(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (51) Int Cl. A61K 39/00 ( ) C12N 15/13 ( ) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet: (86) Europeisk søknadsnr: (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato (30) Prioritet GB (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver Scancell Limited, Department of Clinical Oncology City Hospital Hucknall RoadNottingham, Nottinghamshire NG5 1PB, Storbritannia (72) Oppfinner Durrant, Linda Gillian, Scancell Limited Department of Clinical Oncology, Hucknall Road, Nottingham, Nottinghamshire NG5 1PB, Storbritannia Metheringham, Rachael Louise, Department of Clinical Oncology, City Hospital, Hucknall Road, Nottingham, Nottinghamshire NG5 1PB, Storbritannia Pudney, Victoria Anne, Department of Clinical Oncology, City Hospital, Hucknall Road, Nottingham, Nottinghamshire NG5 1PB, Storbritannia (74) Fullmektig Protector Intellectual Property Consultants AS, Oscarsgate 20, 0352 OSLO, Norge (54) Benevnelse Nukleinsyrer kodende for immunoglobiner bærende gp100- og TRP2-epitoper (56) Anførte publikasjoner US-B B1, WO-A-02/ B1, WO-A-96/19584 B1, ZAGHOUANI H ET AL: "Engineered immunoglobulin molecules as vehicles for T cell epitopes" INTERNATIONAL REVIEWS OF IMMUNOLOGY, HARWOOD ACADEMIC PUBLISHERS, LONDON, GB, vol. 10, no. 2-3, 1 January 1993 ( ), pages , XP ISSN: , WO-A2-03/ B1, WO-A2-2004/ B1, WO-A-99/25379 B1

2 -1- P4089NO00-MB [0001]Den foreliggende oppfinnelse vedrører nukleinsyrer og deres anvendelse som vaksiner, der nukleinsyrene koder for T-celleepitoper som en immunrespons skal bli stimulert mot. Slike vaksiner kan bli anvendt i behandlingen av tumorer. [0002]I feltet kreftvaksiner og kroniske virale infeksjoner blir det nå klart at faktorer andre enn frekvens, slik som funksjonell reaksjonsvillighet for tumorspesifikke T-celler og primingvei, er hoveddeterminanter i maksimering av vaksinekraft. Et antall grupper har vist at CD8" T-celler med høy reaksjonsvillighet viser bedre anti-tumoraktivitet (Alexander-Miller, Immunologic Research, 2005;31: 13-24, Hodge et al, J Immunol 2005;174: , Valmori et al, J Immunol 2002:168: , Zeh et al, J Immunol 1999:162: ). Det har blitt antydet at T-celler med høy reaksjonsvillighet spiller en vesentlig rolle i tumorregresjon i pasienter. Dette er eksemplifisert i et studium hvor antigenspesifikke tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) med høy reaksjonsvillighet ble detektert i en pasient med dramatisk tumorregresjon (Khong & Rosenberg, J Immunol 2002;168: 951-6). Det er også kommet frem bevis som demonstrerer at adoptiv overføring av in vitro-stimulerte autologe tumorspesifikke T-celler er vellykket, muligens ettersom in vitro-stimulering muliggjør seleksjon av T-cellene med høy reaksjonsvillighet (Vignard et al., J Immunol 2005;175: , Dudley et al., J Immunother 2001;24: , Morgan et al, J Immunol 2003;171: , Rosenberg & Dudley, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 20041;101 Suppl 2: ). [0003]Et antall grupper har hittil forsøkt å stimulere en cellulær immunrespons mot en forutbestemt epitop ved å anvende et antistoff som en bærer for den epitopen. WO 96/19584 (Bona et al.) beskriver for eksempel kimære antistoffer der T-celleepitoper blir satt inn i de komplementaritetsbestemmende områdene (complementarity determining regions, CDRs) til et antistoff, og hevder at slike kimære antistoffer er passende for stimulering av en cytotoksisk T-celle (CTL)- respons. Dette dokumentet underviser imidlertid at DNA-et må kode for et funksjonelt protein. Det er derfor fremsatt i sammendraget at de funksjonelle kapasitetene til epitopen og foreldreimmunoglobulinet blir beholdt." På side 21 er det også fremsatt at det av den ønskede epitopen skulle være ved et område av det nukleinsyrekodende foreldreimmunoglobulin-molekylet som ikke

3 -2- P4089NO00-MB er essensielt for ekspresjon eller funksjon av foreldreimmunoglobulinmolekylet." Alle eksemplene i WO96/19584 viser dessuten at intakt immunoglobulin blir produsert etterfølgende innsetting av T-celleepitopen. [0004]US Patent Nr. 7,067,110 beskriver en fremgangsmåte for fremkalling av en immunrespons mot et antigen ved å anvende et fusjonsprotein av antistoff som mangler et immunoglobulin variabelt områdedomene fusjonert til antigenet med en polypeptidbinding. Fusjonsproteinet beholder evnen til å binde til Fc. [0005]EP beskriver en fremgangsmåte for inkorporering av T- celleepitoper inni et antistoffmolekyl som blir sekrert som et intakt immunoglobulinprotein og som kan målsikte CTL-epitoper til tumorer for å gjøre dem til bedre mål for CTL-er. [0006]WO 00/64488 beskriver at en CTL-respons kan bli stimulert av nukleinsyre som koder for et kimært antistoff som har heterologe T- celleepitoper satt inn i CDR-ene, men ikke det variable området derav, gitt at nukleinsyren er rettet for ekspresjon i B-celler. Ettersom B-celler ikke kan stimulere naive T-celleresponser, ville vaksinen beskrevet i WO 00/64488 bare være nyttig for å forsterke allerede eksisterende T-celleresponser. [0007]WO 02/ beskriver at en CTL-respons kan bli stimulert av et polypeptid som omfatter en heterolog T-celleepitop og delen av humant Fo som binder til høyaffinitetsreseptoren CD64. De foreliggende oppfinnere har nå imidlertid vist at avbryting av antistoffsekvensen ved å sette inn en T- celleepitop, for eksempel inni en upassende CDR eller til og med inni det variable området til et antistoff, forhindrer assosiasjon av tung og lett kjede, og det blir ikke skilt ut noe funksjonelt antistoff. DNA som koder for disse feilfoldede antistoffene genererer uventet sterke T-celleresponser. Dette blir dessuten ikke mediert via CD64 ettersom humant IgG2 som ikke binder til mus eller humant CD64 - fungerer akkurat like effektivt som humant IgG1. [0008]Ifølge ett aspekt av den foreliggende oppfinnelse blir det fremskaffet en nukleinsyre som omfatter en ikke-spesifikk promoter og én sekvens som koder for et rekombinant antistoff, hvori antistoffmolekylet har homologe T-celle epitoper deri slik at antistoffet ikke kan ta sin native konformasjon når nukleinsyren blir uttrykt, hvor de heterologe T-celleepitopene er: GTGRAMLGTHTMEVTVYH i CDRH1 og CDRL3 SVYDFFVWL i CDRH2, og

