3. Væskekromatografi, LC (med HP-LC)

Transkript

1 1 KJ2053 Kromatografi (Analytiske metoder II) Lundanes Else, Reubsaet Léon, Greibrokk Tyge, Chromatography, Basic Principles, Sample Preparations and..., Wiley-VCH, ISBN: C LC-Separasjonsmekanismer 3.C. 1. Normal-fase Adsorpsjonskromatografi (NP-LSC) (Reversed Phase (Bonded Phase) Chromatography) 3.C. 3. Ionebyttere og ionebytter-kromatografi 3.C. 4. Hydrofilisk interaksjonskromatografi (HILIC, NP-LLC) 3.C. 5. Eksklusjonskromatografi (gel-kromatografi) og andre 1

2 2 Ulike derivatiserings-prosedyrer Retensjonsmodeller b) Organisk polymer-baserte RP-faser c) Hydrofob(isk) Interaksjons-Kromatografi, HIC 2

3 3 Litt mer Repetisjon: (jfr. Kap. 1.F) I hovedsak brukes : RP mest brukt i dag! Derivatisert silika, med upolare substituenter, som C18, C8, C30, C2, c-c 6 H 11, alkylfenyl, m.m. - bundet til silika-silanol-gruppene, Polymer-SF er: makroporøse partikler av syntetiske organiske polymerer, som polystyren-divinylbenzen-kopolymer, polyakrylat- og polyvinylalkohol-kolonner, med eller uten substituenter (f.eks. C18, C8 og lignende). Aktivt kull-kolonner : kun LSC; spesiell selektivitet sammenlignet med RP-faser ellers. (I dag spesialfremstilt som sfæriske grafittert-aktivt-kull HPLC-partikler). Nevnt i 3.C1.b.(iii) 3

4 4 I hovedsak brukes : Derivatisert silika, med upolare substituenter, som C18, C8, C30, C2 (m.fl.), c-c 6 H 11, alkylfenyl, m.m. - bundet til silika-silanol-gruppene, Polymer-SF er: makroporøse partikler av syntetiske organiske polymerer, som polystyren-divinylbenzen-kopolymer, polyakrylat- og polyvinylalkohol-kolonner, med eller uten substituenter (f.eks. C18, C8 og lignende). Aktivt kull-kolonner : kun LSC; spesiell selektivitet sammenlignet med RP-faser ellers (i dag spesialfremstilt som sfæriske grafittert-aktivt-kull HPLC-partikler). Mest brukt er silikagel-baserte kolonner Begrensning: ph-området (kjemisk stabil ved ph 2 7, kan normalt ikke brukes (lenge) ved ph > 8). Fordeler: bedre mekanisk stabilitet og bedre massetransfer-egenskaper av silika-materialer enn organiske polymerer. Tilgjengelig og brukt: Heltporøse partikler, overflateporøse partikler, kompakte partikler og helt-støpte porøse kolonner (monolitter) Andre formater testes, men er eksperimentelle. 4

5 5 Den mest brukte upolare fasen i HPLC i dag er er silikagel med oktadekyl-grupper -n-c 18 H 37 (typiske forkortelser : "RP18", "C18", "ODS" (for OctaDecyl Silica)). Silika O Si(R ) 2 n-c 18 H 37 (R' = vanligvis metyl) Popularitet skyldes : rask ekvilibrering, gradient-dugandes, greit (grov-)regulerbar retensjon (kan bruk vannholdige (ofte vannrike) MF), rel. lett forutsigbar retensjon (kan vurderes ut fra analytten: andel hydrofobisk overflateareal, eller fra dens vannløselighet). lite av de uønsket kraftige interaksjonene med analytter - nokså lineære isotermer. 5

6 6 De finnes som "monomer" - oligomer - "polymer" - "end-capped" (se nedenfor). Blir syntetisert både fra type A - og fra type B -silikagel Silika type B, fremstilt fra organosilaner (s.o.) og praktisk talt helt fri for uorganiske forurensinger, gir mer homogen silanolgruppe-aktivitet, mindre topp-asymmetri-problemer med sensitive analytter og bedre reproduserbarhet. også for RP-faser. Silikagel har en silanolgruppe-tetthet på maks. ca. 8 mol/m 2. Derav kan maksimalt ca. 50% silaniseres med RP-ligander (det selv med end-capping ). Gjenværende silanoler vil (i noen grad) bidra (som polare grupper) til retensjon og selektivitet av den kjemisk bundne fasen for analyttene. Deres svakt sure karakter kan gjøre kromatografi av basiske stoffer vanskelig. 6

