PLATELIA ASPERGILLUS Ag 96 TESTER 62794

Transkript

1 PLATELIA ASPERGILLUS Ag 96 TESTER Platelia Aspergillus Ag er en immunoenzymatisk sandwich-mikroplateanalyse for påvisning av Aspergillus galaktomannan-antigen i serum og bronkoalveolær skyllevæske (BAL). Innhold 1. BEREGNET BRUK 2. INDIKASJONER FOR BRUK 3. SAMMENDRAG OG FORKLARING 4. PROSEDYREPRINSIPP 5. REAGENSER 6. BRUKERADVARSLER 7. BRUKERFORHOLDSREGLER 8. KLARGJØRING OG OPPBEVARING AV REAGENSER 9. PRØVETAKING 1. PROSEDYRE 11. KVALITETSKONTROLL (GYLDIGHETSKRITERIER) 12. TOLKNING AV RESULTATER 13. PROSEDYRENS BEGRENSNINGER 14. FORVENTEDE VERDIER 15. SPESIELLE YTELSESEGENSKAPER 16. LITTERATURFORTEGNELSE 1

2 1- TILTENKT BRUK Platelia Aspergillus Ag er en immunoenzymatisk sandwich-mikroplateanalyse for påvisning av Aspergillus galaktomannanantigen i serumprøver fra voksne og barn og i prøver av bronkoalveolær skyllevæske (BAL). Platelia Aspergillus Ag er en test som, når den benyttes sammen med andre diagnostiske prosedyrer, f.eks. mikrobiologisk kultur, histologisk undersøkelse av biopsiprøver og radiografisk dokumentasjon, kan benyttes som et hjelpemiddel ved diagnose av invasiv aspergillose. 2- INDIKASJONER FOR BRUK Platelia Aspergillus Ag er en immunoenzymatisk sandwich-mikroplateanalyse for påvisning av Aspergillus galaktomannanantigen i serumprøver fra voksne og barn og i prøver av bronkoalveolær skyllevæske (BAL). Platelia Aspergillus Ag er en test som, når den benyttes sammen med andre diagnostiske prosedyrer, f.eks. mikrobiologisk kultur, histologisk undersøkelse av biopsiprøver og radiografisk dokumentasjon, kan benyttes som et hjelpemiddel ved diagnose av invasiv aspergillose. 3- SAMMENDRAG OG FORKLARING Aspergillus-infeksjoner starter vanligvis i lungene som inngangsport etter inhalering av Aspergillus-sporer som er tilstede i miljøet. Invasive former, som har økt de siste 1 årene, utgjør de mest alvorlige infeksjonene. De forekommer hovedsakelig hos nøytropene pasienter (etter kreftbehandling) og hos pasienter som har blitt behandlet med immunsuppressive midler (organtransplantasjoner, spesielt benmargtransplantasjon) og kortikosteroider 1. Aspergillus er sjelden isolert fra blodkultur. Diagnosen er ofte basert på uspesifikk diagnostisk eller radiologisk dokumentasjon (kliniske symptomer, CT-skanning, brystrøntgen etc.) Testen for løselig galaktomannan-antigen i serum synes å være en serologisk metode som er i stand til å hjelpe ved diagnose av invasiv aspergillose 9, 12, 23, 54, 62. I tillegg har påvisning av galaktomannan-antigen i bronkoalveolær skyllevæske (BAL) for mottakere av faste organtransplantater vist seg å være fordelaktig for diagnostisering av invasiv aspergillose hos denne pasientgruppen 8,17, PROSEDYREPRINSIPP Platelia Aspergillus Ag er en ett-trinns immunoenzymatisk sandwich-mikroplateanalyse som påviser galaktomannan i humant serum og BAL-væske. Analysen benytter EBA-2 monoklonale antistoffer fra rotte, som rettes mot Aspergillus galaktomannan, og den har blitt beskrevet i tidligere studier 25, 46. De monoklonale antistoffene brukes til å (1) belegge brønnene i mikroplaten og binde antigenet og (2) påvise antigenet bundet til den sensibiliserte mikroplaten (konjugatreagens: peroksidase-koblede monoklonale antistoffer). Prøver av serum eller BAL-væske blir varmebehandlet i nærvær av EDTA for å dissosiere immunkomplekser og felle ut proteiner som muligens kan forstyrre testen 24. De behandlede prøvene og konjugatet tilsettes brønnene belagt med monoklonale antistoffer og blir inkubert. Et monoklonalt antistoff galaktomannan monoklonalt antistoff / peroksydasekompleks dannes i nærvær av galaktomannan-antigen. Strimlene vaskes for å fjerne ubundet materiale. Deretter blir substratløsningen tilsatt, som vil reagere med kompleksene som er bundet til brønnen og danner en blåfarget reaksjon. Enzymreaksjonen stoppes ved å tilsette syre, som endrer blåfargen til gul. Absorbansen (optisk densitet) på prøver og kontroller bestemmes med et spektrofotometer innstilt på 45 og 62/63 nm bølgelengde. 5- REAGENSER Platelia Aspergillus Ag: Produktnr (96 tester) Oppbevar kitet ved 2-8 C. Bring alle reagenser til romtemperatur (18-25 C) i minst 3 minutter før bruk. Bring alle reagenser tilbake til 2-8 C umiddelbart etter bruk. Legg ubrukte strimler/plater i posene og forsegl på nytt. Desikkant må ikke fjernes. Etter fortynning kan vaskeløsningen oppbevares i 14 dager ved 2-3 C. Alle andre reagenser unntatt konsentrert vaskeløsning (R2) og stoppløsning (R1) må brukes innen 8 uker etter åpning. Den konsentrerte vaskeløsningen (R2) og stoppløsningen (R1) er stabile inntil utløpsdato etter åpning. Reagenser leveres i tilstrekkelig mengde til å utføre 96 tester i maksimalt 9 batcher. R1 R2 Komponent Innhold Mengde Mikroplate: - 96 brønner (12 strimler á 8 brønner) belagt med antigalaktomannan monoklonale antistoffer 12 x 8 brønner 1 Plate / Microwell Strip Plate - Strimmeletiketter merket "85" Konsentrert vaskeløsning (2x): Concentrated Washing Solution - Tris NaCl buffer 1 x 7 ml - 2 % Tween 2 - Konserveringsmiddel: < 1,5 % ProClin 3 2

3 R3 R4 R5 R6 R7 R9 Negative Control Serum Cut-off Control Serum Positive Control Serum Conjugate Sample Treatment Solution Chromogen:TMB Solution Negativ kontroll-serum: - Humant negativt serum - Negativt for anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti- HCV-antistoffer og HBs Ag - Konserveringsmiddel: < 1,5 % ProClin 3 Cut-off kontrollserum: - Humant serum som inneholder galaktomannan - Negativt for anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv-antistoffer og HBsAg - Konserveringsmiddel: < 1,5 % ProClin 3 Positiv kontroll-serum: - Humant serum som inneholder galaktomannan - Negativt for anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv-antistoffer og HBsAg - Konserveringsmiddel: < 1,5 % ProClin 3 Konjugat (klar til bruk): - Anti-galaktomannan monoklonalt antistoff / peroksidase merket - Konserveringsmiddel: < 1,5 % ProClin 3 Prøvebehandlingsløsning (klar til bruk): - EDTA-syreløsning Kromogen TMB-løsning (klar til bruk): - 3,3,5,5 -Tetrametylbenzidin (<,1 %) - H 2 O 2 (<1, %) Stoppløsning (klar til bruk): 2 x 1,7 ml 2 x 1,7 ml 2 x 1,7 ml 1 x 8 ml 1 x 13 ml 1 x 28 ml Stopping R1 1 x 28 ml Solution - 1 N svovelsyre (H 2 SO 4 ) Plateforseglere - Limark til mikroplater 1 x 8 ark Merknad: TMB (3, 3', 5, 5' tetrametylbenzidin) er et ikke-karsinogent og ikke-mutagent kromogen til peroksidase. 6- BRUKERADVARSLER 1. Kun til in vitro diagnostisk bruk. 2. Kun til profesjonell bruk. 3. Bruk av dette kit til annet enn humant serum og BAL-væsker anbefales ikke. 4. Positiv kontroll, cut-off kontroll og negativ kontroll er produsert av humant serum som har blitt testet og funnet ikke-reaktivt for HBsAg og antistoffer mot HIV-1, HIV-2 og HCV med CE-merkede tester. Alle reagenser skal imidlertid behandles som om de kan overføre smitte. Alle tester må gjennomføres i samsvar med OSHA-standarden om blodbaserte patogener og biosikkerhetsnivå 2 eller andre egnede biosikkerhetstiltak. 5. Bruk verneklær, inkludert laboratoriefrakk, øye-/ansiktsbeskyttelse og engangshansker (syntetiske, lateksfrie hansker anbefales) og håndter kitreagensene og pasientprøver med foreskrevne gode laboratorieprosedyrer. Vask hendene grundig etter at testen er utført. 6. Må ikke pipetteres med munnen. 7. Ikke røyk, drikk eller spis på steder der prøver eller kitreagenser i håndteres. 8. Unngå å søle prøver eller løsninger. 9. Biologisk søl, som ikke inneholder syre, må tørkes opp grundig med et effektivt desinfeksjonsmiddel. Desinfeksjonsmidler som kan brukes er (men ikke begrenset til) en løsning av 1 % blekemiddel (,5 % løsning av natriumhypokloritt, 7 % etanol eller,5 % Wescodyne Plus. Materialer som brukes til å tørke opp søl kan kreve avfallsbehandling som avfall med mikrobiologisk risiko. FORSIKTIG: Plasser ikke løsninger som inneholder blekemiddel, i autoklav. 1. Søl som inneholdende syre må absorberes på en hensiktsmessig måte (tørkes opp) eller nøytraliseres med natriumbikarbonat, og området må skylles og tørkes tørt, hvis det inneholder materialer med mikrobiologisk risiko, og tørk av området med et av de kjemiske desinfeksjonsmidlene. 11. Kast alle prøver og materiell som ble brukt til å utføre testen, som om de inneholder en smittebærer. Laboratoriekjemikalier eller biologisk avfall må håndteres og avfallsbehandles i henhold til alle lokale, regionale og nasjonale forskrifter. 12. FORSIKTIG: Følgende er en liste over potensielle kjemiske farer som finnes i enkelte kitkomponenter (se punkt 5 - REAGENSER): Xi Irriterende FORSIKTIG: Ifølge krav i forskrifter i EU og USA inneholder enkelte reagenser ProClin TM 3 < 1,5 %. R43* : Kan gi allergi ved hudkontakt S *: Unngå innånding av damp/sprøytetåke. Unngå hudkontakt. Bruk egnede vernehansker. Materialet og dets beholder må behandles som farlig avfall. * Risiko- (R) og sikkerhetssetninger (S) (21/59/EU) som formidler spesifikk informasjon om et farlig preparat. 3