4 -3- P4089NO00-MB WNRQLYPEWTEAQRLD i CDRH3 og CDRL 1. [0009]Uten at man ønsker å være bundet av teori, er den foreliggende oppfinnelse basert, minst delvis, på konseptet at en T-cellerespons kan bli generert mot en spesifikk T-celleepitop (slik som en CTL-epitop), ved administrering av en nukleinsyre som koder for et polypeptid som inkluderer T- celleepitopen, men ingen regulatoriske T-celleepitoper. Det er trodd at nukleinsyre enten blir tatt opp av antigenpresenterende celler (APC-er), migrerer til lymfeknuter og blir direkte presentert, eller blir uttrykt for å produsere et polypeptid som blir sekrert og som deretter blir tatt opp av andre APC-er. Den første nukleinsyren er passende for stimulering av hjelpe-t-celleepitoper, og den siste er passende for stimulering av CTL-responser. Polypeptidet som blir kodet av nukleinsyren har ideelt ikke noen naturlige T-celleepitoper. Passende polypeptider i det henseende er immunmolekyler, slik som antistoffer. Tunge og lette antistoffkjeder som ikke kan assosiere slik at lettkjeden forblir i APC-ene og slik at tungkjeden blir sekrert er passende for utøvelsen av foreliggende oppfinnelse. [0010]En suppressor-t-cellepopulasjon ble identifisert for omtrent 40 år siden, men fremdrift ble hindret ved mangel på spesifikke teknikker for å identifisere cellene og på grunn av vitenskapelig skepsis angående eksistensen av suppresjon. Sakaguchi et al blåste imidlertid liv i interessen for suppressorceller i 1995 ved å demonstrere at overføringen av lymfocytter fremstilt av CD4 + CD25 + T-celler inn i brisselløse mus forårsaket utviklingen av forskjellige autoimmune sykdommer i resipientmusene og at rekonstruksjon med CD4 + CD25 + T-celler forhindret autoimmune reaksjoner i disse musene (Sakaguchi et al J.Immunol 1995:155: ). Senere har tallrike studier i mus og mennesker vist at diverse T-cellepopulasjoner med regulatorisk aktivitet spiller en viktig rolle i suppresjonen av immunresponser (både medfødte og adaptive) til selv (som kontrollerer selvtoleranse) (Sakaguchi et al J Immunol 1995;155: ) så vel som fremmede antigener (Shevach, Immunity 2006; 25: , Coleman et al, J. celle Mol. Med. 2007; 11: ). Treg-celledeplesjon i musemodeller med kreft har vist å forbedre endogen immunmediert tumoravvising (Shimizu, et al, J. Immunol. 1999; 163; Onizuka et al, Cancer Research 1999; 59: ) og

5 -4- P4089NO00-MB antigenspesifikk anti-tumorimmunitet (Tanaka, et al, J. Immunother. 2002;25: ). I tillegg forsterker Treg-celledeplesjon tumorimmunoterapi som inkluderer vaksinasjon (Tanaka, et al, J. Immunother. 2002:25: , Dannull et al, J. Clin. Invest. 2005:115: ) og CTLA-4-blokkade (Sutmuller et al, J. Exp. Med. 2001;194: ). Dessuten blir utallige Tregceller høynet i det perifere blodet (Woo et al, Cancer Research 2001;61: , Curiel et al, Nature Medicine 2004;10: , Wolf et al, Clin. Cancer Research 2003:9: , Sasada et al, Cancer 2003; 98: ) og populerer tumormikromiljøet og drenerer lymfeknuter (Curiel et al, Nature Medicine2004;10: , Sasada et al, Cancer 2003;98: , Liyanage et al, J. Immunology 2002;169: , Mat- suura et al, Cancer 2006;106: , Yang et al, Blood 2006;107: , Alvaro et al, Clin. Cancer Research 2005;11: ) hos pasienter med forskjellige krefttyper. I pasienter med magekarcinom (Sasada et al, Cancer 2003; 98: , Ichihara et al, Clinical Cancer Research 2003;9: ) og ovarialkreft (Curiel et al, Nature Medicine 2004;10: ) ble dårlig prognose og avtagende overlevelsesrater assosiert med høyere Treg-cellefrekvenser. Tregceller har også vist seg å undertrykke/hemme prolifereringen, cytokinproduksjonen (IFNy, IL-2) og den cytolytiske aktiviteten til tumorspesifikke CD8 + (Liyanage et al, J. Immunology 2002;169: , Piccirillo et al, J. Immunology 2001;167: , Mempel et al. Immunity 206;25: , Annacker et al, J. Immunology 2001;166: , Woo et al, J. Immunology 2002;168: ) og CD4 + (Liyanage et al, J. Immunology 2002;169: , Ichihara et al, Clinical Cancer Research 2003;9: , Nishikawa et a/, Blood 2005;106: ) T-celler. I tillegg kan Treg-celler undertrykke funksjonene til dendrittiske celler (Romagnani et al, Eur. J. Immunol. 2005;35: ), NK-celler (Ralainirina et al, J. Leukoc. Biol. 2007;81: ) og B-celler (Lim et al, J. Immunology 2005; 175: ). Tatt under ett, antyder disse studiene en viktig rolle for Treg-celler i tumorimmunopatologi og indikerer en nær korrelasjon mellom Treg-cellefrekvenser og tumorvekst. [0011]Treg-celler blir delt inn i naturlige CD4 - CD25 + T-celler og diverse populasjoner av induserte/adaptive Treg-celler (Shevach, Immunity 2006; 25: Bluestone et al, Nat. Immunol. 2005;6: ) (Tabell 1). Rundt 5 %-

