PNA ISH Detection Kit

Transkript

1 PNA ISH Detection Kit Kode nr. K utgave Til in situ-hybridisering ved bruk av fluorescein-konjugerte PNA-prøver. Settet inneholder reagenser til minst 40 tester*. * Antall tester basert på bruk av 25 µl av prøver og 150 µl av andre reagenser per objektglass. ( ) K5201/NO/JEN/ s. 1/8

2 Innhold Side Tiltenkt bruk...3 Prosedyreprinsipp...3 Reagenser A. Utstyr i denne pakken...3 B. Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger...4 C. Klargjøre reagenser...4 Forholdsregler...5 Oppbevaring...6 Endags in situ-hybridiseringsprosedyre for RNA-deteksjon ved bruk av PNA-prøver Rehydrering...7 Forhåndsbehandling...7 Hybridisering...7 Stringent Wash Solution...7 Deteksjon...7 Kontrastfarging og montering...7 Prosedyremerknader... 8 Symbolforklaring... 8 ( ) K5201/NO/JEN/ s. 2/8

3 Tiltenkt bruk Til in vitro-diagnostisk bruk. PNA ISH Detection Kit er ment for påvisning av fluorescein-konjugert peptidnukleinsyre (PNA)-prøver som hybridiseres til mål-rna i celle- eller vevspreparater. Prosedyreprinsipp Dette settet gir brukeren alle reagensene som er nødvendige til å utføre en in situ- hybridisering for å påvise cellulær RNA, unntatt for den spesifikke fluorescein-konjugerte PNA-prøven. På et vevssnitt eller celleutstryk (gitt av brukeren) hybridiseres en fluorescein-konjugert peptidnukleinsyre (PNA)-prøve til sitt RNA-mål etter den prosedyren som er gitt nedenfor. Hybridiseringen følges av en post-hybridiseringsvask med en Stringent Wash Solution ved 55 C i 25 minutter. Alkalisk fosfatase-konjugert F(ab ) Anti-FITC fra kanin tilføres, og prøven inkuberes ved romtemperatur i ca. 30 minutter fulgt av en vask. Bruken av antistoffets F(ab )-fragment sikrer at ikke-spesifikk binding til prøven holdes ved et minimum. Substrat (enzymsubstrat, BCIP/NBT) tilføres og prøven inkuberes ved romtemperatur i minutter, etterfulgt av en vask. En lett kontrastfarging med hematoksylin er frivillig. Tilslutt monteres prøven. Positiv farging gjenkjennes under mikroskopet som en mørk blå/svart farge ved hybridiseringspunktet. Reagenser A. Utstyr i denne pakken Flaske 1 (2 ml) Flaske 2 (0,5 ml) Flaske 3 (0,5 ml) Flaske 4 (25 ml) Proteinase K (x 10) 10 x konsentrert proteinase K i 50 mmol/l Tris/HCl, 15 mmol/l natriumazide, ph 7,5. Siden proteinase K er selvnedbrytende, er det viktig å lagre flaske 1 ved 2 8 C. Negative Control PNA Probe/FITC (bruksklar) Fluorescein-konjugerte vilkårlige PNA-prøver i hybridiseringsløsning. Inneholder 30 % formamid. Positive Control PNA Probe/FITC (bruksklar) Fluorescein-konjugert PNA-prøve rettet mot glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenase i hybridiseringsløsning. Inneholder 30 % formamid. Stringent Wash Solution (x 60) 60 x konsentrert Stringent Wash Solution. Flaske 5 (6 ml) ( ) K5201/NO/JEN/ s. 3/8

4 Anti-FITC/AP (bruksklar) Alkalisk fosfatase-konjugert antistoff for fluorescein (affinitets-isolert kanin F(ab )) i 50 mmol/l Tris buffer, 5 mmol/l MgCl 2, 0,25 mmol/l ZnCl 2, 3 % BSA, stabilisator, konserveringsmiddel, ph 7,5. Flaske 6 (6 ml) Substrate (bruksklar) 5-bromo-4-kloro-3-indolylfosfat (BCIP) og nitroblå tetrazolium (NBT) i 100 mmol/l Tris, 100 mmol/l NaCl, 50 mmol/l MgCl 2, konserveringsmiddel, ph 9,0. Inneholder 1,7 % N,N-dimetylformamid. TBS (Tris-Buffered Saline, ph 7,5) 3 foliepakninger hver for 1 l buffer, ph 7,5. Hver pakning inneholder Tris-Base 1,4 g ±4 %, Tris/HCl 6,0 g ±4 %, 8,75 g NaCl ±4 %. Løs opp innholdet i hver foliepakning i 1 l rent vann. B. Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger 1. Generelt laboratorieutstyr for histologiske prosedyrer. 2. Utstyr og spesifikk fluorescein-konjugert PNA-prøve som er nødvendig for hybridiseringstrinnet. 3. Vannbad justert til 55 C. Risteevne er nødvend ig for strengvasken. 4. Dako Silanized Slides, kodenr. S Dako Pen, kode nr. S2002 (ekstrautstyr). 6. Rent vann (f.eks. Milli-Q vann eller destillert vann). 7. Monteringsmedium, Dako Faramount, kode nr. S3025 eller Dako Glycergel, kode nr. C0563. C. Klargjøre reagenser TBS Buffer Løs opp innholdet til én TBS foliepakning i 1l rent vann. Stringent Wash Solution (arbeidsløsning) Fortynn nødvendig mengde Stringent Wash Solution, flaske 4, 60 ganger i rent vann og forhåndsoppvarm til 55 C i vannbad. Proteinase K (arbeidsløsning) Rett før bruk fortynnes nødvendig mengde Proteinase K, flaske 1, 1:10 i TBS. Straks etter bruk returneres flaske 1 til 2 8 C. (Se prosedyremerknader, 3). ( ) K5201/NO/JEN/ s. 4/8

