(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

(12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP 76243 B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. A61K 9/08 (06.01) A61K 38/19 (06.01) A61K 47/12 (06.01) A61K 47/26 (06.01) A61P 7/00 (06.01) A61P 3/00 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert 1.02.16 (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet 14..01 (86) Europeisk søknadsnr 0878714.0 (86) Europeisk innleveringsdag 08.08.27 (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato 09.07.08 () Prioritet 07.08.27, DE, 07040932 07.08.27, EP, 07016763 (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver ratiopharm GmbH, Graf-Arco-Strasse 3, 89079 Ulm, DE-Tyskland (72) Oppfinner HINDERER, Walter, Dekan-Schuster-Str. 2, 631 Rodgau, DE-Tyskland LUBENAU, Heinz, An Der Eselshaut 12, 6743 Neustadt, DE-Tyskland (74) Fullmektig Onsagers AS, Postboks 1813 Vika, 0123 OSLO, Norge (4) Benevnelse Flytende formulering av G-CSF (6) Anførte publikasjoner WO-A-94/14466 WO-A-0/0396 WO-A-0/0424 WO-A-07/09914 HERMAN A C ET AL: "CHAPTER 7: Characterization, formulation, and stability of Neupogen (Filgrastim), a recombinant human granulocyte-colony stimulating factor", 1 January 1996 (1996-01-01), FORMULATION, CHARACTERIZATION, AND STABILITY OF PROTEIN DRUGS: CASE HISTORIES,, PAGE(S) 3-328, XP009249, ISBN: 978-0-6-4332-8 RATIOPHARM PRESS RELEASE: 'Biosimilar Ratiograstim receives EMEA approval' September 08, EMEA: 'Assessment Report for Ratiograstim' 08, "Filgrastim" In: McEvoy, G.K. (ed.): "AHFS Drug Information 01", 01, American Society of Health System Pharmacists pages 144-1463,

1 1 2 3 Målet for foreliggende oppfinnelse er medikamenter til anvendelse i behandlingen av kreft, alvorlig kronisk nøytropeni (SCN), HIV-infeksjon, skade på sentralnervesystemet eller av skadelige bivirkninger som skyldes cytotoksisk kjemoterapi omfattende en vandig, flytende formulering av G-CSF, vesentlig bestående av G-CSF og en sukkeralkohol, polysorbat 80 ved en konsentrasjon på 0,0-0,06 mg/ml, acetat ved en konsentrasjon på - mm som en buffer ved ph 4.1-4,3, og eventuelt aminosyrer og/eller glyserin og/eller karbohydrater og/eller preserveringsmidler, der acetat blir tilsatt i formen av sin eddiksyre og ph blir justert med NaOH. Mange av de til nå kjente medikamentformene for proteinmidler har ulemper. F.eks. inneholder visse preparater farmasøytiske tilsetningsstoffer som ikke egentlig kan bli klassifiserte som harmløse fra et medisinsk ståsted. På grunn av deres opphav og fysiokjemiske egenskaper har polymerer og proteiner et visst risikopotensial med hensyn på deres hensiktsmessighet som farmasøytiske tilsetningsstoffer. Proteiner av humant opphav eller dyreopphav i tillegg til proteiner som er oppnådd fra cellekulturer har en viss gjenværende risiko for å inneholde virale kontamineringer. På grunn av deres antigenegenskaper kan andre proteinliknende kontamineringer, som er vanskelige å påvise analytisk, også utløse immunologiske reaksjoner hos mennesker. Videre kan proteiner av dyreopphav utløse immunologiske reaksjoner hos mennesker på grunn av deres arts-spesifikke egenskaper generelt sett. Langtidsreaksjoner ved gjentatt bruk av slike proteiner på et senere tidspunkt er også mulig. Blandingen av forbindelser som har høy molekylvekt kan også være problematisk. Polymerer kan akkumuleres i kroppen på grunn av deres høye molekylmasse og kan derfor forbli i kroppen i lang tid, i tilfellet der det ikke er noen biologisk nedbrytning. Dette er spesielt en fare i tilfellet med subkutan applikasjon fordi fjerning og fordeling via blodstrømmen er mye mer forsinket sammenlignet med intravenøs applikasjon. Avhengig av den molare massen kan polymerer også ha antigene egenskaper. Videre er renheten til polymerer vanskelig å sikre på grunn av katalysatorene som benyttes i produksjonen eller på grunn av tilstedeværelsen av monomerer og andre polymerfragmenter. Anvendelsen av polymerer i flytende, farmasøytiske doseringsformer bør slik unngås så langt som mulig, spesielt med subkutant appliserbare medikamentformer. Videre er det fra litteraturen kjent at spesielle ikke-glykosylerte former av G-CSF, når de sammenlignes med glykosylert G-CSF, er ekstremt ustabile på grunn av oksidasjon og/eller aggregering. Det er derfor ekstremt vanskelig å stabilisere ikkeglykosylerte former av G-CSF og spesielt valgte tiltak er nødvendige for å formulere dette molekylet i stabil medikamentform.

