(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (51) Int Cl. A61K 39/395 ( ) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato (30) Prioritet , US, P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR Utpekte samarbeidende stater AL BA MK RS (73) Innehaver Eli Lilly & Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, IN 46285, US-USA (72) Oppfinner KORYTKO, Andrew Ihor, 4720 Marblehead Bay Drive, Oceanside, CA 92057, US- USA MARQUIS, David Matthew, 2106 Meadowgreen Court, Encinitas, CA 92024, US- USA SMITH, Eric Michael, Charbono Terrace, San Diego, CA 92131, US-USA SWANSON, Barbara Anne, 1402 Willowspring Drive North, Encinitas, CA 92024, US-USA (74) Fullmektig Zacco Norway AS, Postboks 2003 Vika, 0125 OSLO, Norge (54) Benevnelse Antistoffer mot sklerostin (56) Anførte publikasjoner WO-A-2006/ WO-A-2006/ BALINT R F ET AL: "ANTIBODY ENGINEERING BY PARSIMONIOUS MUTAGENESIS" GENE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 137, no. 1, 27 December 1993 ( ), pages , XP ISSN:

2 1 ANTISTOFFER MOT SKLEROSTIN 5 Den foreliggende oppfinnelsen vedrører det medisinske feltet, særlig feltet for antistoffer mot sklerostin. Oppfinnelsen vedrører nærmere bestemt antistoffer med høy affinitet som spesifikt binder humant sklerostin, og terapeutisk anvendelse av antistoffene for forskjellige lidelser eller tilstander hos mennesker som drar fordel av en økning i minst én av benmasse, benmineraldensitet, benmineralinnhold eller benstyrke Osteoporose er en sykdom i hvilken benmineraldensiteten (BMD) reduseres, benmikroarkitekturen forstyrres og osteoporotiske ben har stor risiko for fraktur. Osteoporose er fremdeles en viktig årsak til langsiktig uførhet og dødelighet, særlig blant eldre. Selv om virkningsfulle behandlinger for osteoporose finnes i form av livsstilsendring og farmakoterapi, er de aktuelt tilgjengelige behandlingene begrenset i antall og effekt, de er ofte assosiert med uønskede bivirkninger og er ikke universelt akseptable for pasienter. En rekke antiresorptive middel, inkludert kalsitonin, bisfosfonater, østrogenutbytting og selektive østrogenreseptormodulatorer (SERM-er) forebygger ytterligere bentap, men de gjenoppbygger ikke ben når det er tapt. Et anabolt middel som øker benmasse og benmineraldensitet og gjenoppretter benarkitektur, er tilgjengelig i form av humant PTH (1-34). Dette terapeutiske middelet krever imidlertid daglig subkutan injeksjon, ofte i ett år eller mer, hvilket resulterer i mindre enn komplett etterlevelse av behandlingen fra pasientens side Sklerostin, SOST-genproduktet, er sterkt uttrykt i osteocytter i ben. På grunn av dets rolle som en sterk negativ regulator av bendannelse er sklerostin et ønskelig mål for terapeutisk intervensjon for lidelser eller tilstander som ville dra fordel av en økning i minst én av benmasse, benmineraldensitet, benmineralinnhold og benstyrke, f.eks. osteoporose. Antistoffer mot sklerostin kan derfor vise seg nyttige som en anabol tilnærming i behandling av slike lidelser eller tilstander. PCT-publikasjonsnr. WO 2006/ beskriver aminosyresekvenser av særlige humaniserte antistoffer mot sklerostin i hvilke alle CDR-ene er fullstendig murine, dvs. ikke endret fra CDR-ene i et antistoff generert hos en mus. WO 2006/ beskriver antistoffer eller fragmenter derav som er i stand til å binde til sklerostin, hvilke sies å være nyttige for å behandle en lang rekke benrelaterte tilstander.

3 Det er et behov for et alternativt antistoff mot sklerostin som binder humant sklerostin med en sterk bindingsaffinitet og har en lav IC 50 -verdi i et sklerostinbioaktivitetsassay. Et slikt antistoff ville bli predikert til å være mer terapeutisk virkningsfullt, særlig for osteoporose, og kreve mindre hyppig dosering enn PTH (1-34) eller et antistoff mot sklerostin med en mindre bindingsaffinitet (dvs. en høyere K D ) eller en høyere IC 50 -verdi. Det er også et behov for et antistoff som er spesifikt for humant sklerostin, hvori det er en redusert risiko for en immunrespons overfor antistoffet frembrakt av et menneske som får administrert antistoffet, eller en redusert risiko for ustabilitet, samtidig som antistoffets egenskaper med å ha en høy bindingsaffinitet for humant sklerostin og en lav IC 50 -verdi i et bioaktivitetsassay opprettholdes. Antistoffene mot sklerostin ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilfredsstiller disse behovene og tilveiebringer relaterte fordeler Antistoffer ifølge oppfinnelsen er kimære eller humaniserte monoklonale antistoffer, omfatter en spesifikk polypeptidsekvens beskrevet heri, binder spesifikt humant sklerostin med en høy bindingsaffinitet og kan anvendes for å øke minst én av benmasse, benmineraldensitet, benmineralinnhold og benstyrke hos et pattedyr, foretrukket et menneske. I én utførelsesform skiller minst én CDR i et antistoff ifølge oppfinnelsen seg i aminosyresekvens fra CDR ved den posisjonen til stede i et morantistoff, dvs. antistoffet generert hos en gnager (f.eks. en mus), fra hvilken det alternative antistoffet, dvs. humanisert eller kimært antistoff ifølge oppfinnelsen, ble avledet. En slik eller slike aminosyresubstitusjoner i en CDR-sekvens i et antistoff ifølge oppfinnelsen resulterer foretrukket i en større bindingsaffinitet (dvs. lavere K D ) med humant sklerostin, en lavere IC 50 i et sklerostinbioaktivitetsassay, eller begge, enn hva som er til stede i morantistoffet. En aminosyresubstitusjon i en CDR-sekvens i et antistoff ifølge oppfinnelsen fra det som er til stede i CDR-en i morantistoffet, kan resultere i en redusert immunogen respons overfor antistoffet hos et menneske som får administrert antistoffet. En aminosyresubstitusjon i en CDR-sekvens i et antistoff ifølge oppfinnelsen fra det som er til stede i CDR-en i morantistoffet, kan videre redusere risikoen for ustabilitet i antistoffet, f.eks. ved substitusjon av en asparaginrest med en annen aminosyre, hvilket derved reduserer risikoen for deamidering.