6 -5- P4089NO00-MB % av CD4 + T-celler i mus og mennesker er naturlige Treg-celler (Sakaguchi et al, Nat Immunology 2005;6: ). Naturlige Treg-celler utvikler seg i thymus ved sterk TCR-interaksjon med selvpeptid (Picca et al, Current Opinion in Immunology 2005;17: , Jordan et al, Nature Immunology 2001;2(4): , Picca et al, Immunological Reviews 2006;212: 74-85), mens induserte Treg-celler utvikles fra ikke-regulatoriske T-celler i periferien. Denne ekstrathymiske forvandlingen krever spesielle immunologiske betingelser slik som kontinuerlig eksponering for lavdose antigen, eksponering for et systemisk 201, Akbar et al, Nat. Rev. Immunol. 2007; 7: ). Treg-celler kan mediere deres suppresjon med én eller en kombinasjon av de følgende mekanismene: i) celle-celle-kontaktavhengig mekanisme, ii) gjennom sekresjonen av målceller perforin-granzymee veien (von Boehmer, Nature Immunology 2005;6(4); ). [0012]Til nå er veldig lite kjent om antigenspesifisiteten til humane Treg-celler. Wang et al rapporterte identifiseringen av LAQE-1-spesifikke CD4 + CD25 + GITR + funksjonelle Treg-cellekloner i kreftpasienter (Wang et al, Immunity 2004; 20: ). Vence et al demonstrerte tilstedeværelsen av tumorantigenspesifikke CD4 + Treg-celler i det perifere blodet til metastatiske melanompasienter (Vence et al, PNAS 2007;104(52) ). Disse Treg-cellene gjenkjente et bredt spekter av tumorantigener, inkludert TRP1, NY- ESO-1, gp100 og survivin. I tillegg var Vence et al de første til å demonstrere tilstedeværelsen av NY-ES0-1-spesifikke Treg-celleepitoper inni NY-ESO-1- molekylet. Dessuten viste vaksinasjon av melanompasienter med dendrittiske celler som enten var lastet med syntetiske peptider eller tumorlysater seg å indusere økte frekvenser av Treg-celler, ledsaget med ekspansjonen av tumorspesifikke CD8 + T-celler (Chakrabortyet al, Hum. Immunology 2004;65: ). Dette antyder muligheten for at vaksinen inneholdt uidentifiserte Treg-celleepitoper så vel som CD8 + T-celleepitoper, som førte til ekspansjon av Treg-celler in vivo ved ligandspesifikk aktivering gjennom Tregcelle T-cellereseptor (TCR). Det er vidt akseptert at Treg-celler krever antigenspesifikk aktivering gjennom TCR-gjenkjennelse/engasjement, men medierer antigen-ikke-spesifikk tilstedeværende suppresjon (Thorton &

7 -6- P4089NO00-MB Shevach, J. Immunology 2000;164:183190). Li et al antydet dessuten eksistensen av dominante Treg-epitoper innen Hepatitt C-Virus kjerneproteinet som stimulerte HCV-spesifikke Treg-celler i infiserte pasienter (Li et al, Immunol. celle Biol. 2007;85 (3): ). Disse studiene, i tillegg til det nylige funnet at immunisering av HHD transgene mus med det anti-endotele DNA- _ konstruktet C200Fc, feilet kollektivt i å stimulere en signifikant Tie spesifikk anti-tumor immunrespons, og den økte frekvensen av Tie deplesjonen av CD4 + CD25 + Treg-celler (ved administrering av 400 μg PC61 monoklonalt antistoff) før C200Fc DNA-immunisering (Middleton, PhD Thesis. _ University of Nottingham, November 2007) indikerer at Tie inni DNAvaksinen inneholder uidentifiserte Treg-celleepitoper så vel som CD8 + -epitopen. Dette ville forklare vaksinens manglende evne til å bryte toleranse for selvantigenet Tie-2 og å fremkalle anti-tumorimmunitet i HHD-mus på grunn av rikelige antigenspesifikke ekspanderte Treg-celler som undertrykker den cellemedierte anti-tumorimmunresponsen. Det er derfor en fordel å uttrykke T- effektorepitoper med uvirksomme immunbærere som mislykkes i å uttrykke Treg-epitoper for å lede immunresponsen til effektorepitopen og hindre stimulering av den dominante T-reg-responsen. [0013]Nukleinsyren ifølge den foreliggende oppfinnelse inkluderer fordelaktig en sekvens som koder for en sekvens, slik som en ledersekvens, som muliggjør for det uttrykte polynukleotidet, og spesifikt det uttrykte polynukleotidet, å bli sekrert. Dette muliggjør for polynukleotidet å bli overført til antigenpresenterende celler (APC-er). Sekvensen kunne være en ledersekvens som blir naturlig uttrykt med polynukleotidet eller kunne være en heterolog ledersekvens, slik som en immunoglobulin ledersekvens, som blir lagt til. [0014]Strukturen til en slik tungkjede er kjent for fagpersoner, og inkluderer generelt variable og konstante områder. Tungkjeden kan være fra et antistoff. Antistoffet kan være monoklonalt eller polyklonalt og kan være IgA, IgD, IgE, IgG eller IgM, selv om IgG blir foretrukket. IgG-antistoffet kan være hviken som helst IgG-underklasse, slik som humant IgG1, IgG2, IgG3 eller IgG4, eller muse-igg1, -IgG2a, -IgG2b eller -IgG3. IgG-antistoffet kan være et humant IgG1-antistoff som har IgG2 Fc-bindingsdomenet, eller et humant IgG2-antistoff som har IgGI Fc-bindingsdomenet. Tungkjeden kan ha det konstante området til

8 -7- P4089NO00-MB et humant antistoff, og det variable eller hypervariable (CDR) området til et monoklonalt museantistoff inn i hvilken heterologe T-celleepitoper har blitt satt inn. Det variable området annet enn det hypervariable området kan også bli avledet fra det variable området til et humant antistoff. Når anvendt til antistoffer (dvs. omfattende en tungkjede og en lettkjede), blir antistoffet sagt å være humanisert. Fremgangsmåter for fremstilling av humaniserte antistoffer er kjent i faget. Fremgangsmåter er beskrevet, for eksempel, i Winter, U.S. Patent Nr, 5,225,539, Det variable området til tungkjeden utenfor det hypervariable museområdet kan også bli avledet fra et monoklonalt museantistoff. I slikt tilfelle er hele det variable området avledet fra murint monoklonalt antistoff og, når anvendt til antistoffer, blir antistoffet sagt å være kimerisert. Fremgangsmåter for fremstilling av kimeriserte antistoffer er kjent i faget. Slike fremgangsmåter inkluderer, for eksempel, de beskrevet i U.S. patenter av henholdsvis Boss (Celltech) og av Cabilly (Genentech). Se også U.S. Patent Nr. 4,816,397 og 4,816,567. [0015]En separat nukleinsyre somkoder for den lette kjeden av antistoffet kan også bli fremskaffet. T-celle-epitopen kan være slik at den lette kjeden ikke kan ta sin native konfigurasjon når nukleinsyren blir uttrykt. Den lette kjeden kan ha et hvilket som helst av trekkene beskrevet heri med hensyn på den tunge kjeden. Antistoffet ifølge oppfinneslen kan også ha sekvensen ifølge figur 60. [0016]Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også: en vaksine som setter sammen en nukleinsyre ifølge den foreliggende oppfinnelse og en adjuvans; en farmasøytisk sammensetning som omfatter en nukleinsyre ifølge den foreliggende oppfinnelse og en farmasøytisk akseptabel bærer, eksipient eller et fortynningsmiddel; en nukleinsyre ifølge den foreliggende oppfinnelse for anvendelse i medisin; anvendelsen av en slik nukleinsyre ifølge den foreliggende oppfinnelse i fremstillingen av et medikament for stimulering av en immunrespons mot minst én av T-celleepitopen(e); og en nukleinsyre ifølge den foreliggende oppfinnelse for stimulering av en immunrespons mot minst én av T-celleepitopen(e).