2 1 2 3 Anvendelsen av surfaktanter for å stabilisere G-CSF bør prinsipielt bli unngått sett fra et medisinsk ståsted, fordi nevnte surfaktanter kan utløse lokal irritasjon. Formuleringer som har en svært lav ph-verdi, spesielt i tilfellet med subkutan applikasjon, kan også føre til lokale uforeneligheter i pasienter, f.eks. smerte og lokal vevsirritasjon, fordi nevnte ph-verdi ligger under det fysiologiske området fra ph 7,0 til 7, som foreligger i vevene. Den nylig publiserte internasjonale søknaden WO 0/0424 beskriver i likhet med det som er tilkjennegitt i EP 373 679 en måte for å oppnå stabile, farmasøytiske sammensetninger av G-CSF ved blant annet å holde nevnte sammensetninger fri for surfaktanter og, i overensstemmelse med sammensetningene beskrevet i eksemplene, ved å tilveiebringe bufferen ved en svært lav konsentrasjon. Det er ikke gitt noen indikasjoner med hensyn på hvor godt aksepterte medikamentene beskrevet der er. I EP 1 129 7 er preparater er preparater av G-CSF som har en ph-verdi i området fra til 8 beskrevet der sulfat er ment å skulle stabilisere G-CSF inneholdt i preparatet. Igjen er det ikke gitt noen indikasjoner med hensyn på hvor godt akseptert G-CSF-preparatene beskrevet der er. I In "Formulation, Characterisation, and Stability of Protein Drugs: Case Histories", Pearlman, Rodney, Wang, Y. John (Eds.), side 3-328 er sammensetningen av en kommersielt tilgjengelig G-CSF-formulering (Neupogen ) beskrevet. Problemet som ligger til grunn for foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en flytende medikamentform for G-CSF som ikke oppviser de ovenfor beskrevne ulempene ved de hittil kjente medikamentformene. Spesielt bør det farmasøytiske preparatet være stabilt over en lang tidsperiode i tillegg til fysiologisk akseptabelt. Det bør spesielt være passende for selvpåføring ved pasienter og det bør være kjennetegnet ved evnen til å unngå uønskede irritasjoner og smerte på injeksjonsstedet på huden som ofte oppstår sammen med selvpåføringen av medikamenter ved hjelp av en injeksjon eller infusjon. Problemet som løses ved utførelsesformene som er karakterisert i kravene er illustrert i de følgende utførelsesformene. Spesielt vedrører foreliggende oppfinnelse medikamenter for anvendelsen i behandlingen av kreft, alvorlig kronisk nøytropeni (SCN), HIVinfeksjon, skade på sentralnervesystemet eller skadelige bivirkninger som skyldes cytotoksisk kjemoterapi omfattende en vandig, flytende formulering av G-CSF, som vesentlig består av G-CSF og en sukkeralkohol, polysorbat 80 ved en konsentrasjon på 0,0-0,06 mg/ml, acetat ved en konsentrasjon på - mm som et bufferstoff ved ph 4,1-4,3, og eventuelt aminosyrer og/eller glysin og/eller karbohydrater og/eller preserveringsmidler, der acetat blir tilsatt i formen av sin eddiksyre og ph blir justert med NaOH. Videre kan den flytende formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse inneholde ytterligere farmasøytisk konvensjonelle eksipienser. Imidlertid er fraværet av nevnte og/eller andre eksipienser foretrukket.

