Lundanes Else, Reubsaet Léon, Greibrokk Tyge, Chromatography, Basic Principles, Sample Preparations and..., Wiley-VCH, ISBN:

Transkript

1 1 KJ2053 Kromatografi (Analytiske metoder II) Lundanes Else, Reubsaet Léon, Greibrokk Tyge, Chromatography, Basic Principles, Sample Preparations and..., Wiley-VCH, ISBN: D Partikkelformer av stasjonærfaser for pakkede kolonner 1.E Mellommolekylære krefter 1.F Isotermer 1

2 2 1.D Partikkelformer av stasjonærfaser 1.D. 1. Betydning av pakningsmaterial-utformingen Stasjonærfasens (SF's) utforming -- viktig for effektivitet / kvalitet av pakkede kolonner: a) Størrelsen (d P ) : Bestemmer (gjennom eddy-diffusjon) antall partikkel-passeringer pr. strømningsvei bestemmer da, via eddy-diffusjons-termen, platehøyden. Bestemmer (for massetransporten ) diffusjons-/vandrings-lengder i de ulike fasene bestemmer tiden for hver faseovergangs-runde, dermed bestemmer - via massetransfer-termene - platehøyden. 2

3 3 1.D Partikkelformer av stasjonærfaser 1.D. 1. Betydning av pakningsmaterial-utformingen Stasjonærfasens (SF's) utforming -- viktig for effektivitet / kvalitet av pakkede kolonner: Mest effektivitet når : a) minst mulig partikkeldiameter (parameter d P ) b) jevnest mulig pakning av partiklene (inngår i parameter c e ) - mest mulig like store partikler (= mest mulig mono-disperse partikler) - mest mulig regelmessig form, (d.v.s. sfærisk, lettest å pakke jevnt). => tillater best mulig pakning av partiklene. site-ge-energy-com, 1701 Coarse Alumina chemicals-technology-com, 1701 imery-oilfieldsoliutions-com, 1701 philica-com,

4 4 1.D Partikkelformer av stasjonærfaser 1.D. 2. Typer partikler/media : a) Helt porøse partikler (d P ~ 30 μm : konvensjonell søylekromatografi) (d P ~ 20 μm : HPLC) (d P ~ 2 μm : UHPLC) (i) med uregelmessig form ( irregular particles ) : oppmalt og siktet fast stoff (oppmalt aerogel-"kake") : + Stor kapasitet ("100 % SF"), + relativt rimelig pris, - kan være vanskelig å pakke til høy effektivitet. (ii) sfæriske, mikroporøse partikler (bare HPLC, d P ~ 20 μm) (spesial-syntetisert for kromatografi) + effektivitet + stor kapasitet ("100 % SF"), + (relativt) lett å pakke - dyrere enn irregulære 4

5 5 Teori 1.D Partikkelformer av stasjonærfaser 1.D.2. Typer partikler/media : b) Overflateporøse partikler (eng.: pellicular packings, porous layer beads, core-shell beads) : Historisk 2 faser : 1. På 60(?) 80-tall: høyeffektivitets-pakning i lavtrykks-kro. - ikke i bruk lenger (d P m) 2. Fra 2000-tallet utover gjenoppdaget for UHPLC med HPLC-trykk. For 'fast HPLC', og UHPLC (modern, pkt. 2) Partikler på 3 5 μm (med 'fused silica'-kjerne (1,5-3 μm, belagt med ca. 0,5 μm porøs silikagel (som oftest overflate-derivatisert til, f.eks., omvendt-fase SF). Volum-andel av porøst silka-sjikt rel. høy For 1,0 + 0,5 μm : SF utgjør 55% vol-% av partikkelen; for 1,7 + 0,5 μm (s.n.) : SF utgjør 25% vol-% av partikkelen 5

6 6 Teori 1.D Partikkelformer av stasjonærfaser 1.D. 2. Typer partikler/media : c) Kompakte sfæriske partikler (bare (U)HPLC; d P ~ 2 μm) Anvendes for makromolekyler (p.g.a. av deres meget sakte diffusjon). Egnet for overflate-retensjon (adsorpsjon, (mest) ionebytting). + meget høy effektivitet (lite d P ; d S, H SF ~ 0) - meget lite kapasitet (prøvemengde) og rel. lite retensjon, lite mengde (areal) aktiv SF i forhold til kolonnevolumet, - høy mottrykk (små kolonner og/el. UHPLC) 6

