Eksamen i emnet KJ 2053; KROMATOGRAFI

Transkript

1 Kandidat-nr.:... 9 NTNU NORGES TEKNISK- NATURVITENSKAPELIGE UNIVERSITET INSTITUTT FOR KJEMI Studieprogr.:... (frivillig) Faglig kontakt under eksamen: Institutt for kjemi; F.-Aman. Rudolf Schmid Tel , (evt. M.: ) MED SVAR-IDEER Eksamen i emnet KJ 2053; KROMATOGRAFI Lørdag 24. mai 2014, kl (4 timer) Bokmål Skriftlig svar på oppgavene 1 8 skal gis på oppgavearkene bak som skal innleveres Hjelpemidler: (bruk ekstra ark om nødvendig) Med rettelser og med tekst-forbedringforslag D Ingen trykte eller håndskrevne hjelpemidler tillatt. Bestemt (godkjent) enkel kalkulator tillatt. Dette oppgavesett består av 16 - seksten - sider : 2 forsider (s. 0-1), 14 sider med 8 oppgaver (s. 2-15). Vektingen av hver (del-)oppgave er oppgitt. Maks. poengtall er 102. Karakterskalaen (100%) tar utgangspunkt i 100 poeng. Det er tillatt å levere besvarelsen på vanlig svarark (med gjennomskriv-kopi). Det skal ikke skrives med blyant på oppgavearkene, fordi du ikke kan ha med deg gjennomslag av svarene dine (ikke får din sikkerhetskopi). Sign... Rudolf Schmid Eksamensansvarlig faglærer Oppgavesettet er kontrollert : Sign. Lise Kvittingene Sensor Sensurdato : Lørdag,

2 Side 2 av 19 Oppgave 1. (5+4+5= 14 p.) Innen kromatografisk teori opererer man med begrepene/forkortelsene: k, α, tr, RS, N. (5 p) a) Hva kalles hver av disse begrepene/forkortelsene; forklar kort hva de uttrykker. k = Retensjonsfaktor (massefordelings-ratio, kapasitetsfaktor) k = t'r/t0 = (tr-t0) / t0 (t0 = tmf) (eller = nx,sf / n X,MF = cx,sf VSF/ c X,MF VMF = KD,X VSF/VMF) (Retensjonsparamneter som er uavhenig av kolonnediomensjon og MF-hastighet) α = tr = RS = N = Separasjonsfaktor (selektivitetsfaktor) α = k2 / k1 Relativ (justert) retensjon av seneste topp i forhold til første topp (av de 2). (teoretisk mulig seprasjon) tr = Retensjonstid (elueringstid) av en topp, et stoff Tid fra applisering av prøven til toppens maksimum detekteres i detektoren (evt. toppens tyngdepunkt). (kromatografisk) Oppløsningsevne. RS = Δt / ½ (wb,1 + wb,2 ) Forholdstall av toppavstand til gjennomsnittelig basisbredde (av 2 topper). Beskriver hvor nær toppene er i f. t. deres bredde - faktisk praktisk mulig seprasjonsevne ALTERNATIV BESKR.: som funksjon an k α og N ; ikke full pott, maks. ca. 80%: RS = ¼ ((α 1) / α) N ½ (k / (k+1)) = ¼ ((α 1) / α) Neff ½. el. lign. platetall (antall teoretiske plater) av en kolonne N = (tr / σ ) 2 = 5,54 (tr / wh ) 2 = 16 (tr / wb ) 2 N uttrykker effektiviteten (= separasjonsevnen) av et gitt kromatografisk system (f.eks. en kolonne v. gitte betingelser). 1.b Hvilke mål for kolonneeffektivitet kjenner du: ta med navn (symbol) og hvordan (4 p) du beregner/bestemmer det basert på et kromatogram? Navn - Platetall - effektiv platetall - Platehøyde (Høydeekvivalent av en teoretisk plate) - Effektiv platehøyde (Høydeekviv. t.en effektiv teor.plate) Symbol Beskrivelse/Formel N = s.o. Neff = = (t'r / σ ) 2 = 5,54 ((tr -t0)/ wh ) 2 (evt. = N (k/(1+k)) 2 platetall utregnet på justert retensjon (t'r el. V'R ) uttrykker spredning i f.t. oppholdstiden i SF. H = = L/N L=kol.-lengde (H jo minder jo bedre) Heff = = L/Neff = H ((1+k)/k) 2 L=kol.-lengde - redusert platehøyde - Separasjonstall ("Trennzahl") - Toppkapasitet (Peak capacity) Ikke : RS, As, ikke for vdeem.- ledd (fordi spørsm. gjelder eksperim. kromatogram. h SN = TZ= n= = H /dp (pakningskvalitets-parameter) = [ (tr(n) - tr( n-1)) / (wh(n) + wh(n-1)) ] -1 (n og n-1 er n-alkan-homologer : n-cn og n-cn-1 ) Antall topper som kan separeres med RS = 1 innenfor et gitt tidsintervall ("innenfor et kromatogram"). Poeng-givning: ca. 0,4p for navn, ca. 0,2p for symbol, ca. 0,4p for formel relatert til et kromatogram (mindre for andre relasjoner) Effektive param gir halvparten når vanlige er nevnte.