4 3 5 Ifølge et første aspekt ved den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringes det et antistoff eller et funksjonelt fragment derav som spesifikt binder humant sklerostin, hvori antistoffet eller det funksjonelle fragmentet derav omfatter seks CDR-er med følgende aminosyresekvenser: HCDR1 med SEQ ID NO: 26, HCDR2 med SEQ ID NO: 27, HCDR3 med SEQ ID NO: 28, LCDR1 med SEQ ID NO: 29, LCDR2 med SEQ ID NO: 30 og LCDR3 med SEQ ID NO: Antistoffet eller et funksjonelt fragment derav ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatter en variabel region i en tungkjede og en variabel region i en lettkjede, hvori den variable regionen i tungkjeden har aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 15 og den variable regionen i lettkjeden har aminosyresekvensen med SEQ ID NO: Enda mer foretrukket omfatter antistoffet eller et funksjonelt fragment derav ifølge den foreliggende oppfinnelsen et polypeptid i en tungkjede med aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 3 og et polypeptid i en lettkjede med aminosyresekvensen med SEQ ID NO: Ifølge et andre aspekt ved den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringes det en farmasøytisk sammensetning, omfattende antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynner. 25 Ifølge et annet aspekt ved den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringes det et antistoff eller et funksjonelt fragment derav ifølge den foreliggende oppfinnelsen for anvendelse som medikament. 30 Antistoffet eller et funksjonelt fragment derav ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendes foretrukket for å øke minst én av benmasse, benmineraldensitet, benmineralinnhold eller benstyrke hos et menneske, og nærmere bestemt for å behandle en sykdom eller lidelse valgt fra osteoporose, osteopeni, artrose, smerte assosiert med artrose, revmatoid artritt, periodontal sykdom eller multippelt myelom hos et menneske. 35 Et antistoff beskrevet heri binder spesifikt humant sklerostin og omfatter seks CDR-regioner med aminosyresekvenser valgt fra gruppen bestående av (i) HCDR1 med SEQ ID NO: 20, HCDR2 med SEQ ID NO: 21, HCDR3 med SEQ ID NO: 22, LCDR1 med SEQ ID NO: 23, LCDR2 med SEQ ID NO: 24 og LCDR3 med

5 4 5 SEQ ID NO: 25; (ii) HCDR1 med SEQ ID NO: 26, HCDR2 med SEQ ID NO: 27, HCDR3 med SEQ ID NO: 28, LCDR1 med SEQ ID NO: 29, LCDR2 med SEQ ID NO: 30 og LCDR3 med SEQ ID NO: 31; og (iii) HCDR1 med SEQ ID NO: 32, HCDR2 med SEQ ID NO: 33, HCDR3 med SEQ ID NO: 34, LCDR1 med SEQ ID NO: 35, LCDR2 med SEQ ID NO: 36 og LCDR3 med SEQ ID NO: I et tilfelle binder et antistoff spesifikt humant sklerostin og omfatter et polypeptid i en variabel region i en tungkjede (Heavy Chain Variable Region, HCVR) og et polypeptid i en variabel region i en lettkjede (Light Chain Variable Region, LCVR), hvori (i) HCVR-en har aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 14 og LCVR-en har aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 17; (ii) HCVR-en har aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 15 og LCVR-en har aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 18; eller (iii) HCVR-en har aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 16 og LCVR-en har aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 19. I et annet tilfelle binder antistoffet spesifikt humant sklerostin og omfatter et polypeptid i en tungkjede og et polypeptid i en lettkjede, hvori (i) polypeptidet i tungkjeden har aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 2 og polypeptidet i lettkjeden har aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 5; (ii) polypeptidet i tungkjeden har aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 3 og polypeptidet i lettkjeden har aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 6; eller (iii) polypeptidet i tungkjeden har aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 4 og polypeptidet i lettkjeden har aminosyresekvensen med SEQ ID NO: I et tilfelle er antistoffer som definert heri, foretrukket definert med et SEQ IDnummer, videre karakterisert ved å ha en bindingsaffinitet (K D ) for humant sklerostin på ca. 10 pm eller mindre ved 25 C. Foretrukne antistoffer har en K D for sklerostin fra cynomolog ape på ca. 100 pm eller mindre ved 25 C. Mer foretrukne antistoffer har en bindingsaffinitet for humant sklerostin på ca. 10 pm eller mindre ved 25 C og en bindingsaffinitet for sklerostin fra cynomolog ape på ca. 100 pm eller mindre ved 25 C. 35 I et annet tilfelle er antistoffer som definert heri, foretrukket definert med et SEQ ID-nummer, karakterisert ved å ha en IC 50 på 50 nm eller mindre i et assay for benspesifikk alkalisk fosfatase ved anvendelse av humant sklerostin. Disse antistoffene har også foretrukket en K D for humant sklerostin på ca. 10 pm eller mindre ved 25 C. Mer foretrukket har disse antistoffene en K D for humant

6 5 sklerostin på ca. 10 pm eller mindre ved 25 C og en K D for sklerostin fra cynomolog ape på ca. 100 pm eller mindre ved 25 C. 5 I et annet tilfelle tilveiebringer oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning, omfattende et antistoff ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynner. Den farmasøytiske sammensetningen omfatter foretrukket en homogen eller i det vesentlige homogen populasjon av et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynner. 10 Oppfinnelsen vedrører anvendelsen av et antistoff ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament For anvendelse i en fremgangsmåte for økning av minst én av benmasse, benmineraldensitet, benmineralinnhold eller benstyrke hos et dyr, foretrukket en pattedyrart, mer foretrukket et menneske. 15 Det beskrives heri en fremgangsmåte for økning av minst én av benmasse, benmineraldensitet, benmineralinnhold eller benstyrke som omfatter administrering til et menneske med behov for det av en virkningsfull mengde av et antistoff ifølge oppfinnelsen Det beskrives også heri en fremgangsmåte for behandling av en sykdom, tilstand eller lidelse hos et menneske som drar fordel av en økning av minst én av benmasse, benmineraldensitet, benmineralinnhold eller benstyrke, inkludert for eksempel osteoporose, osteopeni, artrose, smerte assosiert med artrose, periodontal sykdom og multippelt myelom. Det beskrives videre heri en fremgangsmåte for detektering av sklerostinprotein i en biologisk prøve, omfattende inkubering av et antistoff ifølge oppfinnelsen med den biologiske prøven under betingelser og i en tilstrekkelig tidsperiode til å la antistoffet binde til sklerostinprotein og detektere bindingen. Et foretrukket antistoff for anvendelse i et slikt detekteringsassay har et polypeptid i en tungkjede med SEQ ID NO:40 og et polypeptid i en lettkjede med SEQ ID NO: 41; et polypeptid i en tungkjede med SEQ ID NO: 42 og et polypeptid i en lettkjede med SEQ ID NO: 43; et polypeptid i en tungkjede med SEQ ID NO: 2 og et polypeptid i en lettkjede med SEQ ID NO: 5; et polypeptid i en tungkjede med SEQ ID NO: 3 og et polypeptid i en lettkjede med SEQ ID NO: 6; eller et polypeptid i en tungkjede med SEQ ID NO: 4 og et polypeptid i en lettkjede med SEQ ID NO: 7.

