISP Aktiv oocytt aktivering (Ca2+-ionofor løysning i 15 min., deretter ordinær vidaredyrking) Analyse medium, metabolisme Preimplantasjonsgenetisk Screening = PGS Sosial eggfrysing Einslege Surrogati Homofile menn Nasjonal oversikt ved Helsedirektoratet: Rapportering om assistert befruktning utført i barn (3-4 % av alle barn født i Norge ) 482 barn etter innsetting av tinte embryo ( 23 %) 201 barn født etter behandling med donorsæd ( 9 %) < 11 % tvilling/trillingfødsler (alle metodar medrekna) Nokre klinikkar mellom 5-6 % 015%20-%20Assistert%20befruktning%20utført%20i% pdf Nasjonal oversikt ved Helsedirektoratet: Sædbankverksemd, 2014 Fertilitetsbevaring: 296 gutar/menn lagra sæd fordi dei skulle gjennomgå behandling som kunne skade fertiliteten år Testikkelkreft var den vanlegaste enkeltårsaka (41.2 % ). Tilbod om lagring av sæd finnes ved alle dei 6 offentlige verksemdene som har godkjenning for IVF-behandling. Norske sædbankar (OUS/HFO): Godkjente 11 nye sæddonorar Ved utgangen av 2014 var det 55 sæddonorar som ennå ikkje hadde gitt opphav til seks/åtte barn. Private klinikkar: Ved enkelte private verksemder har behandlingar med donorsæd nesten like stort omfang som behandlingar med IVF/ICSI (partner, ikkje donorsæd). Dei private verksemdene importerer sæd frå sædbankar i utlandet, hovedsakleg Danmark. Sædgjevar skal kunne identifiserast slik at barn som ynskjer det kan få informasjon om identiteten hans. Antall par behandla per metode Starta behandlingar (IVF/ICSI), fordelt på kvinna sin alder, %20-%20Assistert%20befruktning%20utført%20i% pdf 5%20-%20Assistert%20befruktning%20utført%20i% pdf

7 Helsedirektoratet: utført i 2013 SET-politikk og resultat ved HUS Utvikling singel embryotransfer i fersk syklus Utvikling singel embryotransfer ved tining % 90% 80% 80% 70% 70% 60% 60% 50% elektiv SET 50% elektiv SET 40% SET 40% SET 30% Fleirlingrate 30% Fleirlingrate 20% 20% 10% 10% 0% % %20Assistert%20befruktning%20utført%20i% pdf er teamarbeid Felles mål: Unngå fleirlingar og overstimuleringar Dyktige klinikarar, sjukepleiarar, sekretærar Velfungerande lab med gode scoringssystem: Seleksjon av embryo med størst mogleg implantasjonspotensiale Gode frysemetodar til bevaring av overskotsembryo Godt samspel mellom profesjonane: Alle profesjonar involvert i behandlinga, god dialog og skreddarsydd behandlinga for det enkelte par