1. Teori 1. B Sonespredning / Båndspredning. KJ2053 Kromatografi (Analytiske metoder II)

Transkript

1 1 KJ2053 Kromatografi (Analytiske metoder II) Lundanes Else, Reubsaet Léon, Greibrokk Tyge, Chromatography, Basic Principles, Sample Preparations and..., Wiley-VCH, ISBN: B Sonespredning / Båndspredning 1

2 2 1.B. Sonespredning / Båndspredning (eng. Band broadening) Ideal : Vårt Ønske : minst mulig spredning!!! Minst mulig overlapping av topper (soner, bånd) lettere, sikrere identifisering og kvantifisering. REALITET : " toppene" (el. flekkene) = sonene med analytter sprer seg, utvider seg under elueringen. 2

3 3 1. B. 1. Ideal kromatografisk topp = Gauss- eller Normalfordelings-kurve ( klokke -kurve): Når stoffene "fordeler seg konstant" mellom fasene i kromatografi (konstant fordelingskoeffisient K c, K g = lineær (fordelings-)isoterm) : Topper med klokke -form (Gauss-kurve-form, Normal-fordelingskurve-form): 3

4 4 1. B. 1. Ideal kromatografisk topp = Gauss- eller Normalfordelings-kurve ( klokke -kurve): y-akse: stoffmengde = detektor-respons; enhet: h max (= maks. topphøyde) Infleksjonspunkt = vendepunkt (= inflection point) x-akse : (x- x) = avstand fra gjennomsnittlig x, x (toppmaksimum); enhet : s (standardavvik) 4

5 5 1. B. 1. Ideal kromatografisk topp Spesielle egenskaper/karakteristika av Gauss-toppen : Kurven er symmetrisk, i forhold til (x - x) = 0 Ved 0,607 h max er bredden 2! (Der er også kurvens vendepunkter) Basisbredde w b = 4 Avstand av skjæringspunktene mellom basislinjen og tangentene til kurven (gjennom vendepunktene) (N.B.: Ved basisbredden (4 ) er kurvehøyden fortsatt ca. 13,5% av toppmaksimum; først ved 3 avstand fra aksen (= 6 -bredde) er kurvehøyden nede på 1,11% av h max (se figur ovenfor). Det er punktet ved 6 -bredden, som 2 topper med en oppløsning med R S = 1,5 har kontakt med hverandre (1,5 x w b = 1,5 x 4 ). Toppbredde ved halv maksimalhøyde, el. halvbredden", w h : w h = 2,354 = 2 (2 ln2) ½ = 0,589 w b = ½ (2 ln2) ½ w b = Bredden av toppen i halv høyde av toppmaksimum; engelsk også FWHM = Full Width at Half Maximum; foruten på dagligtale : "halvbredde", half-width - som ikke er et anbefalt uttrykk, fordi det kan lett føre til feiltolkninger av begrepet.) 5

6 6 1. B. 1. Ideal kromatografisk topp Når Gausskurven er er en kromatografisk topp da er _ x = gjennomsnittlig, eller "sann", vandringslengde L x, eller retensjonstid t R (x), eller retensjonsvolum V R (x) for stoffet. = midten av flekken, toppen = x ved det høyeste punkt av toppen Kurveformen oppstår ved at molekylene til analytten ikke alle har den sanne retensjonstiden (eller sanne L eller V R ). Avviket (x -x) fra x er tilfeldig (stokastisk) og hyppigheten av avvikene er normalfordelte, følger en Normalfordeling. Normalfordelings-, Gauss-, klokke -kurve Ved ideale, normalfordelte kurver / topper, kan statistiske mål brukes for å beskrive - kvantifisere - toppbredden : varians ( 2 ) eller standardavvik ( ). 6

7 7 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone-(ikke-)spredning) : Effektiviteten av et kromatografisk system er systemets evne til å holde stoffet/analyttene (sonene, båndene, toppene) samlet: evnen til å hindre spredning. stor effektivitet lite sonespredning (og omvendt) Som mål for sonespredningen kan (bl.a.) statistiske uttrykk benyttes, som er utledet av Normalfordelings-toppens egenskaper, s.o., (selv om de da kalles noe annet). Det finnes ulike numeriske mål for (kromatografisk) effektivitet : De fleste slike mål forutsetter konstante elueringsbetingelser : isotermisk, isokratisk, konstant MF-hastighet. 7

