Ionebytterkromatografi.

Transkript

1 1 Ionebytterkromatografi. I løsning vil to ioner med motsatt ladning tiltrekkes hverandre. F. eks forklarer vi syrestyrke med størrelsen på negativ ladning i punktet der protonet bindes til syra. Sterkt ladde seter binder protoner sterkere. Dersom positivt ladde grupper er bundet til en stasjonærfase vil ioner med negativ ladning tiltrekkes disse. Ionisk interaksjon kan benyttes til å sparere ioner med forskjellig i gjennomsnittlig ladning. Stasjonærfasen der ionene er bundet kalles ionebytterresinen. Noen få er listet i tabell 1. Årsaken til at de kalles ionebytter resiner er at ionisk media alltid inneholder lik antall positive og negative ladninger d. v. s. er elektrisk nøytrale. Ioner i resinen vil alltid assosiere med ioner med motsatt ladning i mobilfasen. Et ion som er bundet til resinen kan kun forlate denne når det byttes ut med et annet. Positive ioner, kationer, utveksler med stasjonærfaser som består av kryssbundet polymer med negative ladninger. Dette kalles kationbytterresiner. Analogt polymere med kovalent bundet positive ladninger utveksler med negative ioner, anioner. Slike resiner kalles anionbyttere. Før en analyse vaskes resinen med en konsentrert løsning av et utbyttbart ion. F. eks. kan en anionbytter resin vaskes med en konsentrert NaCl eller KOH løsning. Essensielt alle seter vil da okkuperes av Cl - og gi kloridformen eller av OH - og gi hydroksidformen. Prosessen med å vaske på denne måten kalles regenerering. På liknende måte kan en kationbytter vaskes med HCl eller KNO 3 for å produsere syreformen eller kaliumformen av resinen. Ionebytterens matriks består som regel enten av polymere på styren basis, polymere karbohydrater (cellulose, dekstran, agarose), silika eller modifisert silika. Økt tverrbinding gir mindre svelling, økt utbytterkapasitet og økt selektivitet, men lengre retensjonstid. Styrenbaserte polymere er tverrbundet med divinylbenzen (DVB) i varierende grad (1-16% DVB). Med høy tverrbindingsgrad er det mulig å anvende slike materialer til HPLC, i motsetning til polymere karbohydrater som har for liten mekanisk stabilitet. I tillegg til de nevnt hovedgrupper finnes også andre materialer som alifatiske polymere og hydratiserte uorganiske oksider.

2 2 Bortsett fra de såkalte pellikulære (overflateporøse) ionebyttere, består materialene av porøse partikler. Avhengig av porestørrelsen vil større eller mindre mengde mobilfase bli inkludert i partiklene. Polymere med liten tverrbindingsgrad har store porer og sveller derfor mer enn polymere med høy tverrbindingsgrad. Graden av svelling er egentlig en funksjon av det osmotiske trykk inne i porene, som igjen er en funksjon av ionekonstrasjonen. Kationbytter: Positive ioner, kationer, utveksler med stasjonærfaser som består av kryssbundet polymer med negative ladninger. Anionbytter: Polymere med kovalent bundet positive ladninger utveksler med negative ioner, anioner. Tabell 1. Ionebyttergrupper. Type Aktiv gruppe ph område Anvendelser Sterk kationbytter - -SO Aminosyre, uorganiske separasjoner Svak kationbytter Sterk anionbytter Svak anionbytter -COO Overgangsmetaller, organiske baser -N + (CH 3 ) Alkaloider, fettsyrer -C 2 H 4 N(C 2 H 5 ) Organiske syrer, aminosyrer Ionebyttere klassifiseres som sterk sure, svakt sure, sterkt basiske eller svakt basiske. Ionebytterselektivitet. Selektivitetskoeffisient øker med økt grad av tverrbinding i resinen R - Na + + Li + R - Li + + Na [ R Li ][ Na ] K = + + [ R Na ][ Li ] Jo høyere ladning, jo sterkere vil ionet bindes. Jo mindre hydratisert radius, jo sterkere vil ionet bindes. Jo mer polarisertbart ionet er, jo sterkere bindes det.

