Teststrategi og metodevalg ved OUS for diagnostikk av autoimmune leversykdommer

Transkript

1 Teststrategi og metodevalg ved OUS for diagnostikk av autoimmune leversykdommer Randi Karlsen Fagbioingeniør Seksjon for medisinsk immunologi Oslo Universitetssykehus Ullevål sykehus April 2016

2 Innhold Test repertoar Test strategi Metoder Guidelines

3

4

5 Analysepakker

6 Test repertoar ved OUS ANA-IIF (kjerneantistoff og cytoplasmaantistoff) SMA (antistoff mot glattmuskel) AMA (antistoff mot mitokondrier) LKM (antistoff mot liver/kidney mikrosomalt) LC-1 (antistoff mot levercytosol) SLA/LP (antistoff mot soluble liver antigen/ liver pancreas protein) ANCA-IIF (P-ANCA) IgG, IgA og IgM ALD-Blot: a-m2, a-3e(bpo), a-lc1, a-lkm1, a-sla/lp, a-pml, a-sp100, a-gp210,

7 TEST-STRATEGI LEVER DIAGNOSTIKK LKS ANA IgG, A, M Hep-2 KJERNE OG CYTO- PLASMATISK PH50 CTD OG A-M2 LKS-IIF MØNSTER EV. TITRERING IMMUN- GLOBULINER - NEFELOMETRI MØNSTER OG STYRKE AKTIN- ELISA ALD- BLOT 2. LINJE ANALYSE: ALD-BLOT

8 Metoder Indirekte immunfluorescens Vevssnitt av gnager lever, nyre og mage Hep-2 Transfekterte celler Elisa FEIA Immunoblot Line immunoassay, dot blot

9 Indirekte immunfluorescens LKS-slides Tre sammensatte organer fra mus Kan teste på flere antistoffer samtidig SMA, AMA, LKM, LC-1, GPC og ANA Screening fortynning 1/40 Titrering av positive 1/80, 1/256 og 1/1280 IgG spesifikt konjugat Må ha fluorescensmikroskop og kompetanse Kan automatiseres, billig og effektiv.

10 Negativ nyre, mage

11 Antistoff mot glatt muskel (SMA) Kan påvises hos ca. 80 % av pasientene med AIH (autoimmun hepatitt) type 1. Deles i undertyper basert dels på reaksjonsmønster i vevssnitt, dels på antigenkarakterisering. Den viktigste undertypen har et såkalt VGT-mønster, som viser at det foreligger antistoff mot F-aktin Mønsteret sees hos ca. 80% av pasienter med AIH. Mønsteret har en sensitivitet på ca. 80% og en spesifisitet på over 90 % for AIH-type1. Andre varianter av anti-glattmuskulatur er nokså uspesifikke og trolig av beskjeden diagnostisk verdi. Analysen har liten verdi av måling for sykdomsaktivitet eller prognose.

12 Ulike mønstre: V (vessel):fluorescens i cytoplasma til muskelcellene i Muscularis Mucosa, muskelceller i kar og muskelfibre mellom parietalcellene. VG (Vessel + glomeruli): Som over, men også markant farging i glomeruli (mesangialt). VGT (Vessel + glomeruli + tubuli): Som over, men også nålelignende farging peritubulært i nyrebarken samt i ytterkant av parietalceller. V-mønster er lite spesifikk for AIH VGT-mønster er svært spesifikk for AIH og assosieres med anti-faktin Titer 80 eller høyere er viktig for diagnose score Titer 40 kan bety noe.

13 SMA på mage, nyre

14 VGT mønster på nyre og mage

15 Antistoff mot mitokondrier (AMA) Har vært delt i 10 eller flere undertyper basert vesentlig på reaksjonsmønster i vevssnitt, i noen grad på antigenkarakterisering. Diagnostisk betydning av de fleste av disse subspesifisitetene er usikker. Den diagnostisk mest interessante varianten er (M2), som finnes hos % av pasientene med primær biliær cholangitt (PBC), og som kan opptre mange år før klinisk sykdom utvikles Det er ukjent hvor mange av pasientene med mitokondrieantistoff, men uten leversykdom, som senere vil utvikle PBC. Mitokondrieantistoff kan også sees hos noen pasienter med autoimmun hepatitt (gjerne lave titer), hepatitt C og systemisk sklerose, samt mer sporadisk ved en del andre tilstander. Analysen har ingen verdi mht. måling av sykdomsaktivitet eller vurdering av prognose hos pasienter med etablert PBC. M2-reaktiviteten omfatter E2 -subenhetene i tre enzymkomplekser: Pyruvate dehydrogenase complex E2 (PDC- E2) 2-oxo-glutarate dehydrogenase complex E2 (OGDC-E2) Branched chain 2-oxo-acid dehydrogenase complex E2 (BCOADC-E2)

16 Mønster Kornet fluorescens i nær alle nyretubuli i margen(distale tubuli). Kornet fluorescens i proksimale tubuli i barken P1>P2>P3. Kornet fluorescens i cytoplasma av parietalceller og hovedceller i magen. Oppklaring av den sekretoriske kanal og skarp celleavgrensning er karakteristisk. Kornet farging i leverparenchymet. OBS. Mulighet for prozone fenomen hvor det ikke er typisk farging i nyren, men med prikker (relativt tett). Må titreres. Positiv test bekreftes med annen teknikk. Titer >40 regnes som spesifikk for PBC (primær biliær cholangitt) Ikke for monitorering. Flukterer ikke med sykdomsaktivitet.