7 7 fra Lundanes & al læreboken (Fig. 3.17) Ulike prosedyrer for derivatisering av silikagel: 1. Monomere faser ("brushes") : SiOH + Cl Si(CH 3 ) 2 C 18 H 37 SiO Si(CH 3 ) 2 C 18 H 37 + Cl Si(CH 3 ) 3 (end-capping) End-capping etterbehandling av den funksjonaliserte (C-18)- silikagelen: (noen av) de gjenværende frie silanol gruppene (ikke sterisk tilgjengelig i selve silylerings-reaksjonen) avreageres med et (mindre plasskrevende) silyleringsreagens f.eks. trimetylklorsilan.. fri silanol TMS-gruppe (fra end-capping) Hensikt: å blokkere overflaten mest mulig for analyttenes tilgang til polare silanoler og redusere 'tailing' og lignende, for å bremse/hindre hydrolysen av silikagel substituent-bindingene. 7

8 8 1. Monomere faser ("brushes") : ( her C8 ) SiOH + Cl Si(CH 3 ) 2 C 8 H 17 SiO Si(CH 3 ) 2 C 8 H 17 8

9 9 Ulike prosedyrer for derivatisering av silikagel: 2. Polymere faser : Si-OH + Cl 3 SiC 18 H 37 silika Si-O Si(Cl)C 18 H H 2 O - HCl Cl fra Lundanes & al læreboken (Fig. 3.17) Si-O Si(OH)C 18 H 37 + Cl 2 Si(Cl)C 18 H 37 silika OH Si-O Si(OH)C 18 H 37-2 HCl OH Si-O Si(OH)C 18 H 37 - HCl O Si(Cl)C 18 H 37 + H 2 O (el. Si-OH) Cl 9

10 10 Ulike prosedyrer for derivatisering av silikagel:?? (CH 2 ) 16 (CH 2 ) 16 (CH 2 ) 16 (CH 2 ) 16 (CH 2 ) 16 (CH 2 ) (CH 16 2 ) 16 (CH2 ) 16 Uventede (spesielle (?)) strukturer fra LRG(2014)- læreboken Illustrasjon av polymer C18-silika-overflate) som (mis-)tenkt av faglærer) 10

11 11 Ulike prosedyrer for derivatisering av silikagel: gir utslag i noe varierende retensjon og noe ulik selektivitet. Høyere retensjon ved større alkylkjede-lengde av liganden R. (f.eks. C18 vs. C8) Høyere karboninnhold (pr. overflateareal) vanlig for polymere faser enn for monomere, høyere retensjon, noe større stereokjemisk selektivitet Retensjon er sterkt avhengig av mengde organiske substituenter (klassisk: %C, fra forbrenningsanalyse, el. %C / g silikagel) men mest meningsfult målt som mol/m² eller som g C/m² (pr. overflateareal-enhet)). Overflateareal og porestørrelsen henger sammen. Men porestørrelsen kan også bestemme om eksklusjonseffekter må vurderes Typisk : 100 Å-porer for normal HPLC ( små molekyler), 300 Å-silikagel for protein-hplc 11

12 12 Retensjonen blant silika-rp-faser kan variere ganske stort (Eksempel her: ca. 50 ulike C8- og C18-faser, og lignende): k (for toluen i MeOH-H 2 O 50:50 (åpne firekant-symboler)) k α Fra Handbook of HPLC, 2011 (fig. 2.9) 12

13 13 Forskjellen mellom ulik bindingsteknologi : Sammenligning av monomere og polymere faser for ulike PAH : BaP = Benzo[a]pyren (planar) PhPh = Phenantro[3,4c]Phenantren ( helix ) TBN = TetraBenzoNaphtalene ( twisted ) Fra Handbook of HPLC, 2011 (fig. 2.9) viser ulik retensjon og shape selectivity (ulik elueringsrekkefølge) 13

