(12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP 226406 B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. B23K 26/00 (06.01) A01N 1/00 (06.01) A01N 1/02 (06.01) B23K 26/24 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert 13.03.2 (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet 12..31 (86) Europeisk søknadsnr 09723.4 (86) Europeisk innleveringsdag 09.03. (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato.12.29 () Prioritet 08.03.11, FR, 0816 (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver Imagene, 2 Allée du Doyen Georges Brus Parc Scientifique Unitec 1, 33600 Pessac, Frankrike (72) Oppfinner TUFFET, Sophie, 1 rue de Cadaujac, F-33800 Bordeaux, Frankrike DE SOUZA, David Georges, 1 rue de Cadaujac, F-33800 Bordeaux, Frankrike (74) Fullmektig Plougmann & Vingtoft, Postboks 03 Sentrum, 04 OSLO, Norge (4) Benevnelse Industriell fremgangsmåte for innkapsling av biologiske materiale med sikte på oppbevaring ved omgivelsestemperatur med en vakuumforseglingstest av kapslingen (6) Anførte publikasjoner CN-A- 1 708 JP-A- 02 07 8 US-A1-06 099 67 US-B1-6 167 70 WO-A-04/033729
1 Tittel: INDUSTRIELL FREMGANGSMÅTE FOR INNKAPSLING AV BIOLOGISK MATERIALE MED SIKTE PÅ OPPBEVARING VED OMGIVELSESTEMPERATUR MED EN VAKUUMFORSEGLINGSTEST AV KAPSLINGEN Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en industriell fremgangsmåte for innkapsling av biologisk materiale, særlig DNA, nærmere bestemt med sikte på oppbevaring ved omgivelsestemperatur. Patentet EP 1 07 1, som beskriver en fremgangsmåte for langtidsoppbevaring av DNA i en lufttett, rustfri metallkapsel, er kjent. 1 Dokumentet WO 04/033729, som representerer den nærmeste kjente teknikken, beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av en prøve av biologisk materiale i en beholder med sikte på oppbevaring, gjenvinning og senere anvendelse omfattende følgende trinn: fremstilling av det biologiske materialet, merking av beholderen med registrering av identifikasjonen, overføring av dette materialet til beholderen under kontrollert atmosfære, dehydrering av det biologiske materialet, forsegling av beholderen under kontrollert atmosfære og plassering i en oppbevaringsstasjon når testen er gunstig. 2 Dette DNA innkapsles i en nøytral atmosfære og med en svært lav hygrometrisk grad for å gjøre oppbevaring mulig ved omgivelsestemperatur, hvilket således forhindrer anvendelse av komplekse og dyre kjøle- og/eller frysemidler. Denne fremgangsmåten kan anvendes på ethvert biologisk materiale fra mennesker, dyr eller planter og omfatter særlig: vev, celler, mikroorganismer slik som bakterier, sopp, encellede alger, virus, proteiner og nukleinsyrer slik som DNA og RNA. Det biologiske materialet anvendes i stadig flere sammenhenger, både på forskningsfeltet og en lang rekke andre felter slik som bioteknologi, helse, miljø, landbruksbasert næringsmiddelindustri, identifikasjon, rettsvesenet og
2 kriminologi, og det blir avgjørende å bygge opp banker med prøver av biologisk materiale eller biblioteker. En prøvebank krever absolutt streng klassifisering og identifisering. En eventuell manuell behandling i laboratoriemålestokk er faktisk uegnet til oppbygging av slike biblioteker. Det bør derfor konstrueres automatiserte systemer for produksjon av prøver av biologisk materiale, fra det initiale biologiske materialet til dets anvendelse. Denne anvendelsen kan skje etter svært variabel tid, opp til flere tiår senere. 1 Et slikt system bør tilveiebringe følgende trinn: fremstilling av prøven av biologisk materiale og kontroll av dens kvalitet, plassering av prøven i en beholder og oppbevaring av den og deretter gjenvinning av det biologiske materialet med sikte på dets anvendelse fra den således oppbevarte prøven av biologisk materiale. Under alle disse trinnene er det nødvendig å sikre styring av alle prøvenes kvalitet og sporbarhet. Til dette formål er det nødvendig å tilveiebringe en identisk beholder for alle prøvene for for eksempel å gi mulighet til håndtering ved hjelp av forskjellige automatiske anordninger og utveksling av prøvene mellom brukere. 2 Det er også nødvendig å sikre oppbevaring ved omgivelsestemperatur under betingelser som begrenser nedbryting av det biologiske materialet, og gi mulighet for merking med sikte på angivelse av disse prøvene og klassifisering av dem samtidig som det primære målet oppnås: gjøre det mulig å gjenvinne det biologiske materialet og anvende det. Denne beholderen må gi mulighet for håndtering ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen på en automatisert måte og særlig ved hjelp av holdere av stativtypen som overholder formatet til mikroplatene i den såkalte SBSstandarden, et varemerke som tilhører selskapet SBS. 3 Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen består av å anvende denne
