Hematologiinstrumenter. Anvendelse og tolkning av resultater

Hematologiinstrumenter. Anvendelse og tolkning av resultater

Monocytter Basofile Lymfocytter Nøytrofile Eosinofile

Det hele begynte med van Leewenhoek i 1674

Der Grosse Blut-Laache Die Anemiä. 1881

Det første brukbare tellekammer, 1874 Ehrlichs fargemetode, 1879 Det første gjennomarbeidede referansematerialet for hemoglobinmåling og erytrocytt-telling, ca 1920. Sammehengen mellom leukocyttmorfologi og infeksjon/inflammasjon, 1929 Klassifisering av anemier, 1934 Klassifisering av leukemier basert på morfologi, 1979 Maxwell M. Wintrobe Starting in the 1920s, from the descriptive discipline dominated by the study of blood cell morphology that it had been, hematology began to be transformed into a science founded on quantitative measurements.

Det første spede forsøk på å automatisere blodcelletelling Moldavan 1934 Fotodetektor Okular

Coulter-prinsippet, basert på elektrisk impedans Coulter Model A, 1956 H. Wallace Coulter: Means for Counting Particles Suspended in a Fluid (1949).og ikke glem Ljungbergs Celloscope

Technicon kommer på banen i 1965 SMA 4/7 Moldavan 1934 Fotodetektor Okular

Kappløpet mellom Coulter og Technicon Coulter Technicon Andre 1956 Modell A Enkanaler, Ery,MCV Leu 1965 SMA 4/ Ery, Hct, MCV,MCH, MCHC, Hgb, Leu 1968 Modell S Ery, Hct, MCV,MCH, MCHC, Hgb, Leu 1970 Hemalog 8 7 + Trc Hemalog D Dedikert DIFF 1974 Coulter Diff 3 Dedikert DIFF 1980 Modell S Plus 7+Trc, 1981 H6000 +DIFF 1983 Modell Plus IV 3-part DIFF 1985 H*1/3 +DIFF 1988 Abbott CellDyn 3000 Sysmex-R1000 (retic) 1989 Coulter STKS 1990 Roche Argos. Sysmex EE-8000

200 år 25 år 20 år 30 år 30 år 20 år Van Leuwenhoeks mikroskop Celler endrer seg ved sykdom (Laacke, Ehrlich) Kvantitering av celler (Bürker) Første referansemateriale Første celleteller (Coulter) Helautomatisk celleteller med Diff (Technicon) Helautomastisk instrument med full pakke (Alle) 15-20 år????????????????

Instrumentspesifikke forhold

LUC? MPXI? LI? Enzymcytokjemi. ADVIA.

Cell Dyn

Technicon H*1, 1987-1998 på RH CD 4 CD 8

Sysmex 6-part diff?

Normale prøver vs prøver med patologi

Hvor mye kan vi stole på instrumentene når det gjelder påvisning av morfologisk patologi? Blaster? Umodne granulocytter? Atypiske lymfocytt?

Hvor god er instrumentene til å -telle/karakterisere celler i prøver med morfologisk normale celler -påvise morfologisk patologi

Sammenligning av CELL-DYN, ADVIA, Coulter og Sysmex 400 prøver fra pasienter, 100 normale prøver Karakterisering/klassifisering av celler i 5-part diff Morfologisk klassifisering (påvisning av patologiske celler). Rapportering av flagg. Rapportering av hver enkelt flagg (blaster, IG, atypiske lymfocytter osv) i forhold til manuell vurdering av utstryk Kang SH et al. Int J Lab Hematol 2007

Karakterisering/klassifisering av celler i 5-part diff Antall prøver med resultater utenfor og innenfor referanseområdet ble sammenlignet med manuell telling. Hvis en av populasjonene var utenfor referanseområdet ble det oppfattet som patologi. CELL-DYN ADVIA Coulter Sysmex Sensitivitet 93 96 95 94 Spesifisitet 68 67 73 74 Kang SH et al. Int J Lab Hematol 2007

Morfologisk klassifisering (påvisning av patologiske celler). Antall prøver med resultater med morfologiske flagg ble vurdert i forhold til manuell vurdering av utstryk og NCCLS protokoll som beskriver patologi. CELL-DYN ADVIA Coulter Sysmex Sensitivitet 87 93 77 94 Spesifisitet 79 67 80 94 Kang SH et al. Int J Lab Hematol 2007