3 Side 3 av 19 1.c (i) Hva er minimumsverdien for α og RS? (1 p) 1,000 < α 0. < RS (1 p) (ii) Hvilke av de 5 begrepene i 1.a (over) angir kun egenskapene ved kolonna uavhengig av substansene som kromatograferes? bare platetallet, N er (nesten) substans-uavhengig. (1 p) (iii) Hvilke av de 5 parametrene over (i 1.a) kan økes for å gi en økning av RS? RS = (1/4) N ½ x k/(k+1) x (α -1)/ α N, k og α - for alle 3: jo større desto større oppløsningsevne. (1 p) (iv) Hva er sammenhengen mellom k, tr og t0? k = (tr-t0) / t0 (der t0 = tmf ) og tr = t0 (k+1) (1 p) (v) Skisser en figur som illustrerer RS = 1,5 (husk benevning av aksene). det. sign, (sånn omtrent) tr el. VR

4 Side 4 av 19 Oppgave 2. (12+4= 16 p) 2.a Indikér hvorvidt følgende kromatografiske metoder er (i) hhv. fordelings- eller adsorpsjons-kromatografi og (ii) GLC, GSC, LLC eller LSC: (12 p) 9? p Kromatografisk metode i) (enten/eller) fordeling / adsorpsjon Papirkromatografi (PC) Ford. Tynnsjikt-kro. (TLC, silicagel) Eksklusjonskro. (SEC, gelpermeasjonskro., PSV-DVB-kol., THF) HPLC (silicagel 60, acetonitril:vann 80:20) Gasskrom.(pakket kolonne, stasjonær fase: PDMS ('metylsiloxan')) Gasskrom. (PLOT-kolonne, stasjonær fase: zeolitt-molekulær-sikt) Fastfaseekstraksjon (SPE, oktadekylsilika: 1.) 50% metanol 2.) etylacetat) Ads. Ford. Ford. evt. Ads. Ford. Ads. Ford. el. Ads. ii) (enten/eller/ / ) GLC/GSC/LLC/LSC LLC LSC LLC LLC (HILIC) GLC GSC 0,5p 0,5p 0,5p 0,5p LLC el. LSC (RP-LC) 2.b (i) Hvilke fordeler har planar kromatografi (f.eks. TLC) i forhold til kolonnekromatografi (HPLC)? (2 p) o Paralleleprosessering av flere appliseringer/flekker, i én analyse (tidsbesparende) o Bruker (vanligvis) mye mindre løsningsmidler pr analyse ("grønnere"). o Trenger mye mindre for-rensing av prøve / vask av kolonne, fordi plata er bruk-og-kast - o TLC kan gi et mer komplett bilde av prøven (urenset) når ikke noen komponenter må fjernes på forhånd for å beskytte kolonna o Finnes som "quick, dirty and cheap"-versjon (kvalitativt, som på lab.-øvingen) ikke i HPLC med flere? (Og "High-tech"-HPLC kan ha lignende effektivitet og det.-grenser som HPLC). (2 p) (ii) Beskriv kort prinsipp og typiske anvendelse av (Det skal være kort - elementær) ENTEN : (Bio )affinitetskromatografi (BAC) (bok, s. 78) Det baserer seg på selektive ikke-kovalente bindinger mellom stoffer som "passer til hverandre" som har en "spesiell tiltrekning". I BAC er da det ene stoff (=ligand) immobilisert på et kro. "bærematerial", matriks, (de 2 tilsammen utgjør SF'en) mens analytten tilføres i en MF som favoriserer god binding mellom ligand og aktuell analytt. Øvrige prøvekomponenter (ikke spesifikt retarderte) elueres med/nær "dødvolumet". Deretter elueres analytten etter en endring i MF, som svekker analytt-ligandbindingen. (Noe kortere svar, som har med det viktigste godtas også som ok.) ELLER : Hydrofob(isk) interaksjonskromatografi (HIC). (bok, s. 73)

5 Side 5 av 19 HIC = omvendt fase adsorpsjon-kro. = LSC: Hydrofobiske partikler (noe svakere enn typiske RP-LCmaterialer) brukes i kombinasjon med sterkt polare MF (ofte vandige saltløsninger). Dermed blir selv svakt hydrofobiske analytter retardert ved "hydrofobiske interaksjoner" med SF. Brukes mest på proteiner, fordi vandige saltløsninger er skånsomme ("nær fysiologiske") og de hydrofobiske interaksjonene er ikke alt for kraftige - proteinene overlever uten denaturering. (HIC finnes som lavt- og høyttrykksversjon) ELLER : Isoelektrisk fokusering (IEF) (bok, s. 134 & 142) IEF: Elektroforese-teknikk (både vanlig og kapillær) for sep. av amfotære analytter (f.eks. proteiner, peptider, aminosyrer). Separerer etter pi (isoelektrisk punkt. Det skapes en stasjonær jevn ph-gradient i gelen/kapillæren i en stasjonær spesial-iefelektrolytt (d.v.s. uten elektrosooosmose aktivtet). Elektroforese med lav ph ved pluss-pol /anode og høy ph ved minus-pol/katode. Da trekkes protonerte ioner mot basisk/høy ph ved katoden deprotoneres i økende ph inntil de er nøytrale ved pi og blir stående der. Det motsatte fra høy ph -anioniske analytter som trekkes mot anoden ved lav ph inntil de er protonert til nøytralitet og blir stillestående ved (fokusert til) ph = pi. Prøven kan appliseres hvor som helst (f.eks. oppløst i bufferen) den fokuseres uansett til ph = pi-sted. Ved klassisk el.-for. deteksjon på fokuseringssted; ved kapillæer-ief: etter fokusering transporteres gradeienten forbi detektoren (enten elektroforese-basert eller hydrodynamisk (pumping/ suging)