beholderen og tilveiebringe en serie av suksessive trinn for å behandle det biologiske materialet industrielt. 3 Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen beskrives nå nærmere ifølge en særlig og optimalisert utførelsesform. Fremgangsmåten for fremstilling av prøver av biologisk materiale ifølge den foreliggende oppfinnelsen er definert i krav 1. Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatter også anvendelse av den fremstilte prøven etter gjennomføring av de forutgående trinnene i krav 1. Denne fremgangsmåten for anvendelse består av følgende suksessive trinn: 1! identifisering av en bestemt beholder plassert på et stativ ved avlesning av merkingen! åpning ved perforering av beholderens propp! resolubilisering av det biologiske materialet i beholderen! prøvetaking av det gjenvunne biologiske materialet! anvendelse særlig til analyseformål Oppfinnelsen beskrives nå nærmere. 2 Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen består derfor av å fremstille det biologiske materialet, rense det og solubilisere det. Dette biologiske materialet er om nødvendig fordelt på flere prøver av mindre volum på grunnlag av kravene og det tilgjengelige materialets initiale volum. Prøvens kvalitet kontrolleres under eller før alikvoteringsoperasjonen. Hver prøve og/eller hver alikvot er dessuten angitt. Kvalitetskontrollen av det biologiske materialet er for eksempel kombinasjonen av teknikker slik som en måling av optisk densitet, en måling av fluorescens, en elektroforesegel, en måling av proteiner eller en molekylær amplifikasjon. Hver
4 prøve som kontrolleres, og som oppfyller kvalitetskriteriene, overføres til en beholder. Parameterne som er knyttet til denne beholderen i seg selv, er svært viktige. For å utføre fremgangsmåten er den tilveiebrakte beholderen metallisk og sylindrisk i formen, oppnådd ved deformasjon av metall av stansingstypen. Metallet er med fordel rustfritt stål 4L eller, for å være mer metallurgisk korrekt, indeksert under kvaliteten Z2CN18-. Denne beholderens dimensjoner, i dette tilfelle en diameter på 7 mm, en lengde på 18 mm for den sylindriske innkapslingen og en veggtykkelse på 0,2 mm, er valgt av en rekke grunner. 1 Disse dimensjonene er for det første definert slik at hver beholder kan få plass i brønnen til en standard mikroplate, særlig en mikroplate med SBS-standarden. Det rustfrie stålets kvalitet muliggjør dessuten, foruten de iboende kvalitetene knyttet til dette materialet slik som korrosjonsmotstand, på den ene side en ypperlig deformabilitet som gir mulighet til produksjon av en slik type beholder ved stansing med svært høy presisjon og total reproduserbarhet, det hele til en svært fordelaktig kostnad, og på den annen side en god egnethet til sveising. 2 En sylindrisk beholder kan selvfølgelig oppnås fra en sylinder og en første sveiset propp, men denne utførelsesformen ville bare være en teknisk ekvivalent. Den ville ha den ulempe at den krevde en ekstra sveis og ville ha en ekstra risiko for lekkasje. Det er derfor denne oppfinnelsen tilveiebringer en beholder som er oppnådd på en monolittisk måte fra en enkelt del som er mekanisk deformert. Beholderen må dessuten indekseres før den forsynes med det biologiske materialet i den forstand at det viser seg å være nødvendig i en automatisert fremgangsmåte slik som denne ifølge den foreliggende oppfinnelsen for å sikre fullstendig sporbarhet. 3 Denne merkingen foretas foretrukket ved hjelp av en laser. Denne kan
gjennomføre en merking bare ved kontrast på materialets overflate ved en endring i tilstand på denne overflaten, fullt synlig for det blotte øye og særlig for ethvert elektronisk øye. Det er også mulig å gravere det, dvs. angripe materialet. Merkingen plasseres nærmere bestemt på beholderens ytre bunn og omfatter som identifikator en Data Matrix-matrisekode og/eller et system av alfanumeriske tegn. En annen løsning består av å bruke en RFID-etikett, idet det anvendes radiofrekvensbølger til å identifisere hver beholder og tilføye andre opplysninger om nødvendig. 1 Det bør anføres at en slik ekstra merking omfatter en etikett som sikrer beskyttelse av RFID-antennen, idet antennen er et aktivt element og derfor beskyttet. Denne merkingen kan betraktes som permanent. Den således merkede beholderen plasseres på et stativ på et sted hvis koordinater også registreres, foruten stativets koordinater. Beholderen er klar til å bli forsynt med det tidligere identifiserte biologiske materialet, selv om en automatisk anordning kan avsette det biologiske materialet i den indekserte beholderen slik at det gjøres bruk av henvisningene assosiert med det biologiske materialet og beholderen som er forsynt med det. 2 Ved DNA blir væsken hvor det oppløses, foretrukket overført til en glassinnsats som i seg selv på forhånd plasseres i beholderen. Beholderen og det biologiske materialet som den er forsynt med, utsettes for dehydreringsmidler av fordamper/konsentrator-typen. Kjente midler består av å bruke plassering under vakuum til å dehydrere det biologiske materialet som deretter danner en tørr avsetning på glassinnsatsen. 3 Denne dehydreringen forskyves slik at det biologiske materialet bringes til et egnet dehydreringsnivå for å forhindre eventuell nedbryting på grunn av vannet, i størrelsesordenen 1 % for å gi en størrelsesorden ved DNA.