4 C-Etsende Ifølge krav i forskrifter i USA virker 1.N svovelsyre (H 2 SO 4 ) stoppløsning svært irriterende eller etsende på hud og øyne, avhengig av mengden og lengden på eksponeringen. Større eksponering kan gi øyeskader, inkludert permanent nedsatt syn. Ved kontakt med øynene, må de skylles straks med store mengder vann og lege kontaktes. Holdes borte fra sterke baser og reduksjonsmidler, hell ikke vann eller blekemiddel i denne komponenten. Avfall fra dette materialet betraktes som farlig, syreholdig avfall, men dersom det er tillatt i lokal, regional, nasjonal og internasjonale forskrifter, kan det nøytraliseres til ph 6-8 slik at det kan avfallsbehandles som ufarlig avfall, hvis man har fått opplæring og har utstyr til å gjøre det. 13. Sikkerhetsdatablad (MSDS) er tilgjengelig på forespørsel eller på 7- FORHOLDSREGLER FOR BRUKERE 1. DYPFRYST SERUM ELLER BAL-VÆSKEPRØVER LAGRET UNDER UKJENTE FORHOLD KAN GI FALSKE POSITIVE RESULTATER PÅ GRUNN AV FORURENSNING MED SOPP OG/ELLER BAKTERIER. 2. Bruk ikke kitet eller noen kitreagenser etter den angitte utløpsdatoen. 3. Bland ikke reagenser fra andre kit som har forskjellige lotnumre, med unntak av vaskeløsningen (R2, identifikasjon*: 2x farget grønn), kromogenet (R9, identifikasjon *: TMB farget turkis) og stoppløsningen (R1, identifikasjon*: 1N farget rød), forutsatt at disse reagensene er fullstendig tilsvarende og det samme partinummeret brukes i en gitt testkjøring. * på hetteglassetiketten MERKNAD: Vaskeløsningen (R2, identifisert* i grønt som 2x) kan ikke blandes med vaskeløsningen (R2, identifisert* i blått som 1x) som følger med i Bio-Rads reagenskit. * på ampulleetiketten 4. Bring alle reagenser til romtemperatur i minst 3 minutter før bruk. 5. Bland alle reagenser grundig før bruk. 6. Bland grundig den konsentrerte vaskeløsningen (R2) før du klargjør vaskeløsningen som skal benyttes og utvis forsiktighet for å forebygge mikrobiell forurensning. 7. Ikke utfør testen i nærvær av reaktive damper (syre, alkaliske stoffer, aldehyder) eller støv som kan påvirke enzymaktiviteten til konjugatet. 8. Til manuell pipettering av kontroller og prøvetaking må du bruke individuelle pipettespisser for å hindre overføring av prøver. 9. For å sikre at brønnene er tilstrekkelig rene, må anbefalt antall vaskesykluser utføres og man må sørge for at alle brønnene fylles helt opp og deretter tømmes helt. Vasking må ikke utføres manuelt. 1. La ikke mikroplaten tørke mellom slutten av vaskesyklusen og tilsetning av reagenser. 11. Bruk ikke samme beholder til konjugatet og den kromogene TMB-løsningen. 12. Tillat ikke at konjugat eller kromogen TMB-løsning kommer i kontakt med metall eller metallioner. 13. Unngå å eksponere den kromogene TMB-løsningen for sterkt lys under oppbevaring eller inkubering. La ikke de kromogene løsningene komme i kontakt med oksideringsmidler. 14. Unngå kontakt mellom stoppløsningen og eventuelle oksideringsmidler. Tillat ikke at stoppløsningen kommer i kontakt med metall eller metallioner. 15. Bruk rene, støvfrie materialer (rør, spisser, beholdere etc.) for å redusere muligheten for forurensning med Aspergillussporer fra omgivelsene. Fordi galaktomannan er varmestabil, garanterer ikke sterilisering av materialet som brukes, fravær av forurensende antigen. Pyrogenfrie materialer er optimalt, men standardmaterialer kan brukes med tilstrekkelige forholdsregler. 16. Begrens eksponering av løsninger (serumer, BAL-væske, prøvebehandlingsløsning, konjugat) eller åpne beholdere (plater, rør, pipetter) for luft. 17. Hell ikke eventuelt ubrukt konjugat tilbake i originalbeholderen. 18. Den kromogene TMB-løsningen skal være fargeløs. Utseende med en blåfarge etter fortynning indikerer at reagensen er forurenset, og den må i så fall ikke brukes. 8- KLARGJØRING OG OPPBEVARING AV REAGENSER Mikrobrønnstrimmelplate (R1) Hver ramme bestående av 12 strimler pakket i en pose. Klipp opp posen med saks rett under skjøten. Åpne posen og ta ut rammen. Legg rammen med de ubrukte strimlene tilbake i originalposen. Forsegl posen igjen forsiktig og oppbevar den ved +2-8 C. Etter at den vakuumpakkede posen har blitt åpnet, er remser som oppbevares ved +2-8 C i den godt forseglede originalposen stabile i åtte uker. Kontroller at dessikanten fremdeles ligger i posen. Vaskeløsning (R2) Klargjør vaskeløsningen som skal brukes, etter behov ved å tilsette én del konsentrert vaskeløsning (R2) til 19 deler avionisert eller destillert vann. Vaskeløsningen som skal brukes, kan oppbevares i 14 dager ved 2-3 C. Klargjør en tilstrekkelig mengde vaskeløsning til å utføre kjøringen (8 ml til en strimmel: 4 ml R ml destillert vann). Etter åpning oppbevares den konsentrerte vaskeløsningen ved 2-3 o C, og i fravær av forurensning er den stabil frem til utløpsdatoen som er angitt på etiketten. 4

