europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. C07K 16/28 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato (30) Prioritet , US, 1869 P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver MEDIMMUNE LIMITED, Milstein Building Granta Park, CambridgeCambridgeshire CB21 6GH, GB-Storbritannia (72) Oppfinner COHEN, Suzanne, MedImmune LimitedMilstein BuildingGranta Park, CambridgeCambridgeshire CB21 6GH, GB-Storbritannia DOBSON, Claire, Louise, MedImmune LimitedMilstein BuildingGranta Park, CambridgeCambridgeshire CB21 6GH, GB-Storbritannia ERIKSSON, Per-Olof, Fredrik, Astra Zeneca R&D Lund, Lund, SE-Sverige LANE, Deborah, Louise, MedImmune LimitedMilstein BuildingGranta Park, CambridgeCambridgeshire CB21 6GH, GB-Storbritannia VON WACHENFELDT, Karin, AstraZeneca R&D Lund, Lund, SE-Sverige (74) Fullmektig Tandbergs Patentkontor AS, Postboks 170 Vika, 0118 OSLO, Norge (4) Benevnelse BINDENDE MEDLEMMER FOR INTERLEUKIN-4 RESEPTOR ALPHA (IL-4Ralpha) (6) Anførte publikasjoner WO-A-01/92340 US-A GOEBELER M ET AL: "Interleukin-13 selectively induces monocyte chemoattractant protein-1 synthesis and secretion by human endothelial cells. Involvement of IL-4R-alpha and Stat6 phosphorylation" IMMUNOLOGY, vol. 91, no. 3, 1997, pages 40-47, XP ISSN: BIELORY LEONARD: "American Academy of Allergy, Asthma & Immunology--08 Annual Meeting." IDRUGS : THE INVESTIGATIONAL DRUGS JOURNAL MAY 08, vol. 11, no., May 08 (08-0), pages , XP ISSN: HORNER ET AL: "Toxicity and Pharmacodynamics of Cy317HuXCy, A Surrogate for AMG 317, in Cynomolgus Monkeys: 4-week and 13-Week Repeated-Dose Studies" JOURNAL OF ALLERGY AND CLINICAL IMMUNOLOGY, MOSBY - YEARLY BOOK, INC, US, vol. 121, no. 2, 1 February 08 ( ), page S7, XP ISSN: RUDIKOFF S ET AL: "Single amino acid substitution altering antigen-binding specificity", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, WASHINGTON, DC; US, vol. 79, 1 March 1982 ( ), pages , XP , ISSN: , DOI: DOI:.73/PNAS CANFIELD S M ET AL: "THE BINDING AFFINITY OF HUMAN IGG FOR ITS HIGH AFFINITY FC RECEPTOR IS DETERMINED BY MULTIPLE AMINO ACIDS IN THE CH2 DOMAIN AND IS MODULATED BY THE HINGE REGION", THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE,

2 ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS, US, vol. 173, no. 6, 1 June 1991 ( ), pages , XP , ISSN: , DOI:.84/JEM STAPLETON NM, ANDERSEN JT, STEMERDING AM, BJARNARSON SP, ET.AL.: "Competition for FcRn-mediated transport gives rise to short half-life of human IgG3 and offers therapeutic potential", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 2, 99, December 11 ( ), pages 1-9, XP , DOI:.38/ncomms1608

3 1 Beskrivelse [0001] Denne oppfinnelsen er tilknyttet bindende medlemmer for for interleukin (IL)-4 reseptor alpha (IL-4Ra, også kalt CD124), spesielt antistoffmolekyler, og deres terapeutiske bruk f.eks. i behandling eller forebygging av lidelser tilknyttet IL-4Rα, IL- 4 og/eller IL-13, eksempler på dette er astma og KOLS. [0002] Menneskelig IL-4Rα underenhet (Swiss Prot accession number P24394) er en 140kDa type 1 membran-protein som binder menneskelig IL-4 med høy affinitet (Andrews et al J. Biol. Chem (02) 277: ). IL-4/ IL-4Rα kompleks kan dimerisere med enten den vanlige gammakjeden (γc, CD132) eller IL-13Ralpha1 (IL- 13Rα1) underenhet, via domener på IL-4, for å opprette to forskjellige signalerende komplekser, vanligvis referert til som