3 3 Donnan likevekten. Når en ionebytter plasseres i en elektrolyttløsning vil konsentrasjonen av elektrolytt være høyere utenfor resinen enn inne i resinen. Det kan vises at ioneproduktet inne i kolonnen vil være likt ioneproduktet utenfor resinen [K + ] i [Cl - ] i = [K + ] o [Cl - ] o Ladningsbalanse: [K + ] o = [Cl - ] o [K + ] i + [R + ] i = [Cl - ] i Innsatt i uttrykket for ioneproduktet: [K + ] i ([K + ] i + [R + ] i ) = [K + ] o 2 Som sier at [K + ] o må være større enn [K + ] i. Anta at en ionebytterresin (R - Na + ) settes ned i en løsning av NaCl. La konsentrasjonen av R - i resinen være 3,0 M. (a) Hva er forholdet [Cl - ] 0 /[Cl - ] i dersom [Cl - ] 0 er 0,10 M? (b) Hva er forholdet [Cl - ] 0 /[Cl - ] i dersom [Cl - ] 0 er 1,0 M? (c) Vil fraksjonen av elektrolytt inne i resinen øke eller avta når konsentrasjon av elektrolytt utenfor øker? (a) [Cl - ] i ([Cl - ] i + [R - ] i ) = ([Cl - ] 0 ) 2 [Cl - ] i ([Cl - ] i + 3,0 ) = (0,1) 2 [Cl - ] i = 0,00333 M [Cl - ] 0 /[Cl - ] i = 0,1/0,00333 M = 30 (b) [Cl - ] i ([Cl - ] i + [R - ] i ) = ([Cl - ] 0 ) 2 [Cl - ] i ([Cl - ] i + 3,0 ) = (1) 2 [Cl - ] i = 0,303 M [Cl - ] 0 /[Cl - ] i = 1/0,303 M = 3,3 0,0033 (c) Fraksjonen inne i resinen er = 3,2% når konsentrasjonen av klorid 0,1033 0,303 utenfor er 0,1 M og = 23,2% når konsentrasjonen av klorid er 1,0. 1,303

4 4 Ione-eksklusjonskromatografi Ioner separeres fra ikke-elektrolytter i en ionebytterkolonne. Ikkeelektrolytter trenger inn i stasjonærfasen, mens ioner med samme ladning som ionebytteren frastøtes. Ioner med motsatt ladning av stasjonærfasen vil ikke ekskluderes. Elektrolytter har mindre adgang til kolonnevolumet og vil elueres før ikke-elektrolytter. Ionebytterresiner. Resiner benyttes for anvendelser som involverer små molekyler (MW< 500) som kan trenge inn i små porer i resinen. En mesh størrelse på 100/200 er passende for de fleste analyser. Store partikler knuses. Partiklene passerer en sil der åpningen mellom hullene er 0,075 mm (=200 mesh). Partiklene som har passert silen lar man så passere ytterligere en sil der størrelsen på hullene er 0,038 cm (=400 mesh). Partikler som har passert den første, men ikke den neste gis betegnelsen 200/400 mesh. Partiklene passerer en sil der åpningen mellom hullene er 0,150 mm (=100 mesh). Partiklene som har passert silen lar man så passere ytterligere en sil der størrelsen på hullene er 0,075 cm (=200 mesh). Partikler som har passert den første, men ikke den neste gis betegnelsen 100/200 mesh. Siden 100/200 mesh partikler ikke går igjennom silen med avstand 0,075 cm, mens 200/400 gjør det, må 200/400 partiklene være minst. Høyere mesh størrelse gir bedre separasjon, men det tar lengre tid å gå gjennom kolonnen. Ionebyttergeler benyttes for større molekyler som proteiner og nukleinsyrer. Disse kan ikke trenge gjennom porene i resiner. Ved separasjoner ved høy temperatur, høye strålingsnivå, sterkt basisk løsning eller kraftige oksidasjonsmiddel benyttes uorganiske ionebyttere som hydroksider av Zr, Ti, Sn og W. Økende ionestyrke Forandring av ph Gradient eluering. Oppgave pk a verdiene for NH + 4 er 9,244, for CH 3 NH ,64, for (CH 3 ) 2 NH ,774 og for (CH 3 ) 3 NH + 9,800. Dersom de fire ammoniumionene absorberes på en kationbytter ved ph = 7 kan de separeres ved eluering med en gradient med økende ph. Elueringsrekkefølge basert på pk a verdier er da NH 3 < (CH 3 ) 3 N < CH 3 NH 2 < (CH 3 ) 2 NH

