3. Væskekromatografi, LC (med HP-LC)

Transkript

1 1 KJ2053 Kromatografi (Analytiske metoder II) Lundanes Else, Reubsaet Léon, Greibrokk Tyge, Chromatography, Basic Principles, Sample Preparations and..., Wiley-VCH, ISBN: A. Innledning B. Instrumentelle aspekter 1. Elueringsmiddel / Den mobile fasen, MF C. LC-Separasjonsmekanismer 1

2 2 HPLC-systemets oppbygging 1. Elueringsmiddel 2. Pumpe(r) 3. Injektor 4. Filter ("In-line"-filter) 5. Beskyttelseskolonne ("Guard column") 6. Temperaturkontroll ( kolonneovn") 7. Kolonne 8. Detektor 9. evt. Fraksjonsoppsamler 10. Signal/data-lagring, -behandling (PC, integrator, skriver) Elueringsmiddel 2

3 3 HPLC-systemets oppbygging Gjennomgang litt som for GC: I kap. 3.B Instrumentelle aspekter, tas utgangspunkt i det praktiske HPLC-apparatet: Vi følger material- og signal-strømmen. Punkt 1.-6., 7. (teknisk del av kolonna) og 8. Diskusjon av hovedtyper pakningsmaterialer og tilhørende separasjonsmekanismer diskuteres i eget Kapittel: 3.C (som er relatert til kap i Lundanes-læreboken) 3.B. 1. Elueringsmiddel / Den mobile fasen, MF 3.B.1. a. Elueringsmiddel Egenskaper og kvalitet 3.B.1. b. Elueringsmiddel Egenskaper som MF 3.B.1. c. Elueringsmiddel Eluerings-varianter 1. Elueringsmiddel 2. Pumpe(r) 3. Injektor 4. Filter ("In-line".filter) 5. Beskyttelseskolonne ("Guard column") 6. Temperaturkontroll ( kolonneovn") 7. Kolonne 8. Detektor 9. evt. Fraksjonsoppsamler 10. Signal/data-lagring, -behandling (PC, integrator, skriver) 3

4 4 3.B. 1. Elueringsmiddel / Den mobile fasen, MF Utvalg - avhengig av separasjonsproblemet som bestemmer valg av separasjonsprinsippet: av type prøve & kolonne/sf i bruk som vanlig: helst med k 2 5 4

5 5 3.B. 1. Elueringsmiddel / Den mobile fasen, MF 3.B.1. a. Elueringsmiddel Egenskaper og kvalitet: Viktig med god kvalitet av MF : høy renhet (særlig for sporanalyse & prep. HPLC) : destillert, filtrert (partikkelfri!!), tørt, (se også HPLC-systemdeler 4 og 5) 5

6 6 3.B.1. a. Elueringsmiddel Egenskaper og kvalitet Viktig med god kvalitet av MF : minst mulig viskøs apropos lav giftighet, miljøfare (HMS) passe kokepunkt (spes. v. prep. HPLC) akseptabel pris med en viss fordel termostatert (hvis behov) oksygen- / luft-fritt (avgassing kan være nødvendig) apropos 6

7 7 3.B.1. a. Elueringsmiddel Egenskaper og kvalitet Viktig med god kvalitet av MF : minst mulig viskøs - hvis man har valget - ved ellers tilsvarende / tilfredsstillende egenskaper, (f.eks.: sykloheksan er 4 x mer viskøs enn pentan, ved ~ samme elueringsstyrke ε ). N.B.: Viskositet er ikke en lineær funksjon av løsningsmiddelsammensetning. F.eks.: metanol og vann er betydelig mer viskøs (gir høyere mottrykk) i blanding enn både ren metanol og rent vann (og tilsv. gjelder for acetonitril-vann med ca. 0-30% acetonitril-innhold. lav giftighet, miljøfare (HMS) passe kokepunkt (spes. v. prep. HPLC) akseptabel pris med en viss fordel termostatert (hvis behov) oksygen- / luft-fritt (avgassing kan være nødvendig) apropos 7