7 6 5 Det beskrives heri isolerte nukleinsyremolekyler som koder for et antistoff ifølge oppfinnelsen; en vektor omfattende den nukleinsyren, eventuelt operativt bundet til kontrollsekvenser gjenkjent av en vertscelle transformert med vektoren; en vertscelle omfattende vektoren; en fremgangsmåte for produksjon av et antistoff ifølge oppfinnelsen, omfattende dyrking av vertscellen slik at nukleinsyren uttrykkes, og eventuelt gjenvinning av antistoffet fra vertscellekulturmediet. 10 Oppfinnelsen vedrører antistoffer som spesifikt binder humant sklerostin, nøytraliserer eller antagoniserer minst én bioaktivitet for humant sklerostin in vitro eller in vivo og viser videre en sterk bindingsaffinitet med humant sklerostin. 15 Betegnelsen "sklerostin" betyr som anvendt heri det humane proteinet av full lengde med aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO: 1 eller den modne formen av proteinet med signalsekvensen fjernet Betegnelsen "antistoff" betyr som anvendt heri med henvisning til et antistoff mot sklerostin ifølge oppfinnelsen (eller bare "antistoff ifølge oppfinnelsen") et monoklonalt antistoff. Et "monoklonalt antistoff" betyr som anvendt heri et kimært antistoff eller et humanisert antistoff, med mindre noe annet er angitt. Monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan produseres ved anvendelse av for eksempel rekombinante teknikker, fagvisningsteknikker, syntetiske teknikker, f.eks. CDR-poding, eller kombinasjoner av slike teknikker eller andre teknikker som er velkjent i teknikken. "Monoklonalt antistoff" betegner et antistoff som er avledet fra en enkelt kopi eller en enkelt klon, inkludert for eksempel hvilken som helst eukaryotisk klon, prokaryotisk klon eller fagklon, og ikke fremgangsmåten ved hvilken den produseres. Et "monoklonalt antistoff" eller "antistoff ifølge oppfinnelsen" eller bare "antistoff" kan være et intakt antistoff (omfattende en komplett Fc-region eller Fc-region av full lengde), eller en porsjon eller et fragment av et antistoff, omfattende en antigenbindingsporsjon, f.eks. et Fab-fragment, Fab'-fragment eller F(ab') 2 -fragment av et kimært eller humanisert antistoff. Særlig foretrukne antigenbindingsfragmenter av et antistoff ifølge oppfinnelsen bevarer evnen til å inhibere eller nøytralisere én eller flere bioaktivitetskarakteristikker for et

8 pattedyr-sklerostin in vivo eller in vitro. I én utførelsesform kan for eksempel en antigenbindingsporsjon av et antistoff ifølge oppfinnelsen inhibere interaksjonen mellom modent humant sklerostin og én eller flere av dets ligander og/eller inhibere én eller flere reseptormedierte funksjoner av humant sklerostin. Et "monoklonalt antistoff" eller "antistoff ifølge oppfinnelsen" eller bare "antistoff" kan videre som anvendt heri være et enkeltkjedet Fv-fragment som kan produseres ved sammenføyning av DNA-en som koder for LCVR-en og HCVR-en med en linkersekvens. (Se Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, bd. 113, Rosenburg og Moore eds., Springer-Verlag, New York, s , 1994). Det skal forstås at uavhengig av om antigenbindingsfragmenter eller -porsjoner er spesifisert, inkluderer betegnelsen "antistoff" som anvendt heri slike fragmenter eller porsjoner i tillegg til enkeltkjedede former, med mindre noe annet er angitt. Så lenge proteinet bevarer evnen til spesifikt å binde sklerostin, er det inkludert i betegnelsen "antistoff" Betegnelsen "binder spesifikt" betyr som anvendt heri situasjonen i hvilken ett element av et spesifikt bindingspar ikke signifikant binder til andre molekyler enn dets spesifikke bindingspartner(e) som målt ved en teknikk som er tilgjengelig i teknikken, f.eks. kompetitiv ELISA, BIACORE -assay eller KINEXA -assay. Betegnelsen er også anvendelig hvor for eksempel et antigenbindingsdomene i et antistoff ifølge oppfinnelsen er spesifikt for en særlig epitop som er båret av en rekke antigener, i hvilket tilfelle antistoffet som bærer antigenbindingsdomenet, vil kunne binde spesifikt til de forskjellige antigenene som bærer epitopen. Betegnelsen "epitop" betyr den delen av et molekyl som er i stand til å bli gjenkjent og bundet av et antistoff ved én eller flere av antistoffets antigenbindingsregioner Betegnelsen "bioaktivitet" med henvisning til et antistoff ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, epitop- eller antigenbindingsaffinitet, evnen til å nøytralisere eller antagonisere en bioaktivitet for sklerostin in vivo eller in vitro, IC 50 i et assay for benspesifikk alkalisk fosfatase (f.eks. som beskrevet i eksempel 2 heri) eller et annet in vitro-aktivitetsassay, antistoffets in vivo- og/eller in vitro-stabilitet og antistoffets immunogene egenskaper, f.eks. når det administreres til et menneske. Ovennevnte egenskaper eller karakteristikker kan observeres eller måles ved anvendelse av teknikker som er anerkjent i teknikken, inkludert, men ikke begrenset til, ELISA, kompetitiv

9 ELISA, overflateplasmonresonansanalyse, in vitro- og in vivonøytraliseringsassay uten begrensning, reseptorbinding og immunhistokjemi med vevssnitt fra forskjellige kilder, inkludert menneske, primat eller hvilken som helst annen kilde etter behov. Betegnelsen "bioaktivitet" med hensyn til sklerostin inkluderer, men er ikke begrenset til, spesifikk binding av sklerostin til et annet protein (f.eks. en reseptor eller et TGF-ß-familieelement), én eller flere reseptormedierte funksjoner av humant sklerostin, signaltransduksjon, immunogene egenskaper, in vivo- eller in vitro-stabilitet, hvilket påvirker nivåene eller aktiviteten av et annet protein in vivo eller in vitro (se for eksempel eksempel 2), sklerostinekspresjonsnivåer og vevsfordeling. 15 Betegnelsene "inhibere" eller "nøytralisere" betyr som anvendt heri med hensyn til en bioaktivitet for et antistoff ifølge oppfinnelsen evnen til i det vesentlige å antagonisere, prohibere, forhindre, begrense, bremse, avbryte, eliminere, stoppe, redusere eller reversere en bioaktivitet for sklerostin (f.eks. som målt i eksempel 2 heri) Betegnelsen "Kabat-nummerering" er som anvendt heri anerkjent i teknikken og betyr et nummereringssystem for aminosyrerester som er mer variable (dvs. hypervariable) enn andre aminosyrerester i tung- og lettkjede-regionene i et antistoff (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190: (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH-publikasjonsnr (1991)). Posisjoneringen av CDR-er i et den variable regionen i et antistoff følger Kabatnummerering eller bare "Kabat". 30 Et polynukleotid er "operativt bundet" når det plasseres i et funksjonelt forhold til et annet polynukleotid. En promoter eller enhancer er for eksempel operativt bundet til en kodingssekvens hvis den påvirker sekvensens transkripsjon. 35 Betegnelsene "individ" og "pasient" brukes om hverandre heri og betyr et pattedyr, foretrukket et menneske. I en viss utførelsesform er individet videre karakterisert ved en sykdom eller lidelse eller tilstand som ville dra fordel av et redusert nivå av sklerostin eller redusert bioaktivitet for sklerostin.