9 -8- P4089NO00-MB [0017]Foreliggende oppfinnere har overraskende funnet at antistoffer, slik som monoklonale antistoffer, som kan være humane eller ikke-humane, som har forutbestemte T-celleepitoper klonet inni deres variable områder, for slik å avbryte den primære antistoffstrukturen, hemme folding og/eller begrense sekresjon til enten bare tungkjede eller veldig lave mengder av intakt antistoff, stimulerer sterke hjelpe- og antigen-spesifikke T-celleresponser. De foreliggende oppfinnere har også funnet at denne effekten kan oppnås ved å anvende nukleinsyre som koder for tungkjeden til et slikt antistoff. Det er trodd at T-celleepitopen blir prosessert, men ikke ødelagt av immunoproteosomet. I visse utførelsesformer tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en DNAvaksine som presenterer forhåndsdefinerte T-celleepitoper inni denaturert immunoglobulin som forsterker frekvensen og reaksjonsvilligheten til T- celleresponsen. Polypeptidene kodet for av nukleinsyrene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan bli referert til heri som "Immunolegemer". [0018]Det funnet at en immunrespons mot en T-celleepitop kan bli stimulert av en nukleinsyre som koder for minst tungkjeden til et immunoglobulinmolekyl inn i hvilket T-celleepitopen har blitt satt inn slik at immunoglobulinmolekylet ikke kan ta sin naturlige konformasjon er i motsetning til forventningene i faget, hvor det er undervist at antistoffet må bli uttrykt i en funksjonell form. For eksempel, som diskutert over, underviser WO 96/19584 at hvor en nukleinsyre koder for et antistoff der T-celleepitoper blir satt inn i CDR-ene til antistoffet, må nukleinsyren kode for et funksjonelt antistoff. På liknende måte beskriver EP en fremgangsmåte for inkorporering av T-celleepitoper inni et antistoffmolekyl som blir sekrert som et intakt immunoglobulinprotein. Selv om US patent nr. 7,067,110 beskriver at en immunrespons kan bli stimulert mot et antigen av et fusjonsprotein av antistoff og antigenet, er antistoffet beskrevet som å mangle et immunoglobulin variabelt område. I tillegg vil dette fusjonsproteinet ha regulatoriske T-celleepitoper i antigenet. Selv om proteinet kan stimulere en antistoffrespons, vil det derfor ikke stimulere T-celleresponser med høy reaksjonsvillighet på grunn av regulatoriske T-celleepitoper i antigenet. [0019]Som diskutert over, beskriver WO 00/64488 en nukleinsyre som koder for et kimært antistoff som har heterologe T-celleepitoper innsatt i CDR-ene, men ikke det variable området derav, hvilken nukleinsyre er ledet for ekspresjon i B-celler. Nukleinsyren ifølge den foreliggende oppfinnelse blir ikke ledet for

10 -9- P4089NO00-MB ekspresjon i B-celler, og vil derfor ikke målsikte B-celler spesifikt verken in vitro eller in vivo. Nukleinsyren ifølge den foreliggende oppfinnelse kan bli tatt opp av hvilke som helst antigenpresenterende celler, inkludert dendrittiske celler, og kan derfor prime naive CTL- og hjelpe-t-celleresponser, mens vaksinen beskrevet i WO 00/64488 bare ville være nyttig i forsterkning av preeksisterende T-celleresponser. [0020]Analyse av den funksjonelle reaksjonsvilligheten til responser indusert av nukleinsyrer i henhold til den foreliggende oppfinnelse demonstrerte at en høy reaksjonsvillighetsrespons kan bli generert når sammenlignet med immunisering med syntetisk peptid. Dette korrelerte også med forsterket evne til å gjenkjenne og drepe tumorceller in vitro og in vivo. Denne observasjonen er sammenlignbar med det dokumentert i andre studier hvor bedre antitumoraktivitet er vist ved TRP2-spesifikk CTL med høy reaksjonsvillighet (Zeh et al, J Immunol 1999;162: , Harada et al, Immunology 2001;104: 67-74). [0021]Nukleinsyrene ifølge visse aspekter av foreliggende oppfinnelse har en ikke-spesifikk promoter, dvs. en promoter som vil fremme ekspresjon av nukleinsyren, men som ikke har noen spesifisitet for celler der ekspresjon blir fremmet. Promoteren forårsaker fortrinnsvis ekspresjon av nukleinsyren i dendrittiske celler og/eller keratinocytter. Eksempler på passende promotere inkluderer CMV-promoteren, SV40-promoteren, og andre ikke-spesifikke promotere kjent for fagpersoner. [0022]Nukleinsyren ifølge visse aspekter ifølge den foreliggende oppfinnelse koder for et immunoglobulinmolekyl, fortrinnsvis et antistoff, som inkluderer alle hovedegenskapene til et antistoff, det vil si tunge og lette kjeder som inkluderer variable og konstante områder. Antistoffet kan være monoklonalt eller polyklonalt og kan være IgA, IgD, IgE, IgG eller IgM, selv om IgG blir foretrukket. IgG-antistoffet kan være hvilken som helst IgG-underklasse, slik som humant IgG1, IgG2, IgG3 eller IgG4, eller muse-igg1, -IgG2a, -IgG2b eller -IgG3. IgG-antistoffet kan være et humant IgG1-antistoff som har IgG2 Fcbindingsdomenet. Antistoffet kan ha det konstante området til et humant antistoff, og det variable eller hypervariable området til et monoklonalt museantistoff inni hvilket heterologe T-celleepitoper har blitt satt inn. Det variable området annet enn det hypervariable området kan også bli avledet fra det variable området til et humant antistoff. Et slikt antistoff blir sagt å være