Type I og Type II-reseptorer, henholdsvis. Alternativt, kan IL-13 binde IL-13Rα1 for å danne et IL-13/IL-13Rα1 kompleks som rekrutterer IL-4Rα underenhet for å danne en Type II reseptorsammensetning. Dermed formidler IL-4Rα de biologiske aktivitetene til både IL-4 og IL-13 (gjennomgått av Gessner et al, Immunobiology, 1:28, 00). In vitro-studier har vist at IL-4 og IL- 13 aktiverer effektorfunksjoner i en rekke celletyper, for eksempel i T-celler, B-celler, eosinofiler, mastceller, basofiler, glatte muskelceller i luftveiene, respiratoriske epitelceller, lungefibroblaster og endotelceller (gjennomgått av Steinke et al, Resp Res, 2:66, 01, og av Willis-Karp, Immunol Rev, 2:17, 04). [0003] IL-4Rα er uttrykt i lave antall (0-000 molekyler/celler) på en rekke celletyper (Lowenthal et al, J Immunol, 140:46, 1988), f.eks. perifere blod-t-celler, monocytter, epitelceller i luftveiene, B-celler og lungefibroblaster. Type I-reseptor dominerer i hematopiske celler, mens type II-reseptor er overuttrykt på både hematopoietiske celler og ikke-hematopoietiske celler. [0004] IL-4Rα polymorfismer i den menneskelige populasjon har blitt beskrevet (gjennomgått av Gessner et al, Immunobiology, 1:28, 00) og tilknytning til IgEnivåer eller klinisk atopi har blitt rapportert i enkelte populasjoner. For eksempel er V7R76 IL-4Rα tilknyttet allergisk astma og forbedret IL-4Rα-funksjon (Risma et al. J.Immunol. 169(3): ,02). [000] Flere linjer med bevis støtter en viktig rolle for IL-4/IL-13-banen i astmapatologi (gjennomgått av Chatila, Trends in Molecular Med, :493, 04), og også i en rekke andre tilstander, som listet ellers i dette dokumentet. Økt sekresjon av IL-4 og IL-13 er ment å både initiere og opprettholde sykdomsprosessen. IL-13 anses å være den dominerende partneren i utløsningen av luftveis-hyperresponsivitet (AHR),

4 2 hypersekresjon av slim og luftveisremodellering, der IL-4 er forslått å være hovedindusenten for Th2-polarisering og IgE-produksjon (Wynn, Annu Rev Immunol, 21: 42, 03) [0006] Rollen til IL-4Rα i astma er videre støttet av bevis fra sykdommer i dyremodeller. Administrasjon av en funksjonell rotte-il-4r-antogonist (IL-4 mutant, C118-sletting) i løpet av allergenprovokasjon med (OVA, et modellallergen) hemmer utviklingen av allergisk luftveiseosinofili og AHR i mus som tidligere er sensibilisert med OVA (Tomkinson et al. J.Immunol. 166(9): , 01). Videre har en rekke in vivo-studier vist positive effekter på blokkering av enten IL-13 eller IL-14 i dyremodeller for astma. For eksempel hemmet terapeutisk dosering med en anti-il-13 mab i en kronisk modell med OVA-indusert vedvarende luftveisbetennelse AHR, stanset utviklingen av subepitel fibrose og betennelse og gjenopprettet mucus hyperplasia til basale nivåer (Yang et al., J. Pharmacol. Eksp. Ther. 313(1):8-1, 0). I en mus-ova-modell, viste hemming av IL-4 med et anti-il-4 antistoff en betydelig reduksjon i eosinofil infiltrering når det administreres i løpet av immunisering (Coyle et al., Am J Resp Cell Mol Biol, 13:4, 199). I en lignende modell hadde IL-4- manglende mus betydelig færre eosinofiler i bronkoalveolar utskylling og mye mindre peribronkial betennelse etter OVA-provokasjonen (Brusselle et al., Clin Exp Allergy, 24:73, 1994). [0007] I mennesker vise fase IIa-studier at en IL-4Ra-antogonist (en såkalt IL-4- mutein) reduserte en allergen-indusert sen astmatisk respons