Rapportering av atypiske lymfocytter Antall prøver med resultater med Atyp Lymf flagg ble vurdert i forhold til manuell vurdering av utstryk og NCCLS protokoll so beskrive patologi. CELL-DYN ADVIA Coulter Sysmex Sensitivitet 40 60 0 40 Spesifisitet 91 85 96 90 Kang SH et al. Int J Lab Hematol 2007

Rapportering av NRBC Antall prøver med resultater med NRBC flagg ble vurdert i forhold til manuell vurdering av utstryk og NCCLS protokoll so beskrive patologi. CELL-DYN ADVIA Coulter Sysmex Sensitivitet 33 17* 75* 58 Spesifisitet 98 97 96 96 p=0.016 Kang SH et al. Int J Lab Hematol 2007

Rapportering av umodne granulocytter (IG) Antall prøver med resultater med IG flagg ble vurdert i forhold til manuell vurdering av utstryk og NCCLS protokoll so beskrive patologi. CELL-DYN ADVIA Coulter Sysmex Sensitivitet 86* 74 52* 81 Spesifisitet 84 76 96 91 p=0.001 Kang SH et al. Int J Lab Hematol 2007

Rapportering av BLAST Antall prøver med resultater med BLAST flagg ble vurdert i forhold til manuell vurdering av utstryk og NCCLS protokoll so beskrive patologi. CELL-DYN ADVIA Coulter Sysmex Sensitivitet 77 59* 64 91* Spesifisitet 96 86 98 90 74** 62** p=0.016 **Eilertsen et alt 2012 Kang SH et al. Int J Lab Hematol 2007

Hvilke konsekvenser skal en BLAST melding ha for laboratoriet?

Baso morfologiflagg BLASTS 1. %LUC > 4,5%, og %BLASTS 1.5% - 5.0% 2. %BLASTS > 5.0% WBCB 3. %BASO + %BASOsusp +BASO sat > 10% Baso d/d < 0.15

Blastmelding på ADVIA BLASTS

Hvor mye kan vi stole på instrumentene når det gjelder påvisning av morfologisk patologi? Ett eller flere instrumenter rapporterte BLAST i 208 prøver Det var overenstemmelse mellom de tre instrumentene for 128 prøver

q-verdi for blastflagg Median: 70 Median: 40 Eilertsen H et alt 2012

Sensitivity and specificity of BLAST-flag at different Q-value cut-offs Eilertsen H et alt 2012

ROC for BLAST-melding basert på q-values Eilertsen H et alt 2012

Prediktiv verdi for BLAST-flagg basert på q-verdi Eilertsen H et alt 2012

Kappa statistikk (presisjon for blast-flagg) A kappa value of 0 indicates an observed agreement equal to chance and a value of 1 indicates perfect agreement above chance. XE1: 0.32 XE2: 0.15 XE3: 0.65 Eilertsen H et alt 2012