14 14 (Reversed Phase (Bonded Phase) Chromatography) Alternative modeller hvordan RP-LC-kromatografien" kan tenkes fungere: a) Ved høy vannandel i MF og/el. polare organiske løsningsmidler innblandet: Ligand-laget vil normalt være "lagt flat" og "tørrlagt" og vil neppe kunne vurderes som væskelignende fase, men mest som en hydrofob adsorpsjons-overflate. "LSC"-lignende. "Solvophobic interaction mechanism" (el.lign.på den) b) Ved polare MF inneholdende en del organisk løsningsmiddel: SF'en kan ligne på / oppføre seg som et tynt lag med en konsentrert oppløsning av ligandene (f.eks. C18 = oktadekyl-rester på silikagelen) i MF sterkt anriket med dens organiske komponent(er) : et omtrent monomolekylært, "ligand-dypt", organisk, (kanskje) løsningsmiddel-holdig, væskelignende, (relativt) hydrofobt SF-lag "LLC"-lignende. "Partition mechanism" En idee om alternativene - skissert i : A. Weston & Ph.R. Brown, HPLC and CE, Principles and Practice, Academic Press (1997) (s. 30). 14

15 15 Strukturer av SF (eksempelet, en "polymer oktadekyl-silika fase") (MM-modellregning) SF-lagets sammensetning, og tykkelse, varierer også med type og andel organisk modifikator i den vandige MF, som løser seg i/assosierer seg med RP-ligand-fasen, (el. modifikator-molekylene solvatiserer alkyl-kjedene). Teoretisk modellerte (del-)strukturforslag for polymere C18-faser (på silikaoverflate, (nederst i figurene), her med litt atypisk mye orden (p.g.a. høy C18-tetthet) i kontakt med organiske MF-komponenter (i fra MF-blandingen med vann). (Pemberton & al. Anal.Chem.(2003), 75, p.3360ff; strukturene er baserte på Molecular Mechanics -regninger) 15

16 16 (Reversed Phase (Bonded Phase) Chromatography) Monomer C18-silika-fase, modellert (MM) : her i kontakt med vann (analytt: 1-butanol) Teoretisk/matematisk beskrivelse/modellering av retensjonen for RP-faser er forsøkt - og fortsatt i arbeid: Gammel-læreboken Kromatografi (1994) nevner kort i Kap. 4 den klassiske teoretiske modellen basert på Solvofobiske interaksjoner (C. Horvath). Se også Kap. 3.C.2.suppl. a/b om det (pdf fra Word - men det er ikke detalj-pensum). Ny-læreboken Kromatografi (2014) nevner kort The Solvation Parameter Model (Kap ). Denne behandles i mer detalj i KJ 3059, Videregående kromatografi. Siepman&al_AnalyCh2007;Fig1-del Nyttige relasjoner: For homologer øker log k (tilnærmet) proporsjonalt med antall karbonatomer i homologene. For innflytelsen av MF-sammensetningen på k gjelder log k = log k W - S k minker med ca. faktor 2 ved en økning med ca. 15 % av andelen organisk løsningsmiddel i den vandige MF for typiske RP-løsningsmiddel-blandinger. 16

17 17 Varianter av (klassiske) omvendt-fase-materialer : Kjeder med innebygget polare funksjonelle grupper et stykke ned i hydrokarbon-kjeden. Slike faser skal skjerme (rest-)silika-silanol-aktiviteten og redusere topp-asymmetri (Eks. : Supelco s RP-Amid-C18 (amid-gruppe); Waters Symmetry Shield: (carbamat-gruppe = uretangruppe)). X = Embeded polar group silika O Si X Sidekjedene (normal 2 metylgrupper) på bindings-silisium-atomet kan erstattes med mer plasskrevende grupper (f.eks. iso-propyl, iso-butyl) disse gir bedre skjerming av silikagel-overflaten større phstabilitet i surt miljø. silika (CH 2 ) x silika (CH 2 ) x Det kan brukes end-capping med polare organosilisium-forbindelser. Hensikten: bedre skjerming av rest-silanol-aktivitet (samme idé som for embeded polar group -RP-faser). (hemmelig, lite opplysninger hvordan det gjøres,). 17