3 1 2 3 I WO 94/14466 er generelt lagringsstabile, vandige farmasøytiske preparater av G-CSF krevd som er ment å skulle være stabile ved en ph-verdi innenfor området på 3, til og 7 til 8 ved anvendelsen av ulike buffersystemer. Imidlertid er kun flytende G-CSFpreparater med fosfatbuffer testet for deres lagringsstabilitet, mens individuelle, eksperimentelle preparater med andre buffere kun ble testet etter kort mekanisk stress, dvs., turbiditet for forekomsten av grums i prøvene. I prosessen med eksperimenter utført innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse måtte det bli vurdert at G-CSF-løsningene som hadde blitt indikert med acetatbuffer i eksemplene i WO 94/14466, spesielt formulering 4 med mm acetat ved en ph-verdi på 4,, ikke har den ønskede stabiliteten fordi kritiske verdier for tilstedeværelsen av aggregater og oksiderte former av G-CSF hadde blitt bestemt. Dermed ble det først antatt at, slik dette allerede er illustrert i EP 0 373 979, en ph-verdi på mer enn 4,0 ville føre til dannelsen av aggregater og at en flytende formulering av G-CSF med en ph-verdi med forbedret fysiologisk akseptabilitet ikke kunne bli oppnådd ved å benytte det ellers foretrukne acetatbuffersystemet. I WO 0/0396 ble G-CSF-formuleringer med sammensetningen 0,6 mg/ml G-CSF, mm acetatbuffer, 0,004 % (vekt/volum) Tween 80 og % (vekt/volum) D-sorbitol med en ph-verdi på 4,0 og 4,2 benyttet som sammenligningsformuleringer i undersøkelser på stabiliteten til G-CSF-formuleringer under påvirkning av mekanisk stress etter frysing og tining av G-CSF-formuleringer ved suksinatbuffer med en phverdi på,0 og 0,02 % (vekt/volum) Tween. Ifølge disse undersøkelsene var G-CSFformuleringene med acetatbuffer mindre stabile, slik at det ikke så fornuftig ut ytterligere å studere slike acetatbufrede sammensetninger, og i hvert fall ikke anse dem som kandidater for medikamenter. I motsetning til dette, i prosessen med eksperimenter utført innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse, så ble fordelaktige egenskaper for acetatbufrede G-CSFformuleringer med en ph>4,0 med hensyn på stabilitet ved lagringstemperaturer i et kjøleskap og ved 40 C, dvs., i området rundt kroppstemperatur, overraskende funnet i tillegg til en overraskende god akseptabilitet i pasienter, ettersom færre hudirritasjoner oppsto sammenlignet med kommersielt tilgjengelige medikamenter. Spesifikt ble det funnet at, i betydningen av foreliggende oppfinnelse, ved å kombinere henholdsvis eddiksyre og acetat, som et bufferstoff og en surfaktant slik som polysorbat 80, hver ved en spesifikk konsentrasjon og i nærværet av en sukkeralkohol slik som sorbitol, og ved å justere ph-verdien til omtrent 4,2 +/- 0,1, så blir en stabil formulering av G-CSF oppnådd som gir G-CSF-molekylene den nødvendige stabiliteten for deres hensiktsmessighet som et medikament, som er godt tolerert og som i tillegg muliggjør en nesten fullstendig forhindring av symptomer som ofte kan bli observert på injeksjonsstedet når medikamentet administreres. Dette gjør de flytende G-CSF-

4 formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse passende og fordelaktige til anvendelse i ferdigfylte sprøyter og sett tilveiebrakt med disse, spesielt til bruk hjemme. 1 2 3 De flytende formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse har videre fortrinnet av fortrinnsvis å være fri for proteinliknende eller polymere eksipienser, der anvendelsen av disse kan være problematisk sett fra et medisinsk ståsted. Som vist ved de kliniske studiene som er illustrert i eksemplene har de ytterligere fortrinnet av å være godt akseptert og anvendelige på en så å si smertefri måte. Videre er den flytende G-CSFformuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis fri for aminosyrer og/eller ytterligere proteiner, slik som serumalbumin. I én utførelsesform er den flytende formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse fri for metionin. Det er et ytterligere fortrinn at det i biokjemiske eksperimenter og kliniske studier viste seg, på grunn av valget av bufferstoff i et spesifikt konsentrasjonsområde og tilstedeværelsen av sukkeralkoholen, at på den ene siden små mengder surfaktant fra 0,0 til 0,06 mg/ml er tilstrekkelig for å stabilisere G-CSF og at det på den andre siden ikke utløses vesentlige hudirritasjoner eller andre avvik hos pasienten. Dette er spesielt fordelaktig i slike flytende medikamentformer som er ment for subkutan applikasjon av G-CSF. Ved hjelp av tiltak ifølge foreliggende oppfinnelse blir videre spesielt de labile, ikke-glykosylerte G-CSF-molekylene tilstrekkelig stabilisert for farmasøytiske preparater. Det ettersøkte utvalget av eksipienser gir sammen svært godt akseptable G- CSF-inneholdende flytende doseringsformer som er høykvalitetspreparater når det gjelder proteinstabilitet og er spesielt hensiktsmessige injeksjons- eller infusjonsløsninger som er klare til bruk. I de flytende formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse vil mengder av surfaktant i området fra 0,0 til 0,06 mg/ml, spesielt foretrukket omtrent 0,06 mg/ml, bli benyttet. Surfaktanten som skal benyttes er polysorbat 80, også kjent som Tween 80. De G-CSF-inneholdende medikamentformene ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder middelet i en mengde som er tilstrekkelig for oppnåelse av en terapeutisk effekt. Normalt blir konsentrasjoner av middel i området fra 0,01 til mg/ml benyttet, fortrinnsvis 0,1 til 1 mg/ml, 0,3 til 0,8 mg/ml, og spesielt foretrukket blir en konsentrasjon på omtrent 0,6 mg/ml benyttet. Spesielt i tilfellet med en subkutan applikasjon viste doseringer på 0,3 mg/0, ml og 0,48 mg/0,8 ml seg å være spesielt foretrukket. I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse blir eddiksyre benyttet som et bufferstoff. I fremstillingen av den flytende formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse er bufferstoffet tilveiebrakt i formen av sin frie syre. Den ønskede phverdien i løsningen blir justert ved tilsetningen av baser, slik som f.eks. alkalihydroksider, jordalkalihydroksider eller ammoniumhydroksid. Til dette formålet er anvendelsen av natriumhydroksid foretrukket.