og svekket den hvilende betennelsesstatusen i lungene hos astmapasienter (Wenzel et al., Lancet, 370:1422, 07). Disse menneskelige dataene styrker antagelsen om at en IL-4Ra-antagonist kan være klinisk nyttig ved astma ytterligere. [0008] I tillegg til dens rolle i astma, har IL-4Ra blitt koblet til en rekke patologier, f.eks. følgende: Kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) inkluderer pasientpopulasjoner med varierende grader av kronisk bronkitt, sykdommer i de små luftveiene og emfysem kjennetegnes av progressiv ikke-reversibel forringelse av lungefunksjonen som responderer dårlig på nåværende astma-basert behandling. De underliggende årsakene til KOLS er fortsatt uklare. Den "nederlandske hypotesen" antyder at det er en vanlig mottakelighet for KOLS og astma, og derfor kan lignende mekanismer bidra til patogenese av begge sykdommer (Sluiter et al., Eur Respir J, 4(4): p , 1991). Zheng et al (J Clin Invest, 6(9):81-93, 00) har vist at overuttrykk av IL-13 i muselunge forårsaket emfysem, økt slimproduksjon og betennelse, reflekterende aspekter av menneskelig KOLS. Videre har AHR, en IL-13-avhengig respons i

5 3 rottemodeller med allergisk betennelse, vist seg å være prediktiv for forringelse av lungefunksjon hos røykere (Tashkin et al., Am J Respir Crit Care Med, 13(6 Pt 1): , 1996). Det har også bli etablert en kobling mellom en IL-13- akseleratorpolymorfisme og mottakelighet for å utvikle KOLS (Van Der Pouw Kraan et al., Genes Immun, 3(7): (02). Tegnene er derfor at IL-4/IL-13-banen, og spesielt IL-13, spiller en viktig rolle i patogenesen av KOLS. 1 [0009] IL-13 kan spille en rolle i patogenesen av bukbetennelse-sykdom. Heller et al. (Heller et al., Immunity, 17():629-38, 02) rapporterer at nøytraliseringen av IL-13 ved administrasjon av oppløselig IL-13R.alpha.2 forbedret tykktarmbetennelse i en rottemodell av menneskelig ulcerøs kolitt. På samme måte var IL-13-uttrykk høyere i rektale biopsi-prøver fra ulcerøs kolitt-pasienter når den ble sammenlignet med kontroller (Inoue et al., Am J Gastroenterol, 94(9):2441-6, 1999). [00] I tillegg til astma, har IL-4/Il-13-banen blitt koblet til andre fibrotiske tilstander, som systemisk sklerose (Hasegawa et al., J Rheumatol, 24(2):328-32, 1997), lungefibrose (Hancock et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 18(1): 60-, 1998), parasittfremkalt leverfibrose (Fallon et al., J Immunol, 164(): 28-91, 00; Chiaramonte et al., J Clin Invest, 4(6): 777-8, 1999; Chiaramonte Hepatology 34(2):273-82, 01), og cystic fibrose (Hauber et al,. J. Cyst Fibr, 2:189, 03) [0011] IL-4 og til en viss grad IL-13, er avgjørende for B-celle-formidlede aktiviteter, som B-celle-spredning, immunoglobulin-sekresjon og uttrykk av FcepsilonR. Klinisk bruk av en IL-4Rα-hemmer inkluderer for eksempel bruk i allergibehandling for å undertrykke IgE-syntese (inkludert for eksempel atopisk dermatitt og matallergi), bruk i transplantasjonsbehandling for å hindre transplantatavvisning, samt undertrykking av hyperfølsomhet av forsinket type eller kontakt-hyperfølsomhetsreaksjoner. [0012] Il-4R-antagonister kan også brukes som hjelpemidler for allergi-immunoterapi og som vaksine-hjelpemidler. [0013] Antistoffer til IL-4Rα har blitt beskrevet. To eksempler er de nøytraliserende rotte-anti-il-4ra-monoklonale antistoffene MAB230 (klone 2463) og I6146 (klone ) som leveres av R&D Systems (Minneapolis, MN) og Sigma (St Louis, MO), henholdsvis. Disse antistoffene er av IgG2a-undertypen og ble utviklet fra musehybridomer utviklet fra mus som er immunisert med renset rekombinant menneskelig IL-4Ra (baculovirus-avledet). To videre nøytraliserende rotte-anti-il-4rα antistoffer M7 og X2/4-12 leveres av BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) og

