(12) PATENT (19) NO (11) (13) B1. (51) Int Cl. NORGE. Patentstyret

Transkript

1 (12) PATENT (19) NO (11) 3314 (13) B1 NORGE (1) Int Cl. C07K 16/28 (06.01) A61P 29/00 (06.01) A61P 37/02 (06.01) A61P 37/06 (06.01) A61P 43/00 (06.01) A61K 39/39 (06.01) Patentstyret (21) Søknadsnr 0789 (86) Int.inng.dag og søknadsnr PCT/US00/027 (22) Inng.dag (8) Videreføringsdag (24) Løpedag (30) Prioritet , US, , US, , US, (41) Alm.tilgj (4) Meddelt (73) Innehaver Biogen Idec MA Inc, 14 Cambridge Center, US-MA02142 CAMBRIDGE, USA Topotarget Switzerland SA 18- Avenue de Sevelin LAUSANNE 04 CH (72) Oppfinner Jeffrey L Browning, Concord Avenue, US-MA02138 CAMBRIDGE, USA Jurg Tschopp, Epalinges, Sveits Christine M Ambrose, 197 Wakefield Street, US-MA01867 READING, USA Fabienne Mackay, Vaucluse, NWS, Australia Jeffrey S Thompson, 60 Newcomb Road, US-MA02180 STONEHAM, USA Pascal Schneider, Tuileries 7, CH-66 EPALINGES, Sveits (74) Fullmektig Oslo Patentkontor AS, Postboks 7007 Majorstua, 0306 OSLO, Norge (4) Benevnelse Antistoff mot BAFF-reseptor (BCMA) som et immunoregulatorisk middel (6) Anførte publikasjoner WO A2, MADRY C et al., "The characterization of murine BCMA gene ", International Immunology, 1998, vol., s (7) Sammendrag Det tilveiebringes en ny receptor i TNF-familien: BAFF-R. Kimære molekyler og antistoffer mot BAFF-R og fremgangs- måter ved anvendelse derav tilveiebringes også.

2 1 1 Foreliggende oppfinnelse vedrører et antistoff rettet mot BAFF som angitt i krav 1. BAFF er en -celleaktiverende faktor som tilhører familien tumornekrosefaktor ("TNF"), og blokkerende midler mot BAFF kan enten stimulere eller inhibere ekspresjonen av B-celler og immunoglobuliner. Denne reseptor har anti-kreft- og immunoregulatoriske anvendelser samt nytte ved behandling av immunosuppressive forstyrrelser så som HIV. I tillegg spiller reseptoren og dens blokkerende midler en rolle ved utvikling av hypertensjon og de forbundne forstyrrelser. Videre kan celler som er blitt transfisert med genet for denne reseptor brukes i genterapien for å behandle svulster, lymfomaer, autoimmune sykdommer eller arvelige genetiske forstyrrelser omfattende B-celler. Blokkerende midler, så som rekombinante varianter eller antistoffer som er spesifikke for reseptoren, har også immunoregulatoriske anvendelser. Man tenker på en anvendelse av reseptoren for BAFF som en B-cellestimulator for immunsviktsykdommer omfattende f.eks. anvendelser for pasienter som gjennomgår organtransplantasjon (f.eks. benmargstransplantasjon) samt å komme seg etter kreftbehandling for å stimulere produksjonen av B-celler. Anvendelse av reseptoren for BAFF som hjelpemiddel og/eller kostimulator for å øke og/eller gjenopprette B-cellenivået til omtrent et normalt nivå, overveies også. Løselige former for reseptoren for BAFF som blokkerer B-cellefunksjonen, kan også brukes for å inhibere B-celle-medierte sykdommer. BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN 2 30 TNF-familien består av ligandpar, og deres spesifikke reseptorer benevnes TNF-familieligander og TNF-familiereseptorer (Bazzoni og Beutler, 1996). Familien er omfattet i reguleringen av immunsystemet og muligens også andre, ikke-immunologiske systemer. Reguleringen er ofte på "hovedbryter"-nivå, slik at TNF-familiesignalering kan føre til et stort antall påfølgende hendelser som best typifiseres ved TNF. TNF kan initiere den generelle beskyttende inflammatoriske respons i en organisme mot fremmed invasjon som omfatter en endret fremvisning av adhesjonsmolekyler omfattet i celletrafikken, kjemokinproduksjon for å drive bestemte celler mot bestemte avdelinger, og en priming av forskjellige effektorceller. Som sådant har en regulering av disse banene et klinisk potensiale. 3 Induksjon av forskjellige cellulære responser som medieres av slike TNF-familiecytokiner, antas å initieres ved deres binding til bestemte cellereseptorer. Minst to forskjellige TNF-reseptorer med en omtrentlig størrelse på kda (TNFR1) og 7 kda (TNFR2) er blitt identifisert [Hohman et al., J. Biol. Chem. 264: (1989), og Brockhaus et al., PNAS, 87: (1990)]. Omfattende polymorf-

3 2 isme er blitt forbundet med begge TNF-reseptorgener. Begge TNFR'er har til felles en typisk struktur av celleflatereseptorer omfattende ekstracellulær, transmembran og intracellulær domene. Det ekstracellulære parti av TNFR type 1 og type 2 inneholder et gjentatt aminosyresekvensmønster med fire cysteinrike domener (CDR'er). Et lignende gjentatt mønster av CDR'er foreligger i flere andre celleflateproteiner, omfattende bl.a. p7 nervevekstfaktorreseptor og B-celleantigenet CD Reseptorene er kraftige verktøy for å belyse de biologiske baner, fordi de er enkle å omdanne til immunoglobulin-fusjonsproteiner. Disse dimere løselige reseptorformer er gode inhibitorer av hendelser som medieres av enten utsondrede eller flatebundne ligander. Ved en binding til disse ligander, hindrer de liganden fra å vekselvirke med celleforbundne reseptorer som kan signalere. Ikke bare er disse reseptor/ig-fusjonsproteiner nyttige i eksperimentell forstand, men i tilfellet av TNF-R/Ig er de blitt klinisk brukt med fremgang for å behandle inflammatorisk tarmsykdom, rheumatoid artritt og akutt klinisk syndrom som ledsager OKT3-administrasjon (Eason et al., 1996; Feldmann et al., 1996; van Dullemen et al., 199). En kan se for seg at en manipulasjon av de mange hendelser som medieres ved en signalering via TNF-reseptorfamilien, vil finne en bred anvendelse ved behandling av immunbaserte sykdommer og også i det brede utvalg av menneskelige sykdommer som har patologiske følger som skyldes immunsystemets innblanding. En løselig form for en nylig beskrevet reseptor, nemlig osteoprotegerin, kan blokkere tapet av benmasse, og dermed er hendelsene som reguleres av TNF-reseptorfamiliens signalering, ikke nødvendigvis begrenset til en regulering av immunsystemet. Antistoffer mot reseptoren kan blokkere ligandbinding og kan derfor også finne klinisk anvendelse. Slike antistoffer er ofte meget lengelevende, og kan ha fordeler over løselige reseptor/ig-fusjonsproteiner, som har en kortere halveringstid i blodet Selv om en inhibering av den reseptormedierte bane representerer den mest utbredte terapeutiske anvendelse av disse reseptorer, var det opprinnelig en aktivering av TNF-reseptorene som virket klinisk lovende (Aggarwal og Natarajan, 1996). En aktivering av TNF-reseptorene kan initiere celledød i målcellen, og derfor var og er en anvendelse mot svulster attraktiv (Eggermont et al., 1996). Reseptoren kan aktiveres enten ved administrasjon av liganden, dvs. den naturlige bane, eller noen antistoffer som kan fornette reseptoren, er også sterke agonister. Antistoffer ville være fordelaktige innen onkologien, siden de kan holde seg i blodet over lange tidsrom, mens ligandene generelt har en kort levetid i blodet. Idet mange av disse reseptorer kan uttrykkes mer selektivt i svulster, eller de kan kun signalere celledød eller differensiering i svulster, kunne agonistantistoffer være gode våpen ved

