/10 1. TILTENKT BRUK

Transkript

1 PLATELIA LYME IgM 1 Plakk Kvantitativ påvisning av IgM-antistoffer mot borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum eller plasma med enzym immunoassay /10 1. TILTENKT BRUK Platelia Lyme IgM er en immunoassay av immunocapture-typen for kvalitativ påvisning av IgM-antistoffer mot Borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum eller plasma. 2. KLINISK VERDI Lyme borreliose (eller Lyme sykdom) er en ikke smittsom infeksjon forårsaket av en bakterie fra spirokete-familien, Borrelia burgdorferi, som overføres av flått av Ixodes-familien) (2). Forskjellige dyr fungerer som verter for bakteriene og overføring til mennesker foregår gjennom bitt av infisert flått. Overføringsrisikoen er store når flåttbittet varer lengre. Forekomsten av Lyme sykdom er store i land med temperert eller kaldt klima på nordlige halvkule, fra Kina til Nord-Amerika og fra Skandinavia til Nord-Afrika. Man forventer at ca tilfeller rapporteres hvert år i USA (3), og sannsynelig mer enn i Europa, der det øker fra vest mot øst (4). Det er nå tydelig vist at Borrelia burgdorferi, beskrevet i 1984 som en unik bakterieart, i virkeligheten er et kompleks av flere arter, hvorav fem av dem er patogene for mennesker: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ss), Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia spielmanii og Borrelia bavariensis (6,8). To andre arter er potensielt patogene: Borrelia valaisiana og Borrelia lusitaniae. Disse syv artene finnes i Europa, mens kun B. burgdorferi sensu stricto finnes i USA. Kliniske symptomer av Lyme sykdom er forskjellige og noen ganger vanskelige å gjenkjenne (7). Tre faser kan skilles under den kliniske utviklingen av sykdommen. Tidlig fase (fase I) kan være asymptomatisk og kjennetegnes av et influensalignende syndrom. I 50 til 80 % av tilfellene, flere dager eller uke etter flåttbittet, vises en karakteristisk begrenset hudutslett med sirkelformet utberedelse som kalles migrerende erytem (EM). Uten behandling vil hematogen spredning av Borrelia flere uker senere fremkalle inflammatorisk artritt, nevrologiske eller hjernehinnelidelser og hud eller hjertesymptomer (Fase II). Etter flere måneder eller år kan sykdommen utvikle seg til kronisk fase forbundet med forskjellige nivåer kronisk atrofisk akrodermatitt, encefalopati, encefalomyelitt og kronisk artritt (Fase III) (1). Hver art av Borrelia burgdorferi hae en egen tropisme. Migrerende erytem i fase I er forskjellig i forhold til de tre artene. Nevrologiske komplikasjoner er imidlertid hyppigere forbundet med B. garinii og artritt er hyppigere forbundet med B. burgdorferi, mens kronisk atrofisk akrodermatitt er spesifikk for B. afzelii. Diagnosen Lyme sykdom må ikke bekreftes uten en grundig undersøkelse av pasientens sykehistorie, kliniske og biologiske kriterier, og beregning av risiko for flåttbitt. Siden det er vanskelig å gjennomføre direkte påvisning, isolasjon ved dyrking eller molekylærbiologiske metoder, forblir serologi et nøkkelelement i biologisk diagnostisering av Lyme sykdom (1,5,9). IgMantistoffer mot Borrelia burgdorferi vises ca. 3 til 6 uker etter kontaminasjon og kan fortsette under sykdommens utvikling, mens IgG-antistoffer vises senere og når en topp etter måneder eller til og med år. Selv om serologi er mindre nyttig i tidlig fase, er det imidlertid vesentlig under andre eller tredje fase, spesielt hvis det ikke oppstår migrerende erytem. Når serologien er negativ tross en suggestiv klinisk status må en ny serologisk test utføres 3 uker etter den første testen. Nærvær av spesifikke IgMantistoffer er ikke synonymt med ny infeksjon. Samtidig er nærvær av spesifikke IgG-antistoffer ikke alltid bekreftelsen på gjennomgått infeksjon. Antigener og antistoffer som brukes i Platelia Lyme IgM- (Ref ) og Platelia Lyme IgG- (Ref ) analysene er valgt for å kunne påvise henholdsvis spesifikke IgM- og spesifikke IgG-antistoffer mot de forskjellige amerikanske og europeiske stammene av Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi ss, B. garinii, B. azfelii). 3. PRINSIPP Platelia Lyme IgM er en kvalitativ test for påvisning av IgM-antistoffer mot Borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum eller plasma med enzym immunoassay med fangst av IgM på fast fase. Anti-humane μ-kjedeantistoffer er belagt på den faste fasen (brønner på mikroplaten). En blanding av Borrelia nativt antigen og monoklonalt anti-borrelia flagellar antigen-antistoff merket med peroksidase, brukes som konjugat. Testen bruker følgende trinn: Trinn 1 Pasientprøver og kontroller fortynnes 1/101 og fordeles i brønnene på mikrotiterplaten. Under 1 times inkubasjon ved 37 C bindes IgM-antistoff mot Borrelia burgdorferi som fines i prøven seg til anti-µ-antistoffene som dekker brønnene på mikroplaten. Etter inkubasjon fjernes ubundne ikke-spesifikke antistoffer og andre serumproteiner ved vasking.