8 8 3.B.1. a. Elueringsmiddel Egenskaper og kvalitet Viktig med god kvalitet av MF : oksygen- / luft-fritt (avgassing kan være nødvendig) Behov for avgassing - fordi Luft kan kraftig forstyrre deteksjon (endre respons i fluorescensdetektor og elektrokjemisk detektor). Luft kan danne bobler i systemet som forstyrrer på flere steder: - I detektoren: STORE basislinje-hopp: kan ødelegge kromatogrammet/ analysen, integreringen, retensjonstidene. - I kolonna: Boblene kan dannes inne i pakningen, når mottrykket synker langs kolonna: kan skape luftlommer, luftkanaler, øke Eddy-diffusjon forstyrre massetransport-prosesser (og går videre til detektoren ). - I pumpen: gir redusert, sterkt pulserende væskestrøm: pumpen vil først komprimere luftboblen før den kan pumpe væsken. Det blir sterk pulsering. (komprimerer luft de-komprimerer luft komprimerer luft de-komprimerer..., etc.), (Mottiltak i pumpen: forbigående pumpe med høy flow, uten mottrykk ( purging, gjennomskylling ). 8

9 9 3.B.1. a. Elueringsmiddel Egenskaper og kvalitet Viktig med god kvalitet av MF : oksygen- / luft-fritt (avgassing kan være nødvendig) Problemet: Luftbobler - ekstra stort problem ved løsningsmiddelblanding / gradient-eluering : Fordi metnings-konsentrasjon for luft av løsningsmiddel-blandinger er forskjellig fra de av de rene løsningsmidlene de er blandet ut fra. Når luft-mettede rene løsningsmidler blandes til ønsket MF, så endrer luftløseligheten seg (vanligvis reduseres den) løselighetsgrensen overskrides. Det blir luft til overs, som danner boblene. 9

10 10 3.B.1. a. Elueringsmiddel Egenskaper og kvalitet Viktig med god kvalitet av MF : oksygen- / luft-fritt (avgassing kan være nødvendig) Problemet: Luftbobler - ekstra stort problem ved løsningsmiddelblanding / gradient-eluering : Det blir luft til overs, som danner boblene. Mottiltak: fjerne (redusere mengde) luft - først som sist i alle løsningsmidlene før blanding: (mest populær i dag: membran-avgassere: se figur ) Avgassingsmetoder (i oversiktsbildet : 1.a.) : vakuum-behandling, satsvis, eller ultralyd-behandling (satsvis), eller vakuum-behandling, kontinuerlig (i semi-permeable membran-rør/vakuum), eller Helium-gjennombobling, kontinuerlig 10

11 11 3.B.1. b. Elueringsmiddel Egenskaper som MF I dette avsnitt diskuteres mobilfase-væskers innflytelse på retensjon og separasjon: Diskusjonen er her mest orientert mot adsorpsjons-kromatografi (husk TLC-lab.-forsøket). Repetisjon : ABSORPSJON ADSORPSJON Mest sentral egenskap av MF / elueringsmiddelets : -- evnen til å forflytte prøvekomponentene (eluere dem). Denne evnen -- er avhengig av elueringsmiddelets "styrke som MF : ved LSC: konkurranse mellom prøve- og elueringsmiddel-molekyler om adgang til adsorpsjons-setene på adsorpsjonsmiddelet. 11

12 12 3.B.1. b. Elueringsmiddel Egenskaper som MF (i) Eluerings-styrken til den mobile fasen (Eng.: Solvent Strength, Eluent Strength) Jo større affinitet elueringsmiddelet selv har til adsorpsjonssetene, desto mindre anledning til adsorpsjon / retardering får prøvemolekyler, desto mindre retensjon / raskere forflytning / eluering av prøven. Løsningsmidlene kan rangeres m.h.t. evnen til å forflytte / eluere prøven kvalitativ 'rangliste' over "eluerings-evne" / eluerings-styrke: = eluotropisk serie. For polare adsorpsjonsmidler (silikagel, o.l.) : 12

