Vekst og kjønnsmodning i kveite: Interaksjoner og koblinger til lysperiode

Transkript

1 Sluttrapport, prosjekt nr /122 Vekst og kjønnsmodning i kveite: Interaksjoner og koblinger til lysperiode Birgitta Norberg og Finn-Arne Weltzien Prosjektansvarlig: Dr Birgitta Norberg, Havforskningsinstituttet, Austevoll Havbruksstasjon 5392 Storebø Samarbeidspartnere: Dr Penny Swanson, National Marine Fisheries Service, Northwest Fisheries Science Center, Seattle, USA Dr Mark Porter, Professor Niall Bromage Stirling University, Stirling, Skottland

2 SAMMENDRAG Til tross for at gytetidspunkt relativt enkelt lar seg styre i kveite ved hjelp av lysmanipulering, har man ennå ikke lykkes i å finne effektive metoder for å utsette tidspunkt for første kjønnsmodning og samtidig få økt vekst i hannfisk. Resultater fra tidligere forsøk antyder at en kortdagsperiode kan være effektiv, men vi trenger fortsatt mer kunnskap om de bakenforliggende mekanismer for lysoppfatning og formidling av lyssignaler i kveite. Individobservasjoner på hunnkveite tilsier at disse har en meget raskt vekst i perioden foran pubertet. Det finnes imidlertid ikke noen vitenskapelig dokumentasjon på dette. Lønnsomt matfiskoppdrett av kveite forutsetter en tilvekst fra 1 g til 5 kg på 3 måneder. Økt kunnskap om sammenhengen mellom vekst, pubertet og kjønnsmodning i hann- og hunnkveite er en forutsetning for å oppnå et slikt tilvekstmål. Det ble derfor gjennomført et forskningsprosjekt hvor sentrale mekanismer for lysoppfatning, sammenhenger mellom lysperiode, vekst og kjønnsmodning, samt prepubertal vekst i hunnveite ble forsøkt belyst. Hovedaktiviteten ble konsentrert om to problemstillinger: 1) Lysoppfatning, målt som plasmakonsentrasjon av melatonin i kveite eksponert for ulike lysregimer. 2) Vekstmønster og utvikling av plasmanivåer av sentrale hormoner i hann- og hunnkveite i perioden fra juvenil fisk frem til og med første (hunnfisk) eller andre (hannfisk) kjønnsmodning. De viktigste funnene var: 1) Døgnsprofilen av melatonin i kveiteplasma er avhengig av lysinstensiteten, og selv lave lysintensiteter (1 lux) nattestid reduserer melatoninivået sammenlignet med mørke ( lux). 2) Hunnfisken i forsøket økte eksponensielt i vekt gjennom hele perioden frem til første kjønnsmodning. Vekten ble nær tredoblet i en 18-månedersperiode som startet to år før første kjønnsmodning 3) Hannfisken ble kjønnsmoden tre år før hunnfisken (hhv 5 og 8 års alder), og dette ble gjenspeilet i veksten slik at hannfiskenes gjennomsnittsvekt var 8% av hunnfiskenes ved fire års alder, 65% ved fem års, og 5% ved seks års alder. 4) Plasmanivå av kjønnshormoner varierte i henhold til modningsstatus hos fisken. Et respektive to år før første kjønnsmodning var det mulig å detektere såkalte dummy runs, dvs forhøyede nivåer av 11-ketotestosteron (11-KT) i hannfisk og estradiol-17β (E2) i hunnfisk i perioden på året hvor gonadene normalt vokser raskt hos modnende individer. 5) Målemetode for kvantifisering av IGF-1 i kveite ble etablert og plasmanivåer av IGF-1 ble for første gang målt i kveite. 2