18 18 Organo-silika hybrid-materialer; innheolder noe alkylsilika- monomer under silikagel-syntesen: gir innebyggete organiske substituenter i silikagel-strukturen: tåler ofte høyere ph (mindre rask basisk hydrolyse). Organo-silika med polare grupper (diol, amin, nitril, nitro) brukt med relativt polare MF oppfører seg derimot som omvendt-fase-sf (polare grupper solvatiseres av polar MF, mens de upolare strukturelementene av SF (korte hydrokarbongruppene) fungerer som RP-fase. OEt R R Hydrosilylerte materialer: bruker en syntese som fester den organiske substituenten direkte til silisiumatomet (ikke via oksygen-atom). Stabil binding: "Omdanner" silanolgruppe (evt. opptil 95%) til Si-H binding (hydrosilan), som så reagerer (adderes til) en terminal olefin (1-alken). Sies å tåle mer ekstreme (lavere og høyere) ph en vanlige organosilika-sf er. R R OEt OEt R' - EtOH R = (Et), H, Si R R CH 2 R' Enda en (delvis) polar variant av bruk av omvendt fase-sf er er Ion-par-kromatografi (omtales nærmere i kapittel ). 18

19 19 b) Organisk polymer-baserte RP-faser Polystyrene latex: 5 Micron Microspheres (Horiba.com, photo courtesy of Duke Scientific) Polymer-SF er: makroporøse partikler av syntetiske organiske polymerer, som - polystyren-divinylbenzen-kopolymer, - kryssbundet polyakrylat- og - polyvinylalkohol (PVA), uten substituenter (jfr. dokument om organiske polymerer. i kromatografi), eller med substituenter (f.eks. C18, C8 og lignende). Polymer-SF er: Velges primært når MF blir for aggressivt for silikagel - særlig ved ph over 8-9. Har noe dårligere effektivitet (enn silika-baserte RP-faser), Noen ganger mer trykkbegrensninger noe mer begrenset toleranse for en del MF-sammensetninger (?, svellingstendenser )? Noen av disse fasene også tilgjengelig som monolitter. 19

20 20 c) Hydrofobisk interaksjons-kromatografi, HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) ( ) HIC er en omvendt-fase kromatografiteknikk - med "RP"-SF med ikke altfor sterk retensjon (korte alkylgrupper på f.eks. silika eller karbohydratmatriser) eller med kortkjedede polare organiske grupper (f.eks. diol-faser). Utviklet og brukt primært for proteiner: Rel. svak RP-retensjon i HIC er en fordel i f.t. RP-18 Normal RP-LC: ofte alt for sterk retensjon for proteiner, noe som krever proteinskadelige MF for eluering (f.eks. org. ko-solvent, eller tilsats av kaotropiske agenser (urea, etylenglykol, etc..) eller detergenser). HIC finnes både som lavtrykks-, og som HPLC-variant (men rel. sjeldent i HPLC) MF er ofte (rel.) nært fysiologisk, (mest vandig m. moderate saltkonsentrasjoner). (Historisk: Oppstått/utviklet fra såkalt Salting-out -kromatografi for proteiner, på klassiske PS/DVB-baserte ionebyttere). PerSeptive Biosystems

21 21 c) Hydrofobisk interaksjons-kromatografi, HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) ( ) HIC er en omvendt-fase kromatografiteknikk - med SF er med ikke altfor sterk retensjon (korte alkylgrupper på f.eks. silika eller karbohydratmatriser) eller med kortkjedede polare organiske grupper (f.eks. diolfaser). Analytter adsorberes/retarderes fra sterkt polare elueringsmidler (typisk, fra vandige saltløsninger (ofte ammoniumsulfat) v.h.a. hydrofobiske interaksjoner mellom analytt og SF. Eluering: som regel en gradient med avtagende saltkonsentrasjon. etter hvert øker løseligheten til hydrofobiske analytter i MF - og minker retensjonen (organiske koeluenter kan ofte unngås). Dionex: silica-based ethyl/amide Tosoh & Waters: Phenyl polymer Rao &al., DIONEX, (2006) Dionex (2006) 21