1 2 3 Konsentrasjonene av bufferstoff-eddiksyren i den flytende medikamentformen som er klar til bruk ligger i området fra til mmol/l, og for å forenkle vil det i det følgende bli referert til anionkonsentrasjonen av nevnte syre, dvs., acetat, der uttrykket acetat også skal omfatte den ikke-dissosierte eddiksyren. Fortrinnsvis blir de følgende bufferkonsentrasjonene og ph-verdiene benyttet: 7, til 1 mmol, fortrinnsvis mmol acetat og ph 4,1 til 4,3, og spesielt ph 4,2. G-CSF som benyttes i de flytende formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse gjelder i utgangspunktet alle G-CSF-molekyler som er produsert med rekombinante fremgangsmåter i tillegg til variasjoner derav. Uttrykket G-CSF eller G-CSF-variant ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer alle naturlig forekommende varianter av G- CSF i tillegg til G-CSF-proteiner utledet fra disse og modifiserte G-CSF-proteiner ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi, spesielt fusjonsproteiner som også inneholder andre proteinsekvenser i tillegg til G-CSF-delen. Spesielt foretrukket i så henseende er et G-CSG-mutein som har en N-terminal Met-rest på posisjon -1, som er generert ved uttrykkingen i eukaryote celler. Også passende er en rekombinant, metioninfri G-CSFvariant som kan bli produsert i overensstemmelse med WO 91/11. Uttrykket «G- CSF-variant» er ment å skulle betegne slike G-CSF-molekyler der én eller flere aminosyrer kan bli fjernet eller substituert med andre aminosyrer, der de vesentligste karakteristika for G-CSF i stor grad blir opprettholdt. Passende G-CSF-muteiner er f.eks. beskrevet i EP 0 46 0. Spesielt fortrukket er ikke G-CSF som er til stede i de flytende formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse glykosylerte. For fremstillingen av godt aksepterte parenterale medikamentformer er sammenblandingen av isotone eksipienser hensiktsmessig, dersom ikke isotoni allerede kan bli oppnådd med de osmotiske egenskapene til middelet og til eksipiensene som er benyttet til stabilisering. I så henseende blir spesielt ikke-ioniserte akseptable eksipienser, slik som f.eks. mannitol, glyserol eller andre sukkeralkoholer, benyttet. I tilfellet med G- CSF er anvendelsen av sorbitol foretrukket, og dette er spesielt fordelaktig for akseptabiliteten av de flytende formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis er sukkeralkoholen til stede i den flytende formuleringen i en konsentrasjon i området fra omtrent 2, til 7, % (vekt/volum), spesielt foretrukket ved en konsentrasjon på omtrent % (vekt/volum). Sammenblandingen av salter for justering av isotoni er ikke fordelaktig fordi høye konsentrasjoner av salt eller ioner forsterker aggregatdannelse av G-CSF. Derfor blir salter fordelaktig blandet inn i små mengder. Bufferkonsentrasjonene blir målt på en slik måte at den ph-stabiliserende effekten blir oppnådd mens ionestyrken blir holdt på det lavest mulige nivået. Fortrinnsvis ligger bufferkonsentrasjonene innenfor området på opp til mmol, spesielt lavere enn 1 mmol. Videre kan injeksjonsløsningene som er klare til bruk ytterligere inneholde konvensjonelle eksipienser eller tilsetningsstoffer. Antioksidanter slik som f.eks.