11 -10- P4089NO00-MB humanisert. Fremgangsmåter for maskering av humaniserte antistoffer er kjent i faget. Fremgangsmåter er beskrevet, for eksempel, i Winter, U.S. Patent Nr. 5,225,539. Det variable området til antistoffet utenfor det hypervariable museområdet kan også bli avledet fra et monoklonalt museantistoff. I slikt tilfelle, er hele det variable området avledet fra murint monoklonalt antistoff, og antistoffet blir sagt å være kimerisert. Fremgangsmåter for fremstilling av kimeriserte antistoffer er kjent i faget. Slike fremgangsmåter inkluderer, for eksempel, de beskrevet i U.S. patenter av Boss (Celltech) og av Cabilly (Genentech). Se også henholdsvis U.S, Patent Nr. 4,816,397 og 4,816,567. [0023]Nukleinsyren ifølge visse aspekter ifølge den foreliggende oppfinnelse er slik at tungkjeden, lettkjeden eller immunoglobulinmolekylet uttrykt derfra har minst én heterolog T-celleepitop deri slik at tungkjeden, lettkjeden eller immunoglobulinmolekylet ikke kan ta sin naturlige konformasjon. T- celleepitopen kan avbryte det uttrykte proteinet slik at tungkjeden eller immunoglobulinmolekylet ikke lenger kan binde til sitt antigen, slik at de tunge og lette kjedene (hvor tilstedeværende) ikke lenger kan assosiere, eller slik at tungkjeden eller immunoglobulinmolekylet ikke kan bli sekrert riktig, for eksempel. Avbrytelsen kan være i den tertiære strukturen til immunoglobulinmolekylet som kan hindre dannelse av disulfidbindingene. [0024]Som diskutert i mer detalj under, hvor immunoglobulinmolekylet er et antistoff, kan T-celleepitopen(e) bli satt inn i eller substituert for CDR1- og flakkonformasjonen og er delvis senket ned inni det foldede molekylet. Hvilken som helst forandring på deres lengde, aminosyresammensetning eller ladning vil avbryte denne strukturen og hindre tung- og lettkjedefolding og assosiasjon. CORH3 blir fremvist på overflaten til immunoglobulinmolekylet og er derfor mer ettergivende for endringer. I visse utførelsesformer vil riktignok tap av rammeverkområder ved CDRH-forbindelsespunkter fullstendig ødelegge antistoffolding og likevel gir insersjon av epitoper i disse områdene gode T- celleresponser. Inkorporering av hvilken som helst epitop inni CDRH1-en (5 aminosyrer lang) eller CDRH2-en (17 aminosyrer lang) forårsaker tilstrekkelig avbrytelse til å muliggjøre sekresjon av tungkjede, men bare veldig lave mengder av intakt antistoff, selv om lettkjeden har sin naturlige sekvens. Dette viser at den sekundære strukturen er viktig for tung- og lettkjedeparing.

12 -11- P4089NO00-MB Inkorporering av hvilken som helst epitop inni CDRL1 til lettkjeden resulterer i lavt nivå sekresjon av lettkjede, til og med hvis det bare er en enkelt epitop inkorporert inn i CDRH3-en til tungkjeden. [0025]"Heterolog T-celleepitop" er ment å bety en T-celleepitop som er heterolog for antistoffet. En heterolog T-celleepitop kan for eksempel være én som ikke tidligere var tilstedeværende i antistoffet. Den heterologe T- celleepitopen kan bli satt inn som en helhet, selv om den kan være fremstilt fra en innsatt aminosyresekvens, sammen med ledende aminosyrer fra den andre delen. Dette er for å sikre at den innsatte epitopen har en liknende prosesseringsprofil i de heterologe nukleinsyrene som fra det opprinnelige antigenet. [0026]De foreliggende oppfinnere har overraskende funnet at når T- celleepitoper ble satt inn i strukturelt begrensede COR-er eller ikke-cdrområder av tungkjeden, ga de bedre CTL-responser. Dette synes å være på grunn av sekresjon av store mengder tungkjede, som bare svakt kan assosiere med lettkjede på grunn av insersjonen av store epitoper inn i deres variable områder. Dette er i motsetning til dogme, som erklærer at bare proteiner syntetisert endogent av antigenpresenterende celler blir presentert på MHC klasse I-molekyler og gjenkjent av CTL-er"- WO 96/ Opptak av eksogent antigen og presentasjon på MHC klasse 1 er en prosess kjent som krysspresentasjon, og krever vanligvis opptak via spesifikke reseptorer. Dette forutsagt at store mengder av intakt antistoff eller antigen-antistoff-komplekser ville være bedre ved målsikting av denne reseptoren. I motsetning viser resultatene presentert heri klart at veldig lave nivåer av intakt antistoff og store mengder av fri tungkjede, som ikke skulle binde til CD64, gir bedre CTLresponser. Det er riktignok vist heri at CTL-responser kan bli stimulert når CTLepitoper blir satt inn i antistoffer som ikke kan binde til CD64, slik som IgG2- antistoffer eller IgG1-molekyler med deres CD64-bindende område erstattet med det ikke-cd64-bindende området fra IgG2. [0027]Nukleinsyren som koder for tungkjeden inkluderer fortrinnsvis en ledersekvens for å muliggjøre at den blir sekrert. De foreliggende oppfinnere har funnet at hvis ledersekvensen til tungkjeden blir fjernet for å hindre sekresjon og tillate produksjon av mer endogent protein, reduserer dette CTL-

13 -12- P4089NO00-MB responsen. Dette er fullstendig i motsetning til det som er forventet. Mens det ikke er ønskelig å være bundet av teori, tror de foreliggende oppfinnere at dette impliserer at nukleinsyren blir uttrykt i ikke-antigenpresenterende celler, som skiller ut høye nivåer av tungkjede og lave mengder av naturlig protein som deretter kan bli tatt opp av antigenpresenterende celler. Alternativt kan nukleinsyren direkte transektere antigenpresenterende celler som migrerer til den drenerende lymfeknuten hvor de sekrerer lave mengder av naturlig protein og store mengder av tungkjede som blir tatt opp av de samme eller tilstøtende antigenpresenterende celler og presentert på MHC klasse I for naive CTL-er. For at en nukleinsyrevaksine skal stimulere effektive CTL-responser, må den fortrinnsvis kode for CTL-epitoper inni et protein som blir sekrert ved veldig lave nivåer og/eller på samme tid sekrerer store mengder av denaturert protein. En CTL-respons kan imidlertid ikke modnes til en høyaffinitets hukommelserespons i fravær av hjelperesponser. Det er derfor foretrukket hvis T-hjelpeepitoper blir satt inn i tungkjeden eller immunoglobulinmolekylet, fortrinnsvis inn i det variable området til antistofflettkjeder. Igjen, overraskende og i motsetning til dogmet som uttrykker at bare proteiner tatt opp eksogent av målcellene blir presentert av MHC klasse II-molekyler og gjenkjent av hjelpe-t-celler", ble lettkjede bare sekrert i veldig lave mengder. Fjerning av ledersekvensen for å hindre sekresjon av lettkjeden hadde ingen effekt på hjelperesponsene. Nukleinsyren ifølge den foreliggende oppfinnelse kan eller kan ikke følgelig ha en ledersekvens for lettkjeden til antistoffet. Disse resultatene impliserer at nukleinsyren blir tatt opp av de antigenpresenterende cellene som presenterer T-hjelpeepitoper i konteksten av MHC klasse II fra endogent-syntetisert protein, muligens ved autofagi. For at hjelpe-t-celler skal assistere CTL-responser, må begge T-celleepitopene de gjenkjenner bli presentert på de samme antigenpresenterende cellene i en prosesss kjent som koblet T-cellehjelp. Dette impliserer at den antigenpresenterende cellen som syntetiserer lettkjeden, kodet for av nukleinsyren, enten også må syntetisere, sekrere og krysspresentere CTL-epitopene selv eller ta opp tungkjede fra en tilstøtende APC. [0028]Beskrevet heri er også isolerte dendrittiske celler som presenterer de heterologe hjelpe-t-celleepitopene på MHC klasse II fra endogent produsert lettkjede og heterologe CTL-epitoper fra krysspresentert tungkjede. Slike