4 3 beandling av kreft. Likeledes medieres mange positive immunologiske hendelser via TNF-reseptorfamilien, f.eks. inflammatoriske reaksjoner i verten, antistoffproduksjon osv., og derfor kunne agonistiske antistoffer ha gunstige virkninger i andre, ikke-onkologiske anvendelser. Paradoksalt nok kan en inhibering av en bane ha en klinisk fordel ved behandling av svulster. F.eks. uttrykkes Fas-liganden av noen svulster, og denne ekspresjon kan føre til døden av Fas-positive lymfocytter og dermed forenkle svulstens evne til å unngå immunsystemet. I dette tilfellet ville en inhibering av Fas-systemet tillate immunsystemet å reagere på svulsten på andre måter, nå da en tilgang er blitt mulig (Green og Ware, 1997). Tidligere er de kjent fra WO , et kjent polypeptid fra BCMA samt fusjonsprotein bestående av BCMA-peptider bundet til et immunoglobulin Fc-domene. Fra en artikkel av Mandryl C et al., (Int. Immunolocy, 1998, vol., s ) er det kjent sekvensen til humant og mutint 8c MA. 1 SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN Søkerne har identifisert en cdna-klon som koder for et polypeptid og som i foreliggende søknad benevnes "BAFF-R" eller "BCMA", som binder tumornekrosefaktoren BAFF, som er en B-celleaktiverende faktor som tilhører familien tumornekrosefaktor ("TNF"). BAFF er det samme molekyl som tidligere er blitt beskrevet i WO99/ I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som spesifikt bindes til et BAFF-R-polypeptid. Valgfritt er antistoffet et monoklonalt antistoff. KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE 2 Fig. 1 viser nukleinsyresekvensen (SEKV ID NR: 2) av et cdna for humant BAFF-R (BCMA) og dens avledede aminosyresekvens (SEKV ID NR: 1). Potensiell translasjonsstart ved enten nukleinsyreresiduum 219 eller 228; cysteinrik domene (CRD) ved nukleinsyreresiduene av SEKV ID NR: 2 (aminosyreresiduene 8-41 av SEKV ID NR: 1) og potensielt transmembrant parti ved nukleinsyreresiduene av SEKV ID NR: Fig. 2 viser nukleinsyresekvensen (SEKV ID NR: 4) og dens avledede aminosyresekvens (SEKV ID NR: 3) av pjst38, et plasmid som koder for BAFF-R/Fc: nuk-

5 4 leinsyreresiduene 1-69: murin IgG-kappasignalsekvens; nukleinsyreresiduene : BAFF-R (nukleinsyreresiduene 1-13); nukleinsyreresiduene : humant IgG. Fig. 3 viser nukleinsyresekvensen av pjst3, et plasmid som koder for hellengdes humant BAFF-R og dens avledede aminosyresekvens. Fig. 4 viser en struktursammenligning av TNF-R og BAFF-R. Fig. viser 293EBNA-celler som er transfisert med enten (a) CH269 (1.0 g) eller (b) pjst3 (0,1 g), plasmidet som uttrykker hellengdes BAFF-R, og flekket med 0, g/ml flag-hbaff i plateassayformatet. Fig. 6(a) viser FACS-overlagring av 293EBNA transfisert med pjst3 og flekket som følger: ingen ligand (sort histogram), 1 g/ml flag-hcd40l (lyserødt) eller flag-hbaff (grønt). Alle prøvene ble deretter flekket med anti-flag-m2 fulgt av eselanti-muse-igg slik det beskrives i metodene i eksempel 2. 1 Fig. 6(b) viser FACS-histogrammer med statistikker fra det samme eksperiment. Flekkingen er som følger: (1) uflekket, (2) kun 7AAD, (3) kun andre trinn og 7AAD, (4) 9 g/ml flag-hbaff, () 3 g/ml flag-hbaff, (6) 1 g/ml flag-hbaff, (7) 0,33 g/ml flag-hbaff, (8) 0,11 g/ml flag-hbaff, (9) flag-hcd40l 1 g/ml. 2 Fig. 7 viser immunofelninger med BAFF-R/Fc slik det beskrives i metodene i eksempel 4. Molekylvektstandarder i kda er slik som det oppgis på venstre side av figuren. Bane (1): 12, ng flag-htweak, (2): 12, ng flag-hbaff, (3): immunofelning av flag-hbaff med 0, ml BAFF-R/Fc-kondisjonert medium, (4): immunofelning av flag-htweak med 0, ml BAFF-R/Fc-kondisjonert medium, () immunofelning av ingen ligand med 0, ml BAFF-R/Fc-kondisjonert medium, (6): immunofelning av flag-hbaff med 0, ml kondisjonert medium fra utransfiserte 293EBNA, (7): immunofelning av flag-htweak med 0, ml kondisjonert medium fra utransfiserte 293EBNA. Fig. 8 viser et plott av resultatene fra et splenocytt-proliferasjonsassay hvor tellingene pr. minutt (CPM) innlemmet i muse-splenocyttceller er plottet mot mengden humant BAFF som ble tilsatt ( g/ml).

6 Fig. 9 viser en plott av resultatene av et BAFF-blokkeringsassay som analyserer BAFF-bindingen til Raji-celler hvor avlesningen av MFI (den midlere fluorescensintensitet) er plottet mot mengden R:hIgG1 (ng/ml). Fig. (a) viser plotter av ekspresjonen av IgM vs. CD1 i en FACS-analyse for Baff- Tg-mus som fikk h-ig (midlere rute) eller hbcma/ig (nederste rute) og for villtypekontroller fra samme kull som fikk PBS-injeksjoner (øvre rute) slik det beskrives i eksempel 11. Fig (b) viser plotter av ekspresjonen av CD21 vs. IgM i FACS-analyse ved utelukking på IgD-positive populasjoner for Baff-Tg-mus som fikk h-ig (midtre rute) eller hbcma/ig (nedre rute), og for villtypekullkamerater som fikk PBS-injeksjoner (øvre rute), slik det beskrives i eksempel Fig. (c) viser plotter av ekspresjonen av CD21 vs. IgM i FACS-analyse ved utelukking på IgD-negative populasjoner for Baff-Tg-mus som fikk h-ig (midtre rute) eller hbcma/ig (nedre rute), og for villtypekullkamerater som fikk PBS-injeksjoner (øvre rute), slik det beskrives i eksempel 11. Fig. 11 viser miltvekten for alle grupper av Baff-Tg-mus (oppgitt som vekten i mg ± standardavviket). Fig. 12 viser et plott av proteinurea (mg/dl) vs. injeksjonsantallet for Baff-Tg-mus som var blitt behandlet med PBS, hig eller hbcma/ig, og for kontroller fra samme kull. Fig. 13 viser et plott av det midlere arterietrykk (mmhg) i Baff-Tg-mus og villtypekontroller. Fig. 14 viser et plott over det individuelle midlere arterietrykk (mmhg) for Baff-Tgmus og villtypekontroller. 2 Fig. 1 viser et stolpediagram av prosentdelen SNF1-mus som oppviste alvorlig nefritt etter behandling med BAFF-R/Ig (BCMA/Ig), HuIgG eller PBS. Fig. 16 viser en graf over det samlede CD11c + -DC-celleantall (i millioner) for mus behandlet in vivo med g BCMA/Ig, 0 g BCMA/Ig, HuIgG eller PBS. CD11c + -

