Hva skiller ulike hematologiinstrumenter? Når kommer de til kort? Marthe Wedø Aune Avd. for Medisinsk biokjemi NKK møte, mars 2016

Transkript

1 Hva skiller ulike hematologiinstrumenter? 1 Når kommer de til kort? Marthe Wedø Aune Avd. for Medisinsk biokjemi NKK møte, mars 2016

2 ADVIA 2120 CELLDYN SAPPHIRE Sysmex XN 2 Coulter DXH 800 ABX Pentra DX Nexus

3 Sysmex XN 9000 v/ St Olav 3

4 Om instrumentene 4 Alle instrumenter: Kan tilkobles autovalideringssystemer og utstryks og fargemaskiner har GOD analytisk kvalitet Flagger og teller kjerneholdige røde og korrigerer leukocyttall for medtelling av NRBC (NB! Hvis DIFF mode for ADVIA 2120) Designet for å telle og klassifisere normale, modne leukocytter Flagger eller kvantifiserer tilstedeværelse av umodne eller abnormale celler Holdbarhet for de ulike parametrene varierer med metodene som benyttes i de ulike instrumentene Alle instrumenter har Bodyfluid kanaler

5 5 normale leukocyttyper 5 Nøytrofil granulocytt, segmentert Lymfocytt Monocytt Eosinofil granulocytt Basofil granulocytt

6 Hva skiller instrumentene? Analysereportoar,metoder,prinsipper Analysehastighet ( antall prøver pr time) Linearitet FLAGGING og kvantifisering av abnormale og umodne celler Interferenter for ulike parametere og metoder Holdbarhet for de ulike parametrene

7 Hematopoiesen ( Ref.:The Morphology of Human Blood Cells; DIGGS,Sturm,, BELL; fifth edition).

8 Erytrocyttmorfologi Normal erytrocytt; rund/oval form, bikonkav, godt mettet liten hvit oppklaring midten Angivelse av størrelse: Normocytær= normal Mikrocytær=små Makrocytær=store Anisocytose: stor størrelses-variasjon Angivelse av hemoglobin- Metning (Hgb-metning): Normokrom=normal Hypokrom= lav hgb-metning Hyperkrom=økt hgb-metning (sfærocytter) Polykromasi=RNA medfører blåfarging Poikilocytose: ulik form på erytrocyttene (teardrop, sfærocytter,scistocytter etc)

9 Hva skiller instrumentene? ADVIA 2120 Celldyn Sapphire Sysmex XN Coulter DXH 800 ABX DX Nexus Spinalvæske- kanal Bodyfluid kanal NRBC FLAG, Reanalysering m/diff+nrbc FLAG + reflextesting med NRBC 6-part DIFF? m/luc m/ NRBC m/ IG mulig m/nrbc m/lic og ALY DIFF med subpop.? (+) - (CYTODIFF) + Blastkvant.? /+ (LIC) Immunologis ke metoder? - PLT:CD 61 T-lymf: CD3,4,

10 Hva skiller instrumentene? ADVIA 2120 Celldyn Sapphire Sysmex XN 2000 Coulter DXH 800 ABX DX Nexus Holdbarhet RBCindekser (rom) Holdbarhet DIFF (rom) Diff av RBC (Micro,Macro, Hypo, Hyper) <8 timer 8 timer 8 timer 24 timer 24 timer 24 timer 24 timer 48 timer 24 timer 24 timer WBC kanal for å skille blaster fra abnormale lymfocytter - - WPC (CYTODIFF + flow) - Interferens av lysresistente røde ( LPK) ++ + (+) +?

11 Analyseprinsipper Instrument LPK EPK Hgb TPK DIFF NRBC Retik 11 ADVIA 2120 Peroxidas e og optisk scatter (lobularite t/kjernetet thet) Cellene sfæres Optisk metode Cyanidfri Fotometri + cellulært målt PLT-O 2 dim, refraktiv indeks Peroxidas e og optisk scatter Utføres når DIFF er best. BAROX met. Absorban ce Oxazin 750 CELLDYN Sapphire Optisk scatter v/ 4 vinkler+ fluorosce nce Cellene sfæres Imp. + Optisk Cyanid fri, Fotometri PLT-O PLT-I PLT- CD61 (imm.- met) Optisk scatter v/ 4 vinkler+ 3-farge fluorosce nce Måles i alle prøver fluorsece nsce ( PI) Fluorscen ce Modifisert thiazol orange UniCel DxH 800 Impedans e Impedans e Cyanidfri, fotometris k Impedans e VCS m/- 5 optiske målinger Flowcyto metrisk metode Absorban ce