5 Forholdsregler 1. For profesjonelle brukere. 2. Flaske 2 og 3, Positive og Negative Control PNA Probes, inneholder 30 % formamid og er merket: Giftig. R61 Kan gi fosterskade. S45 Ved uhell eller illebefinnende er omgående legebehandling nødvendig; vis etiketten om mulig). S53 Unngå direkte kontakt innhent spesielle opplysninger før bruk. S60 Dette kjemikaliet og dets emballasje skal behandles som spesial avfall. Som hovedregel har personer under 18 år ikke tillatelse til å arbeide med dette produktet. Brukerne må instrueres nøye i riktig arbeidsprosedyre, de farlige egenskapene til produktet og de nødvendige sikkerhetsinstruksjonene. Vennligst se databladet for materialsikkerhet (MSDS) for ytterligere informasjon. 3. Flaske 6, Substratet, inneholder 1,7 % N,N-dimetylformamid og er merket: Giftig. R61 Kan gi fosterskade. S45 Ved uhell eller illebefinnende er omgående legebehandling nødvendig; vis etiketten om mulig). S53 Unngå direkte kontakt innhent spesielle opplysninger før bruk. S60 Dette kjemikaliet og dets emballasje skal behandles som spesial avfall. Som hovedregel har personer under 18 år ikke tillatelse til å arbeide med dette produktet. Brukerne må instrueres nøye i riktig arbeidsprosedyre, de farlige egenskapene til produktet og de nødvendige sikkerhetsinstruksjonene. Vennligst se databladet for materialsikkerhet (MSDS) for ytterligere informasjon. 4. Foliepakninger av TBS (Tris-Buffered-Saline, ph 7,5) inneholder 2-amino-2-(hydroksymetyl) propan-1,3-diol hydroklorid og er merket: Skadelig. R22 Farlig ved svelging. R36/37/38 Irriterer øynene, luftveiene og huden. S60 Dette kjemikaliet og dets emballasje skal behandles som spesial avfall. Vennligst se databladet for materialsikkerhet (MSDS) for ytterligere informasjon. Når innholdet av en foliepakning er oppløst i vann, gjelder ikke lenger faremerkingen. 5. Flaske 4, Stringent Wash Solution, inneholder 3,6 % Trometamol. Ved ulike produktkonsentrasjoner krever ikke Trometamol faremerking. Databladet for materialsikkerhet (MSDS) er tilgjengelige for profesjonelle brukere på forespørsel. 6. Flaskene 1 og 5, Proteinase K og Anti-FITC/AP, inneholder natriumazid som konserveringsmiddel. Natriumazid (NaN 3 ) er en kjemikalie som er svært giftig i ren form. Selv om produktkonsentrasjonene ikke klassifiseres som farlige ved, kan natriumazid reagere med bly- og kopperrør og danne høyeksplosive avleiringer av metallazider. Ved avfallsbehandling, skyll rikelig med vann for å forhindre ansamling av metallazid i rørene. 7. Flaske 5, Anti-FITC/AP inneholder materialer med dyreopprinnelse. Riktig håndteringsprosedyrer bør brukes i likhet med alle andre produkter derivert fra biologiske kilder. ( ) K5201/NO/JEN/ s. 5/8

6 Oppbevaring Reagensene i settet bør lagres ved 2 8 C. Flaskene 2 og 3 skal lagres mørkt. Skal ikke benyttes etter utløpsdato som er stemplet på flasken. Hvis reagensene oppbevares under andre forhold enn de som er spesifisert, må forholdene verifiseres av brukeren. Det er ingen tydelige tegn som indikerer at dette produktet er ustabilt. Positive og negative kontroller bør derfor kjøres samtidig med pasientprøver. Hvis det observeres uventet farging som ikke kan forklares med variasjoner i laboratorieprosedyrer, og det er mistanke om at det er et problem med produktet, ta kontakt med vår tekniske avdeling. Siden proteinase K er selvnedbrytende, er det viktig å lagre flaske 1 ved 2 8 C og å minimere eksponeringen til romtemperatur. Endags in situ-hybridiseringsprosedyre for RNA-deteksjon ved bruk av PNA-prøver Prosedyren har blitt utviklet for formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnitt. Reagenser inkludert i dette settet, samt hybridiserings- og vaskeforhold, har blitt justert for å gi optimale resultater ved bruk av Dako fluorescein-konjugerte PNA-prøver. En positiv vevskontroll skal kjøres samtidig med prøvene. MERK: Alle inkubasjoner er ved romtemperatur hvor annet ikke er oppgitt. ( ) K5201/NO/JEN/ s. 6/8