42 prøver Dato Labnummer Q-flagg Leuko HB PLT NRBC (maskin) Manuell telling/vurdering. Positiv på blaster Manuell telling/vurdering. Negativ på blaster Kommentar på utstryk 18.05.2012 34676671 140 1,2 7,4 31 0 1 18.05.2012 34678333 300 32,7 12,8 103 0 Finner noen få blastlignende 1 celler. 18.05.2012 34672737 100 6,7 9,1 97 0,68 1 18.05.2012 34664625 240 9,4 11,2 592 1,11 1 Sett flere blaster/blastlignende celler 18.05.2012 34683009 200 17,2 9,4 601 0 1 19.05.2012 34682447 300 16,2 8,9 63 0,66 1 20.05.2012 34683284 300 10,2 10,1 92 0,08 1 21.05.2012 12042954 260 4,2 13,1 155 0 1 PHT 21.05.2012 34669755 270 10,4 10,5 161 1,36 1 22.05.2012 34685925 140 2,8 10,6 48 0,05 1 22.05.2012 34685821 300 1 8,9 23 0 1 22.05.2012 34685604 300 18,6 10,2 173 0,08 1 26.05.2012 34692253 300 14,9 11,8 64 0,06 Sett et par blastlignende celler i 1 utstryket. Toksisk granulering. 28.05.2012 34693214 230 6,9 12,8 81 0,05 Finner enkelte myelocytter og 1 erytroblaster. 29.05.2012 34693525 120 8,5 11,8 239 0,09 Venstreforskyvning opp til myelocyttnivå. Toksisk granulering. Enkelte 1 erytroblaster. 30.05.2012 34696192 100 9,7 8,6 26 0 31.05.2012 34696738 160 0,5 10,3 65 0,05 1 01.06.2012 34698190 300 20,6 12,4 142 0,49 1 01.06.2012 34698001 300 1,6 9,4 118 0 1 01.06.2012 34698625 260 0,8 11,6 93 0,03 1 01.06.2012 34699304 300 9 11,6 63 0,13 1 02.06.2012 34700713 180 29,1 11 25 0 1 03.06.2012 34700805 300 14,6 16,5 375 0,04 1 03.06.2012 34701178 300 35,9 13 144 0,07 1 04.06.2012 34694672 150 2,15 8,1 20 0,02 1 04.06.2012 34702068 190 33,9 13,6 439 0 1 05.06.2012 34701765 300 7,4 10,7 42 0 1 05.06.2012 34701859 220 0,4 10,5 28 0 1 05.06.2012 34702345 230 30,9 12,4 135 0,06 1 05.06.2012 34702603 110 4,7 8 268 0 1 09.06.2012 34709036 300 1,6 10,2 95 0 1 10.06.2012 34703791 230 3,8 10,6 286 0 1 11.06.2012 34710491 300 0,72 9,1 44 0,02 1 11.06.2002 34709897 100 1,2 9,7 41 0 1 11.06.2012 34709955 210 32,9 10 593 0 Sett på, ikke bestilt (minus blaster) 12.06.2012 34711984 240 0,8 8,2 12 0,02 Kommentar: Finner noen 1 blastlignende celler. 13.06.2012 34713393 300 17,2 9,9 48 0 1 13.06.2012 34689234 210 12,6 13,5 220 0,13 Venstreforskyvning opp til myelocyttnivå. Enkelte 1 erytroblaster. 12.06.2012 34684823 300 39,7 12,3 216 11,8 Myelo: 7,22. Meta: 2,62. Staver: 4,92. Mange 1 erytroblaster. 12.06.2012 34711949 300 8,5 10,5 35 0,02 1 Finner blast/blastlignende celler i utstryket 11.06.2012 34705831 300 72,2 10,5 116 0 1 Finner noen blast/blastlignende celler 11.06.2012 34710491 300 0,9 8,1 33 0,02 1 Finner blast/blastlignende celler i utstryket

AML

SIS-regel (Sysmex) for BLAST-flagg

Antall utstryk/dag Ahus Dato Antall utstryk Blast - regel 64 04.03.2012 19 4 05.03.2012 44 10 06.03.2012 58 11 07.03.2012 52 5 08.03.2012 42 11 09.03.2012 56 12 10.03.2012 17 7 11.03.2012 15 3 12.03.2012 41 8 17.03.2012 14 1 18.03.2012 11 3 19.03.2012 42 9 20.03.2012 59 14 21.03.2012 46 11 22.03.2012 40 6 23.03.2012 46 9 24.03.2012 16 4 25.03.2012 18 5 26.03.2012 42 8 27.03.2012 50 8 28.03.2012 48 7

Rutiner for oppfølging/rapportering ved BLAST-meldinger Sykehus A Sykehus B Sykehus C Sykehus D Sykehus E Sykehus F BLASTmelding skal genere utstryk, unntatt ved kjent pasient og prøve fra hematologisk avd. 1-2 utstryk/dag vurderes av lege MBK Totalt 600-800 prøver/dag Ved blastflagg på Sysmex holdes WBC og DIFF tilbake, analyseres på ADVIA, hvis BLAST >5%, LUC > 4 %, vurdering på Cellavision Ca. 5 utstryk/dag Totalt 1000 prøver/dag Interne pas: BLASTmelding, rapporteres og rekvirent må selv følge opp. PHT: gir melding til rekvirent, får evt hematolog til å vurdere utstryk Få utstryk vurderes av hematolog 200-250 prøver/dag til DIFF Alle prøver med BLASTmelding vurderes visuelt i første omgang på Cellavision, evt mikroskop. 40-50 utstryk/dag Totalt 1000-1200 prøver/dag Ved BLASTmelding rapporteres mulig umodne celler (CellDyn). evt vurderes av hematolog. ADVIA: > 5% BLAST vurderes av lege MBK BLAST: Rapporteres at utstryk er laget på laboratoriet. Hvis kjent pas lages ikke utstryk og blast rapporteres. 1-3 prøver/dag 2-3 prøver/dag.