12 Analyseprinsipper Instrument LPK EPK Hgb TPK DIFF NRBC Retik 12 ABX Pentra Nexus Imp. + basotall fra Baso kanal Imp Modifisert cyanmeth emoglobi nmet. Imp DHSS Cytokjemi (Chlorazol black) og Absorban ce Impedans e + fluoresce nce Fluoresce nce, thiazol orange Sysmex XN WNR, WDF, WPC Fluoresce nce,kompl eksitet, volum Imp. m/hydrod yn fok + optisk Cyandidfri (SLS), fotometri PLT-I (imp) PLT-O (opt) PLT-F (fluoresc. Oxazine). ACAS & SAFLAS, Fluorsece nce,kompl eksitet, Fluoresce nse i WNR kanalmåles i alle prøver Fluoresce nce, polymethi n

13 ADVIA 2120 Hva skiller instrumentene? Coulter Unicel DxH CELLDYN Sapphire Sysmex XN Pentra DX Nexus Kapasitet Prøvevolum 175 ul 165 ul 112,5 ul 88 ul 200 ul Nedre nivå Bodyfluid kanal LPK Nedre nivå Bodyfluid kanal EPK > /L > /L (> /L, Har ikke egen kanal) > /L > /L ( > /L, Har ikke egen kanal) > /L (CV 20%) > 1000 x 10 6 /L x 10 6 /L Nedre nivå LPK CSF kanal Nedre nivå EPK CSF /L PMN/MN rapp > /L /L

14 Linearitet 14 Instrument ADVIA 2120 LPK EPK Hgb TPK MCV NRBC Retik 0,02 400,0 0,0 7,0 0,0 22, ,2 24,5% CELLDYN Sapphire 0,4 285,5 0,022 9,06 0,7 24, (PLT-O) ,0 1,5 x 10*12/l (CD 61) UniCel DxH 800 0, ,0 0,005-8,50 0,1 25, /100 WBC 0 30% ABX Pentra Nexus , (HCT:0-67%) Sysmex XN 0,00-440,0 0,0 8, , (HCT:0 75%) 0 600/100 WBC 0 30%

15 FLAG FLAG av umodne og abnormale celler i ulike instrumenter ADVIA 2120i Sysmex XN Celldyn Sapphire Coulter DXH 800 ABX DSX Nexus 15 Bands Leftshift Left shift x Left shift x IG x x x x x Blaster x x x NE Blast Atypiske lymfo MO-Blast LY Blast x x x x x x (LIC) Abnormale lymf x Myeloperoxi dasemangel x NRBC x x x x Fragmenter (RBC) x x (RIC/ROC og PIC&POC)

16 15-20 цm цm цm цm цm цm La Citología optica en el diagnóstico hematológico. S. Woessner, L. Florensa. 4th edition. Edit. Acción Médica

17 CLL PL Follicular Lymphoma MZL Hairy cell Leukemia Lymphocyte Morphology Hairy cell Leukemia variant LGL-leuk Sezary Syndrome T- PL Lymphoplasmacytic lymphomav Dr. R. Simon B-Coulter Plasma cell Leukemia Splenic LGL-Leukemia lymphoma (NK) CD56+ marginal zone Adult T leukemia lymphoma

18 Kvantifisering av subpopulasjoner av leukocytter % og # ADVIA 2120 Sysmex XN Celldyn Sapphire +konf.faktor Unicel DXH ABX Pentra DX Stavkjernede nøytro Bands Meta, myelo og promyelo IG IG IG IMG Segm. nøytro (Nøyt -hvis satt opp som 6-part DIFF) Segm Nøyt Atypiske lymfo LUC Varlymf ALY Umodne celler LUC LIC IMM IML Blaster Blasts Blasts

19 Kvantifisering av DIFF subpopulasjoner Double Diff Matrix Celldyn Sapphire Eosinofile Large Immature Cells Neutrofile IMmature Granulocytic line Lymfocytter IMmature Monocytic line IMmature Lymphocytic line Monocytter Atypiske LYmfocytter ABX Nexus