5 5 Man bør ikke bli overrasket dersom elueringsrekkefølgen ikke er denne, da steriske effekter og hydrogenbindinger kan være av betydning i bestemmelse av selektivitetskoeffisientene. Det er også mulig at eluering med konstant ph (f. eks ph = 8) kan separere de fire species fra hverandre. Anvendelser av ionebyttere. Ionebyttere benyttes til å rense vann til laboratoriebruk og til industrielt bruk. Deionisert vann har passet en ionebytter for å omdanne kationer til H + og anioner til OH - slik at det dannes H 2 O. Ikke-ioniske forurensninger (slik som organiske forbindelser fjernes ikke i denne prosessen.) H + ionebytter: Cu 2+ 2 H + OH - ionebytter: 2 NO 3-2 OH - 2 H 2 O Ionebytter kan benyttes for å omdanne et salt til et annet. Anionbytter OH - form: (CH 3 CH 2 CH 2 ) 4 N + I - (CH 3 CH 2 CH 2 ) 4 N + OH - Tetrapropylammoniumjodid tetrametylammoniumhydroksid Oppkonsentrering av sporelementer. Chelex 100 er en styren-divinylbenzen resin som inneholder iminodieddiksyre grupper og kjent for sin evne til å binde overgangsmetallene. Metallene elueres ved et lite volum 2 M salpetersyre. OH N O HO O Ionekromatografi med suppressorkolonne. Separasjonskolonnen separerer anionene eller kationene ved ionebytting. Kolonnemateriale: polymerbaserte eller polymerdekkede silikabaserte ionebyttere. Mobilfase: For anioner benyttes en vannløsning av Na 2 CO 3 og/eller NaHCO 3 (ca. 2 mm.)

6 6 For kationer benyttes fortynnede (1-10 mm) løsninger av sterke syrer som HCl, HNO 3 og H 2 SO 4 eller deres salter av organiske aminer (etylendiamin, fenylendiamin etc.). Suppressorkolonnen. Hensikten med denne er å fjerne uønsket elektrolytt (fra eluenten) før konduktivitetsmålinger. (=ledningsevnemålinger) Til bestemmelse av anioner brukes en kationbytter som suppressor. Alle kationer blir fanget opp og byttet ut med protoner som igjen danner f. eks. CO 2 med karbonat, vann med OH -. På denne måten er kationer fjernet og erstattet med molekyler med lav ledningsevne. Na 2 CO 3 går til H 2 CO 3 som går til CO 2 og H 2 O. Etter å separere kationer i kationbytter kolonne, må suppressorkolonnen bytte ut anionet med OH - som gir H 2 O fra eluenten HCl. Detektoren måler ledningsevnen i elektrolytten som går gjennom detektoren. Suppressorkolonnen er i dag ofte erstattet med såkalte mikromembran suppressorer, bestående av tynne ionebyttermembraner montert lagvis med alternerende strømmer av mobilfase og regenereringmiddel. Disse suppressorene har både mindre båndspredning og større utbytterkapasitet enn de gamle suppressorkolonnene. Ionekromatografi med en enkelt kolonne. Dersom ionebytterkapasiteten til separatorkolonnen er tilstrekkelig lav og dersom fortynnet elueringsmiddel (med lav ledningsevne) benyttes, er suppressorkolonne ikke nødvendig. Detektor: Ledningsevnedetektoren gir respons for alle ioner. Når man benytter suppressorkolonne er det enkelt å måle analytten fordi eluentens konduktivitet er redusert til nesten null. Suppressor tillater også bruk av konsentrasjonsgradient i elueringsmiddelet. I enkelt kolonne anionkromatografi er konduktiviteten av analytt anioner høyere enn eluenten slik at ledningsevnen øker når analytten kommer ut av kolonne. Deteksjonsgrensen er i ppb til ppm området UV-detektor. I figur 26-6 har eluatet sterk UV-absorpsjon, mens analytten ikke absorberer. Absorbansen vil derfor avta når analytten kommer. Bruk av eluenter med benzoat og ftalat eluenter gir sensitiv (< 1 ppm) indirekte deteksjon av anioner.