2 Trinn 2 Konjugatet (blanding av Borrelia-antigen og anti-borrelia-antistoff market med peroksidase) tilsettes brønnene i mikrotiterplaten. Under denne inkubasjonen på 1 time ved 37 C, bindes konjugatet til de spesifikke IgM anti-borrelia-antistoffene. Ubundet konjugat fjernes ved vasking etter inkubasjonen. Trinn 3 Nærvær av immunkomplekser (Anti-human µ-kjeder / IgM anti-borrelia / Borrelia-antigen / anti-borrelia monoklonale antistoffer market med peroksidase) påvises ved tilsetting av en enzymatisk utviklingsløsning i hver brønn. Trinn 4 Etter inkubasjon ved romtemperatur ( C), stoppes den enzymatiske reaksjonen ved å tilsette 1N svovelsyreløsning. Avlesningen av optisk tetthet med et spektrofotometer på 450/620 nm er proporsjonal med mengden IgM-antistoffer mot Borrelia burgdorferi som finnes i prøven. 4. PRODUKTINFORMASJON Reagensmengden er beregnet til 96 tester i maksimalt 6 analyseringer. Alle reagensene er kun for in vitro-diagnostisk bruk. Etikett Reagensenes utforming Presentasjon R1 Microplate Mikrotiterplate (Bruksklar) 12 strimler med 8 avbrytbare brønner, belagt med antihumane µ-kjeder R2 Concentrated Washing Solution (20x) Konsentrert vaskeløsning Tampon TRIS-NaCl (ph 7.4), 2 % Tween 20 Konserveringsmiddel: 0,04 % ProClin 300 R3 Negative Control Negativ kontroll Negativt humant serum for IgM-antistoffer mot Borrelia burgdorferi sensu lato, og negativ for HBs antigen, anti-hiv1, anti- HIV2 og anti-hcv Konserveringsmiddel: 0,15 % ProClin 300 R4 Cut-off Control Cut-off-kontroll Humant serum reaktivt for IgM-antistoffer mot Borrelia burgdorferi sensu lato, og negativ for HBs antigen, anti-hiv1, anti- HIV2 og anti-hcv Konserveringsmiddel: 0,15 % ProClin 300 R5 Positive controll Positiv kontroll Humant serum reaktivt for IgM-antistoffer mot Borrelia burgdorferi sensu lato, og negativ for HBs antigen, anti-hiv1, anti- HIV2 og anti-hcv Konserveringsmiddel: 0,15 % ProClin 300 R6a Antigen Antigen (frysetørket) Serumalbumin fra storfe, Borrelia burgdorferi sensu stricto nativt antigen R6b Conjugate (51x) Konjugat (51x) Monoklonalt antistoff anti-borrelia fra gris merket med peroksidase. Konserveringsmiddel: 0,16 % ProClin 300 R7 Diluent Fortynningsvæske for prøver og konjugat (Bruksklar) Tris-NaCl (ph 7.7), serum fra nyfødt kalv, 0,1 % Tween 20 R9 Chromogen TMB og fenolrød Konserveringsmiddel: 0,15 % ProClin 300 Kromogen (Bruksklar) tetrametylbenzidin (< 0,1 %), H 2O 2 (<1 %) R10 Stopping Solution Stoppløsning (Bruksklar) 1N svovelsyreløsning 1 mikrotiterplate 1 x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 2 x 8,0 ml 1 x 0,4 ml 2 x 65 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml Se merkingen på boksene for oppbevaringsbetingelser og utløpsdato.