20 ADVIA

21 Normal Iron deficiency Iron treatment Haemoglobin S+C Megaloblastic Cryoglobulins Haemolytic Uraemia Spherocytosis Elliptocytosis Sickle Cell Anaemia a Thalassaemia b Thal Major

22 ADVIA PANDA- diagnostisk verktøy 22 Lab hem.11;47-61,2005,

23 CELL-DYN Sapphire - Technology Impedance Hydrodynamically focused Spectrophotometri MAPSS Immunology CD 61 CD4 & CD8

24 CELLDYN SAPPHIRE 24 Eneste hematologiinstrument med automatiserte immunologiske metoder Kan i prinsippet benyttes som et standard flowcytometer CD 61: imm PLT-metode- eneste metode som teller PLT uavhengig av størrelse Telles nøyaktig ned til 1 x 10 9 /L Stabilt i 96 timer ( rom og kjøl) Repeterbarhet : 1,6% ved PLT=19 CD4 & CD8- T-lymfocytter: benyttes for HIV pasienter. Ikke egnet for en del kreftpas. Og pasienter med Sezary lymfom Korrelerer godt med Facscanto flowcytometer

25 Sysmex XN 25 Svært fleksibelt analysesystem kan velge/kjøpe moduler etter behov Standard: CBC + DIFF Kan velge ekstra: Retik, PLT-F, WPC, Bodyfluid kanal PLT-F: nøyaktig og presise målinger i lavt nivå Lav WBC mode ( 3 x prøvevolum sammenliknet m/ WNR-kanal) Korrigerer for medtelling av NRBC i alle prøver ( CBC) Godt autovalideringssystem: Extended IPU 3 kanaler for telling av WBC: -WNR: telling av WBC,NRBC + basofile -WDF: klassifisering av Lymf,Mono,Eos, Neut+Baso -WPC: skiller mellom blaster og abnormale lymfo

26 Sysmex XN- WNR,WDF og WPC kanal WNR WPC WDF

27 27

28 28

29 Sysmex PLT-F Fluorokrom Oxazine Sammenliknbar med CD 61 i lavt nivå ( ned til 1 x 10 6 /L), men IKKE for prøver med interferens ved lipemi, WBC og RBC fragmenter Betydelig bedre enn PLT-i og PLT-O. Ved 48 timer ( oppbevart i romtemp) en del prøver 30-50% falskt for lave.

30 Sysmex XN Bodyfluid kanal 30 LPK telles og klassifiseres i WDF kanal Fortynning LPK: 1:20 Antall celler som telles i BF kanal er ca 10x høyere enn iwb mode. RBC: fortynning 1:498 ( DC metode)

31 Coulter UniCel DxH Ny design Korreksjon av CBC parametere ved høy WBC Ny RBC måling nrbc-for interferens korr. Utvidet måleområde for WBC,RBC ogplt Lavere bakgrunnsverdier ved analyse av Bodyfluid Ny flowcytometrisk metode for NRBC Ny korreksjon for interferens fra PLT klumper DIFF: Fortsatt VCS teknologi, men med 5 lysspredningsmålinger i tillegg til volum og radiobølger- 29 målinger pr celle!

32 Cyto DIFF + FC 500 Beckman Coulter flowcytometer + Remisol 32

33 UniCel DxH+ CYTODIFF+ FC 500 = 16 parameters DIFF 100 ul blod + 10 ul CytoDIFF 20 min inkubasjon Analysering og autogating Resultatene fra CytoDIFF integreres med DIFF fra DxH i Remisol- 16 parameters DIFF Resultater for utvidet DIFF rapporteres etter ca 1,5 time Direkte deteksjon av: WBC, NEU, LY, MO, EOS, BASO, IG, T+NK Ly, B Ly Indirekte deteksjon av: Blasts, T+NK blasts, B blasts, NRBC, reactive LY, myeloid blasts, plasma cells 33

34 Hva skiller ulike instrumenter- når kommer de til kort? Blastdeteksjon og kvantitering av blaster Evnen til å differensiere leukocytter ved abnormal morfologi FLAGGING av tilstedeværelse av abnormale celler Telling og korrigering av kjerneholdige røde Trombocyttmetoder- interferens problematikk 34

35 35 Når kommer de til kort? Generelt : Ved abnormal morfologi Svært lave eller svært høye leukocyttantall Ved aldring av prøver Oppbevaring av prøver for varmt eller for kaldt Inklusjoner i cellene; malaria, leishmania, Howell Jolly bodies mfl