7 6 DC-cellepopulasjonene som ble undersøkt, var: (1) CD8a - CD4 -, (2) CD8a + CD4 - og (3) CD8a - CD4 +. DETALJERT BESKRIVELSE 1. Definisjoner Begrepene "BAFF-R" og "BCMA" omfatter når de brukes heri, BAFF-R med nativ sekvens og BAFF-R-varianter (som skal defineres nærmere heri). BAFF-R'et kan være isolert fra forskjellige kilder, så som fra murine eller humane vevstyper eller fra en annen kilde, eller kan fremstilles ved rekombinante eller syntetiske metoder. 1 En "BAFF-R med nativ sekvens" omfatter et polypeptid som har den samme aminosyresekvens som BAFF-R avledet fra naturen. En slik BAFF-R med nativ sekvens kan isoleres fra naturen, eller kan fremstilles på rekombinant eller syntetisk måte. De naturlig forekommende avkortede eller utsondrede former for BAFF-R (f.eks. løselige former som f.eks. inneholder en ekstracellulær domenesekvens), naturlig forekommende varierte former (f.eks. alternativt skjøtede former) og naturlig forekommende alle varianter av BAFF-R. I én utførelse av oppfinnelsen er den native BAFF-R-sekvens en moden eller hellengdes nativ BAFF-R-polypeptid-sekvens som omfatter aminosyrene 1 til 184 av SEKV ID NR: 1 eller et fragment derav "BAFF-R-ekstracellulær domene" eller "BAFF-R-ECD" viser til en form for BAFF-R som i det vesentlige er fri for transmembran og cytoplasmatisk domene av BAFF-R. Vanligvis vil BAFF-R-ekstracellulær domene ha mindre enn 1% av disse transmembrane og cytoplasmatiske domener, og vil fortrinnsvis ha mindre enn 0,% av slike domener. Valgfritt vil BAFF-R-ECD omfatte aminosyreresiduene 8 til 41 av SEKV ID NR: 1, eller aminosyreresiduene 4 til 1 av SEKV. ID NR: 1, eller aminosyreresiduene 1 til 3 av SEKV. ID NR: 1. I en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse omfatter BAFF-R-ECD aminosyreresiduene 1 til 1 av SEKV ID NR: 1. I en annen foretrukket utførelse omfatter BAFF-R-ECD aminosyreresiduene 1 til 0 av SEKV. ID NR: 1. Fagmannen vil forstå at den transmembrane domene som identifiseres for BAFF-R-polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, identifiseres idet man følger kriterier som rutinemessig anvendes innen faget for å identifisere denne type hydrofob domene. De nøyaktige grenser av en transmembran domene kan variere, men sannsynligvis ikke med mer enn ca. aminosyrer i hver ende av domenet som spesifikt nevnes heri. Følgelig kan BAFF-R-ECD valgfritt omfatte aminosyrene 8-41 (SEKV ID NR: 1).

8 7 "BAFF-R-variant" betyr et aktivt BAFF-R som definert i det følgende, som har minst ca. 80% aminosyresekvensidentitet med BAFF-R'en som har den avledede aminosyresekvens som vises i SEKV ID NR: 1 for en hellengdes nativ BAFF-R-sekvens eller med en BAFF-R-ECD-sekvens. Slike BAFF-R-varianter omfatter f.eks. BAFF-Rpolypeptider hvor én eller flere aminosyreresiduer tilsettes, eller slettes, i enden eller C-terminus av sekvensen av SEKV ID NR: 1. Vanligvis vil en BAFF-R-variant ha minst 80 eller 8% aminosyresekvensidentitet, mer foretrukket minst ca. 90% aminosyresekvensidentitet og enda mer foretrukket minst ca. 9% aminosyresekvensidentitet med aminosyresekvensen av SEKV ID NR: 1. 1 "Prosent (%) aminosyresekvensidentitet" med hensyn til BAFF-R-sekvenser som identifiseres heri, defineres som prosentdelen aminosyreresiduer i en kandidatsekvens som er identiske med aminosyreresiduene i BAFF-R-sekvensen, etter at sekvensene er blitt linjestilt og det, om nødvendig, er blitt innført opphold for å oppnå en maksimal prosent sekvensidentitet, og idet man ikke anser konservative substitusjoner for å være en del av sekvensidentiteten. En linjestilling for å bestemme prosent aminosyresekvensidentitet kan oppnås på forskjellige måter som ligger innen kunnskapene innen faget, f.eks. ved bruk av alment tilgjengelig dataprogramvare så som BLAST-, ALIGN- eller Megalign (DNASTAR)-programvare. Fagmannen kan bestemme de egnede parametere for måling av linjestillingen, også eventuelle algoritmer som er nødvendige for å oppnå en maksimal linjestilling over hele lengden av sekvensene som skal sammenlignes Begrepet "epitop-tagget" betyr når det brukes heri, et kimært polypeptid som omfatter BAFF-R eller en domenesekvens derav kondensert til et "tag-polypeptid". Tag-polypeptidet har tilstrekkelig mange residuer for å tilveiebringe en epitop som det kan lages et antistoff mot, eller som kan identifiseres med et annet middel, men er tilstrekkelig kort til å ikke forstyrre aktiviteten av BAFF-R. Tag-polypeptidet er fortrinnsvis også nokså ensartet, slik at antistoffet ikke kryssreagerer vesentlig med andre epitoper. Egnede tag-polypeptider har generelt minst 6 aminosyreresiduer og vanligvis mellom 8 og 0 aminosyreresiduer (fortrinnsvis ca. til ca. residuer). 3 "Isolert" betyr når det brukes til å beskrive de forskjellige polypeptider som beskrives heri, et polypeptid som er blitt identifisert og adskilt og/eller isolert fra en bestanddel av sitt naturlige miljø. Forurensende bestanddeler av dets naturlige miljø er materialer som vanligvis ville forstyrre en diagnostisk eller terapeutisk anvendelse av polypeptidet, og kan omfatte enzymer, hormoner og andre proteinholdige