6 askorbinsyre eller liknende stoffer, kaotropiske eksipienser slik som f.eks. urea, eller aminosyrer slik som f.eks. metionin, arginin, lysin, ornitin og liknende, kan bli innblandet. 1 2 3 I en spesielt foretrukket utførelsesform blir den vandige, flytende formuleringen av G- CSF ifølge foreliggende oppfinnelse klargjort i form av en injeksjons- eller infusjonsløsning og består vesentlig av humant, ikke-glykosylert metionyl-g-csf ved en konsentrasjon på omtrent 0,6 mg/ml og sorbitol ved en konsentrasjon på omtrent % (vekt/volum), polysorbat 80 ved en konsentrasjon på omtrent 0,06 mg/ml, og acetat ved en konsentrasjon på omtrent mm som et bufferstoff ved en ph-verdi på omtrent 4,2. I andre henseender og med den samme doseringsstyrken kan de flytende formuleringene av G-CSF ifølge foreliggende oppfinnelse bli benyttet i overensstemmelse med produktinformasjonen til Neupogen, spesielt med hensyn på dosering, administrering og medisinsk indikasjon, fordi anvendelsen av svært godt renset, ikke-glykosylert G- CSF-protein slik som filgrastim, som blir produsert i en laboratoriestamme av E.coli K12, også er foretrukket i de flytende formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse. De flytende formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse blir benyttet som et medikament i behandlingen av sykdommer som er kjent for å kunne bli behandlet ved administrering av G-CSF, slik som kreft, skadelige bivirkninger forårsaket av cytotoksisk kjemoterapi, tilhørende terapi av sykdommer, der en mobilisering av perifere blodforløperceller er nødvendig, alvorlig kronisk nøytropeni (SCN), HIV-infeksjon, og liknende. Dermed vedrører foreliggende oppfinnelse medikamenter som omfatter én av de flytende G-CSF-formuleringene som er beskrevet ovenfor. I én utførelsesform er G-CSF-sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse tiltenkt for fremstillingen av et medikament til behandlingen av nevrologiske indikasjoner, slik som en skade på sentralnervesystemet, f.eks. etter et akutt slagtilfelle, der alvorlige, sekundære skader kan bli lindret eller forebygget ved hjelp av tidlig administrering, f.eks. i formen av en bolus. I andre henseender er de flytende formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse tiltenkt som et medikament, fortrinnsvis for subkutan eller intravenøs administrering, f.eks. ved injeksjon med forhåndsfylte sprøyter eller ved infusjon, i tilfellet en kontinuerlig langtids-administrering av G-CSF er ønskelig. Som allerede illustrert ovenfor er den flytende formuleringen av G-CSF ifølge foreliggende oppfinnelse stabil over en lang tidsperiode og kan i utgangspunktet bli lagret i enhver passende beholder. Dermed gjelder foreliggende oppfinnelse også en beholder som inneholder én eller flere flytende formuleringer av G-CSF som beskrevet ovenfor eller i eksemplene. Fortrinnsvis er minst én overflate på beholderen som er i kontakt med den flytende formuleringen belagt med et materialebestående av silikon, polytetrafluoretylen eller etylen-tetrafluoretylen (ETFE). Typisk er beholderen en beholder som konvensjonelt er tiltenkt lagringen og/eller administrering av et flytende medikament, slik som et rør, en sprøyte, en ampulle, en hylse eller en infusjonsbeholder,

7 1 2 3 der den flytende formuleringen av G-CSF ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt fordelaktig for anvendelsen i sprøyter og ampuller som er klare til bruk. I en foretrukket utførelsesform er den flytende formuleringen til stede i sprøyten eller ampullen ved en konsentrasjon, når det gjelder konsentrasjonen av G-CSF, på 0,3 mg i 0, ml eller 0,48 mg i 0,8 ml. Fordi innblanding av ytterligere eksipienser eller det å foreta ytterligere klargjøringstiltak, slik som filtrering, blanding osv., før administreringen av den flytende formuleringen av G-CSF ifølge foreliggende oppfinnelse fordelaktig kan bli utelatt så kan det flytende G-CSF-medikamentet ifølge