8 8 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone-(ikke-)spredning) : Det finnes ulike numeriske mål for (kromatografisk) effektivitet : De fleste slike mål forutsetter konstante elueringsbetingelser: isotermisk, isokratisk, konstant MF-hastighet. (i) (ii) (iii) (iv) (v) (vi) (vii) (viii) Platetall, (eng.: plate number (tidligere: Antall teoretiske plater )) Platehøyden, (eng.: (chromatographic) plate height (tidligere: Høyde-Ekvivalent til en Teoretisk Plate, HETP)) Effektivt Platetall, (eng.: effective plate number (tidligere: Antall effektive teoretiske plater )) Effektivt Platehøyde, (eng.: effective plate height (tidligere: Høyde-Ekvivalent til en Effektiv Teoretisk Plate, HEETP)) Platetall pr. meter (eller pr. et annet lengdemål) Redusert platehøyde (eng.: reduced plate height) Toppvolum (eng.: peak voulme) Effektivitetsparameter i planar kromatografi (TLC, PC) 8

9 9 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone-(ikke-)spredning) : (i) Platetall, (eng.: plate number) (tidligere: Antall teoretiske plater ) t R N t 2 = kvadrat av retensjonstid / kvadrat av standardavvik av tr = invers (relativ) varians av retensjonstiden R R R R t t t t N 16 5,545 8 ln 2 wb w b wh wh 4 eller tilsv. for V R istedenfor t R. stor N stor effektivitet smale topper lite sonespredning 9

10 10 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone(-ikke)spredning) : (i) Platetall, (eng.: plate number; tidligere: Antall teoretiske plater,) Ofte generelt skrevet som N = a (t R / w x ) 2 a : numerisk faktor, der a må samsvare med type toppbreddemålet w x som brukes. For w x = σ a = 1 = w h = w ½ a = 5,54 = w b a = 16 Hvis de kromatografiske toppene er u-symmetriske Gauss-topper blir den eksakte (= teoretisk korrekte) beregning av platetallet betydelig mer komplisert! (kan gjøres v.h.a. beregning av s.k. statistiske momenter.) 10

11 11 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone(-ikke)spredning) : (ii) Platehøyden, (eng.: (chromatographic) plate height (tidligere: Høyde-Ekvivalent til en Teoretisk Plate, HETP)) H = L / N = L σ t 2 / t R 2 L = kolonnelengde N = platetallet stor H lite effektivitet brede topper stor sonespredning Viktig egenskap av platehøyden: H er proporsjonalt med variansen (av molekylenes retensjonstid), σ t2. 11

12 12 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone(-ikke)spredning) : (iii) Effektivt Platetall, (eng.: effective plate number (tidligere: Antall effektive teoretiske plater )) V R ' 2 t R ' 2 t R - t 0 2 N eff = = = 5,54 5 σ V σ t W h k 2 N eff = N 1 + k N.B.: N eff < N stor N eff stor effektivitet smale topper lite sonespredning 12

13 13 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone(-ikke)spredning) : (iii) Effektivt Platetall, (eng.: effective plate number; tidligere: Antall effektive teoretiske plater ) R R R 0 V ' t ' t t Neff 5,545 V t wh N.B.: N eff < N N.B. : Ifra omregningsformelen N eff = f (N) kan sees at og N eff 0 når k 0 N eff N når k. (fordi t R ' går mot null). Fordelen av N eff : N eff 0 når k 0, d.v.s. når retensjonen er null er en separasjon umulig: N eff lover ikke en (kromatografisk) separasjonsevne som ikke finnes (som en vanlig N kunne "lovet"/antydet). 13