3 BAKGRUNN Forringet kjøttkvalitet og dårlig vekst i hannfisk på grunn av tidlig kjønnsmodning er et av hovedproblemene i moderne, intensivt fiskeoppdrett. For kveite har økonomiske beregninger vist at man kan oppnå en vesentlig reduksjon i produksjonskostnadene hvis problemet med tidlig kjønnsmodning kan elimineres (Engelsen, 1995). I Atlantisk laks har tilleggsbelysning i enkelte livsfaser vist seg å gi både økt vekst, bedre fôrutnyttelse, og utsatt tidspunkt for første kjønnsmodning (Hansen et al. 1992, Taranger et al. 1995, Oppedal et al. 1997). Tilsvarende metoder gir ikke samme resultater for regnbueørret (Solbakken et al, upubl), noe som understreker artsvariasjonen i reguleringen av pubertet og kjønnsmodning. Forsøk på torsk i kar innendørs viste at kjønnsmodningen ble blokkert når fisken ble holdt på kontinuerlig fotoperiode (Hansen et al. 1995). Gytetidspunkt hos kveite er mulig å styre ved fotoperiodemanipulering (Næss et al 1996; Bjørnsson et al. 1998; Norberg et al. 21). Forsøk på å utsette tidspunktet for første kjønnsmodning i hannkveite ved å holde den på kontinuerlig lys har så langt gitt uklare resultater. Imidlertid oppnådde vi nylig, vha fotoperiodemanipulering å påvise en markert nedgang i andelen kjønnsmoden hannkveite (Norberg et al. 21). Hannfisk som gikk på kontinuerlig lys i ett år for deretter å bli overført til naturlig fotoperiode midtsommers året før forventet modning, hadde en modningsandel på bare 26%, sammenlignet med 55% for de som gikk på naturlig fotoperiode. For å reprodusere og ytterligere forbedre disse resultatene, er det nødvendig å øke vår forståelse av de bakenforliggende årsakene til kjønnsmodning. Det ble derfor igangsatt forsøk for å belyse noen av de regulerende mekanismene for vekst og kjønnsmodning i kveite. MATERIALE OG METODER Forsøk 1. Kjønnsavhengig vekst og modningstidspunkt. Fisk, forsøksbetingelser og prøvetaking Prosjektet startet i januar Hunnkveite fra 1992-årsklassen ble fulgt frem til at første kjønnsmodning og gyting var avsluttet, sommeren 2. Fisken ble holdt i et innendørs 7mkar med naturlig fotoperiode og sandfiltert sjøvann fra 55m dyp. Vanntemperaturen varierte i løpet av året, mellom 5-7 grader i mars og grader i oktober. Fisken ble fôret etter appetitt, 3 ganger per uke. All fisk ble veid, målt og blodprøver tatt med 4-6 ukers mellomrom. Blodprøvene ble sentrifugert umiddelbart, plasmafraksjonen ble frosset på tørris og oppbevart ved -8 C.Prøvetakingen av fiskegruppen som ble benyttet i prosjektet startet opprinnelig i januar 1994, da fisken nærmet seg to års alder. Begge kjønn inngikk i den opprinnelige fiskegruppen. Måling, veiing og blodprøvetaking av alle individer skjedde med 2-3 måneders mellomrom fra januar 1994 til juni I november 1998 ble all fisken veiet, 3

4 og hannene ble deretter tatt ut av forsøket. For å utnytte prosjektmidlene best mulig, ble også prøvene og registreringene fra perioden tatt med i materialet som ble analysert. Forsøk 2. Effekt av lysintensitet på uskillelse av melatonin hos juvenil kveite Høsten 1999 ble det gjennomført to forsøk for å studere effekt av lysintensitet på utskillelse av melatonin hos kveite. Egenprodusert kveite av 1998-årsklassen (1+-fisk), med en vekt mellom 15 og 4 gram ble brukt. Forsøk 2a Dagslysintensiteten ble satt til 1 lux, mens nattlysintensitet ble satt til henholdsvis, 1, 1 og 1 lux. Hensikten var å finne ut hvor stor forskjell i intensitet som skal til for at fisken skal skille mellom dag og natt. Forsøk 2b Fisken ble holdt døgnet rundt på henholdsvis, 1, 1 og 1 lux. Prøvetaking Etter en ukes akklimatisering til forsøksbetingelsene ble 8 individer per gruppe tatt ut for blodprøvetaking 7 ganger i løpet av et døgn: klokken 13., 18., 21., 1., 6., 9. og 13. fisken som var brukt til prøvetaking ble deretter tatt ut av forsøket. Prøvene ble behandlet som beskrevet ovenfor i Forsøk 1. Prøvene ble sendt til University of Stirling, hvor de ble analysert for innhold av melatonin i samarbeid med dr Mark Porter og professor Niall Bromage. Analyser Plasmainnhold av E2 (hunnfisk), 11-KT (hannfisk) og testosteron (T; hunn- og hannfisk) ble analysert med ELISA (Cuisset et al., 1996; Rodriguez et al, 2). Ny analysemetode (RIA) for analyse av det vekstregulerende hormonet insulin-lignende vektsfaktor 1 (IGF-1) ble satt opp og tilpasset kveite ved laboratoriet på Austevoll havbruksstasjon (Shimizu et al. 2). Plasmainnhold av melatonin ble analysert med RIA (Randall et al, 1995; Porter et al, 2). 4

