Nevroendokrin regulering av kjønnsmodning

Transkript

1 Nevroendokrin regulering av kjønnsmodning Finn-Arne Weltzien Norges veterinærhøgskole NFR Havbrukskonferanse april 2012

2 Regulering av pubertet og kjønnsmodning

3 Hjerne-hypofyse-gonadeaksen External stimuli (temperature, photoperiod, pheromones, etc.) Hjerne GnRH Dopamin + - Internal stimuli (biological clocks, nutritional status, etc.) GnRH = gonadotropi n-releasi ng hormone FSH = folli cle-sti mulati ng hormone LH = luteinizing hormone Hypofyse FSH LH + + Kjønnssteroider ++ +/- Gonader Steroidogenese og Gametogenese

4 Plasmanivå av FSH og LH hos regnbueørret - Hvordan reguleres den differensierte sekresjon av FSH og LH? Davies et al 1999 Gen Comp Endocrinol

5 NFR Havbruk: Differensiert regulering av FSH og LH Cellesignalering (elektrofysiologi / Ca 2+ imaging) Endringer ved pubertet Regulering av gonadotrope celler BPGkomponenter i tidlig utvikling Sesongvariasjoner Globalt genuttrykk (High-throughput sekvensering)

6 Komplementære modeller Medaka (Oryzias latipes) Torsk (Gadus morhua)

7 Oversikt 1. Elektrofysiologi og Ca 2+ imaging i gonadotrope celler 2. Transkriptomanalyse i gonadotrope celler

8 Mange endokrine celler fyrer aksjonspotesialer Frislipp av nevrotransmitter Na + Na + Ca 2+ Frislipp av nevrohormon Na + Ca 2+ Hormonsekresjon fra endokrine celler Na + Ca 2+

9 Dette involverer bl.a. Ca 2+ -strømmer Voltagedependent channels Agonistgated channels Ca 2+ Storeoperated channels Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ ATP ATP 3Na + Ca 2+- binding proteins Ca 2+ Endoplasmic reticulum Mitochondria K + Voltagedependent channels Ca 2+ -activated channels

10 Membranpotensial og hormonsekresjon varierer med [Ca 2+ ] i

11 Metode: Primærkultur fra hypofyse 1) Modnende torsk 2) Disseksjon av hypofyse Hypofyse 3) Primær cellekultur i petriskåler (Hodne et al Gen Comp Endocrinol 2012) 4) Elektrofysiologi / Ca2+ imaging Poreforming antibiotics Permeant ions Impermeant solutes

12 Spontane aksjonspotensialer fra gonadotrop celle hos torsk (sesongavhengig) Vmembrane (mv) s Haug et al. Neuroendocrinology 2007

13 Identifikasjon av ionekanaler i cellemembran Na+ L Ca2 K+ K+ 4-AP s ensitive vol ta ge gated (A-type) pota ssium channels TEA s ensitive vol ta ge gated (delayed rectifiers) pota ssium channels + Ni fedipine s ensitive vol ta ge gated L-type Ca l cium channels Bl ocking the calcium cha nnels wi th cobalt reduced outwa rd currents 20 Vmembrane (mv) TTX s ensitive vol ta ge gated s odium channels K+ 0 Indikasjon på Ca 2+ a kti verte K+ ka naler s Haug et al. Neuroendocrinology 2007

14 Single-cell qpcr for identifisering av cellene Gonadotrope celler (FSH og LH) cell harvest a) For fenotyping av celler etter elektrofysiologi b) Genekspresjonsstudier 18 qpcr -(d/dt) fluorescence fluorescence amplification curve 1 cell 1 cell -RT EC NTC Høsting av cytosol gjennom Patch-pipetten revers transkripsjon cdna presipitering 0 cycle number Temperatur, C Hodne et al BMC Mol Biol 2010

15 Identifikasjon av spesifikke GnRH reseptorer i gonadotrope celler Harvesting of cytosol trough a patch pipette Linear amplification of RNA Reverse transcription of RNA into cdna Hodne et al. in prep

16 Både FSH- og LH-celler får økt cytosolisk Ca2+ etter GnRH-stimulering (Fura-2 målinger) LH celle 0.5 ratio 50 s GnRH FSH celle GnRH Hodne et al. in prep