7 7 Teori 1.D Partikkelformer av stasjonærfaser 1.D.2. Typer partikler/media : d) Gjennomstrømnings-media (Flow-through media) d. (i) "Flow-through" makroporøse partikler Sfæriske partikler med noen (ekstra-store) makroporer, som er meget vide, tvers (/på langs ) gjennomgående, der MF-strømmen kan gå tvers gjennom partiklene, via (makro-)porene ( netto konveksjon i MF-retningen). Diffusjons-lengdene gjennom SF'en (og gjennom stillestående MF) reduseres; avstandene mellom aktive MF-strømningsveier reduseres: Tilsynelatende reduseres den effektive partikkeldiameteren m.h.t. effektivitet (H SF og H smf ) uten at det medfører høyere mottrykk. + større effektivitet, + større MF-hastighet mulig. 7

8 8 Teori 1.D Partikkelformer av stasjonærfaser 1.D.2. Typer partikler/media : d) Gjennomstrømnings-media (Flow-through media) d. (ii) "Monolitt-kolonner Makroporøse polymer- eller silika-staver, "helstøpte kolonner" Støpt som porøst faststoff inne i kolonne-røret, ingen regulær partikulær struktur, én sylindrisk porøs mega-partikkel. Det kan skilles mellom makro-porer ca. 2 μm diameter (gjennomsnitt) Og meso- og mikro-porer ca. 13 nm diameter (gjennomsnitt). Fra ChromBook 06/07m Merck KGaA : Chromolith gir ekstra stor gjennomstrømning gir stor tilgjengelig SF-overflate (jfr. også tegning for makroporøse partikler). 8

9 9 Teori 1.D Partikkelformer av stasjonærfaser 1.D.2. Typer partikler/media : e) Papir (for papirkromatografi fra "naturlig" cellulose) Fiberstruktur for gjennomstrømning av MF. Gir rel. stor "partikkeldiameter" - heller dårlig oppløsningsevne. Fordelingskromatografi: MF-oppholdssted i submikroskopiske områder med amorfe (uordnete, ikke-krystallinske cellulose-polymerkjeder). Journal of Chemical Education, (1986) vol. 63, s. 49 Edge of a piece of paper, fra edukasi.kompasiana.com,

10 10 Teori 1.D Partikkelformer av stasjonærfaser 1.D.2. Typer partikler/media : f) Chromatography on-a-chip - pillar arrays columns : i silisium-etsede kanaler Chromatography on a chip : Kromatografi i mikro-kanaler (som regel rektangulære) etset i glass-, polymer- eller silisiumskiver, kontrollert med Microfluidics -teknikk; pakket med partikler, med monolittmaterialer eller : Med mikrosøyler, litografisk etset direkte ut av silisiumet, og som regel overflate-modifisert for å skape en SF med egnede egenskaper: SEM bilde av pillar array-kanal med kvadratiske søyler. Schematic overview of the different zones of the chip. europeanpharmaceuticalreview.com; d.l Callewaert M. & al., The Analyst 2014 Grinias & Kennedy,Trends Anal.Chem.2015 (online), doi: /j.trac SEM images for an electrochemically anodized pillar with the white rectangular box in (A) indicating the zoomed-in region shown in (B) and the same magnification scheme for (C). The pillar diameter is 5 µm, the pillar height is 18 µm, the interpillar distance is 2.5 µm, the porous shell thickness is 300 nm, and the pore diameter is approximately 30 nm. Used with permission from the Royal Society of Chemistry from ref. [56]. Callewaert M. & al., The Analyst

11 11 Teori 1.D Partikkelformer av stasjonærfaser 1.D.2. Typer partikler/media : Eksempler fra Google.com /pictures Packing of monodisperse spherical PS particles, fra: sigmaaldrich.com, Edge of a TLC plate Irregular silica particles, fra: jahschem.wikispaces.com, Edge of a piece of paper, fra: edukasi.kompasiana.com, Spherical particles mikroporous and flow-trhough (presumably), fra : intechopen.com,