14 14 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone(-ikke)spredning) : (iv) Effektivt Platehøyde, (eng. : effective plate height (tidligere: Høyde-Ekvivalent til en Effektiv Teoretisk Plate, HEETP)) H eff = L / N eff N.B.: H eff > H L = kolonnelengde N eff = effektivt platetallet stor H eff lite effektivitet brede topper stor sonespredning 14

15 15 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone(-ikke)spredning) : (iv) Effektivt Platehøyde, (eng. : effective plate height; tidligere: Høyde-Ekvivalent til en Effektiv Teoretisk Plate, HEETP) H eff = L / N eff L = kolonnelengde N eff = effektivt platetallet N.B. (tilsvarende N eff ) : H eff når k 0. og H eff H når k. Og viktig : H er proporsjonalt med variansen (av analyttmolekylenes retensjonstider). 15

16 16 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone(-ikke)spredning) : (v) Platetall pr. meter (eller pr. et annet lengdemål) = N / L L = kolonnelengde N = platetallet Gir et mål for kolonnekvalitet, uavhengig fra den aktuelle kolonnelengden. Er det inverse av platehøyden. (vi) Redusert platehøyde (eng.: reduced plate height) d P = d c = partikkeldiameter, i pakkede kolonner kolonnens indre diameter; i åpne kapillærkolonner Gir et mål for kvaliteten av pakningen og pakningsmaterialet for bruk i kromatografi, målt uavhengig av partikkelstørrelsen. 16

17 17 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone(-ikke)spredning) : Når N er (omtrent) konstant øker w h (og σ ) omtrent proporsjonal med t R eller V R! lav t R (eller V R ) smal, høy topp, høy t R (eller V R ) bred, lav topp. Fordi N ikke er helt uavhengig av hvilken topp den utregnes fra (en faktor her er k, s.o.), må det spesifiseres hvilken topp, og ved hvilke analysebetingelser, som er brukt til beregning av N (el.lign.). 17

18 18 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone(-ikke)spredning) : Effektivitets-parameterne oppgitt her er beregnet for bruk i kolonnekromatografi (eluering over gitt kolonnelengde). N, H, N eff, H eff, h : beskriver alle én topp ved konstante betingelser. Verdier varierer litt i en gitt kolonne med t R el. V R (d.v.s. med k). (Det finnes enda flere målemetoder for effektivitet, også slike som kan anvendes for ikkekonstante betingelser (noen kommer vi tilbake til). 18

19 19 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone(-ikke)spredning) : (vi) Toppvolum (eng.: peak volume; n.b. ikke en IUPAC-definert betegnelse) Mobilfase-volumet som inneholder toppens analytt (det meste av den: beregnet ut fra bredde ved basis w b ) V peak = w b F MF V peak Topp-volum (ikke-godkjent / reservert symbol) F MF (or F) : volumetrisk MF-hastighet (Mobile Phase flow-rate)) Ikke en effektivitets-parameter, egentlig men et uttrykk for "absolutt" spredning av en analytt etter kromatografi / separasjon (ved kolonneutgang). Nyttig bl.a.: ved fraksjons-oppsamling, ved konsentrasjons-estimering basert på kjent injisert mengde, 19

20 20 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone(-ikke)spredning) : (viii) Effektivitetsparameter i planar kromatografi (TLC, PC) Forutsatt lineær utvikling, og v.h.a. kapillærkrefter : Platetall : L S 2 R F L M 2 N = 16 = 16 d S d S d S er / tilsvarer w b, basisbredden, av flekken: kan være vanskelig å objektivt finne (er avhengig av flekkintensiteten, om synlighets-grensen går ved w b grensen eller ikke. (Best ved flekk-scanning - og bruk av metoder analoge til dem som brukes på topper fra kolonnekromatografi.) 20

21 21 1. B. 2 Effektivitet (innen kromatografi = sone(-ikke)spredning) : (vii) Effektivitetsparameter i planar kromatografi (TLC, PC) Forutsatt lineær utvikling og v.h.a. kapillærkrefter: Erfaringsmessig: Ved "store" partikler - "vanlig" TLC (d P mm): N varierer lite med L S N er generelt lavere enn ved små partikler (HPTLC). Ved små partikler - HPTLC (d P 5-10 µm), og ved lave L S (vandringslengder 3 cm) : N ~ konstant Men - ved høyere L S : N avtar (raskt) med vandringslengde. Ved aktiv MF-transport (pumping) er forholdene omtrent likt med kolonne-kromatografi : N blir da større enn ved ren kapillær-transport. 21