5 Negativ kontroll-serum (R3), cut off kontroll-serum (R4) og positiv kontroll-serum (R5) Kontrollene må varmebehandles med prøvebehandlingsløsning (R7) som pasientprøver, som også fungere som en overvåking av behandlingen. Etter åpning er disse reagensene stabile i åtte uker hvis de oppbevares ved +2-8 C og ikke blir forurenset. Konjugat (R6), prøvebehandlingsløsning (R7), kromogen: TMB-løsning (R9) Disse reagensene er klare til bruk. Etter åpning er reagensene stabile i åtte uker hvis de oppbevares ved +2-8 C og ikke blir forurenset. Stoppløsning (R1): Denne reagensen er klar til bruk. Etter at denne reagensen åpnes, er den stabil til utløpsdatoen på etiketten hvis den oppbevares ved +2-8 C, forutsatt at den ikke blir forurenset. 9- PRØVEINNSAMLING Denne testen utføres på serum eller BAL-væske. I. SERUM Ta blodprøver i henhold til standard laboratorieprosedyrer. Serumprøver må ikke være kontaminert med soppsporer og/eller bakterier. Transporter og oppbevar prøvene i forseglede rør, ueksponert for luft. Uåpnede prøver kan oppbevares ved 2-8 C i inntil 5 dager før testing. Etter første åpning kan prøvene oppbevares ved 2-8 C i 48 timer før testing. For lengre tids oppbevaring må serumet oppbevares ved -7 C. Serumprøver kan utsettes for maksimalt 4 fryse-/tinesykluser. Etter tining må tidligere dypfryste prøver blandes godt før testing. Resultatene blir ikke påvirket av prøver som inneholder 2 mg/l bilirubin, lipemiske prøver som inneholder tilsvarende 2 g/l triolein (triglyserid) eller hemolyserte prøver som inneholder 5 mg/dl hemoglobin. Forstyrrelser knyttet til for stor mengde albumin har ikke blitt testet. Ikke dekomplementer serumer. II. BAL-VÆSKE Samle inn BAL-væskeprøver i henhold til standard laboratorieprosedyrer. BAL-væskeprøver må samles i steril saltløsning og kan testes på rene prøver (som de er) eller supernatanter fra sentrifugerte prøver (1 o/min i 1 min) før man fortsetter å behandle prøven iht. punkt 1. BAL-væskeprøver må ikke være kontaminert med soppsporer og/eller bakterier. Transporter og oppbevar prøvene i forseglede rør, ueksponert for luft. Det anbefales å oppbevare BAL-prøvene ved 2-8 o C i kjøleskapet snarest mulig etter innsamlingen. Etter første åpning kan prøvene oppbevares ved 2-8 o C i inntil 24 timer. For lengre tids oppbevaring kan BAL-prøvene dypfryses (-2 C eller lavere) i inntil 5 måneder. BAL-prøver kan utsettes for maksimalt 4 fryse-/tinesykluser. Etter tining må tidligere dypfryste prøver blandes godt før testing. 1- PROSEDYRE Materialer som følger med Se punktet om REAGENSER. Materialer som er påkrevet men ikke følger med 1. Destillert eller avionisert vann til fortynning av den konsentrert vaskeløsningen. 2. Absorberende papir. 3. Engangshansker. 4. Vernebriller. 5. Natriumhypokloritt (blekemiddel) og natriumbikarbonat. 6. Pipetter eller multipipetter, justerbare eller faste, til å måle og dispensere 5 µl, 1 µl, 3 µl og 1 µl. 7. 1,5 ml mikrosentrifugerør av polypropylen med lufttette propper, som er i stand til å tåle oppvarming til 12 C (varmeblokk) eller 1 C (kokende vannbad). Skrulokk og rør: 1,5 ml koniske rør, Bio-Rad kat. nr eller tilsvarende. ELLER EZ mikroreagensrør, 1,5 ml, Bio-Rad kat. nr eller tilsvarende. Korklåser til mikroreagensrør (i USA: Fischer Scientific kat. nr. NC ) eller tilsvarende, utenfor USA: VWR kat. nr eller tilsvarende). Disse låsene forsegler rørene sikkert ved å hindre at lokkene åpnes under temperaturog trykkendringer og tillate også at rørene kan løftes ut enkelt av varmeblokken eller det kokende vannbadet. 8. Laboratoriebenksentrifuge til 1,5 ml polypropylenrør som kan hente 1 g (Brinkman kat. nr eller VWR kat. nr eller tilsvarende). 5

6 9. Hvis varmeblokk brukes til behandlingen av serumene/bal-væsken: Varmeblokk. Følgende varmeblokkmodeller anbefales: Enkeltblokkmodell: Grant kat. nr. QBD-1L utenfor USA: Grant kat. nr. QBD1, distribuert av VWR under kat. nr ) Toblokkmodell: Grant kat. nr. QBD-2L utenfor USA: Grant kat. nr. QBD2, distribuert av VWR under kat. nr ) Blokk til varmeblokker: begge varmeblokker (QBD-1L, QBD1 og QBD-2L, QBD2) må brukes sammen med Grantblokk kat. nr. QB-E1, distribuert utenfor USA av VWR under kat. nr Hvis kokende vannbad brukes til behandlingen av serumene/bal-væsken: Rund, flytende mikrosentrifugestativ til et 1 l begerglass (i USA: VWR Scientific kat. nr eller Nalgene kat. nr eller tilsvarende). Kokende vannbad ved 1 C. 1. Virvelblandemaskin. 11. Mikroplateinkubator ved 37 ± 1 C. 12. Halvautomatisk eller automatisk mikroplatevasker. 13. Mikroplateleser utstyrt med filtre på 45 nm og 62/63 nm. Prosedyrekommentarer Negative, positive og cut-off kontroller må testes på hver kjøring for å validere testresultatene. Behandling av serumer/bal-væske Kontroll på alle serumer: negativ (R3), cut-off (R4) og positiv (R5) må behandles samtidig som serum-/bal-væskeprøver: 1. Pipetter 3 µl av hvert testserum / hver BAL-væske og kontroll i individuelle 1,5 ml polypropylenrør. 2. Tilsett 1 µl med prøvebehandlingsløsning (R7) i hvert rør. 3. Bland rørene grundig ved hjelp av kraftig blanding eller sentrifugering for å blande godt. Lukk røret tett for å hindre åpning under oppvarming, 4. Varmeblokkalternativ Varm rørene i 6 minutter i en varmeblokk ved 12 C. Rørene må kun plasseres i blokken når den foreskrevne temperaturen er nådd (*). ELLER Vannbadalternativ Hvis du bruker et kokende vannbad: varm rørene i 3 minutter ved 1 C (*). Rørene må kun plasseres i vannbad når den foreskrevne temperaturen er nådd. 5. Fjern de varme rørene forsiktig fra varmeblokken eller det kokende vannbadet og plasser i en sentrifuge. Sentrifuger rørene ved 1 x g i 1 minutter. Supernatanten brukes for påvisning av galaktomannan-antigenet. 6. Test supernatantene med hjelp av følgende prosedyre. Etter klargjøring kan supernatanten fjernes og oppbevares ved 2-8 C i inntil 48 timer før testing. Hvis analysen av resultatene indikerer at ny testing er påkrevet, må en annen porsjon av prøven behandles for testing. (*) Strengt samsvar med foreskrevet temperatur og foreskrevet behandlingstid samt bruk av anbefalte materialer, er avgjørende for vellykket test. Stol ikke på temperaturen som vises på apparatet, du må kontrollere at temperaturen er i samsvar med spesifikasjonene med hjelp av et kalibrert termometer som monteres i et rør som inneholder mineralolje: 12 C må nås inne i røret i en varmeblokk og 1 C i et kokende vannbad. EIA-prosedyre Følg den forslåtte protokollen nøye. Følg god laboratoriepraksis. 1. Bring reagensene til romtemperatur i minst 3 minutter før bruk. 2. Klargjør vaskeløsningen. 3. Klargjør et diagram for identifikasjon av testserumene/bal-væskeprøvene og kontrollene i mikroplaten. Bruk en brønn til negativ kontroll-serum (R3), to brønner til cut-off kontrollserum (R4) og en brønn til positiv kontroll-serum (R5) A R5 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R3 S8 E S1 S9 F S2 S1 G S3 S11 H S4 S12 6