6 Side 6 av 19 Oppgave 3. (5 p) (2p) En polystyren-oligomer-blanding (poly-fenyleten), polymeriseringsgrad n= 1 -? ca.8 (> ca. 5-8) ekstrahert fra polystyren-næringsmiddelforpakning ønskes analysert: følgende kromatografi-betingelser er foreslått av en noe usikker sommervikar: kapillærkolonne (10 m x 0,1mm) med siloksanpolymer-film (95% metyl:5% fenyl, kryssbundet); mobil fase: CO2 med trykk økende fra 3 bar til 20 bar, temperatur økende fra 50 til 250 C; flammeioniseringsdetektor (ved atmosfæretrykk) plassert etter mobilfase-restriktoren). Litt info om oligo-styrener: styren: bp. 145 C / mp. -30 C (experim.); (en) dimer: bp. ca. 300 C / mp. ca. 40 C (estimert), (en) trimer): bp. ca C / mp. ca. 140 C (estimert); (en nær slektn. til) tetramer: bp. 250 C (v Torr, experim.); ingen data for høyere oligomerer. (i) Intensjonene er å få analysert prøvene v.h.a. superkritisk fluid-kromatografi, SFC: Synes du det er en god ide for denne prøvetypen (polystyren-oligomerer)? Grunngi kort din vurdering (vurder alternativene). God ide (et av eksemplene i forelesningen (& i gammelboken)): Prøven har for høy kokepunkt for GC for de høyeste oligomerene, Og for HPLC trolig for dårlig oppløsning blant de høyeste oligomerene. (kanskje med en god SEC-kolonne?) SFC kan utvide området mot høyere oligomerer v.h.a. solvatisering av polystyrenmolekylene i mobilfasen ved det superkritiske fluidet - langt utover det GC-kan (der MF ikke kan solvatisere overhodet), og oktamerer (og evt. høyere) kan eleures fordi det løser seg i MF selv om damptrykket ved den aktuelle temp ville vært for lavt (v. GC). (1 p) (ii) Er valg av fluid (CO2, Tc=31 C / pc= 73 bar) og betingelsene i den foreslåtte fluidgradienten de riktige for å få gjennomført den planlagte superkritisk fluidkromatografien? Ikke bra : betingelsene opererer med trykk UNDER det kritiske trykket på 73 bar. d.v.s. CO 2 foreligger da som gass, ikke superkritisk fluid, under hele analysen og som nevnt ovenfor:gasskromatografi kan ikke eluere de høyeste oligomerne. For at dette kan fungere må trykket økes OVER 73 bar (helst hele tiden, evt. i det minste mot slutten av analysen). (1 p) (iii) Synes du det er valgt en velegnet detektor (FID), og at dens plassering i systemet er riktig? (Grunngi kort.) Deteksjon kan fungere med FID (GC-lignende betingelser ), fordi analyttene er hydrokarbonforbindelser som gir god følsomhet på FID. Som GC-detektor skal FID'en arbeide med gass, og fungere ved tilnærmet atmosfæretrykk, så fluidet må avspennes fra høyt trykk (overkritisk) ved kolonneutgangen til trykk der MF er i gass-form før detektoren: Det foreslåtte oppsettet er korrekt. (1 p) (iv) UV-detektorer brukes ofte ved SFC: er den velegnet til denne typen prøver her? Hvor ville du plassert restriktoren ved bruk av en UV-detektor? UV-detektoren kunne fungert bra her, fordi vi analyserer aromatiske forbindelser, som typisk har god absorpsjon i UV-området. UV-D er en detektor beregnet på væsker - foretrekker høy tetthet av MF i detektoren. Da må man måle under trykk, slik at CO 2 er enten superkritisk ennå )temp over 31 C, eller væske (under 31 C). Da skal restriktoren være plassert etter detektoren (og UV-cellen må kunne tåle høyt trykk).

7 Side 7 av 19 Oppgave 4. (5+6+6=17 p + 1 bonus)) 4.a (i) Hva er, og hvor forekommer, stillestående mobil fase, smf? (Svar kort og () generelt.) Stillestående MF forekommer i pakkede kolonner med porøse partikler (eller i mikroporer i monolitter / flow-trough-partikler). Det er MF (væske eller gass eller fluid) som ikke beveger seg i MF-strømningsretningen (skjermes fra strømningen av partikkelmaterialet), men ikke har annen affinitet/ selektivitet for analyttene en MF. Den er en ren transportstrekning (massetransferbidrag) for analyttene før de når fram SFen inne i partikkelen. Stillestående MF forekommer ikke i åpne kapillærer og ved kompakte partikler (og i gelelektroforese,der normalt det ikee forekommer mobil fase ). (Spesialtilfelle i SEC: Stillestående MF i SEC-kolonner er selve SF.) (ii) Hvilke faktorer (fysiske, fysikalske) bestemmer bidraget som stillestående (2p) mobil fase, smf, gir til sonespredningen i en kromatografisk kolonne? HsMF = csmf dp 2 u / DsMF d P = partikkeldiameter (eller dybde av porøst lag for core/shell partikler) bestemmer diffusjonslengden for analytten mellom SF og MF: viktigst parameter (i annen potens); u = MF-hastighet: større hastighet gir større spredning (større avstander mellom ulike analyttmolekyler) ved ellers fastlagt smf-diffusjonstid; D smf = diffusjonskonstanten for analytten i MF. raskere diffusjon reduserer masstransferbidraget fra smf. (2+) (iii) Hva har du å si om stillestående MF i : Teknikk finnes smf? / - med TLC (silikagel) SEC (gelkromatografi) RP-LC med overflateporøse partikler (core/shell, pellicular, particles) Kapillær-GLC Ionebytter-kromatografi på xerogel- (bløte) ionebytterpartilker Sone elektroforese, evt - men trenger forklaring påkrevd kommentar / forklaring Det er porøse partikler i sjiktet på det kompakte underalget, og i porestrukturen til disse partikler er den stillestående MF. stillestående MF fungerer/ er selve SF i SEC! SMF i det porøse lagetav partikkelen: Det gir kortere diff.-lengder enn partikkeldiameteren tilsier, fordi det porøse laget er tynnere enn halve d P : kortere maks. diffusjonslengde enn i en helporøs partikkel av samme størrelse. finnes ingen smf i WCOT (litt men neglisjerbar/ininmalt i PLOT/SCOT, også fordi MF er gass og diffusjon i gass er raskt). I mikroporene til xerogelen Bonus 0,5 p Finnes ingen smf Vanskelig å defiiner noe som Mobil fase, om elektrolytten defineres som den i kommentar (evt. p.g.a.eof) kan delvis riktig svar vurderes Bonus 0,5 p