6 Beholderen og det dehydrerte biologiske materialet utsettes deretter for en kontrollert atmosfære, f.eks. en inert gass eller en blanding av inerte gasser argon, helium, tørrgasser for å forhindre enhver reaksjon av kjemisk eller enzymatisk hydrolyse og oksidering. Beholderen forsynes med en propp for å stenge den inerte gassen inne i beholderen, hvilket således forhindrer forekomst av oksygen og atmosfærisk vann og beskytter det biologiske materialet mot lys som kan forårsake modifikasjoner for eksempel ved DNA. 1 Denne proppen er med fordel sylindrisk, av kort lengde, f.eks. 3 mm, og tilveiebrakt for å overføres til den sylindriske innkapslingen. Straks den er overført, sidestilles proppens perifere kant således med beholderens perifere kant. Dette er plassering av en sylinder i en sylinder. 2 Under kontrollert atmosfære sveises proppen samtidig på beholderen, slik at beholderen blir lufttett og det dehydrerte biologiske innholdet holdes under kontrollert atmosfære og beskyttet mot lys. Sveisen er en sveis uten tilførsel av metall og uten tilførsel av varme av sveisetypen ved laserstråle eller elektronstråle, idet laserstrålen er foretrukket på grunn av dens enkle anvendelse og dens kostnad. I tillegg, og dette er svært viktig, er sveisen ved laserstråle foretrukket av den pulsede YAG-lasertypen, hvilken i svært høy grad begrenser stigningen i temperatur utenfor sveiseområdet, i den grad at den kan betraktes som ubetydelig i forhold til beholderen. Veggenes lille tykkelse krever også en begrenset effekt og dessuten en svært kort intervensjonstid. Med "uten tilførsel av varme" menes at den avgitte varmen er lokalisert og svært svak, og at det biologiske materialet ikke blir utsatt for noen nedbryting, særlig hvis det plasseres i en glassinnsats som delvis isolerer det fra metallbeholderen. Fremgangsmåten gjør det således mulig å forsegle beholderne svært hurtig og
7 pålitelig på en lufttett måte og automatisk, siden diameteren er konstant og fullstendig reprodusert. Men for å verifisere at beholderen er helt lufttett, og at det biologiske materialet vil forbli intakt, tilveiebringer fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen en systematisk test for forsegling mot gasser etter sveising. Denne testen består av å plassere den sveisede beholderen i et kammer som plasseres under vakuum, et kammer hvor det plasseres en sensor som kan påvise gassen eller gassblandingen i den kontrollerte atmosfæren som overføres og innestenges i beholderen. 1 Ved forseglingsdefekt i sveisen vil molekyler av gassen eller gassene innestengt i beholderen slippe ut av kammeret under opprettelse av et partielt vakuum og bli oppdaget av sensoren, hvilket medfører en nedgradering av prøven, med det resultat at den defekte beholderen fjernes fra systemet. Det biologiske materialet kan gjenvinnes og plasseres på nytt i en ny beholder. I tilfelle lekkasjetesten viser seg å være tilfredsstillende, plasseres den lufttett forseglede beholderen på nytt på sitt stativ, og de forskjellige beholderne kan for eksempel oppbevares i et bibliotek. 2 Indekserte stativer av mikroplatetypen plasseres da i hver av brønnene hvorfra en indeksert beholder og dets biologiske materiale, også indeksert, finnes. Det er derfor enkelt å klassifisere de således produserte prøvene. Oppbevaringen skjer ved omgivelsestemperatur for de fleste prøvene. 3 Ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anføres det imidlertid at visse prøver av skjørt biologisk materiale, som burde oppbevares ved frysetemperaturer på lavere enn eller på - C, nå kan oppbevares ved temperaturer som er nær null ved utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, hvilket er en betydelig fordel fremfor svært lange oppbevaringsperioder.