3 5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Resultatenes pålitelighet avhenger av korrekt oppfyllelse av følgende god laboratoriepraksis: Ikke bruk reagenser som har gått ut på dato. Ikke bland eller bruk reagenser fra forskjellige lotter i samme analysering. BEMERK: For vaskeløsning (R2, identifikasjon på etikett: 20x grønn farge), Kromogen (R9, identifikasjon på etikett: TMB turkis farge) og stoppløsning (R10, identifikasjon på etikett: 1N rød farge), er det mulig å bruke med andre lotter enn de som finnes i kittet, gitt at disse reagensene er helt lik og samme lott brukes i en gitt analysering. La reagensene stå ved romtemperatur ( C) 30 minutter før bruk. Rekonstituer eller fortynn reagensene forsiktig for å unngå kontaminering. Ikke utfør analysen i nærvær av reaktiv damp (syre-, alkalisk- eller aldehyd-damp) eller støv som kan endre enzymaktiviteten for konjugatet. Bruk glassutstyr som er grundig vasket og skyllet med deionisert vann eller, fortrinnsvis engangsutstyr. Vask av mikrotiterplater er et kritisk trinn i prosedyren: Følg anbefalt antall vaskesykluser og sørg for at alle brønnene er fullstendig fylt og deretter fullstendig tømt. Feil vasking kan føre til unøyaktige resultater. Ikke la mikrotiterplatene tørke mellom endt vasking og fordeling av reagens. Bruk aldri samme beholder for å fordele konjugat og utviklingsløsning. Den enzymatiske reaksjonen er meget sensitiv for metall eller metallioner. La aldri noen metalldeler komme i kontakt med noen av løsningene som inneholder konjugat eller kromogen. Kromogenløsning (R9) må være uten farge. En blå farge indikerer at reagenset ikke kan brukes og må bytes ut. Bruk ny pipettespiss til hver prøve. Kontroller at pipettene og annet utstyr er nøyaktig og fungerer korrekt. Instruksjoner om helse og sikkerhet Materialer av human opprinnelse som er brukt i tillaging av reagenser, er testet og funnet ikke-reaktive for hepatitt B overflateantigen (HBsAg), antistoffer mot hepatitt C-virus (anti-hcv) og mot humant immunsviktvirus (anti-hiv-1 og anti-hiv-2). Fordi ingen metoder kan garantere absolutt fravær av smittsomme stoffer, må reagenser av human opprinnelse og pasientprøver håndteres som mulig smittefarlige. Alt materiale, inkludert vaskeløsninger, som kommer i direkte kontakt med prøver og reagenser med materiale av human opprinnelse, må betraktes som smittefarlig. Bruk beskyttelseshansker ved håndtering av prøver og reagenser. Ikke pipetter med munnen. Unngå å søl med prøver eller løsninger som inneholder prøver. Søl må vaskes med en 10 % klorløsning. Hvis man søler syre, må man først nøytralisere denne med natriumbikarbonat, og deretter vaske med 10 % klorløsning og tørke med cellestoff. Materialer som brukes for å gjøre rent må kastes i en beholder for kontaminert avfall. Pasientprøver, reagenser med materiale av human opprinnelse samt kontaminert materiale og produkter må kun kastes etter dekontaminering: - Enten ved nedsenking i blekemiddel med en sluttkonsentrasjon på 5 % natriumhypokloritt i 30 minutter. - Eller autoklavering ved 121 C i minimum 2 timer. FORSIKTIG: Ikke legg løsninger som inneholder natriumhypokloritt inn i autoklaven Unngå all kontakt mellom hud og slimhinner og kromogen og stoppløsning (risiko for forgiftning, irritasjon eller brannsår). Kjemiske og biologiske rester må behandles og kastes i henhold til god laboratoriepraksis. Alle reagenser i kittet er kun for in vitro-diagnostisk bruk. Når det gjelder fare- og forsiktighetsanbefalinger i forhold til enkelte kjemiske komponenter i dette testsettet, kan du se piktogrammet(-ene) nevnt på etikettene og informasjonen angitt på slutten av bruksanvisningen. Sikkerhetsdatabladet er tilgjengelig på