8 Side 8 av 19 4.b (i) Vis en representativ del-struktur av overflaten av (ubehandlet) silikagel. (2p) Evt. benevn: siloksan-bru silanol-gruppe, (2p) (ii) Hva er den mest benyttede stasjonærfasen (SF) ved omvendt fase (RP) HPLC, angi spesifikt navn og representativ delstruktur. eller (best, og med minst en uderivatisert OH, end-capping ikke påkrevd) H 3 C n-c O Si H O Si O CH 3 O O H Si O H 3 C O CH 3 Si O Si O CH 3 O O Si O H O O Si CH 3 Si O O n-c 18 H 37 CH 3 O Si O O H eller (ikke helt full pott, f.eks. 1,75?) Silika O Si(R ) 2 n-c 18 H 37 (R er oftest metyl)

9 Side 9 av 19 (2p) (iii) Skisser strukturen (og angi navn) til den stasjonære fasen vi brukte i våre gasskromatografi forsøk på lab.-øvingene (og som er den mest vanlige SF i GC). For eksempel en metyl-silikon : PDMS = PolyDiMetylSiloksan (også PolyDiMetylSilikon ) (Akseptert som "godt nok for full pott) H CH 3 C O O 3 Si Si n Si CH 3 H 3 C CH3 H 3 C CH CH 3 3 Eller, litt mer korrekt/detaljert med 95 % m,/ 5% n i tilfeldig fordeling i kjeden (jfr. Equity-5, DB-5 ) (Se bok s )

10 Side 10 av 19 4.c (i) Beskriv kort hvilke typer intermolekylære krefter som virker mellom speciene molekyler, atomer, ioner) ved kromatografi (forklar kort, og/el. tegn eksempler). (2p) - dispersjons-krefter: svak,interaksjon, ved momentan gjensidig tilpassede elektrontetthet-forflyttinger som gir littegrann tiltrekning. mest betydningsfull i upolare stoffer f.eks. hydrokarboner. - dipol-interaksjoner, Både : : dipol-interaksjoner, mellom to permanente dipoler som oreinterere seg i motsatt polaritet og gir tiltrekning Og: : dipol-interaksjoner, mellom en permanent dipol og et polariserbart system (f.eks. aromat, stort atom) som midlertidig blir polarisert av den permanente dipolen til å lage en ad-hoc-dipol av motsatt orientering - som skaper dipol-dipol-tiltrekning. - hydrogenbindinger, mellom et "surt hydrogen" (H bundet til elektronegativt heteroatom) og et heteroatom med fri elektronpar. - elektrostatiske interaksjoner (også syre/base og kompleksdannelse) (2 3p) (ii) Nevn de dominerende intermolekylære vekselvirkningene i følgende faser (mellom analyt med MF og/eller SF) og ranger vekselvirkningene etter styrke (fra svakest til sterkest): A i GSC-(MF) gassfasen: Ingen interaksjoner i en (ideal) gass. B i ionebytter-sf: elektrostatiske interaksjonser og evt. kompleksdannelse C i RP(C18)-LC-SF: dispersjons-krefter med C18-kjedene med rest.silanolgruppene: dipol-interaksjoner og evt. hydrogenbindinger, D i NP-LSC (silika)-sf: hydrogenbindinger, viktige dipol-interaksjoner, viktig når H-bindinger ikke finnes Rangering : A < C < D < B <

11 Side 11 av 19 () (iii) ENTEN: Hva er ofte rollen til vann i den mobile fasen ved RP-HPLC? fungerer som regulator av elueringsstyrken (fortynner av organiske løsningsmidler) for å optimalisere retensjon (økte vanntilsats betyr svakere elueringsstyrke - saktere eluering). (evt. som løsningsmiddel og ph-retgulerende medium, for buffere og uorganiske salter (f.eks. selektiviteskontrollerende).) ELLER: Hva er de tre egenskapene som HPLC-mobilfaser karakteriseres med / klassifiseres etter i 'Snyders selektivitets-trekant'. De tre egenskapene er: - dipol-bindings-evne (målt ved xn, n for nitrometan ) - hydrogendonor-evne (målt ved xd, d for dioksan) - hydrogenakseptor-evne (målt ved xe ), e for etanol) Oppgave 5. (2+3=5p) 5.a ENTEN: Beskriv de to injeksjonsalternativene som finnes ved (manuell) bruk (2p.) av en ventil-injektor i HPLC. (alternativene er begrunnet i at loopen aldri bør brukes til applisering tilsvarende nominell volum av loopen, fordi loop -fylling foregår med hydrodynamisk - med parabolsk flowe-profil.) Parsiell loop-fylling (mindre enn ca. halv loop-volum). Volum (og nøyaktighet) bestemt av sprøyte-doseringen/redskapet som doserer volumet inn i loopen. Full loop : Loopen skylles med minst 2-3 nominelle loop volum prøve for å få nærmest mulig 100% prøve i loopen, og få skylt ut mest mulig av annen væske som var i loopn fra før. Faktisk injisert volum bestemmes av loopen (nominell volum) og (i mindre) grad skylle-graden. Reproduserbarhet som regel bra ved lik "skylle"- prosedyre. ELLER: fortsetter på neste side