12 12 1.E Mellommolekylære krefter (intermolecular forces) Kreftene som bestemmer affiniteter mellom prøvekomponenter og de kromatografiske fasene (og dermed retensjonen). Vanligvis tiltrekkende, når 2 molekyler nærmer seg fra uendelig avstand, maksimal tiltrekning (ved et minimum for den potensielle energien), og raskt økende til frastøtning ved enda kortere avstand. Avstanden ved maks. tiltrekning er den såkalte van der Waals-avstand eller -radius. 12

13 13 1.E Mellommolekylære krefter 1.E. 1. Van der Waals -krefter "( ) the van der Waals' force (or van der Waals' interaction), named after Dutch scientist Johannes Diderik van der Waals, is the sum of the attractive or repulsive forces between molecules (or between parts of the same molecule) other than those due to covalent bonds, the hydrogen bonds, or the electrostatic interaction of ions with one another or with neutral molecules or charged molecules. The term includes: force between two permanent dipoles (Keesom force) force between a permanent dipole and a corresponding induced dipole (Debye force) force between two instantaneously induced dipoles (London dispersion force). ( ) " ( : visited ) 13

14 14 1.E Mellommolekylære krefter 1.E. 1. Van der Waals -krefter 1. a) Dispersjonskrefter (London, ca. 1930) : Momentan koordinering av elektron-bevegelser (elektron-tettheten) f.eks. mellom prøve-molekyl (analytt-molekyl) og løsningsmiddel (MF el. SF), eller mellom prøve-molekyl (adsorbat-molekyl) og adsorpsjonsmiddel. Er en (kortvarig) vekselvirkning mellom indusert-dipol og (mot-) indusert dipol Representerer svake (tiltrekkende) krefter. Sterkest for store molekyler og molekyler med lett bevegelige elektroner (f.eks. konjugerte π-systemer, m.m.). Polariserbarhet (medfølgende høy evne til dispersjon) henger sammen med (høy) brytningsindeks. Dispersjonskrefter finnes mellom alle stoffer - uavhengig polaritet, m.m., men blir i polare stoffer sterkt dominert ( overdøvet ) av de mye sterkere polare vekselvirkningene. Er de viktigste (eneste) mellommolekylære krefter i upolare stoffer. 14

15 15 1.E Mellommolekylære krefter 1.E. 1. Van der Waals -krefter 1. b) Dipol krefter : b.(i) permanent dipol - permanent dipol interaksjoner (Keesom, 1912): f.eks.: b.(ii) permanent dipol indusert dipol interaksjoner (Debye, 1920): f.eks. 15

16 16 1.E Mellommolekylære krefter 1.E. 1. Van der Waals -krefter 1. b) Dipol krefter : Funksjonelle grupper som gir (permanente) dipoler er : CN (nitrill), NO 2 (nitro), C=O (keton), CHO (aldehyd), COOR (ester), C-halogen, C-OH (hydroksyl), COOH (karboksylsyre), -O- (eter), -NR 2 (amin) (not in systematic order) 16

17 17 1.E Mellommolekylære krefter 1.E. 2. Hydrogenbindinger : f.eks. : rel. sterke bindinger (opp til ca. 20 kj/mol, 5 kcal/mol) per H-bindende gruppe. (her illustrert med silanol-oh (fra silikagel), og alkohol-oh (analytt-eksempel). Hydrogen-bindinger : "Når et proton er direkte bundet til et sterkt elektronegativt atom (f.eks. N, O) kan det, i tillegg, inngå svake bindinger til et annet elektronegativt atom med ensomme elektronpar." Hydrogen-bindinger i alkoholer anslås til kj/mol, 5-10 kcal/mol (mye sterkere enn van der Waals-"bindinger", men (klart) svakere enn de fleste kovalente bindingene). 17