7 4. Fjern plateholderen og mikrobrønnstrimlene (R1) fra plateposen. Legg tilbake eventuelle strimler som ikke vil bli brukt i posen, med tørkemiddel og forsegl posen. 5. Bland innholdet i konjugatflasken (R6) ved å snu den før bruk. Tilsett 5 µl konjugat (R6) til hver brønn. Tilsett deretter 5 µl behandlet serum/bal-supernatant i hver brønn, som angitt ovenfor. Tilsett ikke serum/bal-væskeprøver i brønnene før konjugatet. 6. Dekk platen med plateforsegling eller andre midler for å hindre fordampning og sørg for at hele overflaten er tildekket og vanntett. 7. Inkuber mikroplaten i en tørr mikroplateinkubator i 9 ± 5 minutter ved 37 C (± 1 C). 8. Ta av plateforseglingen. Sug ut innholdet i alle brønnene i en avfallsbeholder (som inneholder natriumhypokloritt). Vask platen fem ganger med en mikroplatevasker (med 8 μl vaskeløsning). Etter siste vask vendes mikroplaten opp ned. Dunk lett på den over absorberende papir for å fjerne resterende væske. 9. Tilsett raskt 2 µl av den kromogene TMB-løsningen (R9) i hver brønn og unngå eksponering for sterkt lys. 1. Inkuber mikroplaten ved romtemperatur ( C) i mørke omgivelser i 3 ± 5 minutter. Bruk ikke klebefilm under dette inkubasjonstrinnet. 11. Tilsett 1 µl stoppløsning (R1) i hver brønn, bruk samme rekkefølge som ved tilsetning av kromogen TMB-løsning. Bland godt. 12. Tørk bunnen på hver plate grundig. 13. Avles den optiske densiteten i hver brønn ved 45 nm (referansefilter på 62/63 nm). Mikroplater må avleses innen 3 minutter etter tilsetning av stoppløsning. 11- KVALITETSKONTROLL (VALIDERINGSKRITERIER) Cut-off kontroll: O.D. på hvert cut-off kontrollserum må være,3 og,8. Positiv kontroll: Indeksen for positiv kontroll-serum må være større enn 1,5. OD positiv kontroll (R5) > 1,5 I = Middelverdi cut-off kontroll OD Negativ kontroll: Indeksen for negativ kontroll-serum må være større enn,4. OD negativ kontroll (R3) I = <,4 Middelverdi cut-off kontroll OD Svikt i noen av kontrollene når det gjelder å oppfylle valideringskriteriene beskrevet ovenfor, gjør analysen ugyldig, og pasientprøveresultatene må ikke rapporteres. Operatøren kan beslutte å gjenta analysen, etter å ha gjennomgått prosedyren, eller kan kontakte produsenten for å få hjelp. Hvis det utføres en gjentatt analysen, bør en ny porsjon av den samme prøven brukes i den gjentatte analysen. Eksempelberegning: Prøve Absorbans (OD) Negativ kontroll (R3) OD,116 Cut-off kontroll (R4) OD,513,533 Positiv kontroll (R5) OD 1,834 Beregninger Middelverdi cut-off kontroll For å beregne middelverdien for cut-off kontroll (R4) OD, legges OD-verdiene for hver cut-off kontroll duplisert sammen og resultatet deles med 2: (,513 +,533) 2 =,523 Negativ kontrollindeks: For å beregne indeksen for negativ kontroll, deles OD for negativ kontroll ved middelverdien for cut-off kontroll OD: I =,116,523 =,22 Positiv kontrollindeks: For å beregne indeksen for positiv kontroll, deles OD for positiv kontroll med middelverdien for cut-off kontroll OD: 1,834 I = = 3,51,523 7

8 Gyldighet I eksemplet ovenfor: Hver cut-off kontroll OD er,3 og,8, noe som indikerer at cut-off kontrollen er gyldig. Indeksen for negativ kontroll er <,4, noe som indikerer at den negative kontrollen er gyldig. Indeksen for positiv kontroll er > 1,5, noe som indikerer at den positive kontrollen er gyldig. Testkjøringen i dette eksemplet anses å være gyldig fordi resultatene oppfyller gyldighetskriteriene for hver kontroll. 12- TOLKNING AV RESULTATER Tilstedeværelse eller fravær av galaktomannan-antigen i testprøven bestemmes ved beregning av en indeks for hver pasientprøve. Indeksen (I), er OD-verdien på prøven dividert med middelverdien av optiske densitet i brønnene som inneholder cut-off kontrollserum. Beregning av middelverdien på cut-off kontrollens optiske densitet: Legg til de optiske densitetene på de to brønnene som inneholder cut-off kontrollserum (R4) og del summen med 2. Beregning av en indeks (I) for hver testprøve: Beregn følgende forhold for hver testprøve: OD-prøve I = Middelverdi cut-off kontroll OD Tolkning av serumer/bal-væske med en indeks <,5: Serumer/BAL-væske med en indeks <,5 anses å være negativ for galaktomannan-antigen. Merknad: Et negativt resultat kan indikere at pasientens resultat er under det påvisbare nivået for analysen. Negative resultater utelukker ikke diagnosen invasiv aspergillose. Gjentatt testing anbefales hvis resultatet er negativt, mens sykdommen mistenkes. Tolkning av serumer/bal-væske med en indeks,5: Serumer/BAL-væske med en indeks,5 anses å være positiv for galaktomannan-antigen. For alle positive pasienter anbefales det å gjenta testen med en ny porsjon fra den samme prøven (serum/bal). Merknad: En absorbansverdi på mindre enn, kan indikere en prosedyre- eller instrumentfeil som bør evalueres. Det aktuelle resultatet er ugyldig og prøven må kjøres på nytt. Regelmessig screening (to ganger ukentlig) av serumprøver fra høyrisikopasienter anbefales for å øke sensitiviteten og tidlig positivitet på testen. Merknad: Platelia Aspergillus Ag er beregnet på å bli brukt som et hjelpemiddel ved diagnose av invasiv aspergillose. Positive resultater oppnådd med Platelia Aspergillus Ag bør vurderes i sammenheng med andre diagnostiske prosedyrer, f.eks. mikrobiologisk kultur, histologisk undersøkelse av biopsiprøver og radiografisk dokumentasjon. Eksempelberegning: Prøve Absorbans (OD) Negativ kontroll (R3),116 Cut- off kontroll (R4),513,533 Positiv kontroll (R5) OD 1,834 Pasientprøve nr. 1,134 Pasientprøve nr. 2,436 Pasientprøve nr. 3 1,196 Beregninger Les kvalitetskontrollpunktet (gyldighetskriterier) for å se et eksempel på beregninger for å bestemme gyldigheten av analysekontrollene. Middelverdi cut-off kontrollverdi For å beregne middelverdien for cut-off kontroll (R4) OD, legges OD-verdiene for hver cut-off kontroll duplisert sammen og resultatet deles med 2: (,513 +,533) 2 =,523 Pasientprøve nr. 1 For å beregne indeksen for pasientprøve nr. 1, deles OD for pasientprøve nr. 1 med middelverdien for cut-off kontroll OD:,134 I = =,26,523 I dette eksemplet er pasientprøve nr. 1 negativ, siden indeksen på,26 er <,5. 8

9 Pasientprøve nr. 2 For å beregne indeksen for pasientprøve nr. 2, deles OD for pasientprøve nr. 2 med middelverdien for cut-off kontroll OD:,436 I = =,83,523 I dette eksemplet er pasientprøve nr. 2 positiv, siden indeksen på,83 er,5. Pasientprøve nr. 3 For å beregne indeksen for pasientprøve nr. 3, deles OD for pasientprøve nr. 3 med middelverdien for cut-off kontroll OD: 1,196 I = = 2,29,523 I dette eksemplet er pasientprøve nr. 3 positiv, siden indeksen på 2,29 er,5. Les Tolkning av positive resultater i punkt BEGRENSNINGER VED PROSEDYREN 1. En negativ test fra serum- og/eller BAL-prøver kan ikke utelukke diagnosen invasiv aspergillose. Serumprøver fra pasienter med risiko for invasiv aspergillose bør testes to ganger i uken. 2. Platelia Aspergillus Ag-prosedyren og tolkningen av resultatene må følges når man tester prøver for tilstedeværelse av galaktomannan-antigen. Brukeren av kitet anbefales å lese pakningsvedlegget nøye før testen utføres. Spesielt må testprosedyren følges nøye for pipettering av prøven og reagensen, platevask og tidspunktet for inkubasjonstrinnene. 3. Unnlatelse av å tilsette prøven eller reagensen som beskrevet i prosedyren, kan føre til en falsk negativ test. Gjentatt testing av flere prøver bør vurderes når det foreligger klinisk mistanke om invasiv aspergillose eller prosedyrefeil. 4. Forurensning av negative pasientprøvebrønner med positiv kontroll / pasientprøvebrønner er mulig hvis innholdet i en brønn søles over til en annen brønn på grunn av røff håndtering av mikroplaten eller dårlig pipetteringsteknikk under tilsetning av reagenser. 5. Ytelsen til Platelia Aspergillus Ag har ikke blitt evaluert med neonatale prøver. Det er en høyere forekomst av antall falske positive galaktomannan-resultater rapportert i den europeiske litteraturen i prøver fra neonatal populasjon 13, 15, 34, Platelia Aspergillus Ag kan vise redusert påvisning av galaktomannan hos pasienter med kronisk granulomatøs sykdom (CGD) og Jobs syndrom 56, Samtidig bruk av muggaktiv anti-soppbehandling hos noen pasienter med invasiv aspergillose kan føre til redusert sensitivitet med Platelia Aspergillus Ag 3, Platelia Aspergillus Ag har ikke blitt evaluert for bruk med plasma eller andre prøvetyper som urin eller CSF. 9. Ytelsen til Platelia Aspergillus Ag er ikke fastslått for manuell avlesning og/eller visuell resultatbestemmelse. 1. Andre slekter av sopp, f.eks. Penicillium, Alternaria Paecilomyces, Geotrichum og Histoplasma, har vist reaktivitet hos rotte, EBA-2 monoklonale antistoffer som brukes i analysen for påvisning av Aspergillus galaktomannan. Histoplasmose bør vurderes i endemiske områder, inkludert deler av USA 36, 5, Kryssreaktivitet av BAL-væskeprøver med Mycoplasma pneumoniae eller anestesimidler/smøremidler som brukes til å bedøve nakke-/halsområdet for aspirasjonsprosessen, har ikke blitt vurdert. 12. Positive reaksjoner uten kliniske tegn: Følgende bør vurderes med hensyn til tidlig påvisning av galaktomannan-antigen i serum eller BAL før kliniske og/eller radiologiske tegn vises. Positive testresultater uten kliniske tegn observeres vanligvis, og de har vist seg å svare til "reelle positive" tester hos pasienter som det senere påvises eller sannsynliggjøres diagnose for invasiv aspergillose 3. Imidlertid bør i enkelte spesielle tilfeller spesifikke faktorer tas i betraktning når man tolker testen: a. Positive testresultater uten kliniske tegn har blitt rapportert, spesielt hos små barn 44. Selv om noen av disse tilfellene kan være relatert til reell sirkulasjon av Aspergillus-antigener, kan de fleste tilfellene anses å være falske positive 7. b. Galaktofuranose har blitt påvist i ulike matvarer, særlig frokostblandinger, kornprodukter og kremdesserter 1, 27. I motsetning til melk fra mennesker inneholder kumelksammensetninger ofte høye konsentrasjoner av galaktomannan 13. Kostholdsfaktorer må derfor tas hensyn til ved tolkningen i løpet av antigenemi hos små barn, og mer generelt hos alle pasienter med en endret tarmbarriere 6,13. Eventuelle tilfeller av positiv antigenemi som ikke ledsages av kliniske symptomer, bør tolkes enda mer forsiktig i denne pasientgruppen. c. Det har forekommet rapporter om positive galaktomannan-testresultater hos pasienter som fikk piperacillin/tazobaktam. Det har også forekommet rapporter om enkelte partier eller batcher med piperacillin/tazobaktam som har blitt funnet å være positive for galaktomannan-antigen. Derfor bør positive testresultater hos pasienter som har fått piperacillin/tazobaktam, tolkes med forsiktighet og bekreftes av andre diagnostiske metoder. Påvisning av galaktomannan har også blitt rapportert i enkelte batcher med amoxicillin forbundet parenterale preparater med klavulansyre. Derfor bør halvsyntetiske ß-laktam-behandlinger vurderes ved tolkning av testen 1, 3, 32. Likevel, fordi Platelia Aspergillus Ag kan påvise galaktomannan-antigen i god tid før kliniske eller radiologiske tegn vises, kan forekomsten av invasiv aspergillose ikke utelukkes. Derfor bør pasienter som har blitt behandlet med piperacillin/tazobaktam med positive testresultater, følges nøye. 9