14 -13- P4089NO00-MB dendrittiske celler kan bli anvendt i behandlingene beskrevet heri. [0029]Nukleinsyrer ifølge den foreliggende oppfinnelse kan gjøre eksisterende T-celleepitoper mer immunogene ved å kode for et denaturert antistoff som fører til en økning i både frekvensen og reaksjonsvilligheten til T-celleresponser. [0030]Nukleinsyren ifølge den foreliggende oppfinnelse kan være DNA, cdna eller RNA, slik som mrna oppnådd ved kloning eller produsert helt eller delvis ved kjemisk syntese. For terapeutisk anvendelse, er nukleinsyren fortrinnsvis i en form som er i stand til å bli uttrykt i individet som skal bli behandlet. [0031]Nukleinsyren ifølge den foreliggende oppfinnelse kan være rekombinant eller tilveiebrakt som et isolat, i isolert og/eller renset form. Den kan være fri eller hovedsakelig fri for nukleinsyre som flankerer genet i det humane genomet, unntatt muligens en eller flere regulatoriske sekvens(er) for ekspresjon. Hvor nukleinsyre ifølge den foreliggende oppfinnelse inkluderer RNA, skulle referanse til sekvensene vist heri bli konstruert som referanse til RNA-ekvivalenten, med U substituert for T. [0032]Nukleinsyrer ifølge den foreliggende oppfinnelse kan enkelt bli fremstilt av fagpersonen, for eksempel ved å anvende informasjonen og referansene inneholdt heri og teknikker kjent i faget (for eksempel, se Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, og Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992), gitt at nukleinsyresekvensene og klonene er tilgjengelige. Disse teknikkene inkluderer (i) anvendelsen av polymerase kjedereaksjon (polymerase chain reaction, PCR) for å amplifisere prøver av slik nukleinsyre, f.eks. fra genomiske kilder, (ii) kjemisk syntese, eller (iii) fremstilling av cdna-sekvenser. DNA som koder for polypeptidet kan bli generert og anvendt på hvilken som helst passende måte kjent for fagpersoner, inkludert ved å ta kodende DNA, identifisere passende restriksjonsenzym gjenkjenningsseter på begge sider av delen som skal bli uttrykt, og å kutte ut ovennevnte del fra DNA-et. Delen kan deretter bli opererbart forbundet til en passende promoter i et standard kommersielt tilgjengelig ekspresjonssystem. En annen rekombinant tilnærming er å amplifisere den relevante delen av DNAet med passende PCR-primere. Modifikasjoner på sekvensene kan bli utført, f.eks. ved å anvende seterettet mutagenese, for å føre til ekspresjonen av modifisert peptid eller å ta i betraktning kodonpreferanser i vertscellene som blir

15 -14- P4089NO00-MB anvendt for å uttrykke nukleinsyren. [0033]For å kunne oppnå ekspresjon av nukleinsyresekvensene, kan sekvensene bli inkorporert inn i en vektor som har en eller flere kontrollsekvenser opererbart forbundet til nukleinsyren for å kontrollere dens ekspresjon. Vektorene kan inkludere andre sekvenser slik som promotere eller enhancere for å drive ekspresjonen av den innsatte nukleinsyren, nukleinsyresekvensene slik at polypeptidet blir produsert som en fusjon og/eller nukleinsyre som koder for sekresjonssignaler slik at polypeptidet produsert i vertscellen blir sekrert fra cellen. Hvis ønsket, kan polypeptid deretter bli ervervet ved å transformere vektorene inn i vertsceller der vektoren er funksjonell, dyrking av vertscellene slik at polypeptidet blir produsert og gjenvinne polypeptidet fra vertscellene eller det omgivende mediet. Prokaryote og eukaryote celler blir anvendt for dette fagformålet, inkludert stammer av E. coli, gjærog eukaryote celler slik som insektsceller, og dyreceller, for eksempel, COS, CHOceller, Bowes Melanom og andre passende humane celler. Hvor den foreliggende oppfinnelse vedrører nukleinsyre(r) som koder for de tunge og lette kjedene til et antistoff, kan de respektive nukleinsyrene være tilstedeværende i den samme ekspresjonsvektoren, drevet av de samme eller forskjellige promotere, eller i separate ekspresjonsvektorer. [0034]Nukleinsyrene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt for å stimulere en immunrespons mot minst én av T-celleepitopen(e) i en pasient slik som et pattedyr, inkludert menneske. Hjelpe- og/eller cytotoksiske T- celleresponser kan bli stimulert. T-celleresponsen mot en spesiell epitop oppnådd av den foreliggende oppfinnelse kan ha en høyere reaksjonsvillighet enn den oppnådd ved immunisering med den samme epitopen som et enkelt peptid, eller ved immunisering med den samme epitopen kodet inni et antigen enten som et peptid eller en nukleinsyre. Nukleinsyrene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan bli administrert som en kombinasjonsbehandling, dvs. en nukleinsyre som koder for lettkjeden og nukleinsyren som koder for tungkjeden. Nukleinsyren kan bli administrert intravenøst, intradermalt, intramuskulært, oralt eller gjennom andre veier. Intradermal eller intramuskulær administrering blir foretrukket fordi disse vevene inneholder dendrittiske celler. [0035]Som anvendt heri, inkluderer betegnelsen "behandling" hvilket som helst

16 -15- P4089NO00-MB regime som kan gagne et menneske eller ikke-humant dyr. Behandlingen kan være av en nedarvet eller tilegnet sykdom. Behandlingen er fortrinnsvis av en tilstand/lidelse assosiert med celleproliferering, slik som kreft eller av infeksjonssykdom. Eksempler på krefttyper som kan bli behandlet med nukleinsyren inkluderer hvilken som helst fast tumor, kolorektal kreft, lunge-, bryst-, gastrisk-, ovarial-, livmor-, lever-, nyre-, pankreas, melanom-, blære-, hode og hals-, hjerne-, øsofagus-, pankreas-, og bentumorer, så vel som bløtvevskrefttyper, og leukemier. [0036]Nukleinsyren kan bli benyttet i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer eller bærere. Slike bærere kan inkludere, men er ikke begrenset til, saltløsning, bufret saltløsning, dekstrose, liposomer, vann, glycerol, etanol og kombinasjoner derav. [0037]Adjuvanser kan bli benyttet for å lette stimulering av vertens immunrespons, og kan inkludere aluminiumhydroksid, lysolecitin, pluronic, polyoler, polyanioner, peptider, proteiner og oljeemulsjoner. [0038]Nukleinsyrene som er nyttige i den foreliggende oppfinnelse kan bli formulert i farmasøytiske sammensetninger. Disse sammensetningene kan omfatte, i tillegg til én av substansene over, en farmasøytisk akseptabel eksipient, bærer, buffer, stabilisator eller andre materialer godt kjent for fagpersoner. Slike materialer skulle være ikke-toksiske og skulle ikke interferere med virkeevnen til den aktive ingrediensen. Den presise naturen til bæreren eller annet materiale kan avhenge av administreringsveien, f.eks. intradermale, orale, intravenøse, kutane eller subkutane, nasale, intramuskulære, intraperitoneale veier. Formuleringen er fortrinnsvis nukleinsyre som et stabilt, tørt pulver presipitert over på overflaten til mikroroskopiske gullpartikler og passende for injeksjon via en genpistol. Formuleringen kan være passende for intradermal eller intramuskulær administrering ved å anvende elektroporering. [0039]Sammensetningene som omfatter, eller for levering av, nukleinsyrer blir fortrinnsvis administrert til et individ i en terapeutisk effektiv mengde, der dette er tilstrekkelig til å vise nyttevirkning for individet. Den faktiske mengde administrert, og rate og tidsforløp for administrering, vil avhenge av naturen og alvorlighetsgraden til det som blir behandlet. Preskripsjon av behandling, f.eks. avgjørelser om dosering osv., er allmenpraktikeres og andre medisinske doktorers ansvar, og tar typisk i betraktning lidelsen som skal behandles,