7 Rehydrering Forhåndsbehandling Hybridisering Stringent Wash Deteksjon Kontrastfarging og montering Neddykk objektglassene med vevssnittene i xylen. Neddykk i 99 % etanol. Neddykk i 96 % etanol. Karet må være RNase-fritt (se prosedyremerknader, 1). Sirkle inn prøven med Dako Pen, kodenr. S2002. Neddykk i rent vann. Plasser objektglassene i et fuktighetskammer (bruk rene hansker). Rett før bruk fortynnes nødvendig mengde med Proteinase K, flaske nr. 1, 1:10 i TBS, f.eks. ved bruk av 11 dråper fra flaske nr. 1 (eller 500 µl) i 4,5 ml TBS (se prosedyremerknader, 2). Tilfør 150 µl fortynnet Proteinase K til hvert snitt (se prosedyremerknader, 3). Straks etter bruk, returnes flaske 1 til 2 8 C. Inkuber. Neddykk objektglassene i rent vann. Neddykk objektglassene i 96 % etanol. Lufttørk objektglassene Tilfør 1-2 dråper med fluorescein-konjugert PNA-prøve til vevssnittet. Legg til kontrollprøver på separate snitt, flaskenr. 2 og 3. Dekk til snittene med dekkglass. Plasser objektglassene i et fuktighetskammer (for å unngå uttørking av snittene). Plasser fuktighetskammeret i en inkubator (se prosedyremerknader, 4). Forhåndsoppvarm Stringent Wash Solution (flaskenr. 4 fortynnet 1:60) til 55 C i vannbad. Fjern dekkglassene. Neddykk objektglassene i forhåndsoppvarmet Stringent Wash Solution. Tilpass objektglassene til romtemperatur gjennom en hurtig neddykking i TBS. Plasser objektglassene i et fuktighetskammer. Tilfør 2 3 dråper av Anti-FITC/AP, flaskenr. 5, til hvert snitt. Inkuber. Bank forsiktig bort antistoffet. Neddykk objektglassene i TBS. Neddykk objektglassene i rent vann. Plasser objektglassene i et fuktighetskammer. Tilfør 2 5 dråper substrat, flaske 6 til hvert snitt (se prosedyremerknader, 5). Inkuber. Bank forsiktig bort Substrate. Neddykk objektglassene i vann fra springen. Kontrastfarging med hematoksylin hvis det er ønskelig. Monter i Dako Faramount, kodenr. S3025 eller Glycergel, kodenr. C x 5 min. 3 min min. ~ 10 s ~ 5 min. 1½ t ved 55 C 25 min. ved 55 C med risting 10 s 30 min. 2 x 1 min min. 5 min s ( ) K5201/NO/JEN/ s. 7/8

8 Prosedyremerknader 1. Fra dette punktet i prosedyren og inntil hybridiseringen er utført, er det viktig å unngå forurensning av snittene med RNaser, og objektglassene skal kun berøres med rene engangshansker. Glasstøy kan gjøres Rnase-fri ved inkubasjon over natten ved 200 C. Andre metoder for inaktivering av RNase i løsninger beskrives i Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (se også under Forholdsregler). 2. Løs opp innholdet til én TBS foliepakning i 1 L rent vann (RNase-fritt). 3. Siden proteinase K er selvnedbrytende, er det viktig å lagre flaske 1 ved 2 8 C og å minimere eksponeringen til romtemperatur. Optimal proteolytisk fordøyelse kan variere mellom de ulike vevsblokkene. For frosne snitt og cytospin skal Proteinase K fortynnes mer enn 1:10; som retningslinje fortynn 1:100 1:1000, avhengig av fikseringen. 4. Vi finner at en inkuberingstid på 1½ time gir optimal følsomhet, men tilfredsstillende resultater kan likevel oppnås ved å redusere inkubasjonstiden til min., avhengig av mengden mål som er tilstede i prøven. 5. Vi finner at Substrate (BCIP/NBT), som er inkludert i PNA ISH Detection Kit, gir høyeste sensitivitet, men også Dako New Fuchsin (kodenr. K0625) gir svært tilfredsstillende resultater. 6. Ikke rist flaske 6 før bruk. Substratet danner av og til et presipitat som kan påvirke fargingsresultatene hvis løsningen ristes. Symbolforklaring Katalognummer Temperaturbegrensning Lotnummer Produsent In vitro diagnostisk medisinsk utstyr Skal ikke oppbevares i sollys (se avsnittet om oppbevaring) Tilsett vann Skadelig Se bruksanvisningen Inneholder tilstrekkelig for <n> tester Brukes innen Giftig Produsert av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tlf Faks ( ) K5201/NO/JEN/ s. 8/8