7 7 Ionparkromatografi Ionparkromatografi har sin bakgrunn i ekstraksjon av ioniske substanser fra en vannløsninger over i organiske fase ved hjelp av ionpardannere. Alle ioner i en løsning omgir seg med et motion av motsatt ladning. Dersom motionet blir så stort og hydrofobt at den ioniske gruppen blir av underordnet betydning for løseligheten, vil et ion kunne ekstraheres over i en organisk fase ved hjelp av et dertil egnet motion. Både normal fase og omvendt fase systemer anvendes, men omvendt fase kolonner har generelt sett vist seg å være mer nyttige. Ionparkromatografi på omvendt fase kolonner baserer seg på tilsetning av et motion til den mobile fase. Motionet (X - ) inneholder en eller flere store upolare grupper og danner et ionpar med den ioniserte prøve (Q + ). Dette ionparet har vesentlig større affinitet for den upolare stasjonærfasen og vil få større retensjon enn det opprinnelige ionpar. Q + (aq) + X - (aq)! QX(org) Likevektskonstanten: E QX Fordelingskoeffisienten D Q [ ] = E X QX = [ QX ] + [ Q ] [ X ] aq aq org [ QX ] org [ Q ] aq D Q = + Retensjonen er altså en funksjon av egenskaper ved mobilfasen, som påvirker E QX, av typen motion X - og av konsentrasjonen av motion. I prinsippet skal retensjon være uavhengig av prøvens konsentrasjon, dersom denne ikke påvirker forholdet [QX] org /[Q + ] aq. Når det benyttes store motion hvor retensjonsmekanismen har mer ionebytterkarakter, vil retensjonen også være en funksjon av injisert mengde prøve. Årsaken er at den stasjonære fase vil inneholde, adsorbert eller løst, en relativt stor mengde av et lipofilt motion. Forholdet mellom prøvekonsentrasjonen og ionebytterkapasitet vil påvirke retensjonen. For ioniske substanser kan ionparkromatografi være av meget stor verdi, både for å oppnå øket retensjon og for å oppnå øket selektivitet. Elueringsstyrken kan reguleres ved å regulere motion konsentrasjonen eller mengde organisk løsningsmiddel, og selektiviteten kan reguleres ved å endre ph.

8 8 Ulempen ved ionparkromatografi er at retensjonsreproduserbarheten kan bli dårlig med mindre det anvendes stort overskudd av motion, idet retensjonen kan være avhengig av prøvekonsentrasjon. Stort overskudd av motion er ofte ikke ønskelig av andre grunner, men retensjonen kan stabiliseres ved tilsetning av buffere i ca 0,1-0,2 M konsentrasjoner. Til bruk på aminer er det bl.a. anvendt forskjellige alkylsulfonater som motion (1- heptansulfonat, natriumdodekylsulfonat). Til bruk på syrer og fenoler er det bl.a. anvendt tetrabutylammoniumfosfat. Ved anvendelser av alkylsulfonater med lange kjeder (detergents) er også betegnelser såpekromatografi blitt anvendt i stedet for ionparkromatografi. Med slik motioner er det funnet at ionparkromatografi er en lite egnet betegnelse idet ionebytter, og ikke ionpar mekanismer bestemmer retensjonen. Sammenlignet med ionebytter gir ionparkromatografi på en omvendt fasekolonne raskere separasjon med mindre båndspredning. Den klassiske ionparkromatografi anvender en mekanisk eller dynamisk pålagt stasjonærfase (f. eks. pentan-1-ol) For å ha likevekt i systemet må den mobile fase være mettet med pentan-1-ol. Et slik system er meget følsomt overfor temperaturendringer og krever god termostatering av apparaturen. I tillegg til de nevnte metoder kan ionparkromatografi også utføres på polare adsorbenter med mekanisk pålagt stasjonærfaser og motioner