22 22 1. B. 3 Oppløsning mellom topper, R s (eng.: Resolution) : Mål for separasjon av to topper m.h.t. deres avstand (rel. retensjon) og bredde ("grad av overlapping") : For utregning basert på et kromatogram : t 2 - t 1 Dt R s = = (R S -I) ½(w b,1 + w b,2 ) 2( ) Eller = "Divider toppavstanden med gjennomsnitts-basisbredden". 22

23 23 1. B. 3 Oppløsning mellom topper, R s (eng.: Resolution) : Utledning ut fra generelle teoretiske parametere : k α - 1 α - 1 R s = ¼ N ½ = ¼ N eff ½ (R S -II) 1 + k α α der k = ½ (k 1 +k 2 ) Ligningen R S -II finnes også i forenklede former (m. (varierende grader av) avrunding) k 2 a 1 _ R s = ¼ N for k 2 k 1 + k 2 a el. lærebokens likn (spesifisert "gjelder kun for to overlappende bånd" (1994) / "two closely eluting compounds" (2014)): k _ R s ¼ (a - 1) N for k k 1 k 2 k og a 1,0 1 + k 23

24 24 1. B. 3 Oppløsning mellom topper, R s (eng.: Resolution) : Full "basislinjeseparasjon" tilsvarer vanligvis ca. R s = 1,5. R s = 1,0 tilsvarer ca. 3 % arealoverlapping mellom (ca. like store) topper. Estimering/utregning relativt grei: (særlig for like store topper, med (RS-I)-formel, og/eller med øyemål. Eksempler : lav separasjonsfaktor høy separasjonsfaktor Lavt platetall Høyt platetall Forslag: Estimér oppløsningene for de 4 eksemplene. 24

25 25 1. B. 3 Oppløsning mellom topper, R s (eng.: Resolution) : Vurdering av R s er mer problematisk for topper med ulik høyde, og som ikke er nært basislinjeseparert som er de, hvor faktisk R s er av interesse å diskuteres ) Illustrasjon av oppløsnings-tall : Fig. fra: J.M.Miller, Chromatography, Concepts and Contrasts, Wiley-Interscience, 988, p.19; og 2005, p.59 (og. utg. 1, 1988) jfr. også 1994-"Kromatografi"-læreboken (Greibrokk & al., 3. utg.), s. 21, Fig. 1.11). Når to topper overlapper sterkt: "sann t R " stemmer ikke lenger med observert t R (avlest ved "overlappet topp-maksimum": fare for feil-identifisering. Lav oppløsning kombinert, med sterkt ulike toppstørrelser gjør alt vanskelig: identifisering, kvantifisering, oppløsnings-estimering. F.eks. for R s = 0,6 og toppforhold 1/16: minste-topp er usynlig for det blotte øyet! (se: topp/høyre) 25

26 26 1. B. 3 Oppløsning mellom topper, R s (eng.: Resolution): Ligningen (R S -II) k α - 1 α - 1 R s = ¼ N ½ = ¼ N eff ½ (R S -II) 1 + k α α Viser oss at : R s vokser med N ½ liten a liten R s liten k liten R s Derfor, for optimering : øk N (lengre, bedre kolonner)... øk a (andre SF, MF, evt. betingelser ellers)... øk k (andre SF, MF evt. betingelser ellers) så mye som mulig/forsvarlig 26