36 36

37 Når kommer de til kort ved Abnormal morfologi? Nøytrofile granulocytter To populasjoner Normalt store + abnormalt store Pyknotiske nøytrofile, Pelger Huet anomali Uttalt vakuolisering Abnormale lymfocytter ( eks Sezary celler) Segmenterte monocytter MDS ( nøytro/mono problematikk) Eosinofile granulocytter Atypisk granulering Spesielle medikamenter Eos feiltolkes som nøytrofile gran Peroxidasemangel ( ADVIA) 37

38 Nøytrofile granulocytter (hypo-granulerte/abnormalt granulerte EOS telles som Nøytro i instrumentene) Instr Nøytrofile % Eos % ADVIA * 20 Sysmex XE 2100 Celldyn Sapphire s 0,1 Cellavision 7 91

39 Instrument/ metode Trombocytter- interferens Trombocytter i prøve med Lipemi + hemolyse ADVIA 2120i Trombocytter i prøve med WBC fragmenter Sysmex XE 2100 Sysmex XN 2000 Celldyn Sapphire PLT-i: 573 PLT-i : 65 PLT-O: 240* PLT-F: 300 PLT-F: 55* PLT-O: 266* PLT-O:45 PLT-i: 559 * PLT-i: 92* CD 61: 163 CD 61: 29

40 40 CD 61 ( Celldyn Sapphire) Falskt for lave resultater ved: Glanzman s trombasteni Heterofile antistoffer Uttalt lipemi

41 Utstryk -Xe2, utstryk - ADVIA NRBC Differanse plott NRBC ; %UTSTRYK-XE 2100/2ADVIA 2120, n=74 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0-10,0-20,0-30,0-40, %UTSTRYK

42 Falske flag pga holdbarhet ADVIA 2120: Falske Flag for Left shift og IG for ca 90% av prøvene etter 24 timer (rom og kjøl) Falske Flag for NRBC for ca 50% av prøvene etter 24 timer i romtemp. Celldyn Sapphire: Falske flag etter 24 timer rom for: Band (50%),IG (60%), nwbc (90%), Blast (7%) Sysmex XE 2100: få falske FLAG Sysmex XN: Aged sample software reduserer falske flag med 23% ( se St Olav flag)

43 43

44 Sysmex XN Flag på prøver oppbevart i rom og kjøl 0-96 t. 44 N=60 Ig pres. WBC Atyp abn sc lymf Abn lymf Plt clumps Plt abn distr Plt abn scatt Lymfo cytose Monoc Bla Hypokr Macroc ytose st omasi ytose ROM 0t 1 3 8t t t t t t KJØ L 0t t t t t t t

45 FLAG Evaluering prøver tatt av pasienter med maligne hematologiske sykdommer ble analysert på Sysmex XN 2000, Sysmex XE 2100, CELLDYN SAPPHIRE,ADVIA 2120 og Unicel DxH. Analysert innen 4 timer. 200 cellers manuell DIFF utført av 2 personer International Journal of Lab Hematology; Optimal Flagging combinations for best performance of five blod celle analyzers.volume 37, Issue 1, side Feb M Depoorter et al.

46 46 Flag Evaluering International Journal of Lab Hematology; Optimal Flagging combinations for best performance of five blod celle analyzers.volume 37, Issue 1, side Feb M Depoorter et al.

47 FLAG Evaluering 47 Blast FLAG: ADVIA 2120 best- fulgt av Sysmex XN Atypiske LYMFO: DXH best, fulgt av Sysmex XN IG og Left shift: Sysmex XN NRBC: UniCel DXH International Journal of Lab Hematology; Optimal Flagging combinations for best performance of five blod celle analyzers.volume 37, Issue 1, side Feb M Depoorter et al.

48 «Optimal Flagging combinations for best performance of five blood cell analyzers», IJLH, 2014, M.Depoorter, S Goletti, D. Latinne, JP Defour

49 Blast Sensit ivitet Blast Specif isitet VarLymf Sens VarLymf Spec IG Sens IG Spec PLT Clumps Sens PLT Clumps Spec Sysmex XN 2000 Sysmex Xe 5000 Advia 2120 i Celldyn Sapphire Coulter DXH pasienter, valgt tilfeldig- Ludwig-Maximilians-University Munich