12 Side 12 av 19 ELLER: Hva er høytrykksblanding, og hva er lavtrykksblanding ved HPLC? Ulike metoder for å blande løsningsmidler til HPLC, f.eks. til gradienter: - høytrykksblanding: Bruker flere (typisk 2) pumper som pumper hver sitt løsningsmiddel. Pumpehastighet er koordinert for å gi ønsket blandingsforhold. Blandingen skjer under høyt trykk etter pumpehodene. Det er lite død-volum fra blandingspunktet til kolonnen, bl.a. lite mikser-volum - lavtrykksblanding: Bruker kun en pumpe: Løsningsmidlene blandes fra hvert sitt reservoar v.h.a. en tidsstyrt valgventil som sender de aktuelle løsningsmidlene som korte porsjoner/"plugger" etter hverandre fra ventilen til pumpen (eller mikseren) i et (tids-)styrt volumforhold. Lett og billig å blande flere lsm. om ventilen og den kontroller tillater. viktig(ere) med god miksing, utsatt for utgassing av lsm. ved blanding ved atmosfæretrykk (før pumpen) og rel. stort dødvolum mellom blandingspunkt og kolonnen (lang "gradient-forsinkelse" på kolonna). 5.b (i) Tegn en representativ del-(molekyl-)struktur for den mestbrukte sterke anionbytter-funksjonen. (.) R-N + (R 3) R = metyl, som regel (.) (.) (ii) Tegn en representativ del-(molekyl-)struktur for den mestbrukte sterke kationbytter-funksjonen. R-SO2O - (iii) På hvikle måter (nevn 2) kan du øke mobilfase-styrken for ionebytterkromatografi på en sterk kationbytter (ved konstant ph i MF)? - øke ionestyrken til MF/elektrolytten, øker konkurransen av MF ioner med analyttionene om de fast ionen på ionebytteren - reduserer retensjonen. - skifte til en MF med et motion med høyere affinintet til det aktuelle faste ionet - til "buffer.

13 Side 13 av 19 Oppgave 6. (6+6= 12 p + 1 bonusp.) 6.a Nedenforstående gasskromatogram viser alle topper som elueres i separasjonen (6p.) av en blanding av hydrokarboner på en GLC-spesialkolonne. Peak select. solvents bp.[ C] 1 n-hexane 69 2 n-heptane 98 3 n-octane n-nonane n-decane benzene 78 7 toluene ethylbenzene 136 (fra Restek-katalogen 2011/12, s.654) 10 isopropylbennzene 153 (2p.) (i) Er dette kromatogram fra en kapillær-glc-kolonne eller en pakket kolonne? Gi gjerne en kort begrunnelse. Det er sann (faktisk) en pakket kolonne mnført med kromatogrammene på lab.-øvingene er toppen ganske brede (husk vår analyse av oktan, nonan og dekan og bredden av toppene der rel. til avstanden dem imellom). I tvil? : estimer N for topp 11 (eller 7), evt. TZ for n-alkanene (f.eks. 4 & 5) For N: N for topp 11 = ca , som er ca. 10% av en anstendig WCOT-kolonne, men passer en bra pakket kolonne. (.) (.) (.) (ii) Er analysen isotermisk eller (lineær) temperatur-programmert? Grunngi svaret. Det er mest sannsynligvis en isotermisk analyse. Toppbredden øker jevnt utover (tydlig ikke minst i den homologe alkan-serien). (iii) Er stasjonærfasen upolar eller polar? Gi en kort begrunnelse. At de helt upolare alkanene (selv de mye mer tungtflykte) kommer klart før de lit mindre upolare aromatene (som gruppe) tyder på at kolonnen separere ikke bare etter kokepunkt (som er hovedregelen for upolare SF, men kraftig etter polaritet - som indikerer en (sterkt) polar SF. (iv) Prøven viser 11 topper, men inneholder 12 stoffer, d.v.s. alle 3 xylen-isomerene (isomere dimetylbenzenene) i tillegg til de 9 som er listet opp ved siden av figuren. Det vises altså en "(aromatisk) topp" for lite i kromatogrammet. Basert på kromatogrammet, forklar hva som skjer - hvor 'den savnede' kunne være. De 3 xylenene må være i toppene 9 opg 11,alle andre er tilordnet entydig til andre stoffer. topp 11 er i størrelse og bredde (ekstrapolert økende toppbredde) omtrent som ventet smlgt. med de identifiserte toppene. Topp 9 peker seg ut som for stor (antatt at alle stoffer har omtrent lik opførsel. den er nesten dobbelt så høyt, og dens bredde (sjekket ve w ½ er faktisk litt større enn den etterfølgende topp 10, som egentlig skull vært bredere. Dermed er det sannsynlig at 2 xylener kommer ved nesten samme tid på litt over 10 min og danner én topp, den for høye og litt for brede topp 9.