9 9 Gelkromatografi. Eksklusjonskromatografi (size exclution chromatography, SEC) defineres som den kromatografisk metode som separerer stoffer utelukkende etter deres molekylstørrelse. Dersom kromatografien foregår i vandig miljø, er betegnelsen gelfiltrering kjent som et gammelt og innarbeidet begrep. Med organiske løsningsmidler brukes også betegnelsen gel permeation chromatography, GPC, på engelsk. Til det kromatografiske systems stasjonærfase anvendes porøse pakkematerialer med en gitt porestørrelse. Molekyler som er løst i den mobile fase og er for store til å passere gjennom porene, blir ført ut med mobilfasen mellom partiklene og elueres ut ved det såkalte void volum, V 0. En slik eksklusjon fra stasjonærfasen er bakgrunnen for betegnelsen eksklusjonskromatografi. Stasjonærfasen sies å ha et fraksjonsområde, hvilket betyr at molekyler innen det molekylvektområdet kan separeres. Molekyler som er små kan gå inn i porene i stasjonærfasen og sies å bli inkludert. Disse molekylene har adgang til mobilfasen inn i kulene som til mobilfasen mellom kulene og eluerer sist i en gelfiltrering. Molekyler som er for store til å passe inne i porene sies å ekskluderes. De har kun adgang til mobilfasen mellom kulene og vil derfor elueres først. Molekyler mellom disse to størrelsene vil delvis ekskluderes, hvilket betyr at de kan gå inn i noen av porene, men ikke i alle. Disse molekylene vil elueres mellom de store (som ekluderes) og mellom de små (som inkluderes totalt). En blanding av glutamat dehydrogenase (MM ) K = 0 laktat dehydrogenase (MM ) serum albumin (MM ) ovalbumin (MM ) og cytochrom c (MM ) K = 1 på en gelfiltreringskolonne pakket med Bio-Gel P-150. Fraksjoneringsområde Dersom blandingen påsettes en kolonne vil glutamat dehydrogenase elueres først, fordi massen er større enn øvre fraksjoneringsgrense. Det vil ekskluderes fullstendig fra porene i stasjonærfasen og elueres med V 0. Cytochrom c er under nedre fraksjoneringsgrense og elueres til slutt. De andre proteinene som er delvis inkludert vil elueres etter avtagende molar masse. Separasjonen kan beskrives med denne likningen.

10 10 der V + r = V 0 KV i V r er retensjonsvolumet av proteinet V 0 er volumet av mobilfasen mellom partiklene i stasjonærfasen (noen ganger kalt void volume) V i er volumet av mobilfasen inne i porene (også kalt det inkluderte volum) K er partisjonskoeffisienten I blandingen av proteiner ovenfor vil glutamat dehydrogenase ha K = 0 K= 1 for cytokrom c og K er mellom 0 og 1 for de andre proteinene. Vi regnet 26-14, 26-15, 26-16, og Affinitetskromatografi. Affinitetskromatografi er basert på prinsippet med biologisk gjenkjennelser. Eksempler på biologisk gjenkjennelse inkluderer antilegeme-antigen, enzymsubstrat, og reseptor agonist binding interaksjon. Disse interaksjonene har typisk høy affinitet, K d < 10-6 M, men er reversible når betingelsene forandres. P. g. a. spesifisiteten av gjenkjennelse er det ofte mulig å få 100 til 1000 ganger øket renhet av en protein prøve. Trinn i affinitetskromatografi. 1. Første trinn i affinitetskromatografi er å lage en stasjonærfase ved å immobilisere en av de to komponentene i en uløselig hydrofob polymer som agarose. 2. En blanding som inneholder protein påsettes deretter stasjonærfasen. 3. Under vasketrinnet, som ofte inkluderer en høy konsentrasjon av et salt for å overkomme svakere gjenkjennings interaksjon, vil alle proteiner elueres med unntak av de som er bundet sterkt til stasjonærfasen. 4. Vasketrinnet følges av et elueringstrinn der det bundne proteinet frigis ved å forandre ph på bufferen i mobilfasen. Det fins tusener av eksempler på affinitetskromatografi i litteraturen.