17 AMA på nyre, mage og lever

18 AMA på Hep-2

19 LKM Forkortelsen LKM står for liver, kidney mikrosomal autoantibodies. Anti-LKM1, 2 og 3 er rettet mot tre forskjellige enzymer i det endoplasmatiske retikulum i leverparenkym og nyretubuli. LKM1 og 3 er vanskelig å skille mikroskopisk i nyre og lever fra gnager. LKM1 reagerer med cytokrom P450 2D6. Er markør for en undergruppe AIH (type2), som er karakterisert ved negativ ANA, forekommer hos yngre kvinner (ofte barn). Anti-LKM2 er rettet mot enzymet cytokrom P450 2C9. Medikament indusert. Anti-LKM3 er rettet mot enzymet UTG1A (UDPglucuronosyltransferase 1A). Sees ved HepC, HepD og AIH.

20 Mønster Partiell farging i nyren. Relativt homogen farging innerst i barken, mer variabelt utover i barken. Ingen farging i marg. Kraftig, relativt homogen farging av leverparenchym Vanskelig å se forskjell på LKM-1, 2 og 3 Positiv test bekreftes med annen metode (LIA) LKM1 er assosiert med AIH type2

21 LKM-1 på nyre og lever

22 negativ på distale tubuli

23 LC-1 Opptrer ofte sammen med anti-lkm1, og er da vanskelig å påvise. Nyremarg: Ingen fluorescens. Nyrebark: Ingen fluorescens. Magesekk: Ingen fluorescens. Lever: Fluorescens i leverparenchymet med sentrallobulær avbleking Positiv test bekreftes i annen teknikk (LIA) Assosiert med AIH type 2

24 LC-1 på lever

25 ANA-indirekte immunfluorescens Ved AIH kan det være flere målantigener Negativ på vanlige undergrupper Kan være kromatin assosiert Substrat av gnager eller Hep-2 Serumfortynning 1/40 er relevant Ved PBC Centromer, nukleær membran, multiple nukleære dots Ved andre autoimmune tilstander og hos friske

26 Multiple nukleære dots og punktert nukleær membran på Hep-2

27 ANCA Atypisk p-anca P-ANNA: perifer antinukleær nøytrofil antistoff (antigen i membranen) Ved PSC (primær skleroserende cholangitt) og AIH a-pr3 positiv hos IBD?

28 Anti-SLA/LP Sees ikke ved IIF-metodikk Elisa eller LIA AIH type 3? Oftest ingen andre autoantistoff

29 Oppfølgingstester Mitokondrieantistoff FEIA: Phadia250 EliA brønn coatet med både nativt pyruvat dehydrogenase-kompleks fra mitokondrier og i tillegg det rekombinante M2-antigenet BCOADC-E2 LIA: Euroline blotmaster fra Euroimmun Native M2 antigen M2-3E (BPO): består av E2-BCOADC, E2-PDH og E2-OGDC

30 Anti-glatt muskel positive Anti-F-Aktin: Elisa-kit fra INOVA Settes pt opp på alle SMA positive også de med mønster V. Finnes hos 52-85% med AIH eller kronisk aktiv hepatitt og hos 22% av pasienter med PBC, men også hos 3-18% friske.

31 Line-immunoassay ALD-blot fra Euroimmun MA-M2= native M2 antigen M2-3E (BPO):E2-(BCOADH), -(PDH) og -(OGDH) Sp100= speckled protein (100 kda); PML= promyelocytic leukemia protein; gp210= glycoprotein (210 kda); LKM-1= cytochrome P450 IID6; LC-1= formiminotransferase cyclodeaminase SLA/LP= UGA-suppressor-tRNA associated protein

32 Mange antigener coated på en strips av plast. Membran av nitrocellulose eller nylon Detekterer mange antistoffer samtidig Fra manuell til helautomatisk prosess Fargeintensiteten leses av og graderes, reflekterer antistoff aktiviteten

33 ALD-blot Positiv kontroll Ani-Sp100

34 Ting å tenke på Valg av metode Valg av teststrategi Kvalitetskontroller Ekstern kvalitetskontrollprogram

35 Guidelines Diego Vergani et al. Liver autoimmune serologi; a consensus statement from the committe of autoimmune serologi of the International Autoimmune Hepatitis group. Journal of Hepatology 41 (2004) Diagnostiske guidelines: AIH(AASLD-guidelines): Manns, MP, Czaja, AJ, Gorham, JD, Krawitt, EL, Mieli-Vergani, G, Vergani, D, Vierling, JM Diagnosis and management of autoimmune hepatitis. Hepatology 51: PBC: (AASDL-guidelines): Lindor, KD, Gershwin, ME, Poupon, R, Kaplan, M, Bergasa, NV, Heathcote, EJ Primary biliary cirrhosis. Hepatology 50: European Association for the Study of the Liver (EASL): J Hepatol 2009;51:237