foreliggende oppfinnelse bli klargjort for umiddelbar administrering, f.eks. i et sett. I en utførelsesform som er spesielt fordelaktig for leger, farmasøyter og spesielt for pasienter så vedrører foreliggende oppfinnelse derfor også et sett for den parenterale administreringen av G-CSF, omfattende én eller flere av de ovenfor beskrevne beholderne, fortrinnsvis sammen med instruksjoner for lagring og/eller administrering. Vanligvis vil administreringen av G-CSF ved en dosering på til μg/kg kroppsvekt bli tilveiebrakt, der høyere eller lavere doseringer kan være indikert, imidlertid avhengig av den medisinske indikasjonen og sykdommens stadium. Fortrinnsvis er sprøyter eller ampuller tilveiebrakt i settet ifølge foreliggende oppfinnelse, eventuelt flere, slik som 7 sprøyter eller ampuller, f.eks. i tilfellet der daglig administrering er tiltenkt å vare i én uke. For trygg håndtering har settet ifølge foreliggende oppfinnelse fordelaktig sikkerhetsavdelinger for henholdsvis sprøyter og for injeksjons- og/eller infusjonsnåler. Her skal uttakshjelp for kanyler og klargjorte eller forhåndstilpassede forseglingskorker også bli tatt med i betraktning. Som beskrevet i eksemplene er de flytende G-CSF-formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse stabile over en lang tidsperiode, spesielt ved omtrent C, fortrinnsvis over en periode på minst 4 uker. Derfor kan de flytende formuleringene, beholderne eller settene ifølge foreliggende oppfinnelse fordelaktig bli lagret i et konvensjonelt kjøleskap. Teknikker for utførelse av foreliggende oppfinnelse er kjent for fagfolk på området og beskrevet i den relevante litteraturen, se f.eks. Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986).

8 Eksempel I det følgende blir foreliggende oppfinnelse ytterligere illustrert ved hjelp av en foretrukket utførelsesform som imidlertid ikke er ment å skulle begrense målet med foreliggende oppfinnelse på noen som helst måte. 1 Eksempel 1: Fremstilling av de flytende G-CSF-formuleringene Løsningene av G-CSF benyttet i eksemplene ble klargjort ved å løse de ovenfor beskrevne eksipiensene i vann for injeksjonsformål, tilsetting av de indikerte mengdene av G-CSF, og, dersom nødvendig, eksakt justere ph-verdien til en ønsket verdi ved å benytte en liten mengde bufferkomponent. Under klargjøring av G-CSF-formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse bemerkes det at for justering av acetatbufferen så er det i utgangspunktet nødvendig å tilveiebringe eddiksyre og deretter justere ph-verdien ved å benytte en NaOH-løsning, fordi det i prosessen med tidligere utførte eksperimenter viste seg at anvendelsen av natriumacetat med påfølgende justering av ph-verdien ved å benytte HCl kunne føre til dannelsen av proteinaggregater, muligens på grunn av en økt ionekonsentrasjon. 2

1 Betegnelse Beskrivelse av sammensetning Utgangs-verdi + C 1.uke ved +40 C 2.uke ved +40 C 4.uke ved +40 C 4.uke ved + C ph ph ph ph ph I IIa IIb IIc IIIa IIIb IIIc mm eddiksyre, ph 4.1; % sorbitol, 0,004 % polysorbat 80 mm eddiksyre, ph 4.2; % sorbitol; 0,004 % polysorbat 80 mm eddiksyre, ph 4.3; % sorbitol; 0,004 % polysorbat 80 mm eddiksyre, ph 4.4; % sorbitol; 0,004 % polysorbat 80 mm eddiksyre, ph 4.2; % sorbitol; 0,006 % polysorbat 80 mm eddiksyre, ph 4.3; % sorbitol; 0,006 % polysorbat 80 mm eddiksyre, ph 4.4; % sorbitol; 0,006 % polysorbat 80 4.0 4.08 4. 4.12 4.07 4.23 4.24 4.24 4.2 4.23 4.33 4.3 4.34 4.36 4.33 4.43 4.4 4.43 4.47 4.43 4.24 4.24 4.24 4.27 4.23 4.34 4.34 4.3 4.37 4.33 4.43 4.4 4.43 4.47 4.43 IVa IVb mm eddiksyre, ph 4.2; % sorbitol; 0,008 % polysorbat 80 mm eddiksyre, ph 4.3; % sorbitol; 0,008 % polysorbat 80 4.21 4.24 4.22 4.2 4.21 4.33 4.33 4.34 4.36 4.31 IVc Tabell 1: ph-verdier I flytende formuleringer som hare n doseringsstyrke på MIU, 0,6 mg/ml, 0, ml/ampulle under lagring i 4 uker ved +40 C og mm eddiksyre, ph 4.4; % sorbitol; 0,008 % polysorbat 80 4.43 4.4 4.43 4.4 4.41 + C.