14 Side 14 av 19 (.) (v) Beskriv kort fremgangsmåten du ville brukt for sikkert å identifisere de 3 xylenene i kromatogrammet (v.h.a. kromatografi-metodikk, uten spektroskopi). Kvalitativ ekstern standard analyse: En skaffer minst 2 av de tre (helst alle 3) xylenisomerene som standardstoffer (rene, identifiserte). En analyserer dem under identiske betingelser med prøven og ved sammenligning av retensjonstidene, evt. også ved ko-injeksjon, finner en ut hvilket isomer som tilvarer hvilken topp i den ukjente prøven. 6.b Deteksjonen ved ovenstående kromatogram (i 6.a) var v.h.a. FID. (2p) (i) Gi det fulle navnet, og en kort forklaring (gjerne med skjematisk figur), hvordan FID'en fungerer. Se boken s (Ch ) - (ii) Kunne bruk av GC-MS (koblet gasskromatografi/massespektrometri) med Elektronionisering (EI) gjort identifisering av den savnede toppen i figuren for 6.a enklere? (Bonus ) Egentlig ikke: det er lett å skille alkanene fra aromatene, og homologene i seriene også (d.v.s. topppene 1-5, 6 & 10). Derimot er EI rel. dårlig til å skille stereoisomerer, så xylenene har omtrent identiske massespektra (dessuten her også etylbenzen). EI-MS alene ville dermed ikke hjulpet å finne ut hvilket isomer som tilhører hvilken xylentop. Det avgjørende bir da retensjonstidene og dem får vi her også fra FID'en alene. (2p) (2p) (iii) Gruppe-separasjonen i figuren til 6. a (gruppen flyktige alifater før gruppen aromater) er bare mulig med helt spesielle GC-kolonner. For å kunne analysere de to gruppene separat på vanlige GC-kolonner måtte man evt. prøve en gruppe-separasjon før GC-analysen. Kunne SPE (fastfase-separasjon) vært en mulighet? Grunngi, og hvis ja, forklar hvilken type SPE-separasjon ('SPE-kromatografi') du ville prøvd (hvilken "sorbent", og hvorfor de(n))? Tre HOVED-metoder i SPE: (i) Normalfase-adsorpsjon. (ii) Omvendt fase, (iii) ionebytter. Separasjonen måtte være etter polaritet (se. 6.a.(iii)), der er kanskje normalfaseadsorpsjonskromatografi (LSC) det mest lovende, f.eks. silikagel, (evt. cyanoalkyl?) e.l. For RP-LC og særlig for IEC er løselighet i MF (som er polar) et problem, muligens er hydrofobisitet-/polaritet-separasjonen på RP mindre klar ann for NP. Analysen måtte da trolig foretas av de aktuelle fraksjonene fra SPE-separasjonen direkte, og det måtte også brukes enten et veldig flykttig løsningsmiddel, eller et ganske tungtflyktig ett, for at det enten eluerer før våre aktuelle analyttene i gasskromatogrammet eller godt etter (eller ikke overhodet) - fordi våre analytter alle tilhører grovt sett gruppe løsningsmidler selv. (iv) Når det anvendes fastfase-ekstraksjon (SPE, Solid Phase Extraction), hvilke to fordeler kan særlig oppnås med det i forhold til væske-væske ekstraksjon? - tidsforbruk redusert og - løsningsmiddelforbruk redusert - (evt. høyere utbytte/gjenvinning + evt. bedre reproduserbarhet)

15 Side 15 av 19 Oppgave 7. (2+5 = 7 p.) 7.a) For 4 av stoffene, toppene 1, 5, 6 og 10, eluert i kromatogrammet nedenfor er tebuthiron 1, diuron 5, propanil 6, diflubenzuron 10. de ikke-tilordnede molekylstrukturene A D (med deres trivialnavn) oppgitte her: propanil diflubenzuron diuron tebuthiron. (fra Restek-katalogen 2011/12, s.712) Navn-tabellen bør tas ut for å hindre fordel for de som kan korrelere navnene med strukturene. NY-utgave av figur kan flyttes inn og -tilpasses (2p) (i) Forsøk å tilordne navn/molekylstrukturer A - D til navn/topp 1, 5, 6 og 10, basert på den observerte relative retensjonen på oktadekylsilika-kolonnen i kromato-grammet vist ovenfor. Grunngi valgene dine med utgangspunkt i strukturene (de ulike funksjonelle gruppene). Topp 1 = D topp 5 = C topp 6 = A topp 10 = B Topp1 tebuthiron mest polar analytt -- stoff D :