4 6. PRØVETAKING, KLARGJØRING OG OPPBEVARING 1. Serum og plasma (EDTA, heparin eller citrat) anbefales som prøvetyper. 2. Legg merke til følgende anbefalinger for håndtering, analysering og oppbevaring av blodprøver: Ta blodprøven etter vanlige forholdsregler for venepunksjon. La prøvene koagulere fullstendig før sentrifugering ved bruk av serum. Hold glassene lukket hele tiden. Etter sentrifugering må serum og plasma skilles fra koagelet eller røde blodlegemer og overføres til et godt lukket oppbevaringsglass. Prøvene kan oppbevares ved +2-8 C hvis analysen utføres innen 7 dager. Hvis de ikke er ferdig analysert innen 7 dager eller skal sendes, må prøvene fryses ved -20 C eller kaldere. Ikke bruk prøver som er tint mer enn fem ganger. Prøver som har vært frosset, må blandes godt (vortex) før analysering, etter at de er tint. 3. Prøver med 90 g/l albumin eller 100 mg/l unkonjugert bilirubin, lipemiske prøver med tilsvarende 36 g/l triolein (triglyserid) og hemolyserte prøver med opp til 10 g/l hemoglobin påvirker ikke resultatene. 4. Ikke varm opp prøvene. 7. ANALYSEPROSEDYRE 7.1 NØDVENDIGE MATERIALER SOM IKKE MEDFØLGER Vortexmikser. Mikroplateleser utstyrt med filter på 450 nm og 620 nm (*). Mikroplateinkubator med termostat på 37 ± 1 C (*). Automatisk, semiautomatisk eller manuell mikroplatevasker (*). Sterilt destillert eller avionisert vann. Engangshansker Beskyttelsesbriller. Adsorberende papir. Automatiske eller semiautomatiske, justerbare eller forhåndsinnstilte pipetter eller multipipetter, for å måle og fordele µl, og 1, 2 og 10 ml. Graderte sylindre på 25, 50, 100 og 1000 ml. Natriumhypokloritt (blekemiddel) og natriumbikarbonat. Beholder for smittsomt avfall. Engangsslanger. (*) Kontakt vår tekniske avdeling for detaljert informasjon om anbefalt utstyr. 7.2 REKONSTITUSJON AV REAGENSER R1: Skal stå 30 minutter ved romtemperatur ( C) før posen åpnes. Ta ut bærerbrettet og legg ubrukte strimler øyeblikkelig tilbake i posen og sjekk at det er tørkemiddel der. Lukk posen omhyggelig og sett den til oppbevaring ved +2-8 C. R2: Fortynn vaskeløsningen R2 1/20 i destillert vann: F.eks. 50 ml av R2 og 950 ml destillert vann for å få bruksklar vaskeløsning. Klargjør 350 ml fortynnet vaskeløsning til en plate med 12 strimler ved manuell vask. R3, R4, R5: Fortynn 1/101 i Diluent (R7) (f.eks: 10 µl av R3 + 1 ml av R7). R6a: Rekonstituer det frysetørkede antigenet til en plate ved å tilsette 8 ml Diluent (R7) til hver flaske. Blandes grundig. Vent 15 minutter før det blandes med Conjugate (R6b) for at antigenet skal oppnå en homogen rehydrering. R6b: Klargjør nødvendig mengde konjugat til en analysering ved å tilsette en volumdel konsentrert konjugat (51x) til 50 volumdeler Diluant (R7). Til en plate blandes 0,3 ml R6b og 15 ml av R7. R6 (R6a+R6b): Bland like mengder av de rekonstituerte reagensene R6a og R6b. Bland 12 ml rekonstituert løsning R6a og 12 ml rekonstituert løsning R6b til en plate. Vent 45 minutter før den brukes. 7.3 OPPBEVARING OG VALIDITET FOR ÅPNEDE OG / ELLER REKONSTITUERTE REAGENSER Kittet skal oppbevares ved +2-8 C. Når kittet oppbevares ved +2-8 C før det åpnes, kan alle komponentene brukes fram til utløpsdatoen som er angitt på kittets utvendige etikett. R1: Etter at det er åpnet, er strimlene holdbare opp til en måned dersom de lagres ved +2-8 C i samme godt lukkede pose (sjekk at det finnes tørkemiddel). R2: Etter at den er fortynnet kan vaskeløsningen oppbevares 2 uker ved C. Den konsentrerte vaskeløsningen er stabil til utløpsdatoen som er angitt på etiketten, når den oppbevares ved C og ikke er kontaminert. R3, R4, R5, R6b, R7: Etter at de er åpnet er reagensene stabile i en måned når de oppbevares ved +2-8 C og ikke utsettes for kontaminering. R6a+R7: Etter rekonstituering er antigenet stabilt i 15 dager ved +2-8 C eller frosset ved -20 C. Rekonstituert antigen som er frosset, må ikke tines mer enn tre ganger. R6b+R7: Etter rekonstituering er konjugatløsning stabil i 8 timer ved romtemperatur ( C) eller 24 timer ved +2-8 C. R6 (R6a+R6b): Etter rekonstituering er konjugatarbeidsløsningen stabil i 8 timer ved romtemperatur ( C). R9: Uten kontaminering er reagenset stabilt i to måneder når det oppbevares ved +2-8 C. R10: Etter åpning og uten kontaminering er reagenset stabilt til utløpsdato vist på etiketten når det oppbevares ved +2-8 C.