1 Løsningene blir deretter filtrert gjennom passende steriliserte membranfiltre som hare n porebredde på 0,2 m, fylt I sterile glassinjeksjonsrør av hydrolytisk klasse I og forseglet med steriliserte, tefloniserte gummiplugger. Fylling blir fortrinnsvis utført i nitrogenatmosfære. 1 2 3 Eksempel 2: oppfinnelse Biokjemisk stabilitet for G-CSF-formuleringene ifølge foreliggende De eksperimentelle preparatene av G-CSF blir lagret i forseglede og krympede rør ute av lys ved definerte lagringstemperaturer og deretter testet for proteinrenhet og forekomsten av oksiderte former, aggregater og dimerer ved å benytte standardteknikker slik som UVspektroskopi, reversfase-hplc med C4- og C18-stasjonærfase, eller størrelseseksklusjonskromatografi (SEC HPLC), isoelektrisk fokusering, SDS-PAGE under tiolreduserende og ikke-reduserende betingelser med påfølgende sølvfarging og Western-immunblotanalyse. For informasjon om teknikkene som er nevnt, se f.eks. eksemplene i WO 94/14466. De flytende formuleringene av G-CSF som spesifisert I tabell 1 I eksempel 1 ble testet for deres langtidsstabilitet, som indikert. For formuleringene som har et surfaktantinnhold >0,006 % er kun formuleringen med 0,008 % indikert ved hjelp av eksempel, fordi formuleringer som har et høyere innhold av surfaktant oppviser en enda vesentlig dårligere langtidsstabilitet. I eksperimenter med hensyn på den biokjemiske stabiliteten til G-CSF i de eksperimentelle sammensetningene viste det seg at ved anvendelse av høyere surfaktantkonsentrasjoner ned til og inkludert et innhold på 0,008 % så kunne en akkumulering av den oksiderte formen av G-CSF i store mengder bli observert. Derfor ble det vurdert i eksperimentene utført innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse, i motsetning til det som er tilkjennegitt i WO 94/14466, at allerede en lavere surfaktantkonsentrasjon, men uansett en høy surfaktantkonsentrasjon, negativt påvirker oksidasjonsprofilen i G-CSF-løsningen Videre ble det forsikret at G-CSF-formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse som spesifisert i tabell 1 er karakterisert ved at det relative innholdet av oksiderte enheter er under 1 % mens denne grenseverdien ble overskredet i kontrollprøvene som har et surfaktantinnhold på 0,008 % og mer, som fører til konklusjonen at slike løsninger ikke kan bli ansett som kandidatmedikamenter. Ytterligere undersøkelser av den biokjemiske stabiliteten til G-CSF i de eksperimentelle sammensetningene avslørte at formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse er i stand til vesentlig forebygging av både aggregering og oksidering av G-CSF uten behovet for ytterligere innblanding av eksipienser slik som aminosyrer og/eller antioksidanter.

2 1 Eksempel 3: Akseptabilitet av G-CSF Én av de flytende formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse ble testet i tre fase-iiikliniske studier i kreftpasienter, der blant annet pasientenes reaksjon på injeksjonsstedet ble undersøkt. Her ble en undersøkelse av hevelse, rødhet, hudblødning, sensitivitet overfor trykk og andre symptomer som forekommer på injeksjonsstedet utført. For de kliniske studiene ble G-CSF-formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse valgt i overensstemmelse med indikasjonene for eksperimentelt preparat IIa (XM02) i tabell 1 og ble prosessert ved en dosering på μg/kg kroppsvekt per dag. I løpet av undersøkelsene viste det seg heldigvis at kun én pasient av et totalt antall på 36 pasienter rapporterte om uønskede reaksjoner, dvs., i kun 0,3 % av tilfellene. I kontrolleksperimenter utført med den kommersielt tilgjengelige G-CSF-formuleringen Neupogen kunne det bli vist at G-CSF-formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse viser en akseptabilitet som er forbedret med faktoren 4 med hensyn på bivirkninger på injeksjonsstedene hos pasienter. Disse resultatene er oppsummert i den følgende tabellen. Medisinering ph Totalt antall Positiv % Positive XM02 4.2 36 1 0,3 Neupogen 4.0 249 3 1.2 Placebo 7.0 72 0 0,0 Tabell 2: Hyppighet av reaksjoner på injeksjonsstedet i tre fase-iii-kliniske studier. Evaluering av den første syklusen med kjemoterapi av brystkreft, Non-Hodgkins lymfom og lungekreft. 2 De ovenfor nevnte undersøkelsene førte til resultatet at ved henholdsvis å kombinere eddiksyre og acetat som et bufferstoff og en surfaktant slik som polysorbat 80, hver ved en spesifikk konsentrasjon og i nærværet av en sukkeralkohol slik som sorbitol, og med justering av ph-verdien til omtrent 4,2 +/- 0,1, så blir en stabil, flytende formulering av G-CSF oppnådd, som fir G-CSF-molekylene stabiliteten som er nødvendig for deres hensiktsmessighet som et medikament, som er godt tolerert og som i tillegg muliggjør en nesten fullstendig forhindring av symptomer som ofte kan bli observert på injeksjonsstedet når medikamentet administreres. Dette gjør henholdsvis de flytende G- CSF-formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse og sett som er tilveiebrakt med disse, spesielt passende og fordelaktige for anvendelsen i sprøyter og sett som er klare til bruk som er tilveiebrakt dermed, spesielt til hjemmebruk.