Prøver med morfmeldinger (%): Totalt antall talte prøver før emm = 18052 Totalt antall talte prøver etter emm = 20906 Før emm Etter emm Før emm Etter emm Før emm Etter emm Før emm Etter emm Før emm Etter emm Før emm Totalt antall prøver som det er laget utstryk på Totalt antall prøver som det er laget utstryk på Blasts? Blasts? Atyp Lymph? Atyp Lymph? Abn Ly/L- Blasts? Abn Ly/L- Blasts? IG Present (> 5%)/ Imm gram IG Present (> 5%)/ Imm gram RBC- Fragmenter? 4,3 4,3 0,88 0,44 0,57 0,33 0,8 0,89 1 1,18 0,45

Pattern recognition 1965-1975 Videokamera 100 celler Blodutstryk

I hvilken grad skal en IG melding kontrolleres med utstryk? Hvilken klinisk nytte kan man ha av antall umodne granulocytter (IG) 6-part diff?

Immature Granulocytes (umodne granulocytter) (IG) Flagget for umodne granulocytter utløses hvis [(%NEUT + %EOS) - %PMN] 5,0 %. Hvis det er umode granulocytter til stede, vises de i de nøytrofile og eosinofile områdene i perox-cytogrammet og i det mononukleære (MN) området i basocytogrammet. Standard utløsningsverdier for de tre alvorlighetsnivåene er: + [(%NEUT + %EOS) - %PMN] = 5,0 % til 7,4 % ++ [(%NEUT + %EOS) - %PMN] = 7,5 % til 10,0 % +++ [(%NEUT + %EOS) - %PMN] > 10,0 %

Sysmex 6-part diff?

Ability to predict infection Infeksjon IG Neutro Umodne granulocytter Sepsis WBC Infeksjon

CRP IG WBC Neutro Level of CRP, WBC, Neutro and IG during a normal postoperative course (N=11) and during a postoperative course with infection( N=11). The means and SDs are given. Husby K et al 2012

Malaria nøyt-populasjonen inneholder en del M.Vivax som ikke har blitt lysert?? IG-populasjonen er til dels nøytrofile som har fagocytert M.Vivax?? Den lille nøyt-populasjonen til høyre skulle vært eos??

endret til at alle IG Present > 2% rapporteres med angivelse av prosentandel IG. Det gjøres ikke manuell diff..