13 13 3.B.1. b. Elueringsmiddel Egenskaper som MF (i) Eluerings-styrken til den mobile fasen (Eng.: Solvent Strength, Eluent Strength) kvalitativ rangliste over "eluerings-evne" / eluerings-styrke: = eluotropisk serie. For polare adsorpsjonsmidler (silikagel, o.l.) : Alkaner /\ svakt løsningsmiddel CCl 4 (!), CS 2 / \ (eluerer langsomt) bensen(!), toluen / \ CHCl 3 (!), CH 2 Cl 2 // \\ Et-O-Et, Me-O-t-Bu // \\ Ac-O-Et, aceton // \\ pyridin, acetonotril /// \\\ EtOH /// \\\ Me-OH /// \\\ AcOH /// \\\ sterkt løsningsmiddel vann //// \\\\ (eluerer raskt) På upolare SF (omvendt fase) er rekkefølgen omtrent omvendt. 13

14 14 3.B.1. b. Elueringsmiddel Egenskaper som MF (i) Eluerings-styrken til den mobile fasen (Eng.: Solvent Strength, Eluent Strength) Adsorpsjon - kvantitativ beskrivelse for LSC (NP) (Lloyd R. Snyder) log K ads,x = log V (ads MF) + (S x - A x ε ) K ads,x = adsorpsjonskoeffisient = c ads /c MF for analytten X (den aktuelle adsorberte prøve-komponenten X) V a = "adsorpsjons-overflatevolum" = "volume of one monolayer adsorbed solvent " V a er proporsjonal m. adsorpsjonsmiddelets overflateareal. α = adsorpsjonsmiddel-aktivitets-parameter,...measures the ability of a unit of adsorbent surface to bind adsorbed molecules." (Snyder & al.). (Er proporsjonal med "avarage surface energy") Denne α må ikke forveksles med separasjonsfaktoren α! Det er ingen sammenheng mellom de to brukere av samme symbol α! S x = Adsorpsjonsenergi (pr. overflateareal-enhet) av "analytten" X for standard SF (med α = 1) og standard MF (med ε =0, d.v.s. n-pentan). A x = Analytten X's molekyl-areal (dimensjonsløs), målt i forhold til MF-molekylenes molekylareal ε = Adsorpsjonsenergi (pr. overflateareal-enhet) av den aktuelle mobilfasen for (den samme) standard SF (α = 1) og standard MF (med ε =0, d.v.s. n-pentan). = Løsningsmiddel-styrke, elueringsmiddel-styrke ( eng.: solvent strength parameter eller eluent strength) (ε er noe avhengig av type adsorpsjonsmiddelet!) 14

15 15 (i) 3.B.1. b. Elueringsmiddel egenskaper som MF Eluerings-styrken til den mobile fasen (Eng.: Solvent Strength, Eluent Strength) Polaritet av elueringsmidler - kvantitative mål : ) log K ads,x = log V a(mf) + (S x - A x ε ) P -verdier fra : J.M. Miller, Chromatography, C.& C. 1988, s (blant flere) av de mest anvendte parametere som er brukt innen kromatografi: > Snyders Solvent Polarity Index, P', (f.eks. P' = 0,1 for n-heksan, P' = 10,2 for vann), bl.a. brukt i automatisert metode-optimering for HPLC, som "solvent strength weighing factor" S i : i normal-fase kro. S i = P' 15

