MOLEKYLÆR EPIDEMIOLOGI

Transkript

1 MOLEKYLÆR EPIDEMIOLOGI Mikrobiologiske metoder for undersøkelse av utbrudd av infeksjonssykdommer Kåre Bergh Avdeling for mikrobiologi, St.Olavs Hospital Institutt for laboratoriemedisin, barne- og kvinnesykdommer, NTNU Mars 2015

2 EVALUERING AV TYPING SYSTEMER Hovedpunkter: TYPBARHET: UTVETYDIG POSITIVT RESULTAT REPRODUSERBARHET: - PERFORMANCE AV TESTEN - STABILITET I MIKROORGANISMEN DISKRIMINATORISK STYRKE: EVNEN TIL Å DISKRIMINERE MELLOM IKKE-RELATERTE ISOLATER

3 INGEN METODE VIL OPPFYLLE ETHVERT BEHOV! PGA: HOVEDGRUNNER (OFTE I KOMBINASJON): INADEKVAT DISKRIMINERING TILGJENGELIGHET AV REAGENSER INTRA- AND INTERLABORATORIE REPRODUSERBARHET HVORDAN KVANTITERE DE(N) GENETISKE RELASJONER MELLOM ISOLATENE?

4 TO HOVEDSPØRSMÅL: 1. KORT-TIDS- / LOKAL EPIDEMIOLOGI fokus: variasjoner som opptrer raskt/hyppig 2. LANG-TIDS- / GLOBAL EPIDEMIOLOGI variasjoner som akkumuleres langsomt (fortrinnsvis nøytrale mht seleksjonspresset) mer diskriminatorisk ved å kombinere ulike loci

5 To hovedkategorier av metoder: 1) Fenotypiske metoder 2) Genotypiske metoder

6 Fenotypiske metoder VANLIG BRUKTE FENOTYPISKE METODER: BIOTYPING ANTIBIOGRAM SEROTYPING FAG TYPING IMMUNOBLOTTING MULTILOKUS ENZYM ELEKTROFORESE MALDI-TOF: IKKE DEFINERT ENDELIGE POTENSIAL

7 Karakterisering av fenotypiske metodser (noe subjektivt) FENOTYPISK METODE REPRODUSER- BARHET DISKRIMINATORISK STYRKE BIOTYPING BRA DÅRLIG ANTIBIOGRAM BRA DÅRLIG SEROTYPING GOD BRA PHAGE TYPING BRA DÅRLIG IMMUNO BLOTTING UTMERKET GOD MULTILOCUS ENZYME UTMERKET GOD ELEKTROPHORESIS

8 GENOTYPISKE METODER * PLASMID PROFILANALYSE * RESTRIKSJONS ENDONUKLEASE ANALYSE (FINGERPRINTING) * RIBOTYPING * PCR & RESTRIKSJONSFRAGMENT ANALYSE * RANDOMLY AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD) * AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP) * PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) * VARIABLE NUMBER OF TANDEM REPEATS (VNTR) - inkl Multilocus variable number = MLVA * SEKVENSERINGS BASERTE ANALYSER - MULTILOCUS SEQUENCE TYPING (MLST) - SINGLE LOCUS SEQUENCE TYPING (e.g.spa-typing) - WHOLE GENOME SEQUENCING (WGS)

9 PLASMIDPROFIL ANALYSE ISOLERING AV PLASMID ELFO +/- RESTRIKSJONSFRAGMENT ANALYSE PREMISS: PLASMID +, HELST > 2 PROBLEM: TAPES ELLER ERVERVES OVER TID BEST ANVENDBARHET VED UTBRUDD BEGRENSET OVER TID OG OMRÅDE BRA DISKRIMINATORISK STYRKE

10 FINGERPRINTING RESTRIKSJONS ENDONUKLEASE ANALYSE RESTRIKSJONSENZYMER SOM KUTTER HYPPIG HUNDREVIS AV FRAGMENTER KOMPLEKSE PROFILER (RESOLUSJON /OVERLAPPING) PLASMID(ER) VIL INFLUERE

11 DNA FINGERPRINTING

12 SOUTHERN BLOT ANALYSIS (KROMOSOMALT DNA) RESTRIKSJONSFRAGMENT EL.FO BLOTTE TIL MEMBRAN MERKET DNA FRAGMENT SOM PROBE HYBRIDISERER TIL HOMOLOGE SEKVENSER I MATERIALET VARIASJON I ANTALL OG STØRRELSE: RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORFISM (RFLP) MYE brukt moderne variant: RIBOTYPING: * POLYMORFISME ASSOSIERT MED RIBOSOMALE OPERONER PROBE: FRA KONSERVERTE REGIONER (VANLIGST FRA E.COLI)