17 LH- og FSH-produserende celler viser ulik respons til GnRH (sesongavhengig) LH-celle FSH-celle 0 mv 0 mv GnRH GnRH Hodne et al. in prep

18 Kalsium-aktiverte kaliumkanaler (Kca) deltar i reguleringen av gonadotrope celler hos torsk Single-cell qpcr Halestrøm blokkeres vha KCa kanal blokkere 10 na 1s Hodne et al. in prep

19 Modell for LH-produserende celle hos torsk Na L + Ca2 K+ + Ca2+ Store IP3 γ β Na + L Ca2 α PLC PIP2 SK K+ K(Ca) + GnRH 1b and/or 2a receptor

20 Modell for FSH-produserende celle hos torsk Na L + Ca2 + BK L K(Ca) Ca2 K+ Ca2+ Store - Forskjellige signalveier fra GnRH-binding til sekresjon IP3 sesong - Genutrykk og membranegenskaper varierer med γ β Na + α PLC L Ca2 + K+ GnRH 1b and/or 2a receptor PIP2

21 Oversikt 1. Elektrofysiologi og Ca2+ imaging i gonadotrope celler 2. Transkriptomanalyse i gonadotrope celler

22 RNA-seq av lhb-gfp celler hos medaka - Transkriptomet før og etter pubertet Ager-Wick et al. in prep

23 Fra DNA-chips til RNA-Seq Ser bare det som er på chipen Én verdi per probe Unbiased deteksjon Millioner av korte sekvenser (reads) Normalisering Differensiert uttrykk Mapping/Kvantifisering Normalisering Differensiert uttrykk/alternativ splicing/ nye gener

24 Isolering av lhb-gfp gonadotrope celler lhb-gfp transgen medaka (hunnfisk) Disseksjon av hypofyser lhb-gfp gonadotroper sortert vha FACS RNA isolert fra lhb-gfp gonadotroper

25 Sekvensering av transkriptomet i LH-celler cdna syntetisert fra isolert RNA og amplifisert Amplifisert cdna sequenced vha Illumina HiSeq2000 Samarbeid med Norwegian Sequencing Center (Dr Robert Lyle, Ullevål sykehus)

26 Noen tall Stadium Hypoofyser Celler RNA cdna* Sekvenser (reads) Juvenil ng 3 µg 81 x 106 Adult ng 5 µg 68 x 106 * etter a mplifisering Ager-Wick et al. in prep

27 Mapped reads (%) Reads mapped til genom % 94 % Adult Juvenile

28 Expressed genes (%) Andel gener som er uttrykt i LH-celler % Juvenile 78 % Adult

29 Eksempel 1: Genuttrykksmønster 0 Juvenil 100 Adult

30 Eksempel 2: Spesifikke gener lhb genet er svært høyt uttrykt i LH-celler fra både juvenil og voksen medaka GnRH reseptorer (3 stk) er uttrykt på ulike nivå i LH-celler fra juvenil og voksen medaka Alle Ca2+-aktiverte K+-kanaler (BK, IK, SK1, SK2, SK3) er uttrykt i LH-celler

31 Konklusjon - transkriptomikk 1. Metode etablert for sekvensering av transkriptomet i LH- celler 2. Sekvensering av celler fra juvenile vs adulte hunnfisk 3. Sekvensanalyser pågår - Hvordan endrer gonadotropene seg gjennom pubertet? - Reseptorer for GnRH o.a. - Ionekanaler, spesielt KCa og Ca2+ - Intracellulære signalveier

32 Acknowledgements Finn-Arne Weltzien Rønnaug Strandabø Trude M. Haug Isabelle Heikkinen Jon Hildahl Rasoul Nourizadeh-Lillabadi Nouri Salima Aroua Kjetil Hodne Stine Berg Vaule Gunnveig Toft Bjørndal Kristine von Krogh Eirill Ager-Wick Rikke Lifjeld Line Victoria Moen

33 BAC konstrukt 25 kb upstream of lhb translation start site lhb exon 1 hrgfpii lhb Kozac + intron 1 ATG BAC golwb108_h20 BAC = Bacterial Artificial Chromosome 78 kb downstream of lhb lhb exon 2 poly A