6 4 ebioscience (San Diego, CA), henholdsvis. Disse er IgG1-antistoffer og er også produsert av musehybridomer utviklet fra mus som er immunisert med rekombinant oppløselig IL-4Rα [0014] Helt menneskelige antistoffer har sannsynligvis bedre klinisk nytte enn rotteeller kimeriske antistoffer. Dette er fordi menneskelig anti-mus-antistoffer (HAMA) rettet mot FC-delen av musens immunoglobulin ofte produseres, og fører til en rask fjerning og mulig anafylaktisk reaksjon (Brochier et al,. Int. J. Immunopharm., 17:41-48, 199). Selv om kimeriske antistoffer (mus-variable regioner og menneskelige konstante regioner) er mindre immunogeniske enn rotte-mabs, har menneskelig antikimerisk antistoff (HACA) responser blitt rapportert (Bell and Kamm, Aliment. Pharmacol. Ther., 14:01-14, 00). [001] WO 01/92340 (Immunex) beskriver menneskelige monoklonale antistoffer mot IL-4-reseptoren generert av prosedyrer som involverer immunisering av genmodifiserte mus med oppløsbar IL-4R-peptid og danning av hybridome cellelinjer som utskiller antistoffer til IL-4R, hovedantistoffet 12B beskrives som et IgG1-antistoff og helt menneskelig. WO 0/ (Immunex) beskriver flere antistoffer som er avledet fra12b (kalt H1L1) via oligonukleotid mutagenese av VH-regionen. Hver muterte VH-kjede ble parret med en av 6 forskjellige VL-kjeder for å opprette et lite repertoar med antistoffmolekyler. [0016] WO 07/0868 (Aerovance) presenterer en behandlingsmetode for astma som består av å administrere et mutant menneskelig IL-4 protein og som har erstatninger for R121D og Y124D. Spesifikasjonen viser at slik IL4-mutein administrert i en farmasøytisk sammensetning kan motvirke bindingen av villtype huil-4 og villtype huil-13 til reseptorer. [0017] WO 08/04606 (Regeneron) presenterer spesielle antistoffer mot menneskelig IL-4R som ble økt i genmodifiserte mus som kan produsere menneskelige antistoffer. 3 [0018] Det er fordeler i oppdagelsen og utviklingen av et antistoff til menneskelig IL- 4Rα som også viser kryss-reaktivitet til det ortologe proteinet fra andre arter, for eksempel makak-ape. Et slikt antistoff ville tilrettelegge karakteriseringen av slike antistoffer når det gjelder farmakologi og sikkerhet i in vivo. Potens eller affinitet til andre arter, som f.eks. er mindre enn -ganger annereldes enn den menneskelige aktiviteten, kan være egnet for en slik evaluering. Menneskelig IL-4Rα-protein viser en relativt liten likhet til det ortologe IL-4Rα-proteinet fra andre arter, bortsett fra sjimpanse. Derfor ville oppdagelsen av høy affinitets- og potensantistoffer egnet for