5 RESULTATER OG DISKUSJON a) Analysemetodikk Steroider En stor innsats innen prosjektet har blitt lagt på å overføre radioimmunologiske analysemetoder (RIA) for steroidhormoner til immunkjemiske metoder hvor man ikke bruker radioaktive isotoper (EIA). EIA er både sikrere, billigere, mer effektiv og mer miljøvennlig og det har derfor vært sterkt ønskelig å overføre steroidanalysene til denne type metode ved Austevoll havbruksstasjon. EIA for analyse av E2, 11-KT, T, kortisol og thyroidhormon er nå etablerte for rutinemessige analyser og validerte mot tidligere utviklede og publiserte RIAmetoder (se for eksempel Hyllner et al, 1994). Analyser av IGF-1 har ikke tidligere vært utført i kveite. Derfor ble en del av innsatsen i prosjektet lagt på å tilpasse og validere en eksisterende RIA-metode til vårt laboratorium. Metoden viste seg å fungere meget tilfredsstillende. En seriefortynning av kveiteplasma var parallell med standardkurven. Deteksjonsgrensen var 5 pg og standardkurven var lineær mellom 1 og 15 pg. Intraassayvariasjonen var 8,3% (n=12) og interassayvariasjonen var 6,2% (n=6) b) Kroppsvekst i hunnkveite fra 2 til 8 års alder En gruppe hunnkveite av 1992-årsklassen ble veid hver annen til hver tredje måned fra januar 1994 til juni 2. Fisken viste stort sett eksponentiell vekst fra forsøkets start frem til høsten 1999, da fisken nærmet seg første kjønnsmodning. Høst/vinter/vår stoppet veksten kraftig opp i forbindelse med første kjønnsmodning og gyting. Raskest vekst ble observert fra januar 1998 til juli 1999, da snittvekten nær ble tredoblet fra ca 6 til ca 17 kg. Det er verd å merke seg at veksten flatet ut høst/vinter 1998, ett år før de fleste fiskene var kjønnsmodne første gang. c) Kroppsvekst i hannkveite fra 2 til 6 års alder En gruppe hannkveite av 1992-årsklassen ble veid hver annen til hver tredje måned fra januar 1994 til november1998. Fisken var kjønnsmoden (rennende melke) både vinteren 1997 og vinteren Veksten var klart redusert eller negativ i de perioder fisken var kjønnsmoden eller modnende, dvs mellom august 1996 og april 1997 og mellom september 1997 og april Relativt god vekst mellom disse periodene kunne ikke kompensere for veksttapet ved kjønnsmodning og hannfisken var omtrent halvparten så stor som hunnfisken i november

6 2 16 weight (g) date Fig 1. Kroppsvekst (vektøkning) i hunnkveite fra 2 til 8 års alder 1 8 Weight (g) Date Fig 2. Kroppsvekst (vektøkning) i hannkveite fra 2 til 6 års alder 6

7 d) Plasmanivåer av kjønnsteroider i hunn- og hannkveite Plasmanivåene av E2 (hunnfisk) og 11-KT (hannfisk) er analysert gjennom hele forsøket. Steroidnivåene gjenspeiler kjønnsmodningsforløpet i fisken, med maksimale verdier på henholdsvis 16,5 ± 3,2 ng/ml i februar årstall? (E2) og 12, ± 1,1 ng/ml i januar årstall? (11- KT). En interessant observasjon er at nivåene av E2 i hunnkveite viser forhøyde verdier i tidsrommet for vitellogenesen både ett og to år før første kjønnsmodning, og nivåene av 11- KT i hannfisk er forhøyede ett år før første kjønnsmodning. Tilsvarende observasjoner er gjort i andre arter hvor fisken gjennomfører en eller flere såkalte dummy runs hvor hormonnivåene blir høyere for hvert år, før de endelig er høye nok til å stimulere gonadevekst og gyting. Også T er analysert i både hunn- og hannfisk, men dataene er ennå ikke ferdig bearbeidet. 15 date vs 11-KT (ng/ml) 1 11-KT (ng/ml) 5 jan.94 mai.94 sep.94 jan.95 mai.95 sep.95 jan.96 mai.96 sep.96 jan.97 mai.97 sep.97 jan.98 mai.98 date Fig. 3 Plasmanivåer av 11-ketotestosterone i hannkveite fra 2 til 6 års alder. Merk forhøyede nivåer mellom desember 1995 og mars 1996, et år før første kjønnsmodning 7