16 16 (i) 3.B.1. b. Elueringsmiddel egenskaper som MF Eluerings-styrken til den mobile fasen (Eng.: Solvent Strength, Eluent Strength) Polaritet av elueringsmidler - kvantitative mål : ) log K ads,x = log V a(mf) + (S x - A x ε ) 2 (blant flere) av de mest anvendte parametere som er brukt innen kromatografi: > Elueringsmiddelstyrke (= løsningsmiddelstyrke). (eng.: solvent strength parameter), brukt i Snyders likning ovenfor. "Free energy of adsorption of the solvent pr. unit of adsorbent surface area" stor stor evne til å forflytte prøven (eluere prøven). stor stor evne til å (ut-)konkurrere (med) prøvemolekyler ved adsorpsjonssetene. = 0 for n-pentan, (pr. definisjon) : -verdiene for (de øvrige) løsningsmidlene kan variere litt fra adsorpsjonsmiddel til adsorpsjonsmiddel. 16

17 17 (i) 3.B.1. b. Elueringsmiddel egenskaper som MF Eluerings-styrken til den mobile fasen (Eng.: Solvent Strength, Eluent Strength) > Elueringsmiddelstyrke (= løsningsmiddelstyrke). log K ads,x = log V a(mf) + (S x - A x ε ) Tallverdier (for silikagel): Lundanes & al. Chromatography" 2014 (Table 3.2 s. 66), For tallverdier (for aluminiumoksid): se T.Greibrokk & al. "Kromatografi" 1994 (Tabell 2.2. s.35 i 3. utg), For øvrig : (silika) 0,77 x (aloks) 17

18 18 (i) 3.B.1. b. Elueringsmiddel egenskaper som MF Eluerings-styrken til den mobile fasen (Eng.: Solvent Strength, Eluent Strength) > Elueringsmiddelstyrke (= løsningsmiddelstyrke). log K ads,x = log V a(mf) + (S x - A x ε ) Svært ofte brukt i LSC er blandinger av løsningsmidler. Beregning av for binære blandinger er mulig; f.eks. for binære løsningsmidler: A og B : : x B : n B : adsorbent-aktivitets-funksjon Mol-andel av B i MF "molekylareal" for B Rel. tungvindt å regne ut! (eksakt formel ikke pensum) Derfor finnes -verdier for mange av de viktigste / mest typiske blandingene: 18

19 19 3.B.1. b. Elueringsmiddel egenskaper som MF (i) Eluerings-styrken til den mobile fasen > Elueringsmiddelstyrke (= løsningsmiddelstyrke). -verdier for mange viktige/mest typiske blandinger finnes grafisk presentert: i tabeller: log K ads,x = log V a(mf) + (S x - A x ε ) T. Greibrokk & al. "Kromatografi" 1994, Tabell 2.3. s. 36 J.M. Miller, "Chromatography, Concepts & Contrasts", Wiley,

20 20 3.B.1. b. Elueringsmiddel egenskaper som MF (i) Eluerings-styrken til den mobile fasen > Elueringsmiddelstyrke (= løsningsmiddelstyrke). -verdier for mange av de viktigste/mest typiske blandingene: Legg merke til ikke-lineær sammenheng! Mye større effekt av de første små mengder tilsatt sterkt elueringsmiddel, enn videre økt tilsetting av mer av sterk elueringsmiddel ved høyere konsentrasjoner. Jfr. erfaringene i TLC-forsøket fra optimering av elueringsmiddel-blandingene. Fra J.M. Miller, "Chromatography, Concepts & Contrasts", Wiley,

21 21 3.B.1. b. Elueringsmiddel egenskaper som MF (i) Eluerings-styrken til den mobile fasen Løsningsmiddel-styrke, elueringsmiddel-styrke ε (solvent strength parameter eller eluent strength) uttrykker interaksjons-evnen av løsningsmiddelet med en (vanligvis) polare strukturer på en SF-overflate. De samme evner/krefter blir også aktiv ved interaksjoner med oppløste stoffer: ved solvatisering. Dermed sier ε også noe om løsningsmiddelets evne til å solvatisere polare stoffer - og om MF elueringsstyrken i (vanlig) fordelingskromatografi : Jo større ε desto større løselighet / affinitet for polare analytter: både om det aktuelle løsningsmiddelet er SF i normalfase LLC eller MF i omvendt fase LLC 21