9 8 eller ikke-proteinholdige oppløste stoffer. I en foretrukket utførelse vil polypeptidet renses (1) i tilstrekkelig grad for å erholde minst 1 residuer av en N-terminal eller intern aminosyresekvens ved bruk av en spinnekoppsekvenator, eller (2) til homogenisitet SDSPAGE under ikke-reduserende eller reduserende betingelser ved bruk av Coomassie blue eller fortrinnsvis sølvflekking. Isolerte polypeptider omfatter polypeptider in situ i rekombinante celler, fordi minst én bestanddel av BAFF-R's naturlige miljø ikke vil foreligge. Vanligvis vil isolert polypeptid imidlertid fremstilles ved minst ett rensetrinn. 1 Begrepet "antistoff" brukes i sin videste betydning, og dekker spesielt enkelte BAFF-R-monoklonale antistoffer (omfattende agoniserende, antagoniserende og nøytraliserende antistoffer) og anti-baff-r-antistoffsammensetninger med polyepitopisk spesifisitet. Begrepet "monoklonalt antistoff" som brukt heri viser til et antistoff erholdt fra en populasjon av i det vesentlige homogene antistoffer, dvs. at de enkelte antistoffer som utgjør populasjonen, er identiske unntatt for eventuelle naturlig forekommende mutasjoner som kan foreligge i mindre mengder. Et "renset preparat" eller et "i det vesentlige rent preparat" av et polypeptid betyr slik det brukes her, et polypeptid som er blitt separert fra andre proteiner, lipider og nukleinsyrer som det naturlig foreligger sammen med. Fortrinnsvis er polypeptidet også adskilt fra andre stoffer, f.eks. antistoffer, matriser osv., som brukes for å rense det. Begrepene "behandle", "behandling" og "terapi" viser slik de brukes heri, til en kurerende terapi, profylaktisk terapi og forebyggende terapi. Begrepene "peptider", "proteiner" og "polypeptider" brukes synonymt heri "Biologisk aktiv" betyr slik det brukes heri, at det har en in vivo- eller in vitro-aktivitet som kan utføres direkte eller indirekte. Biologisk aktive fragmenter av BAFF-R kan ha f.eks. 70% aminosyrehomologi med det aktive sete av reseptoren, mer foretrukket minst 80% og mest foretrukket minst 90% homologi. Identitet eller homologi med hensyn til reseptoren defineres heri som prosentdelen aminosyreresiduer i kandidatsekvensen som er identiske med BAFF-R-residuene i SEKV ID NR: 1, eller som er identiske med et bestemt parti av aminosyreresiduene i SEKV ID NR: 1.

10 9 Begrepet "pattedyr" viser slik det brukes heri, til hvilket som helst dyr som klassifiseres som pattedyr, omfattende mennesker, kyr, hester, hunder, mus og katter. I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen er pattedyret et menneske. Utøvelsen av foreliggende oppfinnelse vil, hvis intet annet er nevnt, benytte seg av konvensjonelle teknikker innen cellebiologi, cellekultur, molekylærbiologi, transgenbiologi, mikrobiologi, rekombinant DNA og immunologi, som ligger innen kunnskapen innen faget. Slike teknikker beskrives i litteraturen. Antistoffer for anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse kan også fremstilles ved bruk av teknikker som er kjent innen faget. Generering av løselige former for BAFF-R 1 Løselige former for BAFF-R kan ofte signalere virksomt, og kan derfor administreres som et legemiddel som nå etterligner den naturlige membranform. Det er mulig at BAFF-R'et utsondres naturlig i form av løselige cytokiner, men hvis ikke, kan en imidlertid omkonstruere genet for å fremtvinge en utsondring. For å skape en løselig utsondret form for BAFF-R, vil en på DNA-nivå fjerne N-terminustransmembrane partier, og en del av stilkpartiet, og erstatte dem med en ledersekvens av type I, eller alternativt av type II, som vil muliggjøre en virksom proteolytisk spaltning i det valgte ekspresjonssystem. En fagmann vil kunne variere lengden av stilkpartiet som bevares i utsondringsekspresjonskonstruktet for å optimere både ligandbindingsegenskapene og utsondringseffekten. F.eks. kunne konstrukter som inneholdt alle mulige stilklengder, dvs. N-terminale avkortelser, fremstilles slik at det ville dannes proteiner som starter ved aminosyre 1 til 1. Stilksekvensen med optimal lengde ville resultere fra denne type analyse. Generering av antistoffer som reagerer med BAFF-R 2 30 Oppfinnelsen omfatter antistoffer som reagerer spesifikt med BAFF-R. Anti-protein/anti-peptid-antisera eller monoklonale antistoffer kan fremstilles ifølge standardprotokoller (se f.eks. Antibodies: A Laboratory Manual, utg. av Harlow og Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Et pattedyr så som en mus, en hamster eller en kanin, kan immuniseres med en immunogen form for peptidet. Teknikker ved formidling av immunogenisitet til et protein eller peptid omfatter konjugering med bærere eller andre teknikker som er velkjent innen faget.

11 Et immunogent parti av BAFF-R kan administreres i nærvær av et hjelpestoff. Immuniseringens fremskritt kan overvåkes ved påvisning av antistofftiteren i plasma eller serum. Standard ELISA- eller andre immunoassayer kan brukes med immunogenet som antigen for å bedømme nivået av antistoffer. Det aktuelle antistoffet binder til aminosyrer 8 til 41 av SEQ ID NO Begrepet antistoff skal slik det brukes heri, omfatte fragmenter derav som også reagerer spesifikt med BAFF-R eller dets reseptorer. Antistoffer kan fragmenteres ved bruk av konvensjonelle teknikker, og fragmentsamlingen kan gjennomsøkes for å finne nyttige fragmenter på samme måte som ble beskrevet ovenfor for hele antistoffer. F.eks. kan F(ab') 2 -fragmenter genereres ved å behandle antistoffet med pepsin. Det dannede F(ab') 2 -fragment kan behandles for å redusere disulfidbroer for å danne Fab'-fragmenter. Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse skal også omfatte biospesifikke og kimære molekyler som har anti-baff-r- eller anti-baffkoreseptor-aktivitet. Dermed kan både monoklonale og polyklonale antistoffer (Ab) rettet mot BAFF-R og deres koreseptorer, og antistoffragmenter så som Fab' og F(ab') 2 brukes til å blokkere virkningen av BAFF-R og dens tilhørende koreseptorer. Forskjellige former for antistoffer kan også fremstilles ved bruk av standard rekombinante DNA-teknikker (Winter og Milstein, Nature 349: (1991). F.eks. kan det konstrueres kimære antistoffer hvor den antigenbindende domene fra et dyreantistoff kobles til et human konstant domene (f.eks. Cabilly et al., US Kimære antistoffer kan nedsette de observerte immunogene responser som utløses av dyreantistoffer når de brukes ved klinisk behandling av mennesker I tillegg kan det syntetiseres rekombinante "humaniserte antistoffer" som gjenkjenner den aktuelle delen av BAFF-R. Humaniserte antistoffer er kimærer som omfatter hovedsakelig humane IgG-sekvenser som man har innført partiene som er ansvarlige for den spesifikke antigenbinding, inn i. Dyr immuniseres med det ønskede antigen, de tilsvarende antistoffer isoleres, og andelen av variabelt partisekvenser som er ansvarlige for den spesifikke antigenbinding, fjernes. De dyreavledede antigenbindende partier klones deretter inn i den passende posisjon av humane antistoffgener hvor de antigenbindende partier er blitt fjernet. Humaniserte antistoffer minimerer anvendelsen av heterologe (dvs. inter-art-) sekvenser i humane antistoffer, og vil derfor mindre sannsynlig utløse en immunrespons i individet som behandles.