7 klinisk bruk med kryss-reaktivitet til en art som er ansett som egnet for sikkerhet og toksikologisk evaluering for klinisk utvikling, være svært utfordrende. Oppfinnelsens erklæring 1 2 [0019] Oppfinnelsen gir et isolert antistoff eller fragment av dette for hil-4rα, der det bindende medlemmet også kan binde til makak-apens interleukin-4-reseptor alpha (cyil-4rα), der det isolerte bindende medlemmet består av et sett med CDRer: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 og LCDR3, der: HCDR1 har aminosyresekvens SEK ID NR: 193, HCDR2 har aminosyresekvens SEK ID NR: 194, HCDR3 har aminosyresekvens SEK ID NR: 19, LCDR1 har aminosyresekvens SEK ID NR: 198, LCDR2 har aminosyresekvens SEK ID NR: 199, og LCDR3 har aminosyresekvens SEK ID NR: 0, eller der: HCDR1 har aminosyresekvens SEK ID NR: 363, HCDR2 har aminosyresekvens SEK ID NR: 364, HCDR3 har aminosyresekvens SEK ID NR: 36, LCDR1 har aminosyresekvens SEK ID NR: 368, LCDR2 har aminosyresekvens SEK ID NR: 369, og LCDR3 har aminosyresekvens SEK ID NR: 370, eller der: HCDR1 har aminosyresekvens SEK ID NR: 233, HCDR2 har aminosyresekvens SEK ID NR: 234, HCDR3 har aminosyresekvens SEK ID NR: 23, LCDR1 har aminosyresekvens SEK ID NR: 238, LCDR2 har aminosyresekvens SEK ID NR: 239, og LCDR3 har aminosyresekvens SEK ID NR: [00] Et isolert antistoff eller fragment av dette i henhold til oppfinnelsen, kan velges fra et IgG1-, IgG2- og IgG4-molekyl. [0021] Et isolert antistoff eller fragment av dette i henhold til oppfinnelsen, kan være et isolert menneskelig antistoff som har et VH-domene, der VH-domenet består av et menneskelig kimlinje-rammeverk Vh1_DP-7_ (1-46). [0022] Et isolert antistoff eller fragment av dette i henhold til oppfinnelsen kan bestå av et VL-domene, der VL-domenet består av menneskelig kimcelle-rammeverk Vλ1_DPL.

8 6 [0023] Et antistoff eller fragment av dette i henhold til oppfinnelsen kan bestå av et VH-domene av SEK ID NR: 192, og/eller et VL-domene av SEK ID NR: 197. [0024] Et antistoff eller fragment av dette i henhold til oppfinnelsen kan bestå av et VH-domene av SEK ID NR: 232, og/eller et VL-domene av SEK ID NR: 237. [002] Et antistoff eller fragment av dette i henhold til oppfinnelsen kan bestå av et VH-domene av SEK ID NR: 422, og/eller et VL-domene av SEK ID NR: 427. [0026] Et antistoff eller fragment av dette i henhold til oppfinnelsen kan bestå av et VH-domene av SEK ID NR: 432, og/eller et VL-domene av SEK ID NR: [0027] Et antistoff eller fragment av dette i henhold til oppfinnelsen kan bestå av et VH-domene av SEK ID NR: 362, og/eller et VL-domene av SEK ID NR: 367. [0028] Et antistoff eller fragment av dette i henhold til oppfinnelsen kan bestå av et VH-domene av SEK ID NR: 442, og/eller et VL-domene av SEK ID NR: [0029] Oppfinnelsen gir videre en sammensetning som består av et isolert antistoff eller fragment av dette i henhold til oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabelt bindemiddel. [0030] Videre gis en sammensetning i henhold til oppfinnelsen, for bruk i behandling av sykdom tilknyttet IL-4Rα, der sykdommen er en eller flere blant allergi, astma, bronkitt, KOLS, bukbetennelsessykdom, fibrotiske tilstander, allergi, transplantatavvisning, overfølsomhet av forsinket type eller kontaktoverfølsomhetsreaksjoner. [0031] Oppfinnelsen gir også et isolert nukleinsyremolekyl som består av en nukleotid sekvens som koder et antistoff eller fragment av dette, eller et isolert VH- eller VLdomene av et antistoff eller fragment av dette, i henhold til oppfinnelsen. [0032] I tillegg gir oppfinnelsen en vertscelle in vitro transformert med nukleinsyre i henhold til oppfinnelsen. [0033] Gjennom riktig designet utvalgsteknikker og analyser, har oppfinnerne utviklet bindende medlemmer for IL-4Rα som hemmer den biologiske aktiviteten til menneskelig og makak-ape IL-4Rα.

