Analysering av HbA1c med kromatografisk metode BFI 03. februar 2015 v/ Gro Nielsen (AHUS) Hva er HbA1c? Normalt hemoglobin består av 2 alfakjeder og 2 bettakjeder Glykosylert hemoglobin (HbA1c) er et glykoprotein dannet ved en irreversibel reaksjon mellom glukose og betakjeden i hemoglobinet. Verdien reflekterer det gjennomsnittlige blodglukosenivået de siste 6-10 ukene før prøvetaking. HbA1c avhenger av normal levetid for erytrocyttene. Nedsatt levetid gir falsk for lave resultater. 2 1
Changes in globin expression during embryonic, fetal and adult life α-chain γ-chain β-chain 2 2 2 2 2 2 HbA1 HbA2 HbF δ-chain 0-6 months Birth 6 months 3 HbA1c diagnostisk test Kriterier: HbA1c > 6,5 % Fastende glukose >7,0 mmol/l (hvis ikke HbA1c kan benyttes) 2 timers venøs glukose etter 75 g oral glukose >11,1 mmol/l. 4 2
Instrument - TOSOH G8 5 HbA1c på AHUS Antall prøver pr. døgn: ca 250 (PHT + interne). Analysetid: 1,6 min. pr prøve. Analysering fra kl 08:00 til ca 16:00 Prøvemateriale: 1 ml EDTA-blod (primærrør) 70µL EDTA-blod i analysekopp Holdbarhet: 7 dager (2-8 C) 5 dager (romtemp.) Referanseområde: 4,0 6,0 % (oppgitt av leverandør, verifisert) 6 3
Prinsipp Kromatografi (HPLC) HPLC (high performance liquid chromatography) Høyt trykks væskekromatografi med ionebytting. Stasjonær fase kolonne pakket med kationer. Mobil fase - 3 elueringsbuffere, med ulik ph og ionestyrke. Gode separasjonsegenskaper oppnås med kolonne pakket med svært små partikler og en høytrykkspumpe som pumper den mobile fasen gjennom systemet. 7 Analysering av prøver Prøvemengde 4µL blod fortynnes automatisk med hemolyse/ vaskeløsning (1:200) og hemolysatet sendes inn i kolonnen (via forfilteret). Mobil fase Elueringsbufferne sendes deretter inn i kolonnen, en etter en, slik at de ulike hemoglobinfraksjonene separeres. 8 4
Normalt HbA1c- kromatogram økende bindingsstyrke 9 Når byttes kolonnene? Kolonnene lever ikke evig og må byttes ved behov: For høyt kolonnetrykk QC problemer For lav teoretisk plateverdi (TP-verdi<250), dvs butte topper. 10 5
Kalibrerer ny kolonne Analyserer kvalitetskontroll Rutiner ved kolonnebytter Analyserer minst 10 pasientprøver med gammel og ny kolonne (korrelasjon). Passing & Bablok regresjon. Evt reanalyse av nedfrosset materiale fra tidligere ekstern kvalitetsvurdering eller andre nedfrosne arkivprøver 11 Analysekvalitet - presisjon CVa (langtidscv): HbA1c nivå ca 6 %: CVa= 0,7 %. Kontrollmateriale, EDTA-blod HbA1c nivå ca 9 %: CVa= 1,0 %. Kommersiell kontroll, liquid. Kontrollmaterialene er uavhengige, dvs ikke fra instrumentleverandør. Tillatt total feil: TEa = 3-4 % 12 6
Analysekvalitet - riktighet Ekstern kvalitetsvurdering (Noklus) Små avvik med ny kalibrator. Bias ca +2 %. Ingen faktorisering på AHUS. Biaskrav +/- 2,3 % ved kolonnebytter. Små kolonnelot-variasjoner. 13 Ekstern kvalitetsvurdering Noklus, 4-2014 antall % Eget resultat Eget resultat:5,85% Avvik fra tillagt verdi: +2,5 %. Akseptgrense: +/- 7%. 14 7
Atypiske kromatogram Gammel prøve Ny prøve ønskes 15 Hemoglobinopatier Syntesesvikt Thalassemier (β og α) Mutasjoner i kjedene Ulike varianter (D, S, C og E) 16 8
Thalassemi vs hemoglobinvariant β - globinkjede α - globinkjede Normal β-thalassemi α-thalassemi Hb-variant 17 Forekomst av hemoglobinopatier (Etnisk norske har ingen) Talassemier HbD HbC HbS HbE 18 9
Sannsynlig D-variant Hemoglobinopatier- varianter Svar kan gis ut med tillegg: Funn av variant 19 Sannsynlig S- variant Hemoglobinopatier- varianter Svar kan gis ut med tillegg: Funn av variant 20 10
Sannsynlig E- variant Hemoglobinopatier- varianter Tillegg til svaret: Utført på alternativ metode. Funn av variant. 21 Hemoglobinopatier- føtalt hemoglobin ( ) Økt mengde HbF (lite barn) Svar kan gis ut. HbF= <15 % 22 11
β- Thalassemi minor: Hemoglobinopatier- Thalassemi Diabetes. Nedsatt levetid på RBC? Hb,MCV, MCH, RDW?? Svar kan ikke rapport eres 23 Hb-typing. Normalt kromatogram HbA0 HbF HbA2 24 12
Oppsummering: Brukervennlig instrument. Stabilt Ujevn levetid på kolonnene Lite vedlikehold God presisjon. Liten lot til lot variasjon på kolonnene Ser hva vi analyserer. Usikkert resultat? Positiv bias over tid (jmfr ERL). Noe mindre med ny kalibrator. Mindre kapasitet enn immunologiske metoder (?) En del kommunikasjonsproblemer mellom TOSOH G8 og LIS Oppdager hemoglobinopatier. Videre analyse, med kolonne for dette, gjøres ved behov. 25 13