Nye analysestrategier ved mistanke om flåttbårn sykdom. Andreas Emmert; Lege Mikrobiologisk avdeling SiV

Nye analysestrategier ved mistanke om flåttbårn sykdom. Andreas Emmert; Lege Mikrobiologisk avdeling SiV

Vi vet at spesifisiteten på symptomene ved Borreliose er langt ifra 100%. For eksempel er spesifisiteten til diagnosen Erythema migrans, altså nok det mest spesifikke sykdomstegn ved Borreliose, i litteraturen angitt til å ligge rundt 80%. De andre sykdomsmanifestasjoner må forventes å ha en nok ikke ubetydedlig lavere spesifisitet. Dermed kommer vi over til spørsmål 1: Pasienten oppsøker legen med uspesifikke symptomer. Skal man ta en Borreliaprøve til serologisk analyse? Ifølge den nye veilederen kun dersom det er sannsynlig at pasienten har infeksjon med Borrelia Når man i utgangspunktet definerer Borreliose som en infeksjon med et ofte ukarakteristisk sykdomsbilde biter man seg ved denne framgangsmåten selv i halen???

Men hva skjer hvis man tar testen allikevel? Er testen tatt tidlig i sykdomsforløpet? Et positiv testresultat her, særlig ved positiv IgG vil sannsynligvis gjenspeile en gammel infeksjon. Man vet at 10-20% av den friske befolkningen er seropositive. Testens spesifisitet fra leverandøren angis å være 98%. 98% spesifisitet betyr uheldigivis ikke at 98% av testpositiv er syke men kun at det er 98% sannsynlighet for at et positiv testresultat gjenspeiler aktuell eller tidligere infeksjon med Borrelia. Litteraturen angir at 95% av pasientene er asymptomatiske bærere etter flåttbitt- forutsatt at flåtten har Borrelia i seg. Dette sies om 30% av flåttene. Når 20% av befolkningen er seropositive og testen har en 100% spesifisitet og sensitivitet har 0,05% Borreliose eller med andre ord 5 av 10 000. Riktig?

Hvor stor er sjansen for å få Borreliose når man blir 10 hhv 100 ganger bitt av en flått når 30% av flåttene inneholder Borreliabakterien? (1-0,66i100.)x100= 99,9999999999999999 % hhv (1-0,66i10)= 98,43% Med andre ord blir 1 000 000 nordmenn 100 ganger bitt blir alle infisert. 50 000 blir syke (5%). Blir 1 000 000 nordmenn 10 ganger bitt blir 984316 infisert. 49216 (4,9%) av disse blir syke.

Infisert+ Infisert- Test+ 25 1 Test- 5 74 Praevalens: 30% Spesifisitet: 98% Sensitivitet: 83% PPV: 96% (Syk 5%?) NPV: 94% ( ) 30 75 105

Syk+ Syk- Test+ 4 2 Test- 1 98 Praevalens: 5% Spesifisitet: 98% Sensitivitet: 80% PPV: 66% (ouch ) NPV: 99% 5 100 105

Syk+ Syk- Test+ 2 2 Test- 3 98 Praevalens: 5% Spesifisitet: 98% Sensitivitet: 40% PPV: 50% NPV: 97% 5 100 105

Konklusjon? Pga de viste usikkerhetene rundt omkring både den kliniske diagnosen samt de diagnostiske usikkerhetene i forbindelse med serologisk testing bør diagnostikk og behandling av denne pasientgruppen ivaretas av spesialister i infeksjonsmedisin med erfaring innen feltet.

Dette betyr også at en konfirmasjonstest med C6 og eller en Western Blot vil ikke løse problemet, ved at mange vil være infiserte men ikke syke. Både C6 og Western Blot kan gi tilleggsopplysninger men jeg kan ikke se at produsentene støtter tolkning mht speciesdiagnostikk/ bruk av disse analyser som aktivitetsmarkør. C6 har blitt diskutert i litteraturen som aktivitetsmarkør men tallmaterialet er foreløpig for liten til å trekke noen sikre konklusjoner. Mer forskning! Resultatene av disse testene er en av mange brikker i puslespillet omkring den kliniske problemstillingen.

The end of all hope?