13 Ribotyping Available also as an automated system for identification and investigation of relatedness

14 PCR: PCR-baserte metoder * POS eller NEGATIV ved å benytte spesifikke primere * RESTRIKSJONSFRAGMENT ANALYSER AV PCR-PRODUKTET * PCR + REVERS HYBRIDISERING (EX.: SPOLIGOTYPING - DIRECT REPEATS (DR) MED SPACER REVERS LINE BLOT

15 Line-Probe Assays GenoType Mycobacterium INNO-LIPA 15 Padilla et al. JCM, 2004, 44:

16 Molekylærepidemiologi Genotypingsteknikker: M.tuberculosis SPOLIGOTYPING (Spacer oligonucleotide typing) DR-locus: DR (36bp) separert med unike ikke-repetitive spacersekvenser (43) PCR med (biotinylerte) primere i DR (Revers) Hybridisering med oligonukleotider komplementære til (43) spacer CDC Tuberculosis Genotyping Laboratory Procedures

17 PCR: PCR-baserte metoder * POS eller NEGATIV ved å benytte spesifikke primere * RESTRIKSJONSFRAGMENT ANALYSER AV PCR-PRODUKTET * PCR + REVERS HYBRIDISERING (EX.: SPOLIGOTYPING - DIRECT REPEATS (DR) MED SPACER PROBE) * PCR MED REPETITIVE ELEMENTER SOM TARGET * RANDOMLY AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (ARBITRARILY PRIMED PCR ) - USPESIFIKK BINDING AV EN SINGEL PRIMER - VARIASJON I ANTALL OG STØRRELSE AV PCR PRODUKTER

18 PCR-based methods rep-pcr PrimerE rettet mot interspersed repetitive DNA elements present at characteristic locations in prokaryotic genomes REP sequence bp ERIC sequences bp 154 BOX elements Mer standardiserte primere vs RAPD primere (Kommersielt tilgjengelige kits fins med gode resultater for visse bakteriearter, ex DiversiLab System, men mindre bra for andre)

19 Photo:Lene Granbo & Kari Berg

20 PCR-baserte metoder RANDOMLY AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA: (SYN: RAPD) * USPESIFIKK BINDING AV SINGEL PRIMER * VARIASJON I ANTALL OG STØRRELSE AV PCR PRODUKTENE

21 RANDOMLY AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA: (SYN: RAPD) RAPD in three Neisseria meningitidis isolates: Effect of various annealing temperature in PCR

22 Reproducibility of RAPD in three Neisseria meningitidis isolates tested on three different days Photo: Hanne Amdahl

23 PCR-based methods RAPD: (syn Arbitrarily primed PCR) OFTE KATEGORISERT SOM GOD (MEN TVILSOM FRA VÅR ERFARING) VARIABILITET STERKT INFLUERT AV DE EKSPERIMENTELLE BETINGELSER

24 AFLP:Amplified Fragment Length Polymorphism

25 AFLP:Amplified Fragment Length Polymorphism 1. DNA restriction 2. Ligation of adapters 3. Preselective PCR 4. Selective PCR

26 1. DNA restriction Purified genomic DNA is typically digested with one rare and one frequently cutting restriction enzyme.

27 2. Ligating the adapters Complementary adaptors of known sequence are ligated to the restricted DNA ends. The ligated template DNA is now ready for PCR amplification

28 3. Preselective AFLP amplification PCR at high-stringent conditions To initially reduce the complexity of the adapted fragment population, PCR amplification is performed with primers complementary to the adaptor sequences, each with one selective nucleotide. Theoretically, assuming equal nucleotide frequencies, each additional base extending into the unknown region of DNA should reduce the number fragments generated by 4 n where n = the number of additional bases.

29 The population of preselective PCR-generated fragments consists primarily of those with the following sequence:

30 4. Selective PCR The preselective products are again amplified as before but one of the primers, with possibly multiple selective nucleotides, is now labeled with a fluorophore. Only fragments containing a priming site complementary to the fluorophore labeled primer will be visualized during dpage. The number of selective nucleotides required for optimum fragment distribution is highly dependent on the complexity of the target DNA which varies greatly among classes of organisms.