5 7.4 PROSEDYRE Følg nøye analyseprosedyren og god laboratoriepraksis. La reagensene nå romtemperatur ( C) før bruk. Bruk negativ, cut-off og positiv kontroll ved hver analysering for å validere analyseresultatene. 1. Etabler fordelings- og identifikasjonsplanen for kontroller og pasientprøver. 2. Klargjør fortynnet vaskeløsning (R2) [Se avsnitt 7.2]. 3. Ta bærebrettet og strimlene (R1) ut av beskyttelsesposen [Se avsnitt 7.2]. 4. Rekonstituer antigenflasken R6a ved å tilsette 8 ml av Diluent (R7). Blandes grundig. 5. Fortynn kontroller R3, R4, R5 og pasientprøver (S1, S2 ) i Diluent (R7) for å få en 1/101-fortynning: 10 µl prøve og 1,0 ml Diluent (R7). Vortex de fortynnede prøvene. 6. Klargjør konjugatarbeidsløsningen (R6): Fortynn nødvendig mengde Conjugate (R6b) med Diluent (R7) 1/51. Bland like mengder av reagensene rekonstituert R6a og R6b [Se avsnitt 7.2]. Konjugatarbeidsløsningen må klargjøres minst 45 minutter for den fordeles på platen. Blandes grundig. 7. Følg nøye angitt sekvens nedenfor, fordel med 200 µl fortynnede kontroller og pasientprøver: A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 8. Dekk mikrotiterplatene med en klebende folie og trykk den hardt ned på platen for å sikre tett forsegling. Inkuber mikrotiterplatene umiddelbart i et termostatkontrollert vannbad eller i en tørr inkubator 1 time ± 5 minutter ved 37 C ± 1 C. 9. Etter den første inkubasjonsperioden fjernes den klebelige plateforseglingen. Aspirer innholdet i alle brønnene i en beholder for smittefarlig avfall (med natriumhypokloritt). Vask mikrotiterplatene 4 ganger med 350 µl vaskeløsning (R2). Snu mikrotiterplatene og slå dem lett mot adsorberende papir for å fjerne gjenværende væske. 10. Fordel 200 µl konjugatarbeidsløsning (R6) i alle brønner. Løsningen må ristes forsiktig før bruk. 11. Dekk mikrotiterplatene med en klebende folie og trykk den hardt ned på platen for å sikre tett forsegling. Inkuber mikrotiterplatene umiddelbart i et termostatkontrollert vannbad eller i en tørr inkubator 1 time ± 5 minutter ved 37 C ± 1 C. 12. Etter den andre inkubasjonsperioden fjernes den klebelige plateforseglingen. Aspirer innholdet i alle brønnene i en beholder for smittefarlig avfall (med natriumhypokloritt). Vask mikrotiterplatene 4 ganger med 350 µl vaskeløsning (R2). Snu mikrotiterplatene og slå dem lett mot adsorberende papir for å fjerne gjenværende væske. 13. Fordel raskt 200 µl kromogenløsning (R9) i hver brønn og ikke i direkte lys. La reaksjonen utvikle seg 30 ± 5 minutter ved romtemperatur på et mørkt sted ( C). Ikke bruk klebende plateforsegling inder inkubasjonen. 14. Stopp enzymreaksjonen ved å tilsette 100 µl stoppløsning (R10) i hver brønn. Bruk samme rekkefølge og fordelingshastighet som for utviklingsløsningen. 15. Tørk platebunnen forsiktig. Les av optisk tetthet ved 450/620 nm med en plateleser innen 30 minutter etter at reaksjonen er stoppet. Strimlene må alltid holdes borte fra lys før de leses av. 16. Sjekk overensstemmelsen mellom avlesningen og fordelingsplanen for plate og prøver før resultatene rapporteres. 8 BEREGNING OG TOLKING AV RESULTATER 8.1 Beregning av cut-off-verdien (CO) Cut-off-verdien (CO) tilsvarer gjennomsnittsverdien for optisk tetthet (OD) for cut-off-kontrollparet (R4): CO = gjennomsnitt av OD R4 8.2 Bergning av prøveratio Prøveresultatene uttrykkers av ratio med følgende formel: Prøveratio = prøvens OD/CO