9 7 [0034] Som beskrevet i eksemplene, fra et innledende bly-identifikasjonsprogram, valgte oppfinnerne ett enkelt antistoffmolekyl til menneskelig IL-4Rα som også viste noe, men svak, binding til og funksjonell nøytralisering av, makak-il-4rα. Etter en planlagt og definert prosess med målrettet og tilfeldig mutagenese og videre utvalg av mutanter fra dette foreldreantistoff-molekylet, ble et større panel med antistoffmolekyler med svært forbedrede egenskaper utviklet. VH- og VL-regioner, inkludert regionene som fastlår komplementaritet (CDRer) for foreldreantistoffet (antistoff 1), og for de optimerte antistoffene, vises i figurer 1, 2, 3 og 4. Disse antistoffmolekylene, VH, VL, CDRer, og bindende medlemmer, består av en eller flere CDRer, og danner aspekter av den aktuelle oppfinnelsen. [003] I tillegg til villtype IL-4Rα har de bindende medlemmene i den aktuelle oppfinnelsen også blitt funnet å binde I7V IL-4Rα, en vanlig menneskelig variant. 1 2 [0036] Beskrevet heri er bindende medlemmer som nøytraliserer de biologiske effektene av IL-4Rα med høy potens, binder IL-4Rα med høy affinitet og hemmer signalering indusert av IL-4 og IL-13. Det er viktig å merke seg at bindende medlemmer hemmer signalering fra de høye affinitetskompleksene, f.eks. IL-4:IL- 4Rα:γc, IL-4:IL-4Rα:IL-13Rα1, IL-13:IL-13Rα1:IL-4Rα. Slik handling hindrer signalering av både IL-4 og IL-13. I tillegg indikerer data at de bindende medlemmene viser interaksjon og signalering av IL-4Rα-type 1- og type 2-sammensetninger. Disse og andre egenskaper og effekter av de bindende medlemmene er beskrevet i mer detalj nedenfor. [0037] De bindende medlemmene er nyttige for å behandle sykdommer der IL-4Rα, IL-4 or IL-13 er uttrykt, f.eks. en eller flere av IL-4Rα -, IL-4- eller IL-13-relaterte sykdommer som det ellers refereres til heri, som astma eller KOLS [0038] Som beskrevet ellers heri, kan bindingen til et bindende medlem til IL-4Rα avgjøres ved bruk av overflateplasmon-resonans f.eks. BIAcore. Overflateplasmon-resonansdata kan festes til en 1:1 Langmuir bindingsmodell (simultan ka kd) og en affinitet-konstant KD kalkulert fra forholdet mellom hastighetskonstanter kd1/ka1. Et bindende medlem kan ha monovalent affinitet for binding av menneskelig IL-4Rα som er mindre enn nm. Den monovalente affiniteten for binding av menneskelig IL-4Rα kan være mindre enn nm, f.eks. mindre enn 8, mindre enn nm. Det bindende medlemmet binder også makak-il-4rα. Vi beskriver et bindende medlem med en monovalent affinitet for å binde menneskelig IL-4Rα i området 0.0 til 12nM. Vi beskriver heri et bindende medlem med en monovalent