10 Betegnelsen "vektor" betyr et nukleinsyremolekyl som kan transportere en annen nukleinsyre til hvilken den er blitt operativt bundet, inkludert, men ikke begrenset til, plasmider og virale vektorer. Visse vektorer kan utføre autonom replikasjon i en vertscelle i hvilken de introduseres, mens andre vektorer kan integreres i genomet til en vertscelle ved introduksjon i vertscellen og derved replikeres sammen med vertsgenomet. Visse vektorer er videre i stand til å styre ekspresjonen av gener til hvilke de er operativt bundet. Slike vektorer betegnes heri "rekombinante ekspresjonsvektorer" (eller bare "rekombinante vektorer"). Eksempelvektorer er velkjent i teknikken. Betegnelsene "celle", "vertscelle" og "cellekultur" anvendes om hverandre og inkluderer som anvendt heri en individuell celle eller cellekultur som er mottager av hvilket som helst isolert polynukleotid ifølge oppfinnelsen eller hvilken eller hvilke som helst rekombinante vektorer, omfattende en nukleotidsekvens som koder for en HCVR, en LCVR eller et antistoff ifølge oppfinnelsen. En vertscelle inkluderer celler transformert, transdusert eller infisert med én eller flere rekombinant vektorer eller et polynukleotid som uttrykker et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen eller en lettkjede eller tungkjede derav Hver tungkjede i et antistoff av full lengde er omfattet av en N-terminal variabel region i tungkjeden ("HCVR") og en konstant region i tungkjeden. Hver lettkjede i et antistoff av full lengde er omfattet av en N-terminal variabel region i lettkjeden (heri "LCVR") og en konstant region i lettkjeden. HCVR- og LCVRregionene kan videre deles inn i hypervariabilitetsregioner, kalt komplementaritetsbestemmende regioner ("CDR-er"), blandet med regioner som er mer konservert, kalt strukturregioner ("FR"). Et antistoffs funksjonelle evne til å binde et særlig antigen eller en særlig epitop er i hovedsak påvirket av de seks CDR-ene som finnes i antistoffets variable region. Hver HCVR og LCVR består av tre CDR-er (HCDR1, HCDR2 og HCDR3 i HCVR-en og LCDR1, LCDR2 og LCDR3 i LCVR-en) og fire FR-er, ordnet fra aminoterminal til karboksyterminal i følgende rekkefølge: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR-ene inneholder mesteparten av restene som danner særlige interaksjoner med antigenet. CDRposisjonering innenfor den variable regionen følger Kabat. 35 Lettkjeder klassifiseres som kappa eller lambda og karakteriseres ved en særlig konstant region som er kjent i teknikken. Tungkjeder klassifiseres som gamma, mu, alfa, delta eller epsilo, og definerer antistoffets isotype som henholdsvis

11 IgG, IgM, IgA, IgD og IgE, og flere av disse kan ytterligere deles inn i underklasser, f.eks. IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4. Hver tungkjedetype er karakterisert ved en særlig konstant region med en sekvens som er velkjent i teknikken. Lettkjedens konstante region kappa og tungkjedens konstante regioner IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4 er foretrukne konstante regioner i antistoffene ifølge oppfinnelsen. Tungkjedens konstante region omfatter mer foretrukket et polypeptid med en aminosyresekvens med SEQ ID NO: 38 som kodet av et polynukleotid med SEQ ID NO: 39. Kimære antistoff kan ha konstante regioner av ikke-human opprinnelse, foretrukket rotte eller mus. "Antigenbindingsregion" eller "antigenbindingsporsjon" betyr som anvendt heri den porsjonen av et antistoffmolekyl, innenfor den variable regionen, som inneholder aminosyrerestene som interagerer med et antigen og gir antistoffet dets spesifisitet og affinitet for antigenet. Denne antistoffporsjonen inkluderer strukturaminosyrerestene som er nødvendige for å opprettholde antigenbindingsrestenes riktige konformasjon Et foretrukket antistoff omfatter seks CDR-er med aminosyresekvenser med SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24 og 25. Et annet foretrukket antistoff omfatter seks CDR-er med aminosyresekvenser med SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36 og 37. Et mer foretrukket antistoff omfatter seks CDR-er med aminosyresekvenser med SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30 og 31. CDR-ene i disse foretrukne antistoffene finnes i posisjonen som angitt i tabell 1 nedenfor. CDR-ene er posisjonert i den variable regionen ifølge Kabat. Et foretrukket antistoff omfatter en LCVR med aminosyresekvensen med SEQ ID NO 17, 18 eller 19. Andre foretrukne monoklonale antistoffer omfatter en HCVR med aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 14, 15 eller 16. Et antistoff omfatter mer foretrukket en LCVR med SEQ ID NO: 17 og en HCVR med SEQ ID NO: 14. Et alternativt antistoff omfatter en LCVR med SEQ ID NO: 19 og en HCVR med SEQ ID NO: 16. Et mer foretrukket antistoff omfatter en LCVR med SEQ ID NO: 18 og en HCVR med SEQ ID NO: 15. Slike LCVR-er er foretrukket bundet til en konstant region i en lettkjede, foretrukket av human opprinnelse, foretrukket en kappa-kjede. Slike HCVR-er er foretrukket operativt bundet til en konstant region i en tungkjede, foretrukket av human opprinnelse, foretrukket IgG 1 eller IgG 4, mest foretrukket en konstant region i en tungkjede omfattende sekvensen med SEQ ID NO:38.