1 0 0 Noen få myelocytter. 1 4 Plateaggregater. 3 2 Venstreforskyvning opp til myelocyttnivå..bør jeg ha dårlig samvittighet? 4 0 Betydlig toksisk granulering. 3 Toksisk granulering. 10 0 Sett en og annen myelocytt. 1 Venstreforskyvning samt noe toksisk granulering. 5 Noen myelocytter. Sett noen få atypiske lymfocytter med vakuoler i cytoplasma, rund kjerne. 1 Noe variabel platestørrelse. Aniso- poikiloytose. Noe polykromasi. 4 Aniso - poikilocytose (ovale dråper, blyanter) Noen myelocytter. 4 Noen erytroblaster. Noe polykromasi. Noen få myelocytter. 1 Aktiverte/atypiske lymfocytter. 10 Noen få erytroblaster. (Noe) venstreforkyvning. Sett en blastlignende celle. 4 Noen fragmenterte erytrocytter. Noe venstreforskyvning samt noe Dölie-bodies. 4 Noen få meta - myelocytter. 1 Toksisk granulering. Noe venstreforskyvning. 3 Noen myelocytter. 3 Noen virocytter. Lett venstreforskyvning. 0 Noen få myelocytter (Elin). En del aktiverte lymfocytter. Sett en blastlignende celle. Sett en myelocytt (Siri). 3 Noe venstreforskyvning. 7 Noe venstreforskyvning. 1 Noe venstreforskyvning. 2 Noe makrocytose samt litt hypersegmentering. Noen få myelocytter (Elin). Sett ett par myelocytter Noe aktiverte mononukleære celler. (Siri) 2 (Noe) toksisk granulering. Noe venstreforskyvning. 2 Noe venstreforskyvning. 2 Noen myelo- metamyelocytter (Elin). Noe aktiverte lymfocytter. Sett 1 NRBC (Siri). 1 Noe polykromasi. Noe toksisk granulering. Noen få virocytter (Elin). Noen lett aktiverte lymfocytter (Siri). 5 Noe toksisk granulering/vakuolisering. Noe venstreforskyvning. Noen få erytroblaster (plateaggregater) (Elin). Toksisk granulering (Siri). 7 Venstreforskyvning opp til myelocyttnivå. Toksisk granulering. (OBS: diffscatter på begge innkjøringene.) 2 Venstreforskyvning. Noe Döhlie-bodies. 1 Noen myelo-metamyelocytter. 1 Noen virocytter (plasmacellelignende celler). 4 Noe venstreforskyvning. 2 Noe venstreforskyvning samt toksisk granulering. 2 Lett venstreforskyvning. 5 Toksisk granulering/vakuolisering (Elin). Sett ett par metamyelocytter (Siri). 6 Targetceller, aniso-poikilocytose, toksisk granulering, variabel platestørrelse, noen myelocytter. 0 Noe toksisk granulering. 6 Toksisk granulering. 2 Sett en og annen metamyelocytt. Atypiske lymfocytter, noen aktiverte. 2 3 Betydelig kromasi. Betydelig anisocytose. Noen få erytroblaster. Lett venstreforskyvning. 1 Noen myelo-metamyelocytter. 1 Noe toksisk granulering. Lett venstreforskyvning 3 Noe toksisk granulering. Lett venstreforskyvning. 3 Erytroblaster: 1/100 WBC

Sykehistorie: 17 år gammel jente som fikk diagnosen MDS (myelodysplastisk syndrom) for 6 md. siden. Hun har vært slapp i lengre tid, og oppsøker lege pga. feber og smerte ved vannlating. Prøven sendes til sykehuslaboratoriet for analyse. Det er rekvirert leukocytter, diff og trombocytter.

ABX Advia Cell-Dyn Sysmex CELLAVISIONautomatisert DIFF-100 celler (reklassifisert manuelt) LPK 8,5 8,0 8,2 8,1 NEUT 1,08 (12,8 %) 1,79 (22,5 %) 1,51 (18,5 %) 0,11 (1,3 %) 15,8 % LYMF 1,77 (20,9 %) 0,93 (11,7 %) 0,94 (11,5 %) 1,08 (13,4 %) 12,1 % MONO 5,20 (61,4 %) - (26,20 %) 5,71 (69,9 %) 4,25 (52,5 %) 57,9 % EOS 0,02 (0,2 %) 0,01 (0,2 %) 0,01 (0,13 %) 0 % 0 % BASO 0,4 (4,7 %) - (0,90 %) 0 % 0,03 (0,4 %) 0 % LUC - (38,60 %) PLT 31 44 40,4 42 Flagg Blasts Neutropenia Monocytosis Large Immature cells Basophilia Platelet aggregates Anemia Trombocytopenia ATYP Blasts HC-Var Hyper WBC Band Blasts IG Neutropenia Monocytosis Trombocytopenia WBC ABN SCG NRBC Present Blasts Immature Gran Atypical Ly Anemia Trombocytopenia Blaster : 14 % Av 15,8 % neutrofile er: 2,8 % myelocytter 2,8 %metamyelocytter 0,9 % stavkjernede 9,3 % segmenterte Finner 3,7 kjerneholdige røde pr. 100 leukocytter

Differensialtelling av leukocytter Manual differential leukocyte counting was not designed to be perforemed 500 times a day on a mass production scale. It was designed by the 19th Century hematologists who wanted to look at their one or to patients.