6 8.3 Kvalitetskontroll Inkluder alle kontrollene for hver mikrotiterplate og for hver analysering, og analyser de oppnådde resultatene. For validering av analysen må følgende kriterier tilfredsstilles: Verdier for optisk tetthet: - CO > 0,2-0,80 x CO < OD R4 Replikat 1 < 1,20 x CO - 0,80 x CO < OD R4 Replikat 2 < 1,20 x CO (OD for hver replikat av cut-off-kontrollen (R4) må ikke avvike mer enn 20 % av CO-verdien). Ratioer for optisk tetthet: - Ratio R3 (OD R3 / CO) < 0,5 - Ratio R5 (OD R5 / CO) > 2,0 Testen må gjentas dersom disse kravene til kvalitetskontroll ikke tilfredsstilles. 8.4 Tolking av resultater Prøveratio Resultat Tolkning Ratio < 0,80 Negativ 0,80 Ratio < 1,2 Usikker Ratio 1,2 Positiv Prøven betraktes som ikke-reaktiv for nærvær av IgMantistoffer mot Borrelia burgdorferi sensu lato. Prøven betraktes som usikker for nærvær av IgMantistoffer mot Borrelia burgdorferi sensu lato. Resultatet må bekreftes med en annen test utført på en annen prøve tatt minst 3 uker etter den første. Prøven betraktes som reaktiv for nærvær av IgMantistoffer mot Borrelia burgdorferi sensu lato. Hvis man forventer en infeksjon kan komplementære serologiske tester som påvisning av IgG anti-borrelia antistoffer være nyttig for å bekrefte diagnosen. Hvis serologien er positiv eller usikker, anbefales det å teste prøven med en bekreftelsesanalyse som Western-Blot (9). 8.5 Feilsøkingsguide Ikke validerte eller ikke repeterende reaksjoner kan forårsakes av: Utilstrekkelig vasking av mikrotiterplate. Kontaminering av negative prøver med serum eller plasma med høyere antistofftiter. Kontaminering av utviklingsløsningen av kjemisk oksiderende stoffer (blekemiddel, metall-ioner...). Kontaminering av stoppløsning. 8.6 Eksempel på beregning Obs! Følgende data er gitt som et eksempel og må ikke brukes i stedet for brukerens resultater. Kontroller og pasientprøver OD (450/620 nm) Ratio Resultat R3 0,155 0,22 Negativ R4 0,709 / / R4 0,697 / / R5 2,280 3,24 Positiv Prøve 1 1,181 1,67 Positiv Prøve 2, etc... 0,597 0,85 Positiv Cut-off-verdi: - CO = (0,709+0,697)/2 = 0,703 Verdier for optisk tetthet: - OD CO = 0,703 (N > 0,200) - OD R4 Replikat 1 = 0,709 (0,80 x OD CO < OD R4 Replikat 1 < 1,20 x OD CO) - OD R4 Replikat 2 = 0,697 (0,80 x OD CO < OD R4 Replikat 2 < 1,20 x OD CO) Ratioer for optisk tetthet: - Ratio R3 = 0,22 (N < 0,5) - Ratio R5 = 3,24 (N < 2,0) Kvalitetskontroll: Godkjent

7 9 YTELSER 9.1 Forekomst Bestemmelse av forekomst av IgM-antistoffer mot Borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum ble vurdert med et panel på 296 prøver oppnådd fra blodgivere fra nordlige Frankrike. Følgende resultater ble funnet: 286 negative, 8 usikkert og 2 positive sera. Forekomst med Platelia Lyme IgM-analysen etablert ved 0,68 % (2/296). 9.2 Spesifisitet Spesifisitet i ikke endemisk område Spesifisitet ble beregnet på et panel av 286 sera fra friske blodgivere i et ikke endemisk område i nordlige Frankrike. Prøver ble valgt etter negative resultater med en kommersiell EIA-analyse som brukes i Europa (CE-merket) og betraktes som referanse Spesifisitet i endemisk område Spesifisitet ble også bestemt på et panel med 197 sera fra friske blodgivere i endemisk område i det østlige Frankrike, og ingen av dem viste kriterier relatert til Lyme sykdom (ingen kliniske symptomer på borreliose, ikke kjente bitt av flått). Prøver ble valgt etter negative resultater med en kommersiell EIA-analyse som brukes i Europa (CE-merket) og betraktes som referanse. Oppnådde resultater er vist i tabellen nedenfor: Panel av sera Negativ Usikre (1) Positive (2) Spesifisitet Ikke endemisk område (n=286) (3) ,6 % (280/281) [98,0 %-] Endemisk område (n=197) ,0 % (191/193) [96,3 %-99,9 %] (1) Usikre resultater ble utelatt ved beregning av spesifisitet. (2) En av de tre positive prøvene med Platelia Lyme IgM-analysen ble også funnet positive av Western-blot. (3) IC 95 %: 95 % konfidensintervall. 