10 8 affinitet for å binde menneskelig IL-4Rα i området 0.1 til nm. Vi beskriver også et bindende medlem med en monovalent affinitet for å binde menneskelig IL-4Rα i området 0.1 til 2nM [0039] Et bindende medlem kan immunospesifikt binde til menneskelig IL-4Rα og kan ha en affinitet (KD) på mindre enn 000 pm, mindre enn 4000 pm, mindre enn 3000 pm, mindre enn 0 pm, mindre enn 00 pm, mindre enn 0 pm, mindre enn 00 pm, mindre enn 70 pm, mindre enn 00 pm, mindre enn pm, mindre enn 0 pm, mindre enn pm, mindre enn 0 pm, mindre enn 7 pm som vurdert ved bruk av en metode som er beskrevet heri eller kjent for faglærte personer på feltet (f.eks., en BIAcore-analyse, ELISA) (Biacore International AB, Uppsala, Sweden). [0040] Et bindende medlem kan immunospesifikt binde til menneskelig IL-4Rα og kan ha en affinitet (KD) på mellom 2 til 000 pm, 2 til 4000 pm, 2 til 300 pm, 2 til 3000 pm, 2 til 0 pm, 2 til 00 pm, 2 til 0 pm, 2 til 00 pm, 2 til 70 pm, 2 til 00 pm, 2 til pm, 2 til 0 pm, 2 til 7 pm, 2 til 0 pm som vurdert ved bruk av en metode som er beskrevet heri eller kjent for faglærte personer på feltet (f.eks., en BIAcore-analyse, ELISA). Et anti- IL-4Rα bindende medlem (inkludert et antistoff) kan immunospesifikt binde for å binde til menneskelig IL-4Ra og kan ha en affinitet (KD) av 00 pm, 0 pm, 7 pm eller 0 pm som bedømt ved bruk av en metode som er beskrevet heri eller kjent for en faglært person på feltet (f.eks., en BIAcore-analyse, ELISA). [0041] Som beskrevet i mer detalj i eksemplene, nøytraliserer bindende medlemmer IL-4Rα med høy potens. Nøytralisering betyr hemming av en biologisk aktivitet formidlet av IL-4Rα. Bindende medlemmer kan nøytralisere en eller flere aktiviteter som formidles av IL-4Rα. Den hemmede biologiske aktiviteten formidles sannsynligvis ved hindring av at IL-4Rα danner et signaleringskompleks med gammakjede (eller IL-13Rα) og hvilken som helst av de tilknyttede oppløselige ligandene, f.eks. IL-4 eller IL-13. [0042] Nøytralisering av IL-4 eller IL-13 som signalerer gjennom dets IL-4Rαinneholdende reseptorkompleks kan måles ved hemming av IL-4 eller IL-13 stimulert TF-1 cellespredning. 3 [0043] Epitopen av menneskelig IL4Rα som antistoffene binder seg til ble funnet av en kombinasjon av mutagenese og domenebytting. Hele domenebyttede kimere lokaliserte epitopen til domene 1 (D1) av menneskelig IL4Rα (rester M1-E119). Menneskelig IL- 4Rα inneholder fem sløyferegioner, som er i umiddelbart nærhet til IL4 i en krystall

11 struktur (Hage et al., Cell 97: , 1999). De utskiftede kimerene i sløyfen muliggjorde videre lokalisering av menneskelig IL-4Rα-epitop bundet av et antistoff som beskrives heri, til en hovedkomponent i sløyfe 3 (rester L89-N98) og en mindre komponent i sløyfe 2 (rester V6-H72). Kimere uten menneskelig sløyfe3 kunne ikke hemme menneskelig IL-4Rα-binding til et antistoff og kimere uten sløyfe 2 ga en 0 gang så høy IC 0 som menneskelig IL-4Rα (Table ). Konsistent med domenets utskiftede data befinner både sløyfe 2 og løyfe 3 seg i domene 1 (D1) (Hage et al., Cell 97: , 1999). [0044] Antistoff-epitopen ble lokalisert til en diskontinuerlig epitop av 18 aminosyrer i to sløyferegioner av menneskelig IL-4Rα, V6-H72 og L89-N98. Epitopen kan videre lokaliseres til aminosyrerester L67 og L68 i sløyfe 