8 Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også gjenvinning og anvendelse av dette biologiske materialet, siden det er selve essensen ved den foreliggende oppfinnelsen: oppbevaring til anvendelse. Til dette formål tilveiebringer fremgangsmåten midler for resolubilisering i et løsemiddel av biologisk materiale slik at det kan anvendes for eksempel til analyseformål. Fremgangsmåten tilveiebringer derfor samling av prøven eller prøvene som gjennomsøkes og angis i biblioteket. 1 Straks prøven er identifisert, kan beholderen åpnes ved enkel perforering av proppen. Denne perforeringen forhindrer med fordel overføring av metall og andre partikler som kan forekomme ved åpning ved mekanisk maskinbehandling. Ved en formhukommelseseffekt knyttet til den gjennomførte stansingen krummes de avskårne delene og etterlater en fullkomment fri åpning som er tilgjengelig for prøvetakingsmidler slik som automatiserte pipetter. Perforeringens posisjon kontrolleres og midtstilles fullkomment i proppen selv om bevegelsene av den automatiske anordningens pipetter kan programmeres fullkomment. 2 De forskjellige trinnene i fremgangsmåten som beskrevet kan gjennomføres suksessivt eller parallelt. Merkingen av beholderen kan således foretas samtidig med fremstillingen av det biologiske materialet, slik at materialet kan overføres til den således merkede reserverte beholderen. Merkingen kan også foretas før fremstillingen av materialet ifølge organiseringen av systemet.
9 Patentkrav 1. Fremgangsmåte for fremstilling av en prøve av biologisk materiale i en beholder med sikte på oppbevaring, gjenvinning og senere anvendelse, omfattende følgende trinn: - fremstilling av biologisk materiale med tilsetning i løsning, - kvalitetskontroll av det således fremstilte biologiske materialet, - merking av beholderen med registrering av identifikasjonen, - overføring av dette materialet til beholderen under kontrollert atmosfære, - dehydrering av det biologiske materialet, - forsegling av beholderen under kontrollert atmosfære, 1 - test av beholderens forsegling ved å plassere den lukkede beholderen i et kammer som plasseres under vakuum og ved å påvise gassen eller gassblandingen i den kontrollerte atmosfæren som er overført og innestengt i beholderen som slipper ut av beholderen under vakuumeffekt, og - plassering i en oppbevaringsstasjon når testen er gunstig. 2. Fremgangsmåte for fremstilling av en prøve av biologisk materiale ifølge krav 1, karakterisert ved at beholderen er av metall og omfatter en propp, lukkingen er sikret ved sveising av proppen under termisk oppvarming. 2 3. Fremgangsmåte for fremstilling av en prøve av biologisk materiale ifølge krav 2, karakterisert ved at sveisen utføres ved sveising ved hjelp av en laserstråle av den pulsede YAG-typen.
4. Fremgangsmåte for fremstilling av en prøve av biologisk materiale ifølge krav 3, karakterisert ved at den kontrollerte atmosfæren er sammensatt av en inert gass eller en blanding av inerte tørrgasser for å forhindre enhver reaksjon av kjemisk eller enzymatisk hydrolyse og oksidering av det nevnte biologiske materialet.. Fremgangsmåte for fremstilling av en prøve av biologisk materiale ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert ved at plasseringen i en oppbevaringsstasjon tilveiebringer plasseringen av hver beholder på et stativ, en identifikasjon av stativet og en registrering av posisjonen av nevnte beholder på stativet. 1 6. Fremgangsmåte for fremstilling av en prøve av biologisk materiale ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert ved at dehydreringen skjer ved plassering under vakuum. 7. Fremgangsmåte for anvendelsen av den fremstilte prøven, etter gjennomføring av fremgangsmåten for fremstilling av prøven ifølge ett av kravene 1 til 6, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: - identifisering av en bestemt beholder plassert på et stativ ved avlesning av merkingen, - åpning ved perforering av beholderens propp, - resolubilisering av det biologiske materialet i beholderen, - prøvetaking av det gjenvunne biologiske materialet og 2 - anvendelse av det biologiske materialet, særlig til analyseformål.