9.3 Sensitivitet Sensitivitet for Platelia Lyme IgM-analysen ble beregnet og inkludert med sensitivitetsresultater fra Platelia Lyme IgGanalysen (Ref ) på et panel av 70 prøver fra pasienter med forskjellige former av Lyme sykdom i forskjellige kliniske faser. Resultatene vises i tabellen nedenfor og ble sammenlignet med sensitiviteter oppnådd med kommersielle EIA-analyser som brukes i Europa (CE-merket) og betraktes som referanse: Klinisk fase Antall sera Platelia Lyme (1) Referanse Europa (1) IgM IgG IgM + IgG IgM + IgG Migrerende erytem (Trinn I) 17 58,8 % [32,9 %-81,6%] 66,7 % [38,4 %-88,2%] 82,4 % [56,6 %-96,2%] 93,3 % [68,1 %-99,8%] Nevroborreliose (Trinn II) 33 36,7 % [19,9 %-56,1%] 96,9 % [83,4 %-99,9%] 96,9 % [83,4 %-99,9%] 97,0 % [84,2 %-99,9%] Kronisk atrofisk akrodermatitt (Trinn III) 5 20,0 % [0,05 %-71,6%] [54,9 %- [54,9 %- [54,9 %- Lyme artritt (Trinn III) 15 0,0 % [0,0 %-18,1%] [81,9 %- [81,9 %- [81,9 %- (1) Usikre resultater ble utelatt ved beregning av sensitivitet. Sensitivitet for Platelia Lyme IgM-analysen ble også vist på et dokumentert panel av prøver levert av CDC (Senter for sykdomskontroll), og ble sammenlignet med sensitivitet oppnådd med kommersielle EIA-analyser som brukes i Europa (CEmarked) og USA (FDA-godkjent) og betraktes som referanse. Resultater er vist i tabellen nedenfor:

8 Klinisk fase Migrerende erytem Antall sera 28 Platelia Lyme (1) Referanse Referanse Europa (1) USA (1) IgM IgG IgM + IgG IgM + IgG IgM + IgG 73,7 % [48,8 %- 90,9%] 38,5 % [20,2 %- 59,5%] 86,4 % [65,1 %- 97,1%] 70,4 % [49,8 %-86,3%] 87,0 % [66,4 %-97,2%] Artritt / Artralgi 6 40,0 % [5,3 %-85,3%] [60,7 %- [60,7 %- [60,7 %- [60,7 %- Ukjent fase 4 [0,05 %- [36,8 %- [47,3 %- [19,4 %-99,9%] [36,8 %- (1) Usikre resultater ble utelatt ved beregning av sensitivitet. 9.4 Presisjon Presisjon innen serie (repeterbarhet): For å evaluere repeterbarhet innen analysen ble en negativ og tre positive prøver testet 30 ganger innen samme serie. Ratioen (prøvens OD / CO) ble bestemt for hver prøve. Gjennomsnittelig ratio, standard avvik (SD) og variasjonskoeffisient (%CV) for hver av de fire prøvene er vist i tabellen nedenfor: Presisjon innen serie (repeterbarhet) N=30 Negativ prøve Svakt positiv prøve Positiv prøve Svært positiv prøve Ratio (prøvens OD / Cut-off-verdi) Gjennomsnittsverdi 0,24 1,17 1,88 4,23 SD 0,040 0,052 0,070 0,104 % CV 15,2 % 4,4 % 3,7 % 2,5 % Presisjon mellom serier (reproduserbarhet): For å evaluere reproduserbarheten mellom serier ble hver av de fire prøvene (en negative og tre positive prøver) testet i duplikat i to serier per dag over en periode på 20 dager. Ratioen (prøvens OD / CO) ble bestemt for hver prøve. Gjennomsnittelig ratio, standard avvik (SD) og variasjonskoeffisient (%CV) for hver av de fire prøvene er vist i tabellen nedenfor: Presisjon mellom serier (reproduserbarhet) N=80 Negativ prøve Svakt positiv prøve Positiv prøve Svært positiv prøve Ratio (prøvens OD / Cut-off-verdi) Gjennomsnittsverdi 0,24 1,21 1,76 4,18 SD 0,029 0,067 0,104 0,153 % CV 12,0 % 5,5 % 5,9 % 3,7 %