12 11 En konstruksjon av forskjellige klasser av rekombinante antistoffer kan også oppnås ved å fremstille kimære eller humaniserte antistoffer som omfatter variable domener og humane konstante domener (CH1, CH2, CH3) isolert fra forskjellige klasser av immunoglobuliner. F.eks. kan antistoffer med en hevet antigenbindingssetevalens fremstilles rekombinant ved å klone det antigenbindende sete inn i vektorer som bærer human kjedekonstante partier (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177: (1993), innlemmet heri ved henvisning). I tillegg kan standard rekombinante DNA-teknikker brukes for å endre bindingsaffiniteten av rekombinante antistoffer til sine antigener ved å endre aminosyreresiduer i området rundt antigenbindingssetene. Antigenbindingsaffiniteten av et humanisert antistoff kan heves ved mutagenese på grunnlag av molekylær modellering (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: (1989). Generering av analoger: produksjon av endrede DNA- og peptidsekvenser 1 Analoger av BAFF-R kan skille seg fra de naturlig forekommende BAFF-R i aminosyresekvensen, eller på måter som ikke omfatter sekvensen, eller på begge måter. Ikke-sekvensmodifikasjoner omfatter in vivo- eller in vitro-kjemisk derivatisering av BAFF-R'en. Ikke-sekvensmodifikasjoner omfatter, men er ikke begrenset til, endringer i acetyleringen, metyleringen, fosforylasjonen, karboksylasjonen eller glykosylasjonen. 2 Foretrukne analoger omfatter BAFF-R biologisk aktive fragmenter derav, hvis sekvenser skiller seg fra sekvensen som er oppgitt i SEKV. ID NR: 1, ved én eller flere konservative aminosyresubstitusjoner, eller ved én eller flere ikke-konservative aminosyresubstitusjoner, delesjoner eller innføyelser som ikke forstyrrer aktiviteten av BAFF-liganden. Konservative substitusjoner omfatter vanligvis en erstatning av én aminosyre med en annen som har lignende egenskaper, f.eks. substitusjoner innenfor de følgende grupper: valin, glycin; glycin, alanin; valin, isoleucin, leucin; asparaginsyre, glutamsyre; asparagin, glutamin; serin, treonin; lysin, arginin; og fenylalanin, tyrosin. Anvendelse 30 Hellengdes BAFF-R-gen (SEKV ID NR: 2) eller partier derav kan brukes som hybri- diseringsprober for en cdna-samling for å isolere f.eks. enda flere gener som har en ønsket sekvensidentitet med BAFF-R-sekvensen som oppgis i SEKV ID NR: 2.

13 12 Nukleotidsekvenser som koder for BAFF-R, kan også brukes til å konstruere hybridiseringsprober for å kartlegge genet som koder for BAFF-R, og for en genetisk analyse av individer med genetiske forstyrrelser. Gjennomsøkingsassayer kan utvikles for å finne ledeforbindelser som etterligner den biologiske aktivitet av et BAFF-R. Slike gjennomsøkingsassayer vil omfatte assayer som kan benyttes til et høykapasitets søk gjennom kjemiske samlinger, hvorved de blir spesielt godt egnet til å identifisere småmolekylære legemiddelkandidater. Små molekyler som vurderes, omfatter syntetiske organiske eller uorganiske forbindelser. Nukleinsyrer som koder for BAFF-R eller dens modifiserte former, kan også brukes til å generere enten transgene dyr eller "knock out"-dyr som i sin tur er nyttige ved utvikling av og søk etter terapeutisk nyttige reagensmidler. De følgende eksempler bringes for å illustrere foreliggende oppfinnelse, og skal ikke oppfattes som å begrense den. EKSEMPLER 1 Eksempel 1: Påvisning av BAFF-binding til BAFF-R ved bruk av et plateassay I dette eksempel beskrives bindingen av BAFF til BAFF-R-transfiserte celler ved bruk av et plateassay Hellengdes humant BAFF-R ble generert fra BJAB-polyA + -RNA ved bruk av SuperscriptII-foramplifikasjonssettet (Life Technologies) for å generere cdna-sjablonen, og amplifisert ved Pfu1 ved bruk av primere som var komplementære med de '- og 3'-kodende sekvenser av BAFF-R. PCR-produktet ble klonet inn i CH269, som er et derivat av pcep4 (Invitrogen). Den dannede klon ble benevnt pjst3. Humane embryoniske nyreceller som inneholdt EBNA-1-gen (293EBNA), ble podet inn i 6-brønners plater som var bestrøket med fibronektin, og transfisert ved lipofektamin (Life Technologies) med enten pjst3 i forskjellige fortynnelser, eller CH269 som bakgrunnskontroll. 48 timer etter transfeksjonen, ble de transfiserte celler testet for sin evne til å binde løselig flag-hbaff (aminosyrene L83-L28) som følger. Alle inkubasjonene foregikk ved romtemperatur. Kondisjonert medium ble sugd opp fra brønnene, og cellene ble vasket med BHA-buffer ( mm HEPES ph 7,0, 0, mg/ml BSA, 0,1% NaN 3 ) og inkubert med 0, g/ml flag-hbaff fortynnet i PBS som inneholdt 1 mm MgCl 2, 1 mm CaCl 2 og 0,1% NaN 3. Etter 1 times inkubasjon, ble BAFF-oppløsningen fjernet, og cellene ble vasket med BHA. Cellene ble deretter inkubert i 30 minutter i en PBS-oppløsning som inneholdt 1 g/ml anti-

14 13 flag-monoklonalt antistoff M2 (Sigma). Denne oppløsning ble sugd opp, og cellene ble vasket med BHA. Cellene ble deretter inkubert i 30 minutter i en 1:3000-oppløsning av alkalifosfatase-konjugert geite-anti-muse-igg-f(ab)' 2 (Jackson Immuno- Research). Denne oppløsning ble sugd opp, og cellene ble vasket med BHA. For å nedsette mengden bakgrunnsflekking som skyldes endogent alkalifosfatase, ble cellene inkubert i 1 minutter i 2, mm levamisol (Vector Laboratories) som var fortynnet i 0 mm NaCl, 0 mm Tris-Cl ph 9, og mm MgCl 2. For en kromogen påvisning av alkalifosfatase, ble inhibitoroppløsningen sugd opp, og cellene ble inkubert med en oppløsning av "fast red" og naftolfosfat (Pierce). Flekkingen ble observert og fotografert gjennom et laveffekts mikroskop. 1 Avsettelsen av "fast red"-fargestoff ble observert for alle brønnene som var blitt transfisert med den BAFF-R-uttrykkende plasmid pjst3. Frekvensen av signalet titrerte bort idet mengden av plasmid som var blitt transfisert inn i cellene, sank. Ingen flekking ble observert for cellene som var blitt transfisert med kontrollekspresjonsvektoren CH269. Heller ikke observerte man noen flekking på noen av de transfiserte celler når flag-hbaff ble utelatt fra flekkingsprotokollen, eller når en annen ligand av TNF-familien, nemlig flag-tagget LIGHT, ble brukt istedenfor flaghbaff. Dermed virker flekkingen av BAFF-R-transfiserte celler med BAFF å være spesifikk. Eksempel 2: BAFF-binding til BAFF-R-transfiserte celler ved FACS-analyse Dette eksempel beskriver påvisningen av BAFF til BAFF-R-transfiserte celler ved bruk av FACS-analyse Plasmidet som kodet for hellengdes BAFF-R, nemlig pjst3, ble transfisert inn i 293EBNA-celler ved bruk av FuGene6 (Boehringer Mannheim). 24 eller 48 timer etter transfeksjonen, ble cellene fjernet fra platene ved bruk av mm EDTA i PBS, og telt. Cellene ble vasket to ganger med FACS-buffer (PBS som inneholdt % føtalt bovint serum, 0,1% NaN 3 og g/ml higg (Jackson ImmunoResearch), og deretter ble 2, celler inkubert i 1 time på is med flag-hbaff som var fortynnet inn i FACS-buffer i konsentrasjoner fra 9 g/ml til 0,037 g/ml. Cellene ble vasket med FACS-buffer og inkubert med anti-flag-monoklonalt antistoff M2 i konsentrasjonen g/ml i 30 minutter på is. Cellene ble vasket med FACS-buffer og inkubert i 30 minutter på is i en oppløsning som inneholdt en 1:0-fortynning av R-fykoerytrin-konjugert F(ab') 2 -esel-anti-muse-igg og g/ml 7-AAD. Etter vasking av cellene med FACS-buffer, ble de resuspendert i FACS-buffer som inneholdt