10 d. Positive reaksjoner med fravær av kliniske tegn kan observeres hos pasienter som får produkter som inneholder galaktomannan, enten parenteralt eller oralt (i nærvær av en endring av tarmbarrieren). Tilstedeværelsen av galaktomannan i disse produktene kan ofte forklares med bruk av en fermenteringsprosess basert på fungale mikroorganismer. Et positivt resultat vil imidlertid ikke bli observert hos en pasient med mindre serumkonsentrasjonen av eksogen galaktomannan når eller overskrider testens påvisningsgrense. Hvis det derfor foreligger et mistenkelig positivt resultat uten andre kliniske tegn, anbefaler vi å undersøke produktene som pasienten tar, og spesielt produksjonsprosessene for disse og opprinnelsen til råvarene som brukes 14, 41, Det har forekommet rapporter om positive reaksjoner for galaktomannan i serum og bronkoalveolær skyllevæske assosiert med PLASMA-Lyte som har blitt observert i flere studier 14, 41. Derfor bør enhver administrering av PLASMA-Lyte hensyntas når man tolker resultatene av denne testen. 14. Resultatene av Platelia Aspergillus Ag i væskeprøver fra bronkoalveolær skyllevæske (BAL) fra pasienter uten svekket immunforsvar, bør tolkes med forsiktighet Resultater nær cut-off (,5) må tolkes med forsiktighet og støttes av andre kliniske, radiologiske eller laboratoriemessige tegn på invasiv aspergillose, fordi ingen gråsone inngår i resultattolkningen av analysen. 16. I tillegg har resultater fra Platelia Aspergillus Ag i væskeprøver fra bronkoalveolær skyllevæske (BAL) med indeks mellom,5 og 1, en lavere positiv prediktiv verdi enn BAL-prøveresultater indeksverdier > 1,, derfor bør resultatene mellom indeksverdier,5 og 1, vurderes og støttes av andre kliniske, radiologiske eller laboratoriemessige tegn på invasiv aspergillose 8, FORVENTEDE VERDIER I. SERUM Den forventede forekomsten av invasiv aspergillose varierer med pasientpopulasjon. Forekomster fra 5 til 2 % har blitt rapportert 1, 16. Følgende resultater er hentet fra kliniske studier om pediatriske (alder 21 år) pasienter i USA og på voksne pasienter i Nord- Amerika. A.- Pediatriske pasienter En klinisk studie ble utført på totalt 1954 serumprøver fra 129 immunsupprimerte pediatriske pasienter (alder 21 år), med høy risiko for invasiv aspergillose (IA) og pasienter diagnostisert med påvist og sannsynlig invasiv aspergillose, på tre testsentre i USA for å bestemme ytelsesegenskapene til Platelia Aspergillus Ag. Fordelingen av indeksverdier for disse populasjonene er vist i de følgende diagrammene: Pediatriske pasienter diagnostisert uten invasiv aspergillose (kontrollpopulasjon) Totalt 1625* pediatriske serumprøver hentet fra 18 immunsupprimerte pediatriske pasienter på tre testsentre i USA ble testet for å bestemme ytelsesegenskapene til Platelia Aspergillus Ag. Fordelingen av indeksverdier for prøvene er vist i det følgende diagrammet: Figur 1: Number Antall serumer of Sera Distribusjon av serum indeksverdi fra den Distribution of the Serum Index Value from the pediatriske kontrollpopulasjonen Pediatric Control Population (N=1625) Indeks Index >1.5 *Merknad: 8 prøver fra 4 kontrollpasienter med positive galaktomannan-antigen-resultater sammenfallende med behandling med piperacillin/tazobaktam (Zosyn ) ble ekskludert. 8 1

11 Pediatriske pasienter diagnostisert med invasiv aspergillose Punktplottet viser galaktomannan-analyseresultatene for de 249 serumprøvene fra 17 pasienter i denne studien som ble diagnostisert med påvist eller sannsynlig invasiv aspergillose som definert i EORTC/NIAID-definisjonene. Ikke alle serumprøvene fra hver pasient forventes å være positiv. Den forventede forekomsten av invasiv aspergillose varierer med pasientpopulasjonen. Forekomster fra 5 til 2 % har blitt rapportert 1, 24. Forekomsten i denne studien var 13,6 %. Figur 2: Indeks Index > Pediatrisk Pediatric påvist/sannsynlig Proven/ Probable aspergillose: Aspergillosis: Distribusjon Distribution av of indeks / Index/ pediatrisk Pediatric pasient Patient (N=17) Pasientnummer Patient Number B. Voksne pasienter En klinisk studie ble utført på totalt 1724 serumprøver fra 172 pasienter med benmargtransplantasjoner (BMT) og leukemi, diagnostisert med og uten invasiv aspergillose, på tre testsentre i USA for å bestemme ytelsesegenskapene til Platelia Aspergillus Ag. Fordelingen av indeksverdier for disse populasjonene er vist i de følgende diagrammene. Voksne pasienter diagnostisert uten invasiv aspergillose (kontrollpopulasjon) Totalt 1262 serumprøver hentet fra 143 pasienter med benmargstransplantasjon (BMT) og leukemi på tre testsentre i Nord- Amerika ble testet med Platelia Aspergillus Ag-testen. Fordelingen av indeksverdier for prøvene er vist i det følgende diagrammet: Figur 3: Number Antall serumer of Sera Distribusjon Distribution av of serumindeksverdi the Serum Index Value fra den from voksne the Adult kontrollpopulasjonen Control Population (N=1262) Index Indeks >1.5 11

12 Voksne pasienter diagnostisert med invasiv aspergillose Punktplottet viser galaktomannan-analyseresultatene for de 462 serumprøvene fra 29 pasienter i denne studien som ble diagnostisert med påvist eller sannsynlig invasiv aspergillose som definert i EORTC/NIAID-definisjonene. Ikke alle serumprøvene fra hver pasient forventes å være positiv. Den forventede forekomsten av invasiv aspergillose varierer med pasientpopulasjonen. Forekomster fra 5 til 2 % har blitt rapportert 1, 24. Forekomsten i denne studien var 16,9 %. Figur 4: Indeks Index > Adult Voksne Proven/ påvist Probable / sannsynlig Aspergillosis: aspergillose: Distribution Distribusjon of av Indeks Index/ / Adult Voksne Patient pasient (N=29) (N=29) Patient Pasientnummer Number Følgende grafer viser eksempler på hhv. en pasient uten kliniske tegn eller symptomer på invasiv aspergillose (negativ for Aspergillus) og en pasient med påvist eller sannsynlig invasiv aspergillose (positiv for Aspergillus). Figur 5: Negativ pasient Indeks Index CONTROL Kontrollpasient PATIENT Dag Days Figur 6: Positiv pasient Indeks Index PROVEN Pasient INVASIVE med ASPERGILLOSIS påvist invasiv aspergillose PATIENT Dag Days 12