17 -16- P4089NO00-MB tilstanden til den individuelle pasienten, leveringsstedet, administreringsfremgangsmåten og andre faktorer kjent for praktikere. Nukleinsyrene ifølge den foreliggende oppfinnelse er spesielt relevante for behandlingen av eksisterende kreft og i forebyggingen av tilbakefall av kreft etter innledende behandling eller kirurgi. Eksempler på teknikkene og protokollene nevnt over kan bli funnet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A, (ed), [0040]Nukleinsyren ifølge den foreliggende oppfinnelse stimulerer fortrinnsvis hjelpe- og/eller cytotoksiske T-celler som signifikant kan hemme veksten av tumorceller når administrert til et menneske på en effektiv måte. Den optimale dosen kan bli bestemt av leger basert på et antall inkluderte parametere, for eksempel alder, kjønn, vekt, alvorlighetsgrad for tilstanden som blir behandlet, der den aktive ingrediensen blir administrert og administreringsveien. En dose på μg DNA er for eksempel tilstrekkelig for å stimulere både hjelpe- og cytotoksiske T-celleresponser. [0041]Nukleinsyrene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan bli administrert sammen med supplerende farmasøytiske akseptable ingredienser. Slike ingredienser inkluderer, for eksempel, immunsystem-stimulatorer. [0042]En sammensetning kan bli administrert alene eller i kombinasjon med andre behandlinger, enten samtidig eller sekvensielt avhengig av tilstanden som blir behandlet. Andre kreftbehandlinger inkluderer andre monoklonale antistoffer, andre kjemoterapeutiske midler, andre røntgenbehandlingsteknikker eller annen immunoterapi kjent i faget. Én spesiell anvendelse av sammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelse er som en medhjelper til kirurgi, dvs. for å hjelpe og redusere faren for kreft som gjenoppstår etter at en tumor er fjernet. [0043]Injeksjoner (id) kan være den primære veien for terapeutisk administrering av nukleinsyren ifølge denne foreliggende oppfinnelse. [0044]Nukleinsyrene kan bli administrert på en lokalisert måte til et tumorsete eller annet ønsket sete eller kan bli levert på en måte der de målsikter tumor eller andre celler. [0045]Nukleinsyredosen vil være avhengig av egenskapene til det benyttede middelet, f.eks. dets bindingsaktivitet og in vivo plasma halveringstid, konsentrasjonen av polypeptidet i formuleringen, administreringsveien, setet og

18 -17- P4089NO00-MB doseringsraten, den kliniske toleransen til pasienten som er involvert, den patologiske tilstanden som plager pasienten og dets like, som også er innenfor legens fagområde. For eksempel blir doser på 100 μg nukleinsyre per pasient per administrering foretrukket, selv om doseringer kan variere fra rundt 10 μg til 1 mg per dose. Forskjellige doseringer blir benyttet under en serie av sekvensielle inokuleringer; praktikeren kan administrere en innledende inokulering og deretter forsterke med relativt mindre doser av nukleinsyre. [0046]Beskrevet heri er en fremgangsmåte for enginering av T-celleepitoper fra målantigener inn i de variable områdene til antistoffer, og anvendelsen av slike konstruerte antistoffer som vaksiner for å stimulere både hjelpe- og cytotoksiske T-celleresponser. [0047]Også beskrevet heri er en vertscelle som inneholder en nukleinsyre som beskrevet heri. Nukleinsyren ifølge den foreliggende oppfinnelse kan bli integrert inn i genomet (f.eks. kromosom) til vertscellen. Integrasjon kan bli fremmet ved inklusjon av sekvenser som fremmer rekombinasjon med genomet i henhold til standard teknikker. Nukleinsyren kan være på en ekstrakromosomal vektor inni cellen, eller på annen måte identifiserbar heterolog eller fremmed for cellen. [0048]Også beskrevet heri er en fremgangsmåte som omfatter introduksjon av nukleinsyren ifølge den foreliggende oppfinnelse inn i en vertscelle. Introduksjonen, som (spesielt for in vitro introduksjon) generelt kan bli referert til uten begrensning som "transformasjon", kan benytte hvilken som helst tilgjengelig teknikk. For eukaryote celler kan passende teknikker inkludere kalsiumfosfattransfeksjon, DEAE-Dekstran, elektroporering, liposommediert transfeksjon og transduksjon ved å anvende retrovirus eller andre virus, f.eks. vaccinia- eller, for insektceller, baculovirus. For bakterieceller kan passende teknikker inkludere kalsiumkloridtransformasjon, elektroporering og transfeksjon ved å anvende bakteriofag. Som et alternativ kunne direkte injeksjon av nukleinsyren bli benyttet. [0049]Markørgener, slik som antibiotikaresistens- eller sensitivitetsgener, kan bli anvendt for å identifisere kloner som inneholder nukleinsyre av interesse, somergodtkjentifaget. [0050]Introduksjonen kan bli fulgt av å forårsake eller muliggjøre ekspresjon fra nukleinsyren, f.eks. ved dyrking av vertsceller (som kan inkludere celler som