12 11 5 Ett foretrukket antistoff omfatter et polypeptid i en tungkjede med SEQ ID NO: 2 og et polypeptid i en lettkjede med SEQ ID NO: 5. Polypeptidet i tungkjeden med SEQ ID NO: 2 kan kodes av for eksempel en polynukleotidsekvens med SEQ ID NO: 8, polypeptidet i lettkjeden med SEQ ID NO: 5 kan kodes av for eksempel et polynukleotid med SEQ ID NO: Et annet foretrukket antistoff omfatter et polypeptid i en tungkjede med SEQ ID NO: 4 og et polypeptid i en lettkjede med SEQ ID NO: 7. Polypeptidet i tungkjeden med SEQ ID NO:4 kan kodes av for eksempel en polynukleotidsekvens med SEQ ID NO: 10, polypeptidet i lettkjeden med SEQ ID NO: 7 kan kodes av for eksempel et polynukleotid med SEQ ID NO: Et annet foretrukket antistoff omfatter et polypeptid i en tungkjede med SEQ ID NO: 3 og et polypeptid i en lettkjede med SEQ ID NO: 6. Polypeptidet i tungkjeden med SEQ ID NO:3 kan kodes av en polynukleotidsekvens med SEQ ID NO: 9, polypeptidet i lettkjeden med SEQ ID NO: 6 kan kodes av et polynukleotid med SEQ ID NO: De foretrukne humaniserte antistoffene er heri betegnet 86, 88 og 89. SEQ ID NO-ene for deres sekvenser er som angitt i tabell 1 nedenfor. Tabell 1 SEQ ID NO-er for protein Anti- Tung- Lett- HCVR Tung Tung Tung LCVR Lett Lett Lett stoff kjede kjede CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR Et antistoff hvori alle seks CDR-er, HCVR-en, LCVR-en, HCVR-en og LCVR-en, hele tungkjeden, hele lettkjeden eller hele tungkjeden og hele lettkjeden er begrenset av en særlig sekvens som vist av et SEQ ID NO heri (se for eksempel tabell 1), er foretrukket videre karakterisert ved å ha en K D for humant sklerostin ved 25 C på mindre enn ca. 10 pm, 8 pm, 6 pm eller 4 pm, mer foretrukket mindre enn ca. 2,2 pm. Det er i tillegg foretrukket at et slikt antistoff

13 12 er ytterligere begrenset ved å ha en K D for sklerostin fra cynomolog ape ved 25 C på mindre enn ca. 100 pm, 90 pm eller 80 pm, eller mer foretrukket mindre enn ca. 75 pm Et antistoff hvori alle seks CDR-er, HCVR-en, LCVR-en, HCVR-en og LCVR-en, hele tungkjeden, hele lettkjeden eller hele tungkjeden og hele lettkjeden er begrenset av en særlig sekvens som vist av et SEQ ID NO heri, er foretrukket videre karakterisert ved å ha en IC 50 i et assay for benspesifikk alkalisk fosfatase med humant sklerostin (se for eksempel eksempel 2 heri) på ca. 50 nm eller mindre, ca. 40, 35 eller 30 nm eller mindre, mer foretrukket ca. 25 nm, enda mer foretrukket ca. 20 nm (f.eks. 20,2 nm) eller mindre Et antistoff hvori alle seks CDR-er, HCVR-en, LCVR-en, HCVR-en og LCVR-en, hele tungkjeden, hele lettkjeden eller hele tungkjeden og hele lettkjeden er begrenset av en særlig sekvens som vist av et SEQ ID NO heri, er mer foretrukket videre karakterisert ved å ha en K D for humant sklerostin ved 25 C eller mindre enn ca. 10 pm, 8 pm, 6 pm eller 4 pm, mer foretrukket mindre enn ca. 2,2 pm, og er også karakterisert ved å ha en IC 50 i et assay for benspesifikk alkalisk fosfatase med humant sklerostin på ca. 50 nm eller mindre, ca. 40, 35 eller 30 nm eller mindre, mer foretrukket ca. 25 nm eller mindre, enda mer foretrukket ca. 20 nm (f.eks. 20,2 nm) eller mindre Et antistoff hvori alle seks CDR-er, HCVR-en, LCVR-en, HCVR-en og LCVR-en, hele tungkjeden, hele lettkjeden eller hele tungkjeden og hele lettkjeden er begrenset av en særlig sekvens som vist av et SEQ ID NO heri, er enda mer foretrukket videre karakterisert ved å ha en K D for human sklerostin ved 25 C eller mindre enn ca. 10 pm, 8 pm, 6 pm eller 4 pm, mer foretrukket mindre enn ca. 2,2 pm; er også karakterisert ved å ha en IC 50 i et assay for benspesifikk alkalisk fosfatase med humant sklerostin på ca. 50 nm eller mindre, ca. 40, 35 eller 30 nm eller mindre, mer foretrukket ca. 25 nm eller mindre, enda mer foretrukket ca. 20 nm (f.eks 20,2 nm) eller mindre; og er også karakterisert ved å ha en IC 50 i et assay for benspesifikk alkalisk fosfatase med sklerostin fra cynomolog ape på ca. 75 nm eller mindre. 35 Antistoffekspresjon

14 Den foreliggende oppfinnelsen vedrører også vertsceller som uttrykker et antistoff mot sklerostin ifølge oppfinnelsen. Dannelse og isolering av vertscellelinjer som produserer et antistoff ifølge oppfinnelsen, kan oppnås ved anvendelse av standardteknikker som er kjent i teknikken. En lang rekke vertsekspresjonssystemer som er kjent i teknikken, kan anvendes for å uttrykke et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen, inkludert prokaryotiske (bakterielle) og eukaryotiske ekspresjonssystemer (slik som gjær-, bakulovirus-, plante-, pattedyr- og andre dyreceller, transgene dyr og hybridomceller) i tillegg til fagvisningsekspresjonssystemer Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved hjelp av rekombinant ekspresjon av immunglobulinets lett- og tungkjede-gener i en vertscelle. For å uttrykke et antistoff rekombinant blir en vertscelle transformert, transdusert, infisert eller lignende med én eller flere rekombinante ekspresjonsvektorer som bærer DNA-fragment som koder for immunglobulinets lett- og/eller tungkjeder i antistoffet slik at lett- og/eller tungkjedene uttrykkes i vertscellen. Tung- og lettkjedene kan uttrykkes uavhengig av forskjellige promotere til hvilke de er operativt bundet i én vektor, eller tung- og lettkjedene kan alternativt uttrykkes uavhengig av forskjellige promotere til hvilke de er operativt bundet i to vektorer én som uttrykker tungkjeden, og én som uttrykker lettkjeden. Tung- og lettkjeden kan alternativt uttrykkes i forskjellige vertsceller Den rekombinante ekspresjonsvektoren kan i tillegg kode for et signalpeptid som letter utskilling av lett- og/eller tungkjeden i antistoffet mot sklerostin fra en vertscelle. Lett- og/eller tungkjede-genet i antistoffet mot sklerostin kan klones til vektoren slik at signalpeptidet blir operativt bundet i rammen til antistoffkjedegenets aminoterminal. Signalpeptidet kan være et immunglobulinsignalpeptid eller et heterologt signalpeptid. De rekombinante antistoffene utskilles foretrukket i mediet i hvilket vertscellene dyrkes, fra hvilket antistoffene kan gjenvinnes eller renses. 35 Et isolert DNA som koder for en HCVR-region, kan konverteres til et tungkjedegen av full lengde ved operativt å binde HCVR-en som koder for DNA-en, til et annet DNA-molekyl som koder for konstante regioner i tungkjeder. Sekvensene i humane gener og andre pattedyrgener i en tungkjedes konstante region er kjent i teknikken. DNA-fragment omfattende disse regionene kan for eksempel oppnås