Hvilke antigener bør testene inneholde? Borrelia burgdorferi er en bakterie som har utviklet en mengde egenskaper for å unngå vertens immunaparat. Bakterien uttrykker andre antigen variasjoner in vivo enn in vitro og det er stor heterogenitet mellom de ulike genospecies. Det er derfor viktig at man bruker et bakterielysat med en genospecies og genotyper som har stor kryssreaktivitet med andre genospecies og genotyper. Borrelia afzelii Pko ser ut til å ha denne egenskapen. For å oppnå enda bedre sensitivitet er det viktig å tilsette rekombinante in vivo antigen (p- 100, VlsE,p-39,OspC og p-18. Antigener som er viktig i testsystemet utover det er p58,p39,p35,ospa og p41. Disse antigen bør i tillegg være fra de 4 vanligste genospecies.

Euroimmun IgG

Recomeline Mikrogen

Hva vil framtiden bringe? 1. CXCL13 kjemokinpåvisning i spinalvæske ved tidlig nevroborreliose. Dette er en ELISA metode som påviser CXCL 13 kjemokinet i SPV. CXCL 13 er en kjemoattraktant for B-celler og aktiverte T-celler. CXCL13 kan induseres i ikke lymfoid vev ved inflammatoriske tilstander som f.eksempel i meningene ved sekundær progressiv MS og altså ved Nevroborreliose. Testens sensitivitet er god, men det er ikke avklart om testen er spesifikk nok.

2. Immunkompleksserologi 3. Dyrkning? Forskning? 4. Cellulaer immunologisk diagnostikk: T- og NK-celleforsvaret har i norge ikke blitt brukt til undersøkelse på Borreliabakterien. Det foreligger et fåtall publikasjoner som viser at prinsippet har potensiale for videre utvikling. Basert på resultater fra disse publikasjonene tilbyr et fåtall europeiske laboratorier cellulaær immunologiske analyser. Dette dreier seg om T-celle proliferasjonstest og NK-celle (CD57+/CD3-) lymfocytt telling. Prinsippet er at pasientens T-celler gjenkjenner Borrelia spesifikke antigener og transformeres til aktiverte T-celler med påfølgende celledeling eller produksjon av spesifikke cytokiner. Påvisning av aktiverte T-celler kan f.eks gjøres med radioaktive isotoper som måler DNA syntese som mål for celledeling eller ved immunologisk påvisning av spesifikke cytokiner.

En gjennomgang av publikasjoner fra 1985 viser at in vitro T-celle responser har vært forsøkt ved mange laboratorier. Imidlertid spriker resultatene veldig fra publikasjon til publikasjon med tanke på sensitivitet og spesifisitet. Innen Borrelia diagnostikk er det lansert en kommersiell analyse kalt LTT- MELISA. Forfatteren hevder at testen ser ut til å korrelere med aktiv Lyme Borreliose og at den kan ha diagnostisk relevans i å bekrefte LB i kliniske og serologisk uklare tilfeller. De hevder også at testen kan brukes som markør for å monitorere sykdomsaktivitet/ behandlingseffekt. Det er ingen andre grupper som har publisert resultater ved bruk av denne spesielle protokollen. Metoden er blitt kritisert for å ha lav spesifisitet og er således ikke anvendbar som diagnostisk metode.

CD57+/CD3- lymfocytt telling Metoden er publisert av Stricker et al i 2001. Ved hjelp av flerfarget flowcytometri og antistoffer mot overflatemarkører viser de at pasienter med kronisk LB har redusert antall CD3 negative og CD 57 positive NK celler. De hevder at analysen kan være viktig for å påvise kronisk Lyme Borreliose, og at den kan benyttes for å følge behandling av sykdommen ved at verdiene normaliseres ved vellykket behandling. Gruppa har senere publisert 2 artikkler av enkelt kasus hvor de også hevder at analyse av CD57 lymfocytt- subset viser tilsvarende funn. Imidlertid er det nylig publisert en studie av Marques et al som ikke finer forskjell i CD57 subset analyse mellom kontrollpersoner og post- Lyme Borreliose pasienter.

Vurdering T-celle proliferasjonstesten er arbeidskrevende og kostbar. Det er ikke konsensus mht hvile antigener som bør benyttes i testen, og metoden er vanskelig å standardisere. Blodet må være ved analyselaboratoriet innen 24 timer etter prøvetaking. De tyske, danske, britiske, kanadiske og amerikanske mikrobiologiske organisasjoner anbefaler ikke disse testene for diagnostikk av Lyme Borreliose.