16 Side 16 av 19 heteroaromatisk ring i D, er mer polar en fenylringene i de øvrige A-C; ganske polar ureagruppe (med en sek., en tert. nitrogen), upolar t-butylgruppe kompenserer for lite. Topp 5 diuron nest mest polar analytt -- stoff C : halogensubstituert fenylring i C (som i A og B) men med en polar ureagruppe (mer polar enn amidgruppen i A; ureagruppe i B er med to sek. N trolig mer polar enn den i C, men dette kompenseres av den rel. store upolare ekstra fenylgruppen i B, som gjør B mindre polar enn C. Topp 6 propanil 3.-mest (nest minst) polar analytt -- stoff A : halogensubstituert fenylring (som B og C) men med en noe mindre polar amid-gruppe (med et sek. N) enn urea-funksjonen i C. Topp 10 propanil 3.-mest (nest minst) polar analytt -- stoff B : 2 rel upolare halogensubstituerte fenylringer overkompenserer og delvis skjermer den antaatt mest polare av urea-gruppene (med to sek.nitrogen) i "samlingen" her. (Rekkefølgen på A og B er kanskje mest vanskelig å fastslå). Obs. alle Nitrogen'ene er del av et konjugert system (urea og amid) og dermed ikke basiske, untatt ring-n'ene i 5-ringen. 7.b (i) Hva skjer mellom ca. 11 og 17 min i kromatogrammet, når basislinjen synker? () Observer eluerings-gradient-programmet som er gitt i figuren Conditions / Mobile phase : Fra 8-14 min er en lineær gradient for MF-sammensetning, som lett kan produsere basislinjedrift (litt endret absorbanse i UV detektoren etter hvert som MF sammensetningen endrer seg. Endringen er noe forsinket (ca. 3 min) - som er ikke overraskende fordi MFendringen må flyttes fra blandepunktet via døvolumina og selve kolonnevolum fram til detektor-cellen hvor den detekteres, noe som her åpenbart tar ca. 2,5 min. MF-komp. B- ser ut til å være litt mer gjennomsiktig ved 254nm enn A. () (ii) Hva er årsaken til at analysen starter med en 8 minutters isokratisk periode (med 40 % acetonitril i bufferen) før gradienten starter? Isokratisk analyse tillater høyest effektivitet. Vi ser at etter 9 min så greier metoden såvidt å få (omtrent) basislinjeseparert toppene 6 og 7 (samtidig får vi også grei separasjon på alle tidligere topper) så den 1. isokratiske perioden er valgt vel (litt mindre enn 40% B hadde kanskje gitt litt mer separasjon men også tatt en god del mer tid, litt mer enn 40% B hadde kanskje spart tid, men gitt dårligere separsjon av 6 og 7, som er kritisk. () (bonus) (iii) Hvilken av de 3 toppene, 3, 6 og10, gir det høyeste, korrekt bestemte platetallet i denne analysen? Grunngi ditt valg (målinger eller beregninger skulle ikke trenges). Topp 6 : Innenfor en iso-periode (iso-kratisk i LC) så har alltid den siste toppen som elueres det høyeste platetallet N. Her gir topp 6 høyere N enn topp 3. Om vi prøver å regne platetall "rett-fram" for topp 10 så ville den gitt et enda mye bedre tall, men det blir ikke en gyldig verdi, fordi eluering av topp 10 inkluderer en litt komplisert gradient, og da kan vi ikke bruke den vanlige, for oss kjentte, måten å beregne N! Høyeste teoretisk korrekte utregnbare platetall har da altså topp 6. (2p) (iv) Er det mulig/lov a regne ut en, korrekt bestemt, separasjonsfaktor, α, for toppene 4 og 5 i kromatogrammet i spørsmål 7.a? Hvis svaret er ja, gi et

17 Side 17 av 19 anslag for verdien av α4,5 (skriv formlene med symbol og med de målte eller anslåtte tall). : Det foregår i den isokratiske perioden (40% B) ifra starten og kan derfor brukes til slike beregninger. α = k5 / k4 = (tr,5 -t0 / t0 ) / (tr,4 -t0 / t0) t0 antas her å være ved dumpen i basislinjen (ca. 1 min), tr,4 ved ca. 5.5 min og tr,6 ved ca. 6,4 min. α = ((6,4-1) / 1) / ((5,5-1) / 1) = 5,4 / 4,5 = 1,20

18 Side 18 av 19 Oppgave 8. (25p) Gi / svar pluss (nødvendig!) kort forklaring ("fordi "): (1 poeng pr. riktig og grunngitt svar : uten forklaring ansees ja/nei som potensielt tipping og telles som følger : riktig svar gir + 0,2 poeng, feil svar gir -0,2 poeng (trekk!). 1. Topp A eluerer etter 1,0min, likt med t0= tmf og topp B ved 3,0min. Da er separasjonsfaktoren = 2,0. 2. For Hydrofilisk interaksjonskromatografi (HILIC) må partikkeloverflaten være hydrofob(isk). 3. Ved Micellær elektrokinetisk kromatografi (MEKC) separeres de typiske analyttene, uorganiske ioner, etter deres ioneradius. 4. En sterk basisk anionbytter er ikke basisk i det hele tatt. 5. Silika-RP-kolonner tåler mye bedre basiske mobilfaser enn RP-kolonner laget av organiske polymerpartikler. 6. Fordelingskoeffisienten for viktige analytter i eksklusjonskromatografi (SEC) ønskes å være mindre enn 1,0. 7. Gelpermeasjonskromatografi er eksklusjonskromatografi, SEC. 8. Aluminiumoksid-TLC-plater brukes typisk for omvendt fase TLCanalyser 9. Eddy-diffusjonene forekommer ikke i vanlig kapillærelektroforese (CZE). 10. I ionekromatografi brukes normalt en elektrisk ledningsevne-detektor som universell detektor for (alle) ioner. 11. I selektivitetskurver av SEC-gelmaterialer øker Kav med økende molekylmassen av analyttene. 12. PLOT-kolonner er kapillærkolonner til bruk for GSC. /, fordi. Når A eluerer likt med MF er dens retensjonsfaktor, per definisjon null. Dermed blir (=k 2 /k 1 ), udefinert,- ikke 0, når k 1 = 0 (uansett verdi av k 2 ). Overflaten må være polar for å tiltrekke den polare komp. i MF (vann) og danne en polar væskefilm oppå overflaten som kan fungere som SF. MEKC brukes ikke for uorganiske ioner. MEKC er for (mellompolare nøytrale analytter (like-vektsfordeling mellom polar elektrolytt og det hydrofobe indre til micellene). En sterkt basisk anionbytter er et kvarternært ammonium-ion. Det har ingen mulighet til å lage bindinger med protoner, d.v.s. abstrahere protoner fra syrer, og er derfor ingen base i kjemisk forstand. Silikagel dekomponeres raskt i moderat til sterkt basisk miljø, (Selve silikagelen går i oppløsning.)mange org. polymerer derimot er (mye) mer motsandsdyktige mot baser (f.eks. PS/DVB) En koeff. over 1,0 betyr at retensjonen/separasjonen ikke er basert på ren eksklusjonsprosess (som begrenser K til maks. 1,0). K over 1,0 betyr adsorpsjon (polar el. hydrofob), ionebytting. Gelpermeasjons-kromatografi (GPC) er navnet på SEC med upolare eluenter, særlig brukt på organiske syntetiske polymerer (ikke-vannløselige). "Aloks" er et polart uorganisk faststoff (som silika) og egnet til NORMAL-fase TLC. (Derivatisering til RP er ikke enkel og ikke i bruk for TLC). CZE har ingen pakningsmaterial - ingen ulike veivalg gjennomm pakningen - ingen Eddy-diffusjon. Ionekromatografi bruker suppressorer (kol. membran) spesifikt for å tillate bruk av elektrisk ledningsevne-det.(som er universell for alle ioner). Omvendt: K av er 0 for store (eksludert fra SF), og ca. 1,0 for små molekyler. PLOT=Porøst lag av faststoff på kapillær-kolonneveggen = adsorpsjonsmiddel GSC; ikke tilsatt væskefase for GLC (da hadde det vært SCOT-kol.) fortsetter på neste side