15 14 5 ved alminnelig PCR-amplifikasjon. Den konstante regionen i tungkjeden kan være en konstant region av hvilken som helst type (f.eks. IgG, IgA, IgE, IgM eller IgD), klasse (f.eks. IgG 1, IgG 2, IgG 3 og IgG 4 ) eller underklasse og hvilken som helst allotypisk variant derav som beskrevet i Kabat (ovenfor). En foretrukket konstant region i en tungkjede omfatter polypeptidet med SEQ ID NO: En isolert DNA som koder for en LCVR-region, kan konverteres til et lettkjedegen av full lengde (i tillegg til et Fab-lettkjede-gen) ved operativt å binde LCVRen som koder for DNA-en, til et annet DNA-molekyl som koder for en konstant region i en lettkjede. Sekvensene i humane gener og andre pattedyrgener i lettkjedens konstante region er kjent i teknikken. DNA-fragment omfattende disse regionene kan oppnås ved alminnelig PCR-amplifikasjon. Den konstante regionen i lettkjeden kan være en konstant region av kappa- eller lambda-typen. Foretrukne vertsceller hos pattedyr for anvendelse i oppfinnelsen er CHO-celler (f.eks. ATCC CRL-9096), NS0-celler, SP2/0-celler og COS-celler (f.eks. ATCC, CRL-1650, CRL-1651), HeLa (ATCC CCL-2). Ytterligere vertsceller for anvendelse i oppfinnelsen inkluderer andre pattedyrceller, gjærceller og prokaryotiske celler. Når rekombinante ekspresjonsvektorer som koder for antistoffgener, introduseres inn i vertsceller hos pattedyr, produseres antistoffene ved dyrking av vertscellene i en tilstrekkelig periode til å gi mulighet for ekspresjon av antistoffet i vertscellene eller, mer foretrukket, utskilling av antistoffet i kulturmediet i hvilket vertscellene dyrkes. Antistoff kan gjenvinnes fra vertscellen og/eller kulturmediet ved anvendelse av standardfremgangsmåter for rensing Umiddelbart etter ekspresjon kan de intakte antistoffene, individuelle lett- og tungkjedene eller andre immunglobulinformer ifølge den foreliggende oppfinnelsen renses ifølge standardprosedyrer i teknikken, inkludert ammoniumsulfatutfelling, ionebyttekromatografi, affinitetskromatografi, kromatografi med omvendt fase, kromatografi med hydrofob interaksjon, gelelektroforese og lignende. I det vesentlige rene immunglobuliner med minst ca. 90 %, 92 %, 94 % eller 96 % ensartethet er foretrukket, og 98 til 99 % eller mer ensartethet er mest foretrukket, for farmasøytiske anvendelser. Etter at de sterile antistoffene er renset, delvis eller til ensartethet, kan de anvendes terapeutisk som beskrevet heri.

16 15 Humaniserte antistoffer Foretrukket har et antistoff ifølge oppfinnelsen som skal anvendes til terapeutiske formål, struktursekvensen og den konstante regionen (i den grad de finnes i antistoffet) avledet fra et pattedyr i hvilket det ville bli anvendt som terapeutisk middel for å redusere muligheten for at pattedyret skulle frembringe en immunrespons mot det terapeutiske antistoffet. Humaniserte antistoffer er av særlig interesse siden de er verdifulle for terapeutiske anvendelser og reduserer sannsynligheten for en human anti-murin antistoffrespons ofte observert ved antistoffer av murin opprinnelse eller antistoffer omfattende porsjoner som er av murin opprinnelse når de administreres til et menneske. Foretrukket kan injiserte humaniserte antistoffer ha en halveringstid som ligner mer på den for naturlig forekommende humane antistoffer enn for eksempel murine antistoffer, hvilket derved gir mulighet for at det administreres mindre og mindre hyppige doser til et individ Betegnelsen "humanisert antistoff" betyr som anvendt heri et antistoff hvori minst én porsjon er av human opprinnelse. Det humaniserte antistoffet kan for eksempel omfatte porsjoner avledet fra et antistoff av ikke-human opprinnelse, slik som en mus, og porsjoner avledet fra et antistoff av human opprinnelse, sammenføyd for eksempel kjemisk ved hjelp av konvensjonelle teknikker (f.eks. syntetiske) eller fremstilt som et tilstøtende polypeptid ved hjelp av genetiske konstruksjonsteknikker. Et "humanisert antistoff" har foretrukket CDR-er som stammer fra eller er avledet fra et morantistoff, dvs.et ikke-humant antistoff (foretrukket et murint monoklonalt antistoff, mens strukturregion og konstant region, i den grad de er til stede, (eller en vesentlig eller betydelig porsjon derav, dvs. minst ca. 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 %) er kodet av nukleinsyresekvensinformasjon som forekommer i immunglobulinregionen fra human kjønnscelle (se for eksempel International ImMunoGeneTics Database) eller i rekombinante eller muterte former derav, enten antistoffene er produsert i en human celle eller ikke. Minst to, tre, fire, fem eller seks CDR-er i et humanisert antistoff er foretrukket optimalisert fra CDR-en i et ikke-humant morantistoff fra hvilket det humaniserte antistoffet ble avledet, for å generere en ønsket egenskap, f.eks. forbedret spesifisitet, affinitet eller nøytralisering, som