15 14 1% paraformaldehyd. FACS-analyse fulgte, hvor de 7-AAD-positive (døde) celler ble utelukket. Resultatene av FACS-analysen tyder på at en del av cellene som var transfisert med BAFF-R, har evnen til å binde BAFF. Ved BAFF-konsentrasjonen 9 g/ml binder ca. 28% av cellene BAFF for en midlere fluorescensintensitet (MFI) på 366. Ved bruk av kun PE-merket esel-anti-muse-reagens, forekommer ingen betydelig forskyvning av cellene. Kun 1,3% av cellene har en MFI på 23,, hvor gjennomsnittet for alle celler er,. Signalet på de BAFF-R-transfiserte celler titrerer ut med synkende mengder BAFF. Ved 0 ng/ml har 8,76% av cellene MFI-verdien 78,9. Eksempel 3: FACS-analyse av BAFF/BAFF-R-vekselvirkningen omfattende en GFPmarkør I dette eksempel beskrives evnen av BAFF til å binde celler som er blitt kotransfisert med BAFF-R og et GFP-reporterplasmid EBNA-cellene ble transfisert med pjst3 og et GFP-reporterplasmid, slik det ble beskrevet i eksempel 2. Reporterplasmidet koder for et membran-forankret GFP-molekyl. Ved bruk av ko-transfeksjon av de to plasmider, analyserte vi prosentdelen transfiserte celler som hadde evnen til å binde BAFF. Cellene ble fjernet fra platene og underkastet BAFF-binding og -påvisning slik det ble beskrevet i eksempel 2. Igjen ble 7-AAD innlemmet for å utelukke de døde cellene. Prøvene ble analysert ved FACS og plottet. Kvadranten øverst til høyre representerer celler med bundet BAFF (fykoerytrin-positive) som uttrykker GFP. 2 Selv om ikke alle de GFP-transfiserte celler virker å binde BAFF, foreligger en betydelig andel av cellene i den øverste høyre kvadrant sammenlignet med kontrollen. 33% av de transfiserte celler er øverst til høyre, sammenlignet med 8%. Det kan hende at det er nødvendig med et visst nivå av BAFF-R-ekspresjon for at BAFF skal bindes til cellene. Det er også mulig at det er nødvendig med en koreseptor for en høyaffinitets vekselvirkning, og at denne reseptor er begrensende på 293EBNAcellene.

16 1 Eksempel 4: Immunofelning av flag-hbaff med BAFF-R/Fc-fusjonsprodukt Dette eksempel beskriver den spesifikke vekselvirkning av flag-hbaff med BAFF-R/Fc, som er et molekyl satt sammen av cysteinrik domene (CRD) av BAFF-R kondensert med Fc-domene av humant IgG1. 1 CRD av BAFF-R ble generert ved RT-PCR fra BJAB-polyA + -RNA slik det ble beskrevet i eksempel 1, ved bruk av en oligo som var komplementær med nukleotidene av den hbaff-r-kodende sekvens, som 3'-primer. Det dannede PCRfragment ble klonet inn i CH269 nedstrøms for en murin IgG-kappa-signalsekvens og oppstrøms for Fc-enheten av humant IgG. Dette konstrukt ble benevnt pjst38. Konstruktet pjst38 eller CH269 ble transfisert inn i 293EBNA med lipofektamin. Kondisjonerte medier og celleekstrakter ble samlet timer etter transfeksjonen. Celler ble løseliggjort i mm Tris ph 7,/0 mm NaCl/0,% NP40/0,% deoksykolinsyre, og avfallet ble bortsentrifugert. En alikvot av det kondisjonerte medium og celleekstraktene ble slått sammen med et likt volum 2 SDS-reduserende buffer, kokt og underkastet SDS-PAGE og "western transfer". For å bekrefte ekspresjonen, ble membranen probet med en 1:3.000-fortynning av muse-anti-humant IgG konjugert med pepperrotperoksidase (HRP) i % fettfri tørrmelk i TBST ved romtemperatur i 30 minutter og vasket med TBST. Blottene ble utviklet med ECL (Amersham) og eksponert på film Immunofelninger ble utført ved å inkubere 2 ng enten flag-hbaff eller flaghtweak med 0, ml kondisjonert medium fra 293EBNA som var transfisert med enten pjst38 eller CH269, ved 4 C i 1 time under rysting, fulgt av tilsetningen av 30 l Protein A-Sepharose (Pharmacia), og rystingen ble fortsatt over natten. Protein A-Sepharose-perlene ble vasket to ganger med PBS og resuspendert i 2 SDSreduserende prøvebuffer. Etter SDS-PAGE og "western transfer", ble blottene inkubert med g/ml anti-flag-monoklonalt antistoff M2 (Sigma) i % fettfri tørrmelk i TBST ved romtemperatur i 1 time. Blottene ble vasket med TBST og inkubert med en 1:3.000-fortynning av geite-anti-muse-igg/hrp-konjugat (Jackson Immunoresearch) i % fettfri tørrmelk i TBST ved romtemperatur i 30 minutter. Blottene ble utviklet med ECL (Amersham) og eksponert på film. Etter transfeksjon av pjst38 inn i 293EBNA-celler, påviste man en ekspresjon av et ca. 43 kda tungt protein i både celleekstraktet og det kondisjonerte medium, ved "western blot"-analyse med muse-anti-humant IgG (Jackson ImmunoRe-

17 16 search), hvilket tydet på at BAFF-R/Fc-fusjonsproduktet ble virksomt uttrykt og utsondret. I immunofelningene ble et bånd observert utelukkende som et resultat av inkubasjonen av BAFF-R/Fc og flag-hbaff. Dette bånd ko-migrerte med en direkte ladet prøve av flag-hbaff. Ingen av de andre banene produserte noe signal, hvilket tydet på at vekselvirkningen mellom BAFF-R/Fc og flag-hbaff er spesifikk. Eksempel : Generering av løselige reseptorformer 1 2 For å danne en reseptorinhibitor for bruk på mennesker, trenger man den humane reseptors cdna-sekvens av det ekstracellulære domene. Hvis museformen er kjent, gjennomsøkes humane cdna-samlinger ved bruk av muse-cdna-sekvensen, og slike manipulasjoner utføres rutinemessig i dette område. Med en human cdnasekvens, kan en utforme oligonukleotidprimere for å PCR-amplifisere den ekstracellulære domene av reseptoren i fravær av transmembran og intracellulær domene. Vanligvis innlemmer man de fleste aminosyrer mellom den siste disulfidkoblede "TNF-domene" og den transmembrane domene. En kan variere lengden av "stilk"-partiet som skal innlemmes, for å optimere potensen av den dannede løselige reseptor. Dette amplifiserte stykke ville konstrueres slik at det inneholdt egnede restriksjonsseter, for å muliggjøre en kloning inn i forskjellige C-terminale Igfusjons-kimærvektorer. Alternativt kan en innføye et stoppsignal i 3'-ende og danne en løselig form for reseptoren uten å ty til bruken av et Ig-fusjonskimær. De dannede vektorer kan uttrykkes i de fleste systemer som brukes innen bioteknologien, omfattende gjær, insektceller, bakterier og pattedyrceller, og det finnes eksempler på alle typer ekspresjon. Forskjellige humane Fc-domener kan festes på for å optimere eller eliminere FcR- og komplementvekselvirkninger etter ønske. Alternativt kan muterte former for disse Fc-domener brukes for å selektivt fjerne FcR- eller komplementvekselvirkninger eller en festing av N-bundne sukre til Fc-domene, hvilket har visse fordeler. Eksempel 6: Generering av agonistiske eller antagonistiske antistoffer 30 De ovenfor beskrevne løselige reseptorformer kan brukes til å immunisere mus og fremstille monoklonale antistoffer ved konvensjonelle metoder. De dannede mab'er som identifiseres ved ELISA-metoder, kan testes nærmere for sin agonistaktivitet, enten i form av løselige antistoffer eller immobilisert på plast i forskjellige in vitrocellulære assayer. Ofte er døden av HT29-cellelinjen et bekvemt system som er føl-

