Genetic characterisation of Flavobacterium psychrophilum isolates from Norway and Chile

Transkript

1 Genetic characterisation of Flavobacterium psychrophilum isolates from Norway and Chile Patricia Apablaza Fiskesykdomsgruppen Institutt for biologi Universitet i Bergen FriskFisk konferanse Bergen, februar 2013

2 Oversikt 1. F. psychrophilum - bakgrunn 2. Mål 3. Genetisk variasjon av F. psychrophilum - PhD 4. Metoder 5. Resultater 6. Konklusjoner

3 1. Bakgrunn - F. psychrophilum Aerob Rett eller bøyde staver Vekst: 4 23 C, 0.8% NaCl gule kolonier Overlever lengre in ferskvann Danner biofilm ved suboptimale forhold RTFS (Rainbow Trout Fry Syndrome), akutt, vinter- septikemi, høy dødelighet Bilde: Asbjørn Dyrkorn Løland BCWD (Bacterial Cold Water Disease), kronisk, vinter- smolts, sår, lavere dødelighet

4 Laks ferskvann

5 Regnbuetørret sjøvann

6 2. Mål for PhD Hoved: Genetisk karakterisering av F. psychrophilum isolater fra vill og oppdrettslaks fra Norge og oppdrettslaks fra Chile, for å identifisere mulige genetisk variasjon og geografisk fordeling Delmål: Å finne genetiske markører for å skille isolater av F. psychrophilum med forskjellige virulens Kartlegging av viktige reservoar og smitterute for utvalgt isolater av F. psychrophilum

7 3. Genetisk variasjon F. psychrophilum (art) har forskjellige genetiske varianter som kan gi virulens forskjeller mellom isolater Genotyping er viktig for å separere varianter for: - Implementeres i produksjon - sporbarhet i smitteruter - bruke i risikoanalyse ved virulensforskjeller Metoder for genotyping: a) Multi Locus Sequence Typing (MLST) - Housekeeping gener b) Variable Number Tandem Repeats (VNTR), mikrosatetiler

8 4. Metoder Isolater fra Norge Isolater fra Chile * kun oppdrettslaks Eira Vosso Rogaland Smøla Osterøyfjord Antuco Melipeuco Curarrehue Hornopiren Rupanco Valdivia Llanquihue Puerto Cisnes Puerto Montt Panguipulli Chinquihue Quillaipe Quellon

9 Prøver wounds Spleen Vann - biofilm

10 Metoder Isolater: 18 (15 vill, 3 oppdrettslaks) F. psychrophilum fra Norge + 25 fra oppdrettslaks fra Chile + T.S. = 44 Dyrkning FLPA (24-72 t, 15 C) Gule Kolonier (fenotyping med morfologi, biokj. karakk.) DNA ekstraksjon Verifisering med 16S rrna seqvensering

11 Resultater Differensiering av isolater 16S => art nivå Housekeeping gener (tuf, trpb, murg, gyrb, fumc, dnak and atpa) Seqvensering MLST + 50 isolater Nicolas et al = 96 Fylogeni

12 Resultater MLST (HK) Ja87-47-Ay-K; Ja87-46-Ay-K, ST1 No09-32-As-G, ST28 No10-43-As-K, ST27 Dn91-25-Rt-Sp, ST26 Fr98-24-Rt-K, ST25 Ch10-14-Rt-G, ST24 Ch10-18-Rt-G, ST23 Ch09-13-As-W, ST22 No10-34-T-G, ST21 Ch96-51-Rt-Sp; Gr95-49-Rt-Sp Ch06-1-Rt-E; Ch10-21-Rt-W ST20 Ch10-22-As-nd; Ch07-23-As-E-I Ch10-16-Rt-G, ST19 Ja92-32-Rt-K; Ja92-33-Rt-K, ST18 Is98-31-Rt-Sp, ST17 Ch07-3-As-E; Ch09-12-Rt-W ST16 Ch07-7-As-E Ch07-9-Rt-E-I, ST15 Us93-35-Rt-Sp, ST14 Ch07-24-Rt-E-I, ST13 Us95-34-Rt-nd, ST12 Sc91-29-Rt-Sp; Us91-28-Rt-K ST11 Sp91-30-Rt-L Fr86-27-Rt-K, ST10 Ch01-44-Cs-K Ch07-2-As-E; Ch07-20-Rt-E-I Ch08-8-As-E; Ch08-11-As-E ST9 Ch08-19-As-E; Ch09-6-As-E-I Fr03-43-T-ML, ST8 Ch08-10-Rt-E-I, ST7 No09-28-Rt-K; No11-45-As-W Fr88-42-Rt-Sp; Fr98-40-Rt-DL ST6 Fr99-37-Rt; Fr99-39-Rt-K Sw93-22-Rt-Sp; Dn90-38-Rt-Sp Fr99-45-Rt-Sp, ST5 Gr89-36-Rt-L, ST4 Us95-26-Rt-K, ST3 Ch10-25-nd-Sp, ST2 No09-26-As-K; No09-31-As-Eg, ST Ta91-1-As-EF; Ta91-2-As-EF Ta91-3-As-EF ST53 Us90-4-As-K, ST52 Fr92-5-Ca-G, ST51 Fr92-6-Te-K, ST50 No09-29-As-nd; No10-42-As-K No10-38-As-W; No10-39-As-W ST49 No10-44-As-M, ST48 Fr00-7-Rt, ST47 Fr95-8-Te Gr90-9-Te-L; Gr90-10-Te-Sp ST46 Us90-11-Cs-K; Bc84-13-Cs-K Ch01-12-Cs-Sc ST45 NCIMB1947; NCIMB1947, ST44 Ja84-14-Cs-K, ST43 No09-27-As-SK; No09-33-As-G No10-35-T-W; No10-36-T-W ST42 No10-37-T-W Ja90-15-Cs-PL, ST41 Ch10-15-As-F, ST40 Ch08-17-Rt-E, ST39 Ch07-4-Rt-E-I, ST38 Gr87-16-Ee-K Fr98-17-Ee-K ST37 No96-18-Rt-K; Ch09-5-Rt-E, ST36 No09-30-T-Sp, ST35 Gr90-19-Ca-Sp, ST34 Us86-21-Ct-K, ST33 Sw93-57-Rt-Sp, ST32 Fr97-20-T-K, ST31 Us81-23-CHs-K, ST30 Varianter i samme fiskelanlegg Grupper med lik isolater - Fra samme og forskjellig land - Fra samme og forskjellig fiske art