9 9.5 Kryssreaktivitet 338 prøver med egenskaper som potensielt kan fore til ikke-spesifikke reaksjoner ble testet med Platelia Lyme IgM-analysen. Resultater er vist i tabellen nedenfor: Panel Antall prøver Usikre (1) Positive Kryssreaktivitet % Syfilis ,2 % (2) CMV ,3 % (2) EBV ,4 % (3) Leptospirose ,3 % (3) Malaria ,0 % (3) Anti-nukleære antistoffer (ANA) ,0 % Heterofile antistoffer (HAMA) ,0 % Revmatoid faktor ,0 % HSV ,0 % Toksoplasmose ,6 % (2) Rubella ,0 % Meslinger ,0 % Kusma ,0 % HIV ,0 % VZV ,0 % TOTALT ,8 % (1) Usikre resultater ble utelatt ved beregning av kryssreaktivitet. (2) Ikke signifikant forskjellig fra forekomst i endemisk område (Fisher test, p>0,05). (3) Signifikant forskjellig fra forekomst i endemisk område (Fisher test, p>0,05). De 16 prøvene som var positive med Platelia Lyme IgM-analysen ble også testet med en kommersialisert EIA-analyse som brukes i Europa (CE-merket) og med en Western-Blot-metode. Resultater er vist i tabellen nedenfor: Prøve EIA Analyse Western blot (1) Prøve EIA Analyse Western blot (1) Syfilis Negativ Negativ Leptospirose Positiv Positiv CMV Negativ Negativ Malaria Usikker NT EBV Positiv Positiv Malaria Positiv NT EBV Positiv Negativ Malaria Usikker NT EBV Positiv Negativ Malaria Positiv NT EBV Positiv NT Malaria Negativ NT EBV Positiv Usikker Malaria Negativ NT Leptospirose Negativ Positiv Toksoplasmose Positiv Negativ (1) NT: Ikke testet grunnet utilstrekkelig prøvevolum.

10 10 BEGRENSNINGER VED PROSEDYREN Diagnosen Borrelia burgdorferi-infeksjon kan kun etableres på basis av en kombinasjon av kliniske og biologiske data. Resultatet av en enkelt test med påvisning av IgM anti-borrelia burgdorferi-antistoffer utgjør ikke et tilstrekkelig bevis for diagnosen infeksjon med Borrelia burgdorferi sensu lato. Hvis serologien er positiv eller usikker, anbefales det å teste prøven med en bekreftelsesanalyse som Western-Blot (9). Det har spesielt vært rapportert at pasienter med malaria eller pasienter infisert med Epstein Barr-virus eller andre spiroketearter (leptospirose, etc ) potensielt kan gi falske positive reaksjoner med diagnostiske analyser for antistoffer mot Borrelia burgdorferi. Disse situasjonene må man tenke over når man tolker resultatene fra slike tester. 11 KVALITETSKONTROLL AV PRODUSENTEN Alle produserte reagenser blir fremstilt i henhold til vårt kvalitetssystem som starter ved mottak av råmaterialer til kommersialisering av sluttproduktet. Hver lot sendes inn til kvalitetskontrollvurderinger og sendes kun ut på markedet etter at de er tilpasset forhåndsdefinerte godkjenningskriterier. Registreringene relatert til produksjon og kontroller for hver enkelt lot, beholdes av Bio-Rad. 12 REFERANSER 1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G Diagnosis of Lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Rev. 18: Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J.P Lyme disease a tickborne spirochetosis? Science. 216: Center for Disease Control and Prevention Lyme disease United States, Morb. Mortal. Wkly. Rep. 53: Hubalek, Z., Halouzka, J Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur. J. Epidemiol. 13: Reed, K. D Laboratory testing for Lyme disease: possibilities and practicalities. J. Clin. Microbiol. 40: Rudenko, N., Golovchenko, M., Grubhoffer, L Updates on Borrelia burgdorferi sensu lato complex with respect to public health. Ticks Tick Borne Dis. 2(3): Stanek, G., Strle, F Lyme borreliosis. Lancet. 362: Wang, G., Van Dam, A. P., Spanjaard, L., Dankert, J Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 12: Wilske, B Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis. 3:

11

12

13 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /10 Fax : +33 (0)