13 II. BAL-VÆSKE To studier ble utført med totalt 449 BAL-prøver fra 178 pasienter med organtransplantasjon (SOT) og lungetransplantasjon med og uten invasiv aspergillose i USA å bestemme ytelsesegenskapene til Platelia Aspergillus Ag-kit med prøver av bronkoalveolær skyllevæske. Av disse var det 43 BAL-prøver fra 167 faste organ- og lungetransplantasjonsmottakere uten invasiv aspergillose. I tillegg ble det utført en retrospektiv analyse på BAL-prøver fra 99 evaluerbare hematologiske pasienter med høyrisiko i en studie utenfor USA som omfattet 58 pasienter med påvist eller sannsynlig invasiv aspergillose. Forventede verdier i BAL-prøver fra de kombinerte SOT- og lungetransplantasjonsmottakerne uten invasiv aspergillose er vist i tabellen nedenfor. Resultatene vises fra prøver fra mottakere av transplantater med og uten muggkolonisering. Tabell 1 Forventede verdier av prøve Kombinert SOT- og lungetransplantasjonsmottakere uten invasiv aspergillose N = 43 BAL-væsker Diagnose N Positiv (%) Negativ (%) Kontroller uten kolonisering /341(3,2%) 33/341(96,8%) Kontroller med kolonisering 62 12/62(19,4%) 5/62(8,6%) Kontroll Totalt 43 23/43(5,7%) 38/43(94,3%) Forventede verdier i BAL-prøver fra de kombinerte SOT- og lungetransplantasjonsmottakerne uten invasiv aspergillose er vist etter transplantasjonstype i tabellen nedenfor. Tabell 2 Forventede verdier av prøve Kombinert SOT- og lungetransplantasjonsmottakere uten invasiv aspergillose Etter transplantasjonstype N = 43 BAL-væsker Transplantasjonstype N Positiv (%) Negativ (%) Hjerte 28 3/28(1,7%) 25/28(89,3%) Nyre 25 3/25(12,%) 22/25(88,%) Lever 23 1/23(4,3%) 22/23(95,7%) Lunge /327(4,9%) 311/327(95,1%) Kontroll Totalt 43 23/43(5,7%) 38/43(94,3%) Forventede verdier ble også evaluert i totalt 41 BAL-væskeprøver fra 41 pasienter med hematologisk sykdom uten invasiv aspergillose og er vist i tabellen nedenfor: Tabell 3 Forventede verdier av prøve Pasienter med hematologisk sykdom uten invasiv aspergillose N = 41 BAL-væsker Diagnose N Positiv (%) Negativ (%) Kontroller 41 8/41(19,5%) 33/41(8,5%) 15- SPESIELLE YTELSESEGENSKAPER A- REPRODUSERBARHET a) Reproduserbarhetsstudier i serum Variasjon inter-assay og intra-assay for Platelia Aspergillus Ag ble fastsatt i en studie med et panel med 6 sammenslåtte pasientserumprøver (en negativ, en svak positiv, to positive og to sterkt positive) innsamlet på tre kliniske studiesteder i Nord- Amerika. Hvert av de 6 panelmedlemmene ble testet i triplikat (x3) på 3 forskjellige dager, på 1 parti, på to steder (totalt antall replikater på hvert sted = 9). Hvert av de 6 panelmedlemmene ble testet i duplikat (x2) på 3 forskjellige dager, på 1 parti, på et tredje sted (totalt antall replikater på det tredje stedet = 6). En (1) operatør utførte all presisjonstesting på hvert sted. Dataene ble analysert i henhold til Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) (tidligere National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)). Middelverdien for optisk densitet (OD) og middelverdien for indeksverdi, standardavvik (SD), prosent variasjonskoeffisient (% CV), innenfor kjørepresisjon (intra-assay) og innenfor området (inter-assay) presisjon for hvert panelmedlem på hvert sted er illustrert nedenfor i følgende tabeller. 13

14 Tabell 4 Sted 1 Panelmedlem Neg Lav Pos Pos #1 Pos #2 Høy Pos# 1 Høy Pos# 2 Neg. kontroll CO kontroll Pos. kontroll OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Index OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Indeks N Middelverdi I kjøring (intraassay)1 SD I/R I/R.2.3 I/R I/R %CV I/R I/R 4.8% 4.4% 8.4% 7.6% 4.7% 5.1% 4.2% 4.4% 3.1% 3.6% I/R I/R 3.7% 3.4% I/R I/R Sum (interassay) SD I/R I/R %CV I/R I/R 11.5% 1.4% 1.% 11.6% 4.7% 15.7% 4.7% 14.3% 5.9% 11.9% I/R I/R 16.9% 2.8% 14.3% 3.3% Sted 2 Panelmedlem Neg Lav Pos Pos #1 Pos #2 Høy Pos# 1 Høy Pos# 2 Neg. kontroll CO kontroll Pos. kontroll OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Indeks N Middelverdi I kjøring (intraassay)1 SD I/R I/R..1 I/R I/R %CV I/R I/R 14.5% 13.% 6.4% 7.6% 7.5% 7.1% 5.7% 4.8% 3.5% 3.2% I/R I/R 1.1% 1.1% I/R I/R Sum (interassay) SD I/R I/R %CV I/R I/R 2.8% 27.% 22.7% 19.8% 9.5% 18.7% 5.3% 26.5% 5.8% 29.2% I/R I/R 22.7%.9% 5.7% 18.2% Sted 3 Panelmedlem Neg Lav Pos Pos #1 Pos #2 Høy Pos# 1 Høy Pos# 2 Neg. kontroll CO kontroll Pos. kontroll OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Indeks OD Indeks N Middelverdi I kjøring (intra-assay) I/R I/R.28.6 I/R I/R SD %CV I/R I/R 2.4% 2.4% 12.5% 12.2% 8.2% 8.2% 8.1% 8.2% 5.3% 5.1% I/R I/R 5.8% 5.8% I/R I/R Sum (interassay) SD I/R I/R %CV I/R I/R 2.% 15.8% 1.5% 11.1% 12.5% 14.3% 7.1% 6.2% 4.7% 6.8% I/R I/R 5.8% 4.1% 3.4% 6.6% I/R = ikke relevant 1 NCCLS EP5-A, Vol. 19, Nr. 2, Side 24, Ligning (C2) 2 NCCLS EP5-A, Vol. 19, Nr. 2, Side 25, Ligning (C3) og Ligning (C4) 14

15 b) Reproduserbarhet i BAL-væske Variasjon i inter-assay og intra-assay for Platelia Aspergillus Ag ble fastsatt i en studie med et panel av fire sammenslåtte BAL-pasientprøver tilsatt renset galaktomannan (en negativ, en sterk negativ, en svakt positiv og en middels positiv) på 3 teststeder (to amerikanske, kliniske teststeder og ett internt sted). Hvert av de 4 panelmedlemmene og kontrollene ble testet i duplikat (x2) på 2 kjøringer per dag, på 5 ulike dager på ett parti (totalt antall resultater på hvert sted = 12). To (2) operatører utførte all presisjonstesting på hvert sted. Dataene ble analysert i henhold til Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) (tidligere National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)). Middelverdien for optisk densitet (OD) og middelverdien for indeksverdi, standardavvik (SD), prosent variasjonskoeffisient (% CV), innenfor kjørepresisjon (intra-assay) og presisjon mellom sted, mellom dag, mellom operatør og mellom kjøring (inter-assay) for hvert panelmedlem er illustrert nedenfor i følgende tabell: Tabell 5 Kombinerte steder Sammendrag Sammendrag Gjennomsnittli g Innenfor kjøring (Intraassay) Totalt (Interassay) Lav Middels Positiv Negativ Negativ Sterkt negativ Positiv positiv kontroll kontroll N=6 N=6 N=6 N=6 N=6 N=6 Indek Indek Indek Indek Indek Indek OD OD OD OD OD OD s s s s s s,12 1,29,214,5,375,88,575 1,35 1,58 3,72 SD I/R I/R,37,13,35,78,29,67,111,265 I/R I/R %CV I/R I/R 17,4 %,4 7 2,5% 9,3% 8,9% 5,% 5,% 7,% 7,1% I/R I/R SD I/R I/R,42,95,61,122,7,138,19,438 I/R I/R %CV I/R I/R B- KRYSSREAKTIVITET 19,6 % 18,9% 16,2 % 13,9% 12,2 % 1,2% 12, %,11 11,8% I/R I/R a) Kryssreaktivitet Serum En studie for å evaluere virkningen av potensielt forstyrrende medisinske tilstander, som ikke er relatert til invasiv aspergillose, ble utført med ett parti, med Platelia Aspergillus Ag-kit. Følgende serumprøver ble testet for kryssreaktivitet med Platelia Aspergillus Ag. Totalt 151 serumer ble testet. Tabell 6 * En av hver av blære, bryst (2), tykktarm, endometrisk, lunge, prostata, nyre, og plateepitel (3). 15