19 -18- P4089NO00-MB faktisk er transformert selv om cellene mer sannsynlig vil være etterkommere fra de transformerte cellene) under tilstander for ekspresjon av genet, slik at det kodede polypeptidet (eller peptidet) blir produsert. Hvis polypeptidet blir uttrykt koblet til et passende signallederpeptid, kan det bli sekrert fra cellen inn i kulturmediet. Etterfølgende produksjon ved ekspresjon, kan et polypeptid eller peptid bli isolert og/eller renset fra vertscellen og/eller dyrkingsmediet, som tilfelle kan være, og deretter anvendt som ønsket, f.eks. i formuleringen av en sammensetning som kan inkludere en eller flere ekstra komponenter, slik som en farmasøytisk sammensetning, som inkluderer en eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter, vehikler eller bærere (f.eks. se under). [0051]Beskrevet heri er også en fremgangsmåte for identifisering av T- celleepitoper i et kandidatantigen, omfattende: depletering av regulatoriske T-celler i et ikke-humant dyr; immunisering av det ikke-humane dyret med et kandidatantigen; og screening for å se hvorvidt en T-cellerespons blir stimulert mot begge peptider til forutsagte epitoper i kandidatantigenet eller alle de mulige overlappende peptidene innenfor kandidatantigenet. [0052]Fremgangsmåten kan bli utført i et ikke-humant dyr, slik som en mus eller en rotte. Regulatoriske T-celler kan bli depletert i det ikke-humane dyret ved å anvende anti-cd25-antistoffer, som eventuelt kan bli konjugert med toksiner slik som Ontak, eller ved kjemoterapi slik som syklofosfamid, som fortrinnsvis dreper regulatoriske T-celler. Straks regulatoriske T-celler har blitt depletert, kan det ikke-humane dyret bli immunisert med DNA som koder for kandidatantigenet, eller av kandidatantigenet selv. Det er foretrukket at kandidatantigenet blir tilveiebrakt som et antigen-fc fusjonsprotein. I screeningtrinnet blir peptidet identifisert som hvilken som helst T-cellerespons blir stimulert mot i det ikke-humane dyret. Dette kan bli utført in vitro ved å anvende en teknikk slik som ELISPOT, hvis en T-cellerespons blir fremkalt mot en kandidatepitop, kan denne epitopen bli anvendt til å immunisere et ikkehumant dyr. Hvis dette peptidet fremkaller en T-cellerespons, kan reaksjonsvilligheten og frekvensen bli forsterket ved å kode epitopen inni en nukleinsyre i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Denne fremgangsmåte kan muliggjøre identifiseringen av T-celleepitoper som blir prosessert av

20 -19- P4089NO00-MB immunoproteosomet. [0053]Den foreliggende oppfinnelse vil nå bli beskrevet videre i det følgende eksempelet. Det blir referert til de følgende tegningene: Figur 1. Kart som fremstiller egenskaper til tungkjedevektoren porighib Villtype deimmunisert tungt variabelt område til antistoff SC100 ble klonet ved å anvende HindlIl/Afel i ramme med det humane IgG1 Fc konstante området. Fc-området omfatter CH1-, CH2-, CH-domenene og hengselområdet. Høyt nivå ekspresjon i pattedyrceller blir drevet fra humant cytomegalovirus immediat tidlig promoteren. BGH-polyadenyleringssignaler nedstrøms for Orig HIB humant IgG1-kjeden for å sikre mrna-stabilitet og effektiv terminering. EM7 er en bakteriepromoter som kontrollerer ekspresjon av zeocin-resistensgenet som muliggjør antibiotikaseleksjon i E.coli, mens SV40 tidlig promoteren oppstrøms for resistensgenet muliggjør seleksjon i pattedyrceller. SV40- polyadenyleringssignaler nedstrøms for resistensgenet for å kunne rette riktig prosessering av 3'ende til zeo r -mrna-et. Vektoren inneholder også inni sin ryggrad ColE1 replikasjonsorigoet for propagering i bakterier. Komplimentaritetsbestemmende DNA-sekvenser ble effektivt fjernet og byttet med restriksjonsseter RE1, RE2 og RE3 (henholdsvis Fspl, Mscl og SrfI) enkeltvis og i kombinasjon. Figur 2: Kart som fremstiller egenskaper til tungkjedevektoren poriglib Det villtype de-immuniserte lette variable området til antistoff SC100 ble klonet ved å anvende BamHI/BsiWI i ramme med det humane kappa konstante området. Høynivå ekspresjon i pattedyrceller blir drevet fra humant cytomegalovirus immediat tidlig promoteren. BGH-polyadenyleringssignaler nedstrøms for Orig LIB-kjeden for å sikre mrna-stabilitet og effektiv terminering. Vektoren inkluderer også ColE1 replikasjonsorigo og antibiotikaresistensgenet for ampicillin som muliggjør propagering og seleksjon i bakterier. Komplimentaritetsbestemmende områder ble effektivt fjernet og byttet med restriksjonsseter RE4, RE5 og RE6 (henholdsvis EcoRV, SspIogHpa I) enkeltvis og i kombinasjon. Figur 3: Sekvens for den villtype ImmunoBody kimære tungkjeden. Nukleotide og ved translasjon aminosyresekvens er illustrert for den fullengde kimære

21 -20- P4089NO00-MB IgG1-tungkjeden. Beliggenheter for CDR-er er inni bokser definert av Kabatnummereringsskjemaet. Stoppkodonet er fremstilt med en rød asterisk. HindlIl/Afe I-restriksjonssetene er uthevet som blir benyttet i overføring av det variable tunge området Figur 4: Sekvens for den villtype ImmunoBody kimære kappa-kjeden Nukleotide- og ved translasjon aminosyresekvens er illustrert for fullengde kimær kappa-kjede. Beliggenheter for CDR-er er inni bokser definert av kabatnummereringsskjemaet. Stoppkodonet er fremstilt ved en asterisk. BamHI/BsiWI-restriksjonssetene benyttet i overføring av det variable lette området er uthevet Figur 5: Overlappende ekstensjons-pcr CDR-er ble fjernet og erstattet med unike restriksjonsseter ved overlappings- PCR. Forward primerne H1, H2, H3, L1, L2 og L3 (Tabell 2) ble konstruert for å erstatte CDR1, 2 og 3 inni henholdsvis tung- og lettkjede variabelt område. Hver primer inneholdt, sentralt anbrakt, den valgte unike enzymgjenkjenningssekvensen uten CDR-sekvensen som skal bli fjernet (grønn del) og flankert av bp av villtypesekvens. Forward-primerne ble anvendt i en første runde PCR i forbindelse med en generell revers primer, huheclonr eller huliclonr (Tabell 2), som annealer til de humane tunge og lette konstante domenene inni henholdsvis villtypekonstruktene porighib og poriglib. Det genererte fragmentet inneholder ikke villtype CDR-sekvens (rød del), men blir effektivt skiftet ut med restriksjonssetet. For å kunne amplifisere hele det variable tunge og lette området, er det nødvendig med en andre runde PCR ved å anvende PCR-produkt generert fra den første runden som en revers primer med den generelle CMV forward-primeren som annealer til CMV-promoteren inni de enkelte plasmidene. Andre runde PCR-produkter ble subklonet inn i pcr2.1 (Invitrogen) og, etter sekvensbekreftelse, ble de tunge/lette (VH og VL) variable områdene som inneholder H1-, H2-, H3-, L1-, L2- og L3-versjoner enkeltvis, i kombinasjon og sammen satt tilbake inn i enkle konstrukter porighib og poriglib, som bytter ut villtypeområdene ved å anvende henholdsvis HindlIl/Afel og BamHl/BsiWl.