34 lhb & lhr developmental gene expression - qpcr lhb 0,00025 B B 0,012 Norm s ta rt mrna exp lhr Norm s ta rt mrna exp 0,014 0, ,010 0,008 0,00015 AB AB AB AB AB 0,006 0,004 A 0,002 A A A AB 0,00010 A A AB 0,00005 AB AB AB AB AB AB AB A 0, hpf dpf 0, hpf dpf

35 Oversikt over delprosjekter 1. Transgen medaka (gfp-lhb) ny funksjon i tarm? 2. The first kiss of life 3. Elektrofysiologi og kalsium-imaging 4. Transkriptomanalyse i gonadotrope celler 5. Veien videre

36 Hjerne-hypofyse-gonadeaksen External stimuli Internal stimuli (temperature, photoperiod, pheromones, etc.) (biological clocks, nutritional status, etc.) Hjerne GnRH = gonadotropi n-releasi ng hormone FSH = folli cle-sti mulati ng hormone LH = lutei ni zi ng hormone GnRH Dopamin + Hypofyse FSH LH + + Gonader Steroidogenese og Gametogenese Kjønnssteroider ++ +/-

37 Mikroinjeksjon på én-cellestadiet (transgene linjer, gene knock-down)

38 Transgen linje lhb-gfp - medaka 4 dpf Collaboration: Dr K Okubo and Dr Y Nagahama

39 lhb-gfp uttrykk hpf 48 hpf 200 m 48 hpf 200 m 48 hpf 48 hpf 200 m 48 hpf 200 m 48 hpf 70 μm 70 μm 96 hpf 200 m 96 hpf 200 m Hildahl et al 2012 Dev Dyn

40 lhb-gfp uttrykkes først i tarm Dette bildet k an ik k e v ises for øy eblik k et. 4dpfLH i tidlig tarm? - Hva gjør Dette bildet k an ik k e v ises for øy eblik k et. 4dpf 4dpf Hildahl et al 2012 Dev Dyn

41 Developmental tracing of lhb gene expression using gfp-transgenic medaka reveals a putative novel developmental function Photo: K Okubo Collaboration: Dr K Okubo and Dr Y Nagahama

42 Oversikt over delprosjekter 1. Transgen medaka (gfp-lhb) ny funksjon i tarm? 2. The first kiss of life 3. Elektrofysiologi og kalsium-imaging 4. Transkriptomanalyse i gonadotrope celler 5. Veien videre

43 Hjerne-hypofyse-gonadeaksen External stimuli Internal stimuli (temperature, photoperiod, pheromones, etc.) (biological clocks, nutritional status, etc.) Hjerne GnRH = gonadotropi n-releasi ng hormone FSH = folli cle-sti mulati ng hormone LH = lutei ni zi ng hormone GnRH Dopamin + Hypofyse FSH LH + + Gonader Steroidogenese og Gametogenese Kjønnssteroider ++ +/-

44 Kisspeptin «The gatekeeper of GnRH neurons» Pineal Fotoperiode Melatonin Gonader Binyrer Kjønnsteroider Glukokortikoider KISS nevron GnRH nevron

45 qpcr viser embryonalt uttrykk av kiss ligander og reseptorer Hodne et al (in prep.)

46 Knockdown av kiss ligand eller reseptor gir store misdannelser i utvikling av øyne og forhjerne Villtype Kiss1 KD Kissr2 KD Kissr1 KD A E I B F J Six3 Dag 1 M Dag 3 Øye N Manipulasjon for å hindre kjønnsmodning C - Hvilke følger får det? G K O Dlx2 Dag 2 Øye D H L Dag 3 Øye Hodne et al (in prep.) P

47 Involvement of calcium activated potassium channels (Kca) in regulating the electrical properties of gonadotrope cells in cod Hodne et al. in prep

48 Involvement of calcium activated potassium channels (Kca) in regulating the electrical properties of gonadotrope cells in cod The s ize of the tail current va ries depending on the s eason The s ize of the tail current correlates with the s ize of the fa s t after hyperpolarization (AHP) in fshb producing cells but NOT i n lhb producing cells 25 AHP (mv ) Y = ± X ± R = Tail p (AS ) Ap duratio n (ms) R = Tail p (AS) Hodne et al. in prep