19 Side 19 av 19 (Oppgave 8 fortsetter) Gi / svar pluss (nødvendig!) kort forklaring ("fordi "): (1 poeng pr. riktig og grunngitt svar: uten forklaring ansees ja/nei som potensielt tipping og telles som følger : riktig svar gir + 0,2 poeng, feil svar gir -0,2 poeng (trekk!). 13. Enantiomer-fordelingen av kirale stoffer kan bestemmes med akiral kromatografi, om analytten kan derivatiseres med et rent kiralt reagens. 14. Ved kapillærelektroforese (CE) vil ioner alltid vandre/migrere mot elektroden med motsatt ladning på grunn av elektrostatisk tiltrekning. 15. Ved split-injeksjon ved kapillær-gc er løsningsmiddeleffekten (Solvent effect) viktig for å få smale topper. 16. Carbowax er en gruppe GLC-SF'er, som består av polyetylenglykoler som er vurdert som polare i GLC. 17. Ved RP-HPLC øker retensjonstidene når vi bruker mobile faser med større elueringsevne. 18. Ved GLC-SF'er er øvre temperaturgrense (MAOT) den samme som Flammepunkt og er et brannsikkerhetstiltak. 19. I aminosyreanalysatorer appliseres aminosyrene ved lav ph på en anionbytterkolonne. 20. Det er best separasjonsevne i TLC når RF-verdier er ca. 0,2 - ~0, UV-detektoren i HPLC er en massefølsom detektor. 22. Ekstern standard kalibreringsmetoden kan ikke brukes når analytten er et ukjent stoff. 23. Ved detektor-orientert derivatisering må blandingen og reaksjonen med reagens alltid skje før analytten har kommet fram til kolonnen. 24. Den vanlige ioniseringsmetoden ved koblet LC/MS i dag er Elektrosprayionisering (ESI). 25. I SEC separasjoner av makromolekyler er det best å ha lave MFhastigheter. /, fordi. Derivatisering av enantiomerer med et rent kiralt stoff lager produkter som er et diastereomerpar. diastereomerer ulike "akirale" egensakper og kan derfor separeres på et akiralt kro. system. Elektroosmose-hastigheten mot den aktuelle elektroden kan være sterkere enn elektroforese-hastigheten bort fra den for de frastøtede ionene. Lsm.-effekt brukes for gjenoppkonsentrering av analytt i kolonneinngang. Ikke nødvendig v. split-injeksjon fordi prøveoverføring er raskt p.g.a. høy gasshast.i injektoren, med kort analytt.sone Carbowax er et produktnavn for polyetylenglykoler, brukt som GLC-SF er. (Carbowx 20M, den mest tungtflyktige, er en polar standard-kolonne). Større elueringsevne (elu.-styrke) av MF betyr kortere retensjonstider(høyere analytt-kons i MF). Øvre temp.-grense er temperaturen der partialdamptrykket når omtrent 1 mbar, og er valgt basert på kolonneblødingnivået. Flammpunkt-temperaturen har ikke noe med det å gjøre. Aminosyrer appliseres ved lav ph der alle er kationer, og retarderes sterkt. Mobiliseres/elueres ved trinnvise gradienter. Kol. må være kationbytter For høy RF: gir som regel ustabile RF og dårlige flekker. For lav RF: opnådd avstand mellom flekker ofte (for) lite i forh. til startflekkstørrelse. UV-detektoren måler analytt-konsenstrasjon ikke-destruktivt v. måling av absorbanse ( forbruker ikke analytt ved målingen). Konsentrasjonsfølsom det. Normalt kreves autentisk (rent) analytt for å kunne lage kalibreringskurve. Ved ukjent stoff er slik analytt ikke tilgjengelig og metoden ikke anvendbar. Reaksjonen KAN også skje 'post-column', ETTER separasjonen (men ikke 'in-column'). Den må da skje raskt, reproduserbar, helst komplett og uten økt sonespredning el. forstyrrende biprodukter. ESI passer bra med RPLC,IEC og HILIC, fgor mellompolare og polare analytter (Life Science). Svært følsom (ved lav MF-strøm til ionekilden) Makromolekyler diffunderer sakte (er store og trege ) derfor trengs litt tid for å få til massetransfertrinnene.