22 22 3.B.1. b. Elueringsmiddel egenskaper som MF (ii) Elueringsmiddel-selektivitet - optimering av separasjonen / separasjonsfaktoren α Mobile faser med lik ε, men forskjellig sammensetning: kan gi ulik retensjon for spesifikke prøvekomponenter - Årsak: Spesielle / selektive vekselvirkninger mellom ett løsningsmiddel og én analytt i prøven. Kan benyttes for å få forbedring/optimering av separasjonen mellom dårlig separerte analytter (ved svak selektivitet): En forandrer selektivt retensjonen for (minst) én av de problematiske analyttene, for å oppnå bedre separasjon. (Husk: én-verdis polaritets-parametre, som ε, gir forventet retensjon av "gjennomsnitts-analytten"). Ulik selektivitet av MF'er med ulik sammensetning kan skyldes : ulike proton-donor-/proton-akseptor-egenskaper ulik evne til dipol-stabilisering evt. ulik molekylstørrelse 22

23 23 3.B.1. b. Elueringsmiddel - egenskaper som MF (ii) Elueringsmiddel-selektivitet - optimering av separasjonen / separasjonsfaktoren α Eksempel: (TLC) Stasjonær fase : Silikagel p-nitroanilin vanillin mobil fase : RF (flekk no.) DCM eter/dcm Dietyleter p-nitroanilin 0,23 (1) 0,45 (1) 0,5 (3) vanillin 0,1 (2) 0,35 (3) 0,56 (2) p-hbset-e 0,05 (3) 0,37 (2) 0,7 (1) (silikagel) (Al ) 0,32 0,42 0,35 0,45 0,29 0,38 p-hbset-e 23

24 24 3.B.1. b. Elueringsmiddel egenskaper som MF (ii) Elueringsmiddel-selektivitet - optimering av separasjonen / separasjonsfaktoren α Optimering av selektivitet / separasjonsfaktoren (α) : 1. Finn en mobil fase som gir "sånn passe" retensjon (passe k, R F ) for de interessante analyttene, uansett separasjon av enkeltkomponenter. 2. Hvis separasjonsfaktoren(e) er for dårlig(e): optimer selektiviteten. "prøving og feiling". men gjerne LITT systematisk ved optimeringen : velg løsningsmiddel bevisst m.h.t. nevnte selektivitets-kontrollerende faktorer (H-donor-, H-akseptor-, dipolare krefter) i tankene - spesielt når analyttenes strukturer er kjente. Systematisering (t.o.m. automatisering) av "prøving og feiling" / optimeringen kan gjøres (jfr. KJ3058). 24

25 25 3.B.1. b. Elueringsmiddel egenskaper som MF (ii) Elueringsmiddel-selektivitet - optimering av separasjonen / separasjonsfaktoren α Optimering av selektivitet / separasjonsfaktoren (a) : 1. Finn en mobil fase som gir "sånn passe" retensjon (passe k, R F ) for de interessante analyttene, uansett separasjon av enkeltkomponenter. 2. Hvis separasjonsfaktoren(e) er for dårlig(e): optimer selektiviteten. "prøving og feiling". men gjerne LITT systematisk ved optimeringen : velg løsningsmiddel bevisst m.h.t. ovennevnte selektivitets-kontrollerende faktorer (H-donor-, H-akseptor-, dipolare krefter) i tankene - spesielt når analyttenes strukturer er kjente. Systematisering (t.o.m. automatisering) av "prøving og feiling" / optimeringen (jfr. KJ3058). Ved passe k men dårlig α : Velg ny MF med omtrent lik ε, men med en annen sammensetning, spesielt med andre "kjemiske egenskaper" - andre solvatiserings-egenskaper. F.eks.: komponentene skiller seg mest bytt fra H-donor til H-akseptor (el. omvendt) hvis de aktuelle m.h.t. H-donor-/H-akseptor-egenskaper, eller bytt til et proton-nøytralt dipolart løsningsmiddel. Må det byttes til et sterkere elueringsmiddel, for selektivitetens skyld: Kompenser, ved å blande inn et veldig svakt løsningsmiddel til omtrent lik samlet elueringsstyrke, ved NP-LSC: bland i heksan, petrol-eter o.l., ved RP-LSC: bland i vann. 25