31 AFLP

32 Detection of faflp-products (capillary electrophoresis)

33 Fordeler til AFLP: Universell protokoll (DNA virus, G+/G- bakterier, intracellulære bakt, eukaryoter) DNA sekvensen i målorganismen trenger ikke være kjent Mange restriksjonsenzymer tilgjengelige Antall og størrelse på fragmentene kan skreddersyes Forsiktighet som kreves ved AFLP: Sterkt influert av DNA kontaminasjon Ekstrem kontroll av stringensbetingelsene nødvendig for konstruksjon av databaser basert på AFLP båndmønster

34 PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) MAKRORESTRIKSJONS FRAGMENT ANALYSE SEPARERING AV STORE DNA FRAGMENTER (HELE BAKTERIEGENOMET) RESTRIKSJONSENZYMER SOM KUTTER SJELDEN SPESIELL ELECTROPHORESE TEKNIKK (for å gi 5-20 FRAGMENTS : ~ kbp) UTMERKET DISKRIMINATORISK STYRKE

35

36 electrodes Electric current hours buffer 14 C

37

38 MRSA Ullevål BM Andersen et al, J Hosp Infection 1999, 41:123-32

39 SINGLE GENETIC EVENTS GAIN OF RESTRICTION SITE

40 SINGLE GENETIC EVENTS LOSS OF RESTRICTION SITE

41 SINGLE GENETIC EVENTS INSERTION 100 kb

42 SINGLE GENETIC EVENTS DELETION 30 kb

43 SINGLE GENETIC EVENTS GAIN OF LOSS OF RESTRICTION SITE INSERTION 100 kb DELETION 30 kb 2-3 BANDS DIFFERENCES

44 CATEGORY GENETIC DIFFERENCES BAND DIFFERENCES INTERPRETATION: PART OF OUTBREAK? IDENTICAL indistinguishable 0 0 YES CLOSELY RELATED PROBABLY POSSIBLY RELATED POSSIBLY DIFFERENT 3 7 NO Tenover FC et al, J Clin Microbiol, 1995, 33:2233-9

45 MRSA Ullevål BM Andersen et al, J Hosp Infection 1999, 41:123-32

46 BAND-BASED SIMILARITY COEFFICIENTS S J : a / a + b +c (Jaccard) S D : 2a / 2a + b +c (Dice) a= number of shared bands in strains 1& 2 b= number of unique bands in strain 1 c= number of unique bands in strain 2 S J : 6 / = 6 / 9 = 0.67 No of bands: 8 7 No of shared bands : 6 S D : 2 x 6 / 2 x = 12/15 =0.80 No of unique bands : 2 1

47 UWPGMA: Unweigthed pair group method with mathematical averages 1 vs 2: vs 4: vs 3: vs 4: vs 3: vs 4: 0.75

48 % SIMILARITY UWPGMA: Unweigthed pair group method with mathematical averages 1 vs 2: vs 4: vs 3: vs 4: vs 3: vs 4: 0.75

49 Hovedproblem PFGE Teknisk krevende Arbeidsintensivt Tidsforbruk Kan mangle resolusjonsevne for å skille nesten like store bånd 5 % Noe subjektivt i tolkning Viktige momenter mht kvalitetskontroll, standardisering og data portabilitet

50

51 VNTR Variable Number Tandem Repeats Repeat unit: bp Head tail configuration - satellite DNA : > 100 bp ( rare in prokaryotes) - minisatellites : bp - microsatelittes : 1-10 bp Repetition unit and number of copies define size

52 VNTR Typing I monomorfe arter: (ex: B.anthracis, Y.pestis, F.tularensis, M.tuberculosis) - konserverte sekvenser av repetisjonsenheten - PCR basert deteksjon - kopitallet på hvert locus definerer allelet Ex: B.anthracis vrra 12 bp 2-6 repeats 5 alleles vrrb1 9 bp vrrb2 9 bp vrrc1 36 bp

53 In monomorfic species: (ex: B.anthracis, Y.pestis, F.tularensis, M.tuberculosi - conserved VNTR Typing - PCR based detection - the copy number of each locus defines the allele I polymorfe species: - sekvens variasjon innen repetisjonsenheten - sekvensering vil kunne øke antall typer - innholdet i repetisjonsenheten definerer typen

54 MLVA : Multiple Locus VNTR Analysis Sammenligning av amplifikasjonsproduktstørrelsen av hvert VNTR target repetisjonsenheten størrelse antall kopier på mange loci Premiss: Identifisering av species- og locispesifikke primere

55

56 Resolution of 27 GBS strains of ST17

57 Lindstedt et al. Eurosurveillance 2013;18(4): 24 Jan 2013

58 NUKLEOTID SEKVENSERING SAMMENLIGNING AV DNA SEKVENS FRA SAMME LOCUS MUTASJONER VIL INFLUERE POTENTIAL TIL Å BLI FOR DETALJERT - DESIGN VIKTIG Å VURDERE STORT POTENSIAL BRUKT EN DEL FOR VISSE SPECIES SPECIES MULTI-LOCUS SEQUENCE TYPING

59 MULTILOCUS SEQUENCE TYPING - MLST SEQUENCING OF A NUMBER OF HOUSE-KEEPING GENES : arc aro glp gmk pta tpi yqi (Carbamate kinase) (Shikimate dehydrogenase) (Glycerol kinase) (Guanylate kinase) (Phosphate acetyltransferase) (Triosephosphate isomerase) (Acetyle coenzyme A acetyltransferase) (These 7 apply for S.aureus!)