17 kan identifiseres ved hjelp av et screeningassay, f.eks. et ELISA-assay. En optimalisert CDR i et antistoff ifølge oppfinnelsen omfatter foretrukket minst én aminosyresubstitusjon sammenlignet med det som er til stede i morantistoffet. Visse aminosyresubstitusjoner i CDR-ene i de humaniserte antistoffene 88 og 89 ifølge oppfinnelsen sammenlignet med dem i morantistoffene 788 og 789 (se eksempel 5 og 6 heri) reduserer sannsynligheten for ustabilitet i antistoffet (f.eks. fjerning av CDR Asn-rester) eller reduserer sannsynligheten for antistoffets immungenisitet når det administreres til et menneske (f.eks. som predikert med IMMUNOFILTER -teknologi). Humaniserte antistoffer inneholder foretrukket minimal sekvens avledet fra et ikke-humant antistoff. Humaniserte antistoffer kan videre omfatte rester som verken finnes i mottagerantistoffet eller i CDR-en eller struktursekvensene importert fra morantistoffet. Humaniserte antistoffer kan utsettes for mutagenese in vitro ved anvendelse av rutinemessig anvendte fremgangsmåter i teknikken, og strukturregionaminosyresekvensene i de humaniserte rekombinante antistoffenes HCVR- og LCVR-regioner er således sekvenser som, selv om de er avledet av dem relatert til HCVR- og LCVR-sekvenser fra human kjønnscelle, ikke nødvendigvis forekommer naturlig i det humane antistoffets kjønnscellerepertoar in vivo. Det er betraktet at slike aminosyresekvenser i de humaniserte rekombinante antistoffenes HCVR- og LCVR-strukturerregioner er minst ca. 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 98 % eller mer foretrukket minst 99 % eller mest foretrukket 100 % identiske med en human kjønnscellesekvens I foretrukne utførelsesformer omfatter et humanisert antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen lettkjede-struktursekvenser fra human kjønnscelle (se for eksempel PCT WO 2005/005604) og tungkjede-struktursekvenser fra human kjønnscelle (se for eksempel PCT WO 2005/005604). Foretrukne lettkjedestrukturregioner fra human kjønnscelle er fra et humant kappa-lettkjede-gen valgt fra gruppen bestående av: A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, L1, L11, L12, L2, L5, L6, L8, O12, O2 og 08. Foretrukne tungkjede-strukturregioner fra human kjønnscelle er fra en human tungkjede valgt fra gruppen bestående av: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VH1-24, VH1-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, VH5-51 (se PCT-publikasjonsnr. WO2006/046935).

18 Flere fremgangsmåter er tilgjengelige i teknikken for å generere humaniserte antistoffer. Humaniserte antistoffer kan for eksempel fremstilles ved oppnåelse av nukleinsyresekvenser som koder for HCVR-en og LCVR-en i et morantistoff (f.eks. et murint antistoff eller antistoff fremstilt av et hybridom) som selektivt binder sklerostin, identifiserer CDR-ene i HCVR-en og LCVR-en (ikke-human) og poder slike CDR-kodende nukleinsyresekvenser på utvalgte humane strukturkodende nukleinsyresekvenser. En CDR-region kan eventuelt optimaliseres ved tilfeldig mutagenisering eller på særlige steder for å substituere én eller flere aminosyrer i CDR-en med en annen aminosyre før poding av CDR-regionen inn i strukturregionen. En CDR-region kan alternativt optimaliseres etter insersjon i den humane strukturregionen ved anvendelse av fremgangsmåter som er tilgjengelige for fagmannen Etter at de CDR-kodende sekvensene er podet på de utvalgte humane strukturkodende sekvensene, blir de resulterende DNA-sekvensene som koder for de humaniserte variable tunge og variable lette sekvensene, deretter uttrykt for å fremstille et humanisert antistoff som binder sklerostin. Den humaniserte HCVR-en og LCVR-en kan uttrykkes som del av et helt antistoffmolekyl mot sklerostin, dvs. som et fusjonsprotein med sekvenser i det humane konstante domenet. HCVR- og LCVR-sekvensene kan imidlertid også uttrykkes i fravær av konstante sekvenser for å produsere et humanisert Fv mot sklerostin. 25 Henvisninger som videre beskriver fremgangsmåter involvert i humanisering av et murint antistoff som kan anvendes, inkluderer for eksempel Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991 og fremgangsmåten i Winter et al. [Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534 (1988)]. Diagnostiske anvendelser Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å diagnostisere en lidelse eller sykdom assosiert med ekspresjonen av humant sklerostin. Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan likeledes anvendes i et assay for å overvåke sklerostinnivåer hos et individ som behandles for en sklerostinassosiert tilstand. Slike anvendelser inkluderer fremgangsmåter som benytter et antistoff ifølge oppfinnelsen og en etikett for å detektere sklerostin i en biologisk prøve, f.eks. i en human kroppsvæske eller i en celle- eller vevsekstrakt (se for eksempel

19 18 eksempel 1 heri). Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan anvendes med eller uten modifikasjon og kan merkes ved kovalent eller ikke-kovalent binding av en detekterbar enhet En rekke konvensjonelle protokoller for måling av sklerostinnivåer i en biologisk prøve, inkludert for eksempel ELISA-er, RIA-er og FACS, er kjent i teknikken og gir grunnlag for diagnostisering av endrede eller abnormale nivåer av sklerostinekspresjon. Normale eller standard sklerostinnivåer som er til stede i en prøve, fastslås ved anvendelse av hvilken som helst kjent teknikk, f.eks. ved kombinasjon av en prøve omfattende et sklerostin-polypeptid med for eksempel et antistoff ifølge oppfinnelsen under betingelser egnet til å danne et antigenantistoff-kompleks. Antistoffet merkes direkte eller indirekte med et detekterbart stoff for å lette detektering av det bundne eller ubundne antistoffet. Egnede detekterbare stoffer inkluderer forskjellige enzymer, prostetiske grupper, fluorescerende materialer, luminescerende materialer og radioaktive materialer. Mengden av et dannet standardkompleks kvantiteres ved forskjellige fremgangsmåter, slik som for eksempel fotometriske middel. Mengder av sklerostin-polypeptid som er til stede i prøver, sammenlignes deretter med standardverdiene. Terapeutiske anvendelser 25 Sklerostin fungerer som en negativ regulator av bendannelse. (Se for eksempel Cytokine & Growth Factor Reviews, 16: , 2005). Hos voksne detekteres sklerostin-mrna primært i osteocyttter, selv om patentsøkerne har funnet lavere konsentrasjoner i brusk En farmasøytisk sammensetning omfattende et monoklonalt antistoff mot sklerostin ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å øke minst én av benmasse, benmineraldensitet, benmineralinnhold eller benstyrke i enten virvel- eller ikkevirvelben, eller begge deler, når en virkningsfull mengde administreres til et menneske med behov for det. En farmasøytisk sammensetning omfattende et monoklonalt antistoff mot sklerostin ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å redusere insidensen av fraktur av virvel- og/eller ikke-virvelben, når en virkningsfull mengde administreres til et menneske med behov for det. Reduksjon av insidensen av fraktur inkluderer reduksjon av sannsynligheten eller