27 27 1. B. 3 Oppløsning mellom topper, R s (eng.: Resolution) : Ligningen (R S -II) k α - 1 α - 1 R s = ¼ N ½ = ¼ N eff ½ (R S -II) 1 + k α α Viser oss at : R s vokser med N ½ liten a liten R s liten k liten R s Derfor, for optimering : øk N (lengre, bedre kolonner)... øk a (andre SF, MF, evt. betingelser ellers)... øk k (andre SF, MF evt. betingelser ellers) så mye som mulig/forsvarlig Enkel omforming av formelen R S -II gir mulighet til å regne ut effektivitets-krav for en separasjon, basert på "gitt" k, α og ønsket oppløsning R S : (N req ). 27

28 28 1. B. 3 Oppløsning mellom topper, R s (eng.: Resolution) : Kvantitative sammenheng i ligningen (R S -II) k α - 1 R s = ¼ N ½ 1 + k α R s som funksjon av k, R s som funksjon av N R s som funksjon av α retensjonsfaktor platetall separasjonsfaktor For k : Rask økning fra start, nær optimum ved k over ca. 3. For N : Jevn økning : ikke lineær men med kvadratroten av N. For α : Rask økning fra start, nær optimum ved α over ca

29 29 1. B. 3 Oppløsning mellom topper, R s (eng.: Resolution) : For å kunne oppnå en ønsket oppløsning (f.eks. R s =1,5 = basislinjeseparasjon) kan balansen mellom separasjonen (ved α) og effektivitet (v. N eff ) beregnes : α - 1 R s = ¼ N ½ α Neff(req) Neff (req for Rs 1,5) = f (alfa) alfa For Rs = 1,5 alfa N(eff) 1, , , , , , ,7 73,5 1,8 56,25 1,9 44, Behov : For eff. platetall typisk teknikk minimum α for R S 1,5 100 (lavtrykks prep. søylekromatogr.) 1, (typisk enkel pakket kolonne GC) 1, (god HPLC-separasjon) 1, (god HRGC-kolonne) 1,006 29

30 30 1. B. 4 Kompliserende faktor : Asymmetri : Planar: Tailing (haledannelse) Fronting (= leading) Kolonne: Fravik fra Gauss -toppens strenge symmetri! 30

31 31 1. B. 4 Kompliserende faktor : Asymmetri Tailing (haledannelse) & Fronting (= leading): Fravik fra Gauss -toppens strenge symmetri! Årsak : K c, fase-fordelingskoeffisienten, varierer med konsentrasjonen av analyttene! (Raoult's lov følges ikke). Vises i analyttens adsorpsjons-, eller fordelings-isotermer, c S = f(c M ), som da er ikke-lineære (n.b. fordelingskoeffisienten er lik stigningen av isotermen). Slike situasjoner gir asymmetriske topper (jfr. kap. 3) Dette er meget uønsket!. 31

32 32 1. B. 4 Kompliserende faktor : Asymmetri Tailing (haledannelse) & Fronting (= leading): Fravik fra Gauss -toppens strenge symmetri! Dette er meget uønsket!. Asymmetri gjør : effektivitetsmålinger kompliserte, (krever bruk av statistiske momenter, "Gauss-kurve-baserte" formler holder ikke lenger, strengt tatt). retensjonsparametere (t R, R F, V R, k) blir prøvemengde-avhengig upålitelige for identifikasjon. topp-høyder og arealer blir mindre entydig bestembare (hvor starter, hvor slutter toppen?) 32

33 33 1. B. 4 Kompliserende faktor : Asymmetri Mål for asymmetri (empirisk) : Asymmetri-parameter (blant flere mulige ) : f.eks. A S = b / a (For a, b, jfr. figuren, c = 0,1 h max ) For A S = 1,0 : symmetrisk topp A S < 1,0 : fronting A S > 1,0 : tailing (haledannelse) Alternativ asymmetriparameter : f.eks. A = (b-a)/ a : Da blir det haledannelse/'tailing' ved A > 0, 'fronting' ved A < 0 og symmetrisk ved A = 0 (måles også ved c = 0,1 hmax). USP (US Pharmacopiea) bruker enda en annen metode: T = w 0,05 / 2f : som gir forskjellige tall fra A s. Det måles ved 5% av topphøyden (w 0,05 tilsvarer a+b, og f tilsvarer a, men altså målt v. 5% istedenfor 10%). 33