16 C- Klinisk testing KLINISKE STUDIER I NORD-AMERIKA I. SERUMPRØVER Klinisk testing for å evaluere sensitivitet, spesifisitet, og prediktiv verdi på Platelia Aspergillus Ag, ble gjennomført på pediatriske pasienter (alder 21 år) på tre steder i USA og på voksne pasienter på tre steder i Nord-Amerika. Studiene ble utført med hjelp av totalt 1954 serumprøver samlet inn fra 129 pediatriske pasienter og totalt 1724 serumprøver samlet inn fra 172 voksne pasienter fra følgende populasjoner*: pasienter uten tegn på invasiv aspergillose (kontrollpasienter) pasienter med sannsynlig invasiv aspergillose pasienter med påvist invasiv aspergillose * The Invasive Fungal Infection Cooperative Group (IFICG) i European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) og Mycosis Study Group (MSG) i National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) definerte i 22 kriterier for diagnose av invasiv aspergillose (IA) hos pasienter med hematologisk malignitet eller hematopoetisk 2, 39 stamcelletransplantasjon. SENSIBILITET A. Pediatriske pasienter Resultatene fra denne studien har blitt analysert i forhold til pasientens sensitivitet. Sensitivitetstestingen ble utført med hjelp av Platelia Aspergillus Ag på tre steder på kombinert totalt 17 immunsupprimerte pediatriske pasienter diagnostisert med påvist eller sannsynlig invasiv aspergillose. Tabell 7 Diagnose Antall pasienter Sensitivitet 95 % konfidensintervall Påvist aspergillose 9 44,4% (4/9) 18,9-73,3% Sannsynlig aspergillose 8 62,5 % (5/8) 3,6-86,3% Kombinert påvist og sannsynlig 17* 52,9% (9/17) 31,-73,8% aspergillose *Merknad: 8 av de 17 pasientene ga negative resultater for Aspergillus galaktomannan-antigen. Alle 8 pasienter med negative resultater for Aspergillus galaktomannan-antigen fikk behandling med flere anti-soppmidler. Samtidig bruk av muggaktiv antisoppbehandling hos enkelte pasienter med invasiv aspergillose kan føre til redusert sensitivitet 31. B. Voksne pasienter Sensitivitetstestingen ble utført med hjelp av Platelia Aspergillus Ag på tre steder på kombinert totalt 29 voksne pasienter med benmargtransplantasjon (BMT) og leukemi, diagnostisert med påvist eller sannsynlig invasiv aspergillose. Tabell 8 Diagnose Antall pasienter Sensitivitet 95 % konfidensintervall Påvist aspergillose 11 81,8% (9/11) 52,3-94,9% Sannsynlig aspergillose 18 77,8% (14/18) 54,8-91,% Kombinert påvist og sannsynlig aspergillose 29 79,3% (23/29) 61,6-9,2% SPESIFISITET A. Pediatriske pasienter Spesifisitet etter pediatriske pasienter Spesifisitetstestingen ble utført med hjelp av Platelia Aspergillus Ag på tre steder på kombinert totalt 18 immunsupprimerte pediatriske pasienter uten tegn på invasiv aspergillose (kontrollpasienter). 16

17 Tabell 9 Sted Antall pasienter Spesifisitet 95 % konfidensintervall ,4 % (38/44) 73,3-93,6% ,4 % (51/59) 75,5-93,% 3 5 1% (5/5) 56,6-1% Kombinerte steder 18 87,% (94/18) 79,4-92,1% *Merknad: 4 pasienter med positive galaktomannan-antigen-resultater sammenfallende med behandling med piperacillin/tazobaktam ble ekskludert. Spesifisitet etter pediatriske prøver Spesifisitetstestingen ble utført med hjelp av Platelia Aspergillus Ag på tre steder på kombinert totalt 1625* prøver innsamlet fra 18 immunsupprimerte pediatriske pasienter uten tegn på invasiv aspergillose (kontrollpasienter). Tabell 1 Sted Antall prøver Spesifisitet 95 % konfidensintervall ,9% (785/794) 97,9-99,4% ,8% (715/731) 96,5-98,6% 3 1 1% (1/1) 96,3-1% Kombinerte steder ,5% (16/1625) 97,7-99,% *Merknad: 8 prøver fra 4 pasienter med positive galaktomannan-antigen-resultater sammenfallende med behandling med piperacillin/tazobaktam ble ekskludert. B. Voksne pasienter Spesifisitet etter voksne pasienter Spesifisitetstestingen ble utført med hjelp av Platelia Aspergillus Ag på tre steder på kombinert totalt 143 voksne pasienter med benmargtransplantasjon (BMT) og leukemi uten tegn på invasiv aspergillose (kontrollpasienter). Tabell 11 Sted Antall pasienter Spesifisitet 95 % konfidensintervall ,6% (22/28) 6,5-89,8% ,4% (71/77) 84,-96,4% ,5% (34/38) 75,9-95,8% Kombinerte steder ,8% (127/143) 82,6-93,% Spesifisitet etter voksne prøver Spesifisitetstestingen ble utført med hjelp av Platelia Aspergillus Ag på tre steder på kombinert totalt 1262 prøver innsamlet fra 143 voksne pasienter med benmargtransplantasjon (BMT) og leukemi uten tegn på invasiv aspergillose (kontrollpasienter). Tabell 12 Sted Antall prøver Spesifisitet 95 % konfidensintervall ,% (342/349) 95,9-99,% ,6% (552/56) 97,2-99,3% ,9% (349/353) 97,1-99,6% Kombinerte steder ,5% (1243/1262) 97,7-99,% 17

18 PREDIKTIV VERDI Positive og negative prediktive verdier har blitt analysert for pasientpopulasjonen i denne studien. Basert på det faktiske gjennomsnittet på 13,6 % prevalens hos pediatriske pasienter og 16,9 % prevalens hos voksne pasienter som ble observert i denne studien, er positive og negative prediktive verdier blitt beregnet som følger: A. Pediatriske pasienter Studieprevalens 13,6 % PPV: 39,1 % 95 % konfidensintervall: 22,2-59,2% NPV: 92,2% 95 % konfidensintervall: 85,3-96,% B. Voksne pasienter Studieprevalens 16,9% PPV: 59, % 95 % konfidensintervall: 43,4-72,9 % NPV: 95,5 % 95 % konfidensintervall: 9,5-97,9% Den forventede forekomsten av invasiv aspergillose varierer med pasientpopulasjonen. Forekomster fra 5 til 2 % har blitt rapportert 1, 24. For pasientpopulasjoner i den nedre enden av den publiserte prevalensen, har de positive og negative prediktive verdiene blitt beregnet på nytt med hjelp av en 5 % prevalensgrad. A. Pediatriske pasienter Beregnet prevalens 5 % PPV: 17,6% 95 % konfidensintervall: 6,5-39,8% NPV: 97,2% 95 % konfidensintervall: 92,1-99,1% B. Voksne pasienter Beregnet prevalens 5 % PPV: 27,2 % 95 % konfidensintervall: 13,7-46,7% NPV: 98,8% 95 % konfidensintervall: 95,4-99,7% II. BAL-VÆSKEPRØVER ytelsesegenskaper Sensitivitet og spesifisitet på Platelia Aspergillus Ag med BAL-væskeprøver ble undersøkt i to studier i USA på 116 prøver fra 62 organtransplantatmottakere og 333 prøver fra 116 lungetransplantasjonsmottakere og en studie utenfor USA på 99 prøver fra 99 hematologiske pasienter med høyrisiko med og uten invasiv aspergillose. A. SENSITIVITET Sensitiviteten ble evaluert hos mottakere av faste organtransplantasjoner og lungetransplantasjoner diagnostisert med invasiv aspergillose samt pasienter med hematologisk sykdom diagnostisert med invasiv aspergillose i henhold til EORTC-/MSGkriterier. I. Mottakere av faste organtransplantasjoner med invasiv aspergillose Av totalt 116 prøver fra 62 mottakere av faste organtransplantasjoner i en studie ble sensitiviteten evaluert hos fem mottakere, diagnostisert med invasiv aspergillose, som vist i tabellen nedenfor. Tabell 13 Påvist eller sannsynlig invasiv aspergillose hos mottakere av faste organtransplantasjoner Etter pasient Diagnose N Indeks,5 Sensitivitet 95 % konfidensintervall Påvist aspergillose 2 2 2/2(1%) 34,2 1 % Sannsynlig aspergillose 3 3 3/3(1%) 43,8 1 % Kombinert påvist og sannsynlig aspergillose 5 5 5/5(1%) 56,5 1 % Tabell 14 Påvist eller sannsynlig invasiv aspergillose hos mottakere av faste organtransplantasjoner Etter transplantasjonstype Transplantasjon Type N Indeks,5 Sensitivitet 95 % konfidensintervall Hjerte 1 1 1/1(1%) 2,6 1 % Nyre 3 3 3/3(1%) 43,8 1 % Lever 1 1 1/1(1%) 2,6 1 % Totalt 5 5 5/5(1%) 56,5 1 % 18