18 17 somt for signalering via mange TNF-reseptorer. Hvis denne linje ikke har den aktuelle reseptor, kan hellengdes reseptor stabilt transfiseres inn i HT29-linjen for å nå gjøre det mulig for cytotoksisitetsassayet å fungere. Alternativt kan slike celler brukes i Cytosensor-apparatet for å bedømme om en aktivering av reseptoren kan utløse en ph-endring som tyder på en signaleringshendelse. Reseptorer i TNF-familien signalerer godt i et slikt format, og i denne fremgangsmåte er det ikke nødvendig å kjenne til de faktiske biologiske hendelser som utløses av reseptoren. En ville "humanisere" de agonistiske mab'er for klinisk bruk. Denne fremgangsmåte kan også brukes til å definere antagonistiske mab'er. Slike mab'er vil defineres ved en mangel på agonistaktivitet og sin evne til å inhibere reseptor/ligandvekselvirkninger ifølge overvåking ved ELISA, klassisk binding eller BIAcore-teknikker. Til slutt kan en induksjon av kjemokinutsondring av forskjellige celler som respons på et agonistantistoff, utgjøre et gjennomsøkingsassay. Eksempel 7: Søk etter inhibitorer av reseptor/ligandvekselvirkning 1 Ved bruk av reseptor/ig-fusjonsproteinet kan en søke gjennom enten kombinatoriske samlinger for å finne molekyler som kan binde reseptoren direkte. Disse molekyler kan deretter testes i et ELISA-formatert assay ved bruk av reseptor/ig-fusjonsproteinet og en løselig form for liganden for sin evne til å inhibere reseptor/ligand-vekselvirkningen. Dette ELISA kan brukes direkte for å søke gjennom forskjellige samlinger av naturlige produkter osv. for å finne inhibitoriske forbindelser. Reseptoren kan transfiseres inn i en cellelinje så som HT29-linjen for å danne et biologisk assay (i dette tilfelle cytotoksisitet), som deretter kan utgjøre gjennomsøkingsassayet. Eksempel 8: BAFF-R/IgG forårsaker en reduksjon av antallet B-celler i normale mus uker gamle BALB/c-mus av hunnkjønn ble ervervet fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Mus (3 per gruppe) fikk i.p. enten PBS, 400 g humant BAFF-R/huIgG1 (hbaff-r/ig)-fusjonsprotein (levert av Teresa Cachero, Biogen) eller 400 g renset humant IgG (HuIgG) (Sandoz, Basel, Sveits) på dagene -8, -, -1 og +2. Musene fikk 0 l % røde blodceller fra sau (SRBC) (Colorado Serum Company, Denver, CO) på dag 0. På tidspunktet for avlivningen samlet man blod ved hjertepunktur, inn i rør som inneholdt EDT, og de røde blodcellene ble spaltet i en hypotonisk buffer. Blod ble også samlet uten EDTA for serumpreparering. Enkeltcellesuspensjoner ble fremstilt

19 18 fra milter og mesenteriske lymfeknuter (MLN), og røde blodceller ble spaltet i en hypotonisk buffer. Strømningscytometri ble utført ved bruk av PE-konjugert anti- CD4R/B2, anti-syndekan/cd138 og anti-b7.2, og FITC-konjugert anti-igm og anti-cd4r/b2. Alle mab'ene ble ervervet fra Pharmingen (San Diego, CA). Kort sagt ble Fc-reseptorer blokkert med g/ml "Fc Block" (Pharmingen) i 1 minutter på is, hvoretter man tilsatte PE- og FITC-konjugerte mab'er og inkuberte dem på is i -30 minutter. Cellene ble vasket én gang og suspendert i 0,% paraformaldehyd. Cellefluorescensdataen ble innhentet på et "FACSCalibur"-strømningscytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) og analysert ved bruk av "CELLQuest"-programvare (Becton Dickinson). 1 Etter behandling med hbaff-r/ig forelå ca. 0% reduksjon av antallet B-celler i perifert blod og i de perifere lymfeorganer som ble undersøkt. B2 høy IgM lav -B-celler utgjorde henholdsvis 23,4% og 21,% av cellene i de PBS-behandlede hhv. HuIgG-behandlede mus, mens denne populasjon kun utgjorde 9,9% av cellene i hbaff-r/ig-behandlede mus. Plasmacelleantallet (sndecan/cd138 + ) virket også å være noe nedsatt, idet det forelå,7% hhv. 4,8% i blodet av henholdsvis PBS-behandlede og HuIgG-behandlede mus, sammenlignet med 3,9% i hbaff-r/ig-behandlede mus. B7.2-molekylet ble oppregulert på henholdsvis 3,1% og 4,% av B2 + -cellene i de PBS-behandlede hhv. HuIgG-behandlede mus, sammenlignet med 1,9% i de hbaff-r/ig-behandlede mus. 2 I milten var B2 høy -B-celleantallet merkbart redusert i hbaff-r/ig-behandlede mus, idet de utgjorde 18,8%, sammenlignet med 36,7% og 40% i henholdsvis de PBS- og HuIgG-behandlede mus. Denne reduksjon ble observert i både IgM høy - og IgM lav -delpopulasjonen (se tabell 8A). Man observerte ingen endring i den nylig dannede B-celleavdeling i milten, B2 lav IgM høy (data ikke vist). Plasmacelleantallet (syndecan/cd138 + ) virket også å være noe nedsatt, hvor det forelå 3,3% hhv. 3,4% i milten av henholdsvis PBS-behandlede og HuIgG-behandlede mus, sammenlignet med 2,4% i hbaff-r/ig-behandlede mus. 30 MLN oppviste en reduksjon i B2 + -B-celleantallet, idet det forelå 14,1% i hbaff-r/ig-behandlede mus sammenlignet med 26,7% hhv. 3,8% i henholdsvis PBS-behandlede og HuIgG-behandlede mus. Dataen oppsummeres i tabell 8A.