20 19 den faktiske insidensen av fraktur for et menneske sammenlignet med en ubehandlet kontrollpopulasjon Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan videre være nyttig for behandling av tilstander, sykdommer eller lidelser hvori forekomsten av sklerostin forårsaker eller bidrar til uønskede patologiske effekter eller en reduksjon i sklerostinnivåer, eller sklerostinbioaktivitet har en terapeutisk fordel hos mennesker. Slike tilstander, sykdommer eller lidelser inkluderer, men er ikke begrenset til, osteoporose, osteopeni, artrose, smerte assosiert med artrose, periodontalsykdom eller multippelt myelom. Individene kan være mannlige eller kvinnelige. Et menneske har foretrukket risiko for fraktur av virvel- og/eller ikkevirvelben, mer foretrukket har et menneske risiko for, eller lider av, osteoporose. Mennesket er foretrukket en kvinne og mer foretrukket en kvinne som har risiko for, eller som har, postmenopausal osteoporose. Det er betraktet at et individ kan ha fordel av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen i hvilket som helst stadium av osteoporose. 20 Anvendelsen av et antistoff ifølge oppfinnelsen for anvendelse i produksjonen av et medikament for behandling av minst én av ovennevnte lidelser er i tillegg betraktet Betegnelsene "behandling" og "behandle" skal bety alle prosesser hvori det kan være en bremsing, avbrytelse, stans, kontroll eller stopp av progresjonen av lidelsene beskrevet heri, men indikerer ikke nødvendigvis en total eliminering av alle lidelsens symptomer. "Behandling" inkluderer som anvendt heri administrering av en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen for behandling av en sykdom eller tilstand hos et pattedyr, særlig hos et menneske, og inkluderer: a) inhibering av videre progresjon av sykdommen, dvs. stoppe dens utvikling, og b) lindring av sykdommen, dvs. forårsake regresjon av sykdommen eller lidelsen eller lindre symptomer eller komplikasjoner derav. Doseringsregimer kan justeres for å tilveiebringe optimal ønsket respons (f.eks. en terapeutisk respons). En enkelt bolus kan for eksempel administreres, flere delte doser kan administreres over tid, eller dosen kan reduseres eller økes proporsjonalt som indikert av den terapeutiske situasjonen. Farmasøytisk sammensetning

21 Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan inkorporeres i sin helhet i en farmasøytisk sammensetning som er egnet til administrering til et menneske. Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan administreres til et menneske alene eller i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller fortynner i enkelt- eller multidoser. Slike farmasøytiske sammensetninger er konstruert for å være egnet for den valgte administreringsmåten, og farmasøytisk akseptable fortynnere, bærere og/eller eksipienter, slik som dispergeringsmiddel, buffere, surfaktanter, konserveringsmiddel, løselighetsformidlere, isotonisitetsmiddel, stabiliseringsmiddel og lignende anvendes etter behov. Sammensetningene kan konstrueres i henhold til konvensjonelle teknikker beskrevet i for eksempel Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19. utgave, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995 som tilveiebringer et kompendium med formuleringsteknikker som er generelt kjent for fagmannen. Egnede bærere for farmasøytiske sammensetninger inkluderer hvilket som helst materiale som, når det kombineres med et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen, beholder molekylets aktivitet og er ikke-reaktivt med individets immunsystem. 20 En farmasøytisk sammensetning omfattende et monoklonalt antistoff mot sklerostin ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan administreres til et individ som har risiko for eller viser patologier som beskrevet heri, f.eks. osteoporose, artritt eller andre bendegenerative lidelser, ved anvendelse av standard administreringsteknikker En farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen inneholder foretrukket en "virkningsfull mengde" av et antistoff ifølge oppfinnelsen. En virkningsfull mengde betyr en nødvendig mengde (ved doseringer og for tidsperioder og for administreringsmåter) for å oppnå det ønskede terapeutiske resultatet. En virkningsfull mengde av antistoffet kan variere avhengig av faktorer slik som sykdomsstadiet, personens alder, kjønn og vekt og antistoffets eller antistoffporsjonens evne til å fremkalle en ønsket respons hos individet. En virkningsfull mengde er også en i hvilken en toksisk eller skadelig effekt av antistoffet oppveies av de terapeutisk gunstige effektene. 35 En virkningsfull mengde er minst den minste mengden, men mindre enn en toksisk mengde, av et aktivt middel som er nødvendig for å overføre terapeutisk fordel til et individ. En virkningsfull mengde eller terapeutisk virkningsfull mengde av et antistoff ifølge oppfinnelsen er med andre ord en mengde som hos

22 21 5 pattedyr, foretrukket mennesker, (i) øker minst én av benmasse, benmineraldensitet, benmineralinnhold eller benstyrke, eller (ii) behandler en tilstand, lidelse eller sykdom hvori nærværet av sklerostin forårsaker eller bidrar til en uønsket patologisk effekt, eller (iii) reduserer sklerostinnivåer eller sklerostinbioaktivitet som resulterer i en gunstig terapeutisk effekt hos et pattedyr, foretrukket et menneske, inkludert, men ikke begrenset til, osteoporose, osteopeni, artrose, revmatoid artritt, periodontal sykdom eller multippelt myelom Som velkjent i legevitenskapen avhenger doseringene for et hvilket som helst individ av mange faktorer, inkludert pasientens størrelse, kroppsareal, alder, den særlige forbindelsen som skal administreres, kjønn, administreringstid og -vei, allmennhelse og andre legemiddel som administreres parallelt. Dosen kan videre variere avhengig av sykdommens type og alvorlighetsgrad. En typisk dose kan for eksempel være i området fra 0,001 til 1000 µg, foretrukket 1 til 100 µg; doser under eller over dette eksempelområdet er imidlertid mulig, særlig med tanke på de ovennevnte faktorene. Et daglig parenteralt doseringsregime kan være fra ca. 0,1 µg/kg til ca. 20 mg/kg av total kroppsvekt, foretrukket fra ca. 0,3 µg/kg til ca. 10 mg/kg. Progresjon kan overvåkes ved periodisk vurdering, og dosen kan justeres deretter. 25 Disse foreslåtte mengdene av antistoff er gjenstand for utstrakt terapeutisk skjønn. Nøkkelfaktoren ved valg av en egnet dose og planlegging er det oppnådde resultatet. Faktorer i denne sammenhengen inkluderer den særlige lidelsen som blir behandlet, den enkelte pasientens kliniske tilstand, årsaken til lidelsen, antistoffets administreringssted, den bestemte typen antistoff, administreringsmåten, planleggingen av administreringen og andre faktorer som er kjent for fagmannen Administreringsveien for et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være oral, parenteral, inhalativ eller lokal. Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan foretrukket inkorporeres i en farmasøytisk sammensetning som er egnet til parenteral administrering. Betegnelsen parenteral inkluderer som anvendt heri intravenøs, intramuskulær, subkutan, rektal, vaginal eller intraperitoneal administrering. Parenteral administrering ved intravenøs eller intraperitoneal eller subkutan injeksjon er foretrukket. Subkutan injeksjon er mest foretrukket. Egnede vehikler for slike injeksjoner er velkjent i teknikken.