8 ,5,45,4 Estradiol-17β (ng/ml),35,3,25,2,15,1,5, date 2 15 E2 (ng/ml) date Fig 4. Plasmanivåer av estradiol-17β i hunnkveite fra 2 til 8 års alder. Merk forhøyede nivåer i januar 1998 og 1999, to respektive et år før første kjønnsmodning. ) Plasmanivå av IGF-1 i kveite Plasmanivåer av IGF-1 ble målt i hannkveite fra juvenilt stadium, gjennom pubertet og to kjønnsmodninger. Gjennomsnittsnivåene varierte mellom 9,4 ±,6 ng/ml (n=2) til 26,9 ± 2,1 (n=12), men det var vanskelig å se noen mønstre i forandringene. I fremtidige studier bør prøvetakingen skje med tettere intervall, for å øke oppløsningen. IGF-1-nivåer i hunnkveite ble ikke målt, fordi det ikke var mer ressurser innenfor prosjektet. Dette vil bli imidlertid bli gjort i forbindelse med annen prosjektaktivitet ved HI. 8

9 3 25 IGF-1 (ng/ml) date vs IGF-1 (ng/ml) jun des jun des jun des jun des jun date Fig 5. Plasmaprofil av IGF-1 i hannkveite. Prøvene ble tatt med 1-3 måneders intervaller fra 1994 til f) Effekt av lysintensitet på melatoninprofil Forsøk 2a Døgnprofilen av melatonin i kveiteplasma var avhengig av lysintensiteten. Selv lave lysintensiteter (1 lux) nattestid førte til reduserte melatoninivåer i plasma sammenlignet med kontrollgruppen. Allikevel var en melatonintopp tydelig i alle gruppene klokken 6., da fisken i kontrollgruppen hadde en gjennomsnittsverdi på 54,4 ± 1 ng MT/ml, 1lux-gruppen hadde 9,1 ± 1,9 ng MT/ml, 1lux-gruppen 1,2 ± 5,8 ng MT/ml og 1lux-gruppen hadde 6,1 ± 2,5 ng MT/ml.. De individuelle variasjonene var store ved noen av prøvetakingene men resultatene tyder på at kveite, i likhet med torsk, kan ha en såkalt B-profil hvor melatoninutskillelsen skjer først noen timer etter mørkets utbrudd. Dette er et annet mønster enn hva som er vist for eksempel i Atlantisk laks, hvor melatoninutskillelsen er høy i hele mørkeperioden. Imidlertid hadde to enkeltfisk i kontrollgruppen svært høye nivåer ved første prøvetaking i mørkeperioden. (131 respektive 229 ng/ml, i motsetning til 1-4 ng/ml i de øvrige forsøksindividene). Dette kan skyldes at noen fisk hadde øyeskader som ikke ble notert, men kan også være et utslag av store individuelle variasjoner. Forsøk 2b I forsøket hvor kontinuerlig lys ble brukt, var variasjonene mellom individ meget store i de ulike forsøksgruppene. Det var ikke mulig å se noen tydelig døgnsrytmer i melatoninnivåer. 9

10 Generelt ga imidlertid høyere lysintensitet lavere melatoninnivåer. Gjennomgående var også melatoninnivåene høyere i forsøk 2 enn i forsøk 1, men grunnen til dette er uklar. 6a) 14 1/ lux 1/1 lux 1/1 lux 12 1/1 lux 1 Melatonin (ng/ml) sampling time 6b) 14 lux 1 lux 1 lux 12 1 lux 1 Melatonin (ng/ml) sample time Fig 6: Melatonin i kveiteplasma ved a) ulik nattlysintensitet og b) kontinuerlig lys av ulik intensitet. Naturlig mørkeperiode er merket med en horisontal svart linje. 1