20 19 Tabell 8A: B-cellepopulasjoner i hbaff-r/ig-, PBS- og HuIgG-behandlede mus 1 Blod B2 høy IgM lav Syndecan B7.2/B2 lav PBS 23,4 ±,7,7 ± 1, 3,1 ± 0, HuIgG 21, ± 4, 4,8 ± 0,9 4, ± 1,0 HBAFF-R/Ig 9,9 ± 1,8 3,9 ± 0,6 1,9 ± 0, Milt B2 høy IgM lav B2 høy IgM + Syndecan PBS 27,8 ± 1,6 11,9 ± 1,6 3,3 ± 0,8 HuIgG 30, ± 2 11,8 ± 1,0 3,4 ± 0,7 HBAFF-R/Ig,6 ± 0,2 8,4 ± 0,2 2,4 ± 0,2 MLN B2 + PBS 26,7 HuIgG 3,8 ± 3,3 HBAFF-R/Ig 14,1 ±,9 1 Musene ble behandlet slik det beskrives i Materialer og metoder, og dataen oppgis som prosent ± standardavviket Den nedsatte andel av B B-celler i blod- og plasmaceller i blodet og miltene av hbaff-r/ig-behandlede mus etter immunisering med SRBC'er tyder på at det foreligger en inhibering av B-celle-aktiveringen og/eller -modningen og eventuelt en hevet eliminering av aktiverte B-celler. En meget liten prosentdel antigen-spesifikke B-celler ville aktiveres og reagere på noe antigen, i dette tilfelle SRBC. Fordi hbaff-r/ig-behandlingen førte til en såpass dramatisk reduksjon av prosentdelen B-celler i alle de undersøkte vev, ca. 0%, virker aktiviteten av hbaff-r/ig også å rette seg mot hvilende, modne B-celler. 1 Man vurderer derfor at BAFF-R-fusjonsprotein kan brukes som et terapeutisk legemiddel med en klinisk anvendelse i B-celle-medierte sykdommer. Sykdommer omfatter slike som er autoimmune av natur, så som systemisk lupus erythematose, myasthenia gravis, autoimmun hemolytisk anemi, ideopatisk trombocytopenia purpura, anti-fosfolipid-syndrom, Chagas sykdom, Graves sykdom, Wegeners granulomatose, polyarteritt Nodosa og raskt fremskridende glomerulonefritt. Det terapeutiske middel finner også anvendelse i plasmacelleforstyrrelser så som multippelt myeloma, Waldenstroms makroglobulinemi, Heavey-kjede-sykdom, primær eller immunocytt-assosiert amyloidose og monoklonal gammopati av ubestemt signifikans (MGUS). Onkologimål omfatter B-celle-karsinomaer, leukemier og lymfomaer.

21 Eksempel 9: Blokkering av BAFF-indusert B-celleproliferasjon in vitro ved bruk av løselig BAFF-R I dette eksempel viser vi at det løselige BAFF-R/hIgG1-fusjonsprotein har evnen til å blokkere en BAFF-indusert B-celleproliferasjon i musesplenocytter. Murine splenocytter ( celler/ml) fra Balb/c-mus ble isolert og dyrket i en 96- brønners plate i 0 l RPMI (Life Technologies) supplementert med % føltalt kalveserum (JRH), 2 mm glutamin, 0 enheter/ml penicillin og 0 mg/ml streptomycin (Life Technologies). Deretter ble forskjellige mengder humant BAFF, g/ml humant BAFF-R/hIgG1 eller humant Ig, samt g/ml anti-muse-overflate- -Heavey-kjede (Jackson ImmunoResearch) tilsatt. Etter 48 timer i kultur ved 37 C, ble cellene pulsbehandlet i 24 timer med 1 Ci/brønn [metyl- 3 H] tymidin (Dupont NEN) og samlet ved bruk av en cellesamler fra Tomtec (Orange, CT). Radioaktiviteten ble målt i en Betaplate-væskescintillasjonsteller (Pharmacia Biotech). 1 Fig. 8 viser resultatene av splenocytt-proliferasjonsassayet. Vist er tellingen per minutt (CPM) innlemmet i muse-splenocyttceller mot mengden humant BAFF-reagensmiddel som ble tilsatt. Mengden anti- eller fusjonsprotein eller kontroll-higg holdes konstant ved g/ml. De sorte firkanter representerer proliferasjonsnivået som induseres av BAFF alene. De sorte sirkler representerer proliferasjonen av cellene med BAFF og anti-. Kurven med de hvite triangler representerer inhiberingen som observeres når BAFF-R/hIgG1-BAFF tilsettes med anti- plus BAFF-R/hIgG1. De hvite ruter representerer inhiberingen som observeres med kontroll-humant Ig Tilsetningen av BAFF plus anti- fører til en proliferasjon av muse-splenocytter in vitro. Mengden av 3 H-tymidin innlemmet i cellene er betydelig høyere enn nivået som oppnås ved tilsetning av enten kun BAFF eller kun anti- til splenocyttene. Behandlingen av splenocyttene med BAFF alene fører kun ved meget høye konsentrasjoner til en 3 H-tymidin-innlemmelse. Tilsetningen av kun anti- fører ikke til noen proliferasjon. Når g/ml kontroll-humant Ig ble tilsatt til splenocyttene med hevede mengder BAFF og g/ml anti-, forelå en svak nedsettelse av proliferasjonsnivået. Derimot når g/ml humant BAFF-R/hIgG1-fusjonsprotein tilsettes til assayet under de samme betingelser, nedsettes proliferasjonen til det nivå som observeres for en behandling med kun BAFF. Dette tyder på at BAFF-R/hIgG1- fusjonsproteinet har evnen til å inhibere proliferasjonen av splenocytter som induseres av BAFF og anti-.

22 21 Eksempel : Blokkering av BAFF-bindingen til Raji-celler ved bruk av BAFF-R/hIgG1 I dette eksempel beskrives en forinkubasjon av BAFF med BAFF-R/hIgG1-fusjonsprotein som fører til en nedsettelse av BAFF-bindingen til Raji-B-cellelymfomalinjen. 1 I dette FACS-assay ble 0 ng/ml flag-tagget humant BAFF forhåndsinkubert med enten humant BAFF-R/hIgG1 eller humant LT R/hIgG1 i to forskjellige fortynninger fra g/ml til 39 ng/ml eller intet fusjonsprotein, i 30 minutter på is. Inkubasjonen fant sted i en FACS-buffer som inneholdt PBS uten Ca 2+ eller Mg 2+ plus % FCS (JRH) og 0,0% natriumazid. Etter forinkubasjonen, ble BAFF-fusjonsproteinblandingen tilsatt til 6 Raji (ATCC)-celler/ml. Denne inkubasjon fant sted i 30 minutter på is, og deretter ble cellene vasket med 2 ml FACS-buffer ved 4 C. For å påvise det bundne BAFF, tilsatte man g/ml anti-flag-antistoff M2 (Sigma) til cellene, og inkuberte i 30 minutter på is. Cellene ble igjen vasket som beskrevet ovenfor, og deretter inkubert med en 1:0-fortynning av PE-konjugert esel-antimuse-ig (Jackson ImmunoResearch) i 30 minutter på is. Etter at cellene igjen var blitt vasket med FACS-buffer, ble de fiksert med 1% paraformaldehyd og avlest ved "FACS" (Becton Dickinson and Co.). Fig. 9 viser resultatene av BAFF-blokkeringsassayet. Vist er MFI-avlesningene (midlere fluorescensintensitet) fra en "FACS"-analyse som undersøkte BAFF-bindingen til Raji-celler. De sorte firkanter representerer dataen når humant BAFF-R/hIgG1 forinkuberes med BAFF før binding til cellene. Sirklene viser kurven som resulterer fra en tilsetning av et ikke-spesifikt fusjonsprotein, humant LT R/hIgG1, til BAFF. x-aksen representerer mengden av fusjonsprotein som ble tilsatt til 0 ng/ml BAFF før inkubasjon med cellene Når intet fusjonsprotein ble forinkubert med humant BAFF, var den midlere fluorescensintensitet (MFI) av prøven 80. Når humant LT R/hIgG1 forinkuberes med BAFF, selv i konsentrasjonen g/ml, forblir verdien av BAFF-bindingen til Rajiceller uforandret. Når imidlertid humant BAFF-R/hIgG1 forinkuberes med BAFF, observeres en betydelig nedsettelse av MFI, ned til -2 selv med 62 ng/ml fusjonsprotein. Bakgrunns-MFI-verdien for dette eksperiment er 7. Dermed er BAFF-R/hIgG1 meget virksomt ved blokkering av BAFF-bindingen til Raji-B-celler.