PCR 1. Detection of Borrelia burgdorferi sensu lato DNA by PCR in serum of patients with clinical symptoms of Lyme borreliosis. Iolanda Santino et al. FEMS Microbiol Lett 283 (2008) 30-35 2. Detection of different Borrelia burgdorferi genospecies in serum of people with different occupational risks. Iolanda Santino et al. International journal of Immunopathology and Pharmacology Vol.22, no.2, 537-541 (2009). 3. Development of real time PCR to detect Toxoplasma gondii and Borrelia burgdorferi infections in postal samples. A.W.L. Joss et al. J Clin Path 2008 61: 221-224.

Detection of different Borrelia Burgdorferi genospecies in serum with different occupational risks: Short report 60 serumprøver fra friske mennesker i Lazio området (Italia). Pasientene ble inndelt i 3 grupper: Gruppe A: Seropostive skogsarbeidere (16 men, 4 kvinner) (7 husket flåttbitt men ingen hadde symptomer. Gruppe B: Seropositive mennesker uten yrkesmessig flåtteksposisjon (20 men). Gruppe C: Seronegative mennesker (20), 10 sogsarbeider og 10 mennsker uten kjent flåtteksposisjon.

DNA ekstraksjon og amplifikasjon Borrelia total DNA ekstraksjonsmetode som beskrevet i en tidligere artikkel ble brukt. 16SrRNA gen spesifikke primere designed for B.burgdorferi sensu lato, B.burgdorferi sensu stricto, B.garinii, B.afzelii og B.valaisiana ble brukt.

Resultater Gruppe A: 19 IgM positiv, IgG negativ, 1 IgM negativ, IgG positiv Gruppe B: 18 IgM positiv, IgG negativ; 2 IgG positiv, IgM negativ.

B.afzelii alene eller i kombinasjon: 77,7% i gruppe A hhv 66,6% i B. B.garinii i 38,8%i A hhv 33,3i B. B.valaisiana i 30,7% i A og 25% i B. B.b.s.s ble ikke funnet. Blandingsinfeksjoner ble funnet i 46% i gruppe A og 25% i Gruppe B.

Diskusjon PCR kan bidra til å identifisere falsk positive ved serologisk testing. Den høye prosentandelen av IgM antistoffer for gruppe A og B indikerer asymptomatisk infeksjon med B.burgdorferi. Dette står i overenstemmelse at ikke alle infiserte individer utvikler kliniske symptomer og at senmanifestasjoner ofte kan bli feilinterpretert. PCR kan bidra til å øke påliteligheten av en en diagnose under tidlige stadier av infeksjonen. Serologisk diagnostikk overestimerer antakeligvis forekomsten av sykdommen.

Detection of Borrelia burgdorferi sensu lato DNA by PCR in serum of patients with clinical symptoms of Lyme borreliosis FEMS Microbiol Lett 283 (2008) 30-35

Material og metoder Pasientprøver: 265 serumprøver innsamlet mellom januar 2003 og april 2007 fra pasienter med symptomer forenlig med Lyme Borreliose inklusive tidlige manifestasjoner (EM, feber, trøtthet, hudutslett, artralgier, myalgier) eller senere manifestasjoner (alvorlig artritt, nevrologisk og kardiologiske manifestasjoner). 20 serumprøver fra friske pasienter ble brukt som negative kontroller. Serologiske tester: ELSA og WB

PCR 1. Extraksjon (protokol A og B). 2. PCR ble gjennomført med 16rRNA PCR primer spesifikk for B.burggdorferi s.l., B.b.s.s., B.garinii, Bafzelii og B. valaisiana. 3. PCR amplifikasjon ble gjennomført med en Perkin Elmer Cetus thermocycler. 4. Amplifikasjonsproduktene ble visualisert etter elektroforese på agarose gel i en TAE buffer med hjelp av etidium bromid. For å bestemme sensitiviteten ble serumprøver fra to friske personer pooled og delt i 2 alikvoter. Hver alikvot ble infisert med 10-fold fortynningsserier av B. burgdorferi B31 celler. DNA ble ekstrahert fra 100µl infisert serum med ovennevnte metoder og PCR ble utført med B.burgdorferi s.l. primer set.

Resultater For å konfirmere PCR pålitelighet undersøkte man ekstrahert DNA fra de dyrkede stammer med 100% riktige resultater. For å teste sensitiviteten ble Borrelia DNA ekstrahert fra fortynningsserier av B.burgdorferi B31 i serum både med protokoll A og B. Ved DNA ekstraksjon med protokoll A ble PCR reaksjonene positive fra serumprøver infisert med 10i 5., i4. og i3. CFU/ml. med protokoll B med 10 i5. CFU/ml.