11 FORHOLD TIL NORGES FORSKNINGSRÅD I PROSJEKTPERIODEN Forholdet til Forskningsrådet har vært utmerket i hele prosjektperioden. BETYDNING AV FORSØKSRESULTATENE Prosjektet har, etter vår mening, bidratt til å øke den grunnleggende kunnskapen om vekstmønstre og regulering av kjønnsmodning hos kveite av begge kjønn. Vi rapporterer også her for første gang plasmanivåer av IGF-1 i kveite. Selv om det var vanskelig å se noen forandringer i IGF-1 knyttet til kjønnsmodning eller årstid, er dette hormonet vist å være svært sentralt i samspillet mellom pubertet og vekst i andre arter, og en tetter oppfølging i forsøk vil kunne vise om dette også er tilfelle hos kveite. Videre har prosjektet bidratt med informasjon om hvordan kveite reagerer på / oppfatter ulike lysintensiteter. Resultatene viser at kveite er svært følsom for lys, og at selv svakt lys om natten blir oppfattet. REFERANSER Bjørnsson B Th, Halldorsson O, Haux C, Norberg B and Brown C. L. (1998) Photoperiod control of sexual maturation of the Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus): Plasma thyroid hormone and calcium levels. Aquaculture 166: Cuisset B, Pradelles P, Kime D E, Kuhn E R, Babin P, Davail S and LeMenn F (1994) Enzymeimmunoassay for 11-ketotestosterone using acetylcholinesterase as label - application to the measurement of 11-ketotestosterone in plasma of Siberian sturgeon. Comp. Biochem. Physiol. C. 18(2), p Engelsen R (1995) Ökonomiske synspunkter på matfiskoppdrett av kveite. Kveite-fra forskning til näring. Kystnäringen forlag og Informasjonkontor. pp Hansen, T., Stefansson, S.O. and Taranger, G.L., Growth and time of ovulation of Atlantic salmon (Salmo salar) in sea cages at two different light regimes. Aquaculture and Fisheries Management, 23: Hansen T, Kjesbu O S, Holm J C and Karlsen Ø (1995) Growth, gonadal development and spawning time of Atlantic cod (Gadus morhua) reared under different photoperiods. In: Proceedings from the 5 th International Symposium on Reproductive Physiology of Fish. Edited by F W Goetz and P Thomas, University of Texas, Austin, Texas, 2-8 July 1995, p Hyllner S J, Norberg B and Haux C (1994) Isolation, partial characterization, induction, and the occurence in plasma of the major vitelline envelope proteins in the Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) during sexual maturation. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 51(8),

12 Norberg B, Weltzien, F-A, Karlsen Ø and Holm, J C (21) Effects of photoperiod on sexual maturation and somatic growth in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.). Comp Biochem Physiol 129B (2-3): Næss T, Harboe T, Mangor-Jensen A, Naas K E & Norberg B (1996) Successful first feeding of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) larvae from a photoperiod adjusted broodstock. Prog. Fish Cult. 58, Oppedal, F., Taranger, G.L., Juell, J.E, Fosseidengen, J.E. and Hansen, T., Light intensity affects growth and sexual maturation of Atlantic salmon (Salmo salar) postsmolts in sea cages. Aquatic Living Resources, 1 (6), Porter M.J.R., Stefansson S.O., Nyhammer G., Karlsen Ø., Norberg B. & Bromage N.R. 2. Environmental influences on melatonin secretion in Atlantic cod (Gadus morhua L.) and their relevance to commercial culture. Fish Physiol. Biochem. 23:191-2 Randall C.F., Bromage N.R., Thorpe J.E., Miles M.S. & Muir J.S Melatonin rhythms in Atlantic salmon (Salmo salar) maintained under natural and out-of-phase photoperiods. Gen. Comp. Endocrinol. 98:73-86 Rodriguez L., Begtashi I., Zanuy S., & Carillo M. 2. Development and validation of an enzyme immunoassay for testosterone: effects of photoperiod on plasma testosterone levels and gonadal development in male sea bass (Dicentrarchus labrax, L.) at puberty. Fish Physiol. Biochem. 23(2): Shimizu M., Swanson P., Fukada H., Hara A. & Dickhoff W.W. 2. Comparison of extraction methods and assay validation for salmon insulin-like growth factor-i using commercially available components. Gen Comp Endocrinol. 119(1): Taranger, G.L., Daae, H., Jørgensen, K.O. and Hansen, T., Effects of continuous light on growth and sexual maturation in seawater reared Atlantic salmon, Salmo salar L. In: Proceedings of the 5th International Symposium on the Reproductive Physiology of Fish. Edited by F.W. Goetz and P. Thomas, University of Texas, Austin, Texas, 2-8 July 1995, p