60 MULTILOCUS SEQUENCE TYPING - MLST SEQUENCING SEVERAL HOUSE-KEEPING GENES (typically 7) TYPICALLY bp ANY VARIATION IS ASSIGNED A NEW ALLELIC NUMBER COMBINATION OF ALLELES DEFINES THE SEQUENCE TYPE Ex: 17 ALLELES AT 6 LOCI 24 MILL. STs THEORETICALLY UNAMBIGUOUS RESULT IN ANY LAB. PORTABLE DATA EXPORTED TO UNIVERSAL DATABASES

61 TILGJENGELIGE MLST DATABASER (pr mars 2015) ( B.burgdorferi B.cereus B.henselae B.pseudomallei C.albicans C.glabrata C.krusei C.trachomatis C.tropicalis C.jejuni C.neoformans var grubii E.coli E.faecium E.faecalis H.influenzae H.pylori Leptospira spp. M.catharrhalis N.meningitidis P.acnes S.agalactiae S.aureus S.dysgalactiae S.enterica S.epidermidis S.pneumoniae S.pyogenes S.suis V.vulnificus

62 MLST results usually presented as: Dendrogram : Caution required in species with frequent recombinations BURST (Based Upon Related Sequence Types) Grouping of ST with > 6 (5?) identical alleles Identification of ancestry - ancestor

63 eburst

64 Singel locus sekvens typing Ex: S.aureus VNTR typing; GAS emm typing Spa: 24 bp repetisjon i 3 -enden av Protein A -genet Coa: 81 bp repetisjon i 5 -enden av coagulase-genet

65 Prinsippet ved spa-typing Tandem repeats in 3 -end of spa gene Variasjon i antall av repetisjoner Variasjon i nukleotidsekvensen til de individuelle repetisjoner (21-30 nt) Hver identifisert repetisjon gies en numerisk kode Spa-type: utledes fra spesifikke antall og rekkefølgen av de funne repetisjoner

66 Principle spa-typing

67 OTHER METHODS COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION - Several microarrays are available Immobilized Probes: pcr amplicons (>200bp) or oligonucleotides ( up to 70-mers) Target DNA : labelled and allowed to hybridize OPTICAL MAPPING Principle: stretch of DNA on a microfluidic device restriction endonuclease fragments stained with intercalating fluorescent dye length of fragments proportional to fluorescence intensity (may be coupled with Next Generation sequencing) WHOLE GENOME SEQUENCING Large potential but several challenges exist

68

69 GENOTYPISK METODE REPRODUSER- BARHET DISKRIMINER- ENDE STYRKE PLASMID PROFIL BRA BRA FINGERPRINTING GOD BRA RIBOTYPING UTMERKET FAIR PCR -FINGERPRINTING UTMERKET GOD ARBITR. PRIMED PCR GOD (?) GOD PFGE UTMERKET UTMERKET AFLP UTMERKET UTMERKET VNTR UTMERKET UTMERKET NUCLEOTIDE SEQUENCE UTMERKET UTMERKET

70 The clock speed of the genetic variations observed is an important factor which has to be taken into account. Yet not completely resolved for every method applicable For S.aureus and VNTR vs other methods: PFGE > spa > coa > MLST (?) Local outbreaks / short term epidemiology Long term epidemiology / Global characterization

71 Konklusjon: Ingen metode idell for ethvert formål Pros & contras må tas i betraktning

72 Meget god, overordnet oversikt kan finnes i: Sabat et al, Eurosurveillance. Vol 18, Issue 4, 24 January 2013

73 MOLECULAR EPIDEMIOLOGY METHODS IN MICROBIOLOGY FOR : INVESTIGATION OF OUTBREAK OF INFECTIOUS DISEASES DELINEATION OF STRAIN IDENTITY

74 5 biopsier (No 1-5) og 1 skrap fra protesen (No 6)

75

76 Biopsi 3: 5 fenotypisk ulike KNS I II III IV V clindamycin R R R R R penicillin R R R R R oxacillin R S S S R erythromycin R R R R R cefotaxim R S S S R PFGE: 1-2 bånd forskjeller - samme klon!

77 Simpsons s Diversity Indices Simpsons s Index (D) measures the probability that two individuals randomly selected from a sample will belong to the same species D = n(n-1) n=number of organisms of a particular sp N = total number of organisms of all spp N(N-1) Simpsons Index of Diversity: 1-D