19 II. Mottakere av lungetransplantasjon med invasiv aspergillose Av totalt 333 prøver fra 116 mottakere av lungetransplantasjoner i en annen studie ble sensitiviteten evaluert hos 6 mottakere, diagnostisert med invasiv aspergillose, som vist i tabellen nedenfor. Tabell 15 Påvist eller sannsynlig invasiv aspergillose hos mottakere av lungetransplantasjoner Etter pasient Diagnose N Indeks,5 Sensitivitet 95 % konfidensintervall Påvist aspergillose 2 1 1/2(5,%) 9,4 9,6% Sannsynlig aspergillose 4 3 3/4(75,%) 3, 95,4% Kombinert påvist og sannsynlig aspergillose 6 4 4/6(66,7%) 3, 9,3% III. Pasienter med hematologisk sykdom med invasiv aspergillose Sensitiviteten ble også evaluert i en tredje studie på 58 prøver fra 58 pasienter med hematologisk sykdom, diagnostisert med invasiv aspergillose som vist i tabellen nedenfor. I studien ble det utført en retrospektiv analyse av BAL-prøver fra hematologiske pasienter med høy risiko med hjelp av Platelia Aspergillus EIA. Dataene fra denne publiserte studien nedenfor ble evaluert for å fastsette ytelsen til Platelia Aspergillus EIA på BAL-væske 29. Tabell 16 Påvist eller sannsynlig invasiv aspergillose hos pasienter med hematologiske sykdommer Diagnose N Indeks,5 Sensitivitet 95 % konfidensintervall Påvist aspergillose /31(1%) 89, 1 % Sannsynlig aspergillose /27(96,3%) 81,7 99,3% Kombinert påvist og sannsynlig aspergillose /58(98,3%) 9,8 99,7% B. SPESIFISITET Spesifisiteten ble evaluert på totalt 98 BAL-prøver fra 57 SOT-mottakere og 35 BAL-prøver fra 11 lungetransplantasjonsmottakere uten invasiv aspergillose og er vist i tabellen nedenfor. Resultatene vises fra prøver fra mottakere av transplantater med og uten muggkolonisering. Tabell 17 Spesifisitet etter prøve Kombinert SOT- og lungetransplantasjonsmottakere uten invasiv aspergillose N = 43 BAL-væsker Diagnose N Indeks 95 % Negativ (%) <,5 konfidensintervall Kontroller uten kolonisering /341(96,8%) 94,3 98,2% Kontroller med kolonisering /62(8,6%) 69,1 88,6% Kontroll Totalt /43(94,3%) 91,6 96,2% Spesifisitet i BAL-prøver fra de kombinerte SOT- og lungetransplantasjonsmottakerne uten invasiv aspergillose er vist etter transplantasjonstype i tabellen nedenfor. 19

20 Tabell 18 Spesifisitet etter prøve Kombinert SOT- og lungetransplantasjonsmottakere uten invasiv aspergillose Etter transplantasjonstype N = 43 BAL-væsker Transplantasjonstype N Indeks <,5 Negativ (%) 95 % konfidensintervall Hjerte /28(89,3%) 72,8 96,3% Nyre /25(88,%) 7, 95,8% Lever /23(95,7%) 79, 99,2% Lunge /327(95,1%) 92,2 97,% Kontroll Totalt /43(94,3%) 91,6 96,2% Spesifisiteten ble også evaluert på totalt 41 BAL-prøver fra 41 pasienter med hematologisk sykdom uten invasiv aspergillose og er vist i tabellen nedenfor. Tabell 19 Spesifisitet etter prøve Pasienter med hematologisk sykdom uten invasiv aspergillose N=41 Indeks 95 % Diagnose N Negativ (%) <,5 konfidensintervall Kontrollpasienter /41(8,5%) 66,-89,8% 16- BIBLIOGRAFI 1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P.M. Rath Detection of Aspergillus galactomannan antigen in foods and antibiotics. Mycoses 4 : s Ascioglu, S., J. H. Rex, B. De Pauw, J. E. Bennett, J. Bille, F. Crokaert, D. W. Denning, J. P. Donnelly, J. E. Edwards, Z. Erjavec, D. Fiere, O. Lortholary, J. Maertens, J. F. Meis, T. F. Patterson, J. Ritter, D. Selleslag, P. M. Shah, D. A. Stevens og T. J. Walsh. 22. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin.Infect.Dis. 34 : s Aubry, A., R. Porcher. J. Bottero, S. Touratier, T. Leblanc, B. Brethon, P. Rousselot, E. Raffoux, J. Menotti, F. Derouin, P. Ribaud og A. Sulahian 26. Occurrence and Kinetics of False-Positive Aspergillus GalactomannanTest Results following Treatment with β-lactam Antibiotics in Patients with Hematological Disorders. J. Clin. Microbiol. 44: s Barnes P. D. og K. A. Marr. 27 Risks, diagnosis and outcomes of invasive fungal infections in haemotopoeitic stem cell transplant recipients. Brit. Journ. Haemotol. 139: s Becker M. J., E. J. Lugtenburg. J. J. Cornelissen, C. V.D. Schee, H. C. Hoogsteden og S. D. Marie. 23 Galactomannan detection in computerized tomography-based broncho-alveolar lavage fluid and serum in haemotological patients at risk for invasive pulmonary aspergillosis. Br. J. Haemotol. 121(3): s Blijevens, N. M., J. P. Donelly, J. F. Meis, P. E. Verweij og B. E. De Pauw. 22 Aspergillus galactomannan antigen levels in allogeneic haemotopoietic stem cell transplant receipients given total parenteral nutrition. Transpl. Infect. Dis. 4: s Chambon-Pautas, C.,J. M. Costa, MT Chaumette, C. Cordonnier og S. Bretagne. 21 Galactomannan and polymerase chain reaction for the diagnosis of primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia. J. Infect. 43: s Clancy C., R. A. Jaber, H. L. Leather, J. R. Wingard, B. Staley, J. L. Wheat, C. Cline, K. H. Rand, D. Schain, M. Baz og M. H. Nyugen. 27 Bronchoalveolar Lavage Galactomannan in Diagnosis of Invasive Pulmonary Aspergillosis among Solid-Organ Transplant Recipients. J. Clin. Microbiol. 45(6): s de Repentigny, L., L. Kaufman, G. T. Cole, D. Kruse, J. P. Latge og R. C. Matthews Immunodiagnosis of Invasive Fungal Infections. J Med Vet Mycol 32: p Denning, D. W Invasive Aspergillosis. Clin Infect.Dis. 26: s Desai R, L.A. Ross og J. A. Hoffman Poster AAA 28. The Role of Bronchoalveolar Lavage Galactomannan Assay in the Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Pediatric Populations. 12. Erjavec, Z. and P. E. Verweij. 22. Recent progress in the diagnosis of fungal infections in the immunocompromised host. Drug Resist. Updat. 5: s Gangneux, J., D. Lavarde, S. Bretagne, C. Guiguen og V. Gandemer. 22. Transient aspergillus antigenaemia: think of milk. Lancet. 359(9313): Hage,C. A., J. M. Reynolds, M. Durkin, L. J. Wheat, K. S. Knox. 27. Plasmalyte as a Cause of false-positive results for Aspergillus galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid. J. Clin. Microbiol. 45: s Herbrecht, R., V. Letscher-Bru, C. Oprea, B. Lioure, J. Waller, F. Campos, O. Villard, K. L. Liu, S. Natarajan-Ame, P. Lutz, P.Dufour, J. P. Bergerat og E. Candolfi. 22. Aspergillus galactomannan detection in the diagnosis of Invasive Aspergillosis in cancer patients. J Clin. Oncol. 2: s Herbrecht, R., D. Denning, T. Patterson, J. Bennett, R. Greene, J. Oestmann, W. Kern, K. Marr, P. Ribaud, O. Lortholary, R. Sylvester,R. Rubin, J. Wingard, P. Stark, C. Durand, D. Caillot, E. Thiel, P. Chandrasekar, M. Hodges, H. Schlamm, P. Troke, B. DePauw. 22. Voriconazole Versus Amphotericin B for Primary Therapy of Invasive Aspergillosis. N Engl J Med. 347, 6: s