3 PATENTKRAV 1. Medikament til anvendelse i behandlingen av kreft, alvorlig kronisk nøytropeni (SCN), HIV-infeksjon, skade på sentralnervesystemet eller skadelige bivirkninger som skyldes cytotoksisk kjemoterapi omfattende en vandig, flytende formulering av G-CSF som vesentlig består av G-CSF og en sukkeralkohol, polysorbat 80 ved en konsentrasjon på 0,0-0,06 mg/ml, acetat ved en konsentrasjon på - mm som en buffer ved ph 4,1-4,3, og eventuelt aminosyrer og/eller glyserol og/eller karbohydrater og/eller preserveringsmidler, der acetat blir tilsatt i formen av sin eddiksyre og ph er justert med NaOH. 2. Medikament ifølge krav 1, der G-CSF er ikke-glykosylert. 1 3. Medikament ifølge krav 1 eller 2, der G-CSF er til stede i en konsentrasjon på 0,6 mg/ml. 4. Medikament ifølge ethvert av kravene 1 til 3, der sukkeralkoholen er sorbitol. 2 3. Medikament ifølge ethvert av kravene 1 til 4, der sukkeralkoholen er til stede i en konsentrasjon på % (vekt/volum). 6. Medikament ifølge ethvert av kravene 1 til, der acetatet er til stede ved en konsentrasjon på mm. 7. Medikament ifølge ethvert av kravene 1 til 6, som er vesentlig fritt for aminosyrer og/eller ytterligere protein. 8. Medikament ifølge ethvert av kravene 1 til 7, som er en injeksjons- eller infusjonsløsning. 9. Medikament ifølge krav 1 som injeksjons- eller infusjonsløsning, der G-CSF er humant, ikke-glykosylert metionyl-g-csf og er til stede ved en konsentrasjon på 0,6 mg/ml, sukkeralkohol er sorbitol og er til stede ved en konsentrasjon på % (vekt/volum), surfaktant er polysorbat 80 og acetat er til stede som buffer ved en konsentrasjon på mm.. Beholder for administreringen av flytende medikamenter, omfattende en flytende medikamentformulering ifølge ethvert av kravene 1 til 9.

4 1 11. Beholder ifølge krav, der minst én overflate på nevnte beholder, som er i kontakt med den flytende formuleringen, er belagt med et materiale som består av silikon eller polytetrafluoretylen eller en etylen-tetrafluoretylen(etfe)-kopolymer. 12. Beholder ifølge krav eller 11, som er en sprøyte, en ampulle, en hylse eller en infusjonsbeholder. 13. Sprøyte eller ampulle ifølge krav 12, der den flytende formuleringen er til stede, når det gjelder konsentrasjonen av G-CSF, ved en konsentrasjon på 0,3 mg i 0, ml eller 0,48 mg i 0,8 ml. 14. Sett for parenteral administrering av G-CSF, omfattende en beholder ifølge ethvert av kravene til 13 i tillegg til instruksjoner for lagring og/eller administrering. 1. Sett ifølge krav 14, der administreringen av G-CSF blir tilveiebrakt ved en dosering på - μg/kg kroppsvekt. 2 16. Sett ifølge krav 14 eller 1, der sprøyter eller ampuller er tilveiebrakt i nevnte sett. 17. Sett ifølge ethvert av kravene 14 til 16, der sikkerhetsavlukker for sprøyter eller injeksjons- og/eller infusjonsnåler er tilveiebrakt. 18. Sett ifølge ethvert av kravene 14 til 17, der lagring ment å foregå ved