18 18 1.E Mellommolekylære krefter 1.E. 3. Coulomb-krefter : f.eks. : Elektrostatisk interaksjon mellom permanente elektriske Ladninger (ioner, ioniske grupper). Kan bli sterke bindinger (ofte 'problematisk sterkt' innen kromatografi). Kan inneholde delvis kovalente bidrag i bindingen (f.eks. i komplekser). 18

19 19 1.F Isotermer Isotermer beskriver konsentrasjonsforhold i fasefordelingen av et stoff ved konstant temperatur. Deres egenskaper illustreres her for adsorpsjon på polar adsopsjonsmiddel - ("normal fase" i kromatografi), men tilsvarende gjelder for fordeling eller omvendt fase. Grafisk visning av en isoterm: Kurven c SF (= c ads ) = f(c MF ) ved konstant temperatur (=isotermisk). Stigningen er Fordelingskoeffisienten (her adsorpsjonskoeffisienten) K = c ads / c MF Isotermer i kromatografi er oftest ikke-lineær - som regel konveks (som her), særlig i NP-LSC. 19

20 20 1.F Isotermer En konveks isoterm gir en topp med haledannelse - "tailing". Isotermer som registreres i forbindelse med kromatografi kan være : lineære (ideell), konvekse (rel. vanlig, særlig i adsorpsjons-kromatografi) og konkave - motsatt av konveks, fører til "fronting" (særlig ved masse-overbelastning i fordelingskromatografi). 20

21 21 1.F Isotermer Ikke-lineære isotermer er uønsket/problematisk, fordi de gjør fordelingskoeffisientene (og dermed også retensjonsparameterene) mengdeavhengig og mindre reproduserbare, toppene skjeve og vanskeligere kvantifiserbare / detekterbare. isotermer : lineære konveks konkav. topp-profil : Gauss med hale fronting. t R, V R : stabil minker øker med mengde analytt R F : stabil øker minker med mengde analytt 21

22 22 1.F Isotermer Lineær konveks konkav Isotermer RF-verdier (Jfr. Kromatografi 3. utg. 1994, fig 2.1. s. 27 (f.eks.).) Eleuringsprofiler Retensjonsvolum 22

23 23 1.F Isotermer Ikke-lineære isotermer er uønsket/problematisk, Mulig mottiltak Deaktivering = bruk av moderator. Moderator: et sterkt adsorbert stoff (ved normal-fase kromatografi vanligvis vann, evt. et annet polart stoff). Den tilsettes adsorpsjonsmiddelet (kan evt. også være del av MF). Dens oppgave: å utjevne aktiviteten av ulik sterke adsorpsjonssentra: De meget polare (vann-)molekylene adsorberes av de mest aktive sentra - som dermed modereres. Adsorpsjons-sentrenes aktivitet utjevnes: de mest aktive dempes noe, ned på nivået av de svakere. 23

24 24 1.F Isotermer Ikke-lineære isotermer er uønsket/problematisk, Adsorpsjons-sentrenes aktivitet utjevnes: ( ) de mest aktive dempes noe, ned på nivået av de svakre. større linearitet, mindre asymmetri svakere retensjon. 24

25 25 1.F Isotermer Ikke-lineære isotermer er uønsket/problematisk, Mulig mottiltak Deaktivering = bruk av moderator. Den vanlige deaktiveringsprosedyren (moderator tilsettes SF): Adsorpsjonsmiddelet aktiveres fullt (tørkes godt i varmen: timer ved C). en definert mengde moderator (vann) tilsettes etter nedkjøling i tørr atmosfære. Adsorpsjonsmiddelet settes til likevektsinnstilling (noen timer i lukket kar) og er så klart til bruk. Må lagres godt lukket. Definerte mengde tilsatt moderator valgt slik at det kan oppnås bestemte aktivitetsnivå. Den mest kjente skalaen av aktivitetstrinn er fra Brockmann. Aktiviteten bestemmes/kontrolleres v.h.a. retensjonen (R F -verdier) målt i tester med standardfargestoffer. Tilsatt g vann pr. 100 g tørr adsorpsjonsmiddel (akt. 0). Aktiviteten kan variere noe med produsent og evt.produksjonsnummer. 25