13 No10-44-As-M Gr95-49-Rt-Sp No10-38-As-W; No10-42-As-K Gr90-10-Te-Sp Fr97-20-Bt-K Us95-34-Rt Fr03-43-Bt-ML Fr98-17-Ee-K Gr90-9-Te-L Ch09-6-As-E-I;Ch08-19-As-E Bc84-13-Cs-K Fr99-39-Rt-K Ch10-18-Rt-G Fl. frigidarium NCIMB Fr92-5-Ca-G Ch01-12-Cs-Sc No10-36-T-W;No09-33-As-G Ja87-46-Ay-K No09-30-St-Sp Ch08-8-As-E;Ch07-2-As-E Ch07-7-As-E;Ch10-22-As-nd Ja84-14-Cs-K Gr89-36-Rt-L Fr Rt Dn90-38-Rt-Sp Sp91-30-Rt-L Ta91-1-As-EF Fr99-45-Rt-Sp Sw93-22-Rt-Sp Gr87-16-Ee-K Ch09-13-As-W Fr92-6-Te-K Ch08-17-Rt-E NCIMB1947-Us-Cs-K No09-27-As-SK Ch96-51-Rt-Sp Ch10-15-As-F;NCIMB1947 Us90-11-Cs-K Fr98-40-Rt-DL Ch08-11-As-E Ta91-2-As-EF Us81-23-CHs-K Sw93-57-Rt-Sp Ta91-3-As-EF Ja90-15-Cs-PL No10-39-As-W;No09-29-As-nd Fr00-7-Rt Dn91-25-Rt-Sp Fr86-27-Rt-K No10-43-As-K;No09-32-As-G Ch08-10-Rt-E-I;Ch07-20-Rt-E-I No11-45-As-W;No09-28-Rt-K Fr95-8-Te Ch09-5-Rt-E Ch10-25-nd-Sp;Ch10-14-Rt-G No96-18-Rt-K Us95-26-Rt-K Is98-31-Rt-Sp No10-34-T-G Sc91-29-Rt-Sp Ja92-33-Rt-K No10-37-T-W;No10-35-T-W Fr98-24-Rt-K Us91-28-Rt-K Ch01-44-Cs-K Ja87-47-Ay-K Fr88-42-Rt-Sp Gr90-19-Ca-Sp Us86-21-Ct-K Ch07-4-Rt-E-I;Ch07-9-Rt-E-I Ja92-32-Rt-K No09-31-As-Eg;No09-26-As-K Us93-35-Rt-Sp Us90-4-As-K Ch07-23-As-E-I Ch07-3-As-E; Ch10-21-Rt-W Ch10-16-Rt-G;Ch09-12-Rt-W Ch06-1-Rt-E;Ch07-24-Rt-E-I 100 gyrb-i gyrb-iii gyrb-iv gyrb-v gyrb-ii 100 Resultater Fylogeni gyrase B Oppdretslaks-vill

14 6. Konklusjoner F. psychrophilum ser ut som vanlig bakteria i will laks i Norge flere forskjellige isolater Flere genetiske varianter kan finnes i samme sted Betydelig variasjon i housekeeping gener, men ikke nok for å separare isolater Lignende isolater i flere land => Smitte gjennom transport av laks foster Forskjellige art kan være vert for lignende isolater (laks - rb) F. psychrophilum har vært oppdraget i forbindelse med sykdom i regnbueørret i full sjøvann

15

16 Variable Number of Tandem Repeats VNTRs of F. psychrophilum isolater fra Norge og Chile - Vector NTI Kort sekvenser som gjentas (AATCTG) - Forskjellig nummer av repetisjoner i forskjellige isolater => Genetisk markør

17