26 26 3.B.1. b. Elueringsmiddel egenskaper som MF (ii) Elueringsmiddel-selektivitet - optimering av separasjonen / separasjonsfaktoren α Systematisert optimering av selektivitet: f.eks., v.h.a. Snyder selektivitets-trekant: (kvalitativt) utviklet for systematisk (evt. automatiserbar) selektivitetsoptimering: Bruker 4 løsningsmidler: 3 selektivites-kontrollerende lsm., pluss en (meget) svak "fortynner". Løsningsmidler kartlagt kvantitativt m.h.t deres selektivitetsegenskaper: Egenskap Kvantit. parameter proton-donor x d el. α proton-akseptor x e el. β evne til dipol-stabilisering. x n el. π Løsningsmiddel-selektiviteter kan systematiseres etter deres selektivitetsegenskaper i 3-kantsdiagrammer (selektivitets-trekant, basert på Snyders x d, x e, x n ) 26

27 27 3.B.1. c. Elueringsmiddel Eluerings-varianter (i) Flow-programmering (el. trykk-gradient): (MF-hastighet forandres økes, som regel; trinnvis eller kontinuerlig (stort sett for å spare tid). (ii) Isokratisk eluering : normal eluering (tilsv. isotermisk GC) (gammelgresk: isokratia = lik styrke, lik kraft) samme elueringsmiddel-sammensetning hele tiden gjerne også samme MF-hastighet gjerne også samme MF-trykk og temperatur > toppbredden øker ca. prop. med t R > t R øker eksponensielt for forbindelser i homologe serier. N.B.: blandings-nøyaktighet kritisk (for riktig og reproduserbare k el. t R, V R ) GC-analogi: trykk-programmert isotermisk temperatur-programmert 27

28 28 3.B.1. c. Elueringsmiddel Eluerings-varianter: Elueringsvarianter: (iii) gradient-metoder : (s.n.; tilsv. T-programmert GC) løsningsmiddel-styrken forandres underveis systematisk - trinnvis eller kontinuerlig - som regel økning i styrke, 2 el. flere løsningsmidler tillater større variasjon i prøvekomponentenes retensjon kan tilpasses spesielle prøvers behov (f.eks. ph in IEC) Gradienter generelt : Normalfase (NP) Omvendt fase (RP) svakere sterkere MF upolar polar polar upolar Varianter på kontinuerlige gradienter: - lineære, - logaritmiske, - eksponentielle, og i tillegg kombinasjoner av disse. NB. blandings-nøyaktighet kritisk (for riktig og reproduserbar t R, V R ) 28

29 29 3.B.1. c. Elueringsmiddel Eluerings-varianter : Elueringsvarianter: Illustrasjon av effektene av ulike elueringsmiddel-gradienter i væskekromatografi (hypotetiske eksempler). 29

30 30 3.B.1. c. Elueringsmiddel Eluerings-varianter : Elueringsvarianter: (iv) temperatur-variasjoner (sjeldent programmert) (jfr. punkt 6): noe effekt på retensjon (som regel redusert retensjon ved økende temperatur noe på selektivitet, noe på effektivitet (raskere diffusjon/massetransfer (ved høy hastighet). ellers: effekt på viskositet (MF) - mindre mottrykk med økende T (omvendt av gass i GC) og : på løselighet (som regel økt løselighet ved økt T for analytter i MF (ved løselighetsproblemer: ofte økt T en forutsetning (f.eks. for polymerer i GPC)) Viktig erfaring: vann endrer sin polaritet merkbart med temperaturen: Blir mindre polart med økende temperatur. (v) kolonne-forandringer: aktivitets-forandringer (LSC). (om-)kobling av kolonner : "kolonne-svitsjing") 30