2 og D92 og V93 i sløyfe 3 (se SEK ID NR: 44 eller 460 for lokalisering av rester 67, 68, 92 og 93). D92-rester var de viktigste, etterfulgt av V93, for det testede antistoffet var fortsatt kapabelt til å binde kimerisk IL-4Rα som manglet L67- og/eller L68-rester i sløyfe 2. Selvsagt er det sannsynlig at antistoffene som beskrives heri også vil binde rester av det menneskelige IL-4Rα-proteinet i tillegg til ett av L67, L68, D92 og V93. [004] Vi beskriver heri et isolert bindende medlem som kan binde til menneskelig interleukin-4 reseptor alpha (hil-4rα) ved minst én aminosyrerest som velges fra aminosyren ved posisjon 67, 68, 92 og 93, i henhold til posisjonen i SEK ID NR: 460. Vi beskriver et isolert bindende medlem som kan binde til minst én av aminosyrerestene 67, 68, 92 og 93, i henhold til posisjonen i SEK ID NR: 460, av naturlig menneskelig interleukin-4 reseptor alpha (hil-4rα). Et spesifikt isolert bindende medlem kan binde til aminosyren på posisjon 92 av hil-4rα, i henhold til posisjonen i SEK ID NR: 460. Et annet isolert bindende medlem kan binde til D92 og minst én annen rest valgt fra L67, L68 og V93. Et annet isolert bindende medlem kan binde til D92 og V93. Et annet isolert bindende medlem kan binde til D92 og V93 og enten L67 eller L68. En annen antistoff kan binde til både L67, L68, D92 og V93. Hver av disse referer til aminosyreposisjoner i hil-4rα der lokasjonene kan identifiseres i henhold til hil-4rα aminosyresekvens (fra posisjoner 1-229) avbildet i SEK ID NR: 460. Vi beskriver et bindende medlem som kan binde de nevnte epitop-restene (dvs.minst en av posisjonene 67, 68, 92 og 93) av den fullengdes hil-4rα. Beskrevet heri er et bindende medlem som er kapabelt til å binde til de nevnte epitop-restene (dvs. minst er av posisjonene 67, 68, 92 og 93) av naturlig hil-4rα uttrykt på celleoverflaten. Vi beskriver et bindende medlem som kan binde de nevnte epitoprestene (dvs.minst en av posisjonene 67, 68, 92 og 93) av rekombinant uttrykt fullengdes (229 aminosyre) hil-4rα.

12 [0046] Vi beskriver et isolert bindende medlem som kan binde menneskelig interleukin-4 reseptor alpha (hil-4rα). Det bindende medlemmet kan være et menneskelig antistoff. Det bindende medlemmet kan også binde makak-ape interleukin-4 reseptor alpha (cyil-4rα). 1 [0047] Beskrevet heri er et isolerende bindende medlem for menneskelig interleukin-4 reseptor alpha (hil-4rα), der det bindende medlemmet har et IC 0 geo-metrisk gjennomsnitt for hemming av menneskelig IL-4 (hil-4) indusert cellespredning på mindre enn 0 pm i TF-1-spredningsanalyse ved bruk av 18pM oppløselig menneskelig IL-4 protein og der det bindende medlemmet også er kapabelt til å binde cyil-4rα. [0048] Det bindende medlemmet kan ha en IC 0 geometrisk gjennomsnitt for hemming av menneskelig IL-4 (hil-4) indusert cellespredning på mindre enn 0pM, mindre enn 3pM, mindre enn 2pM, eller mindre enn pm, i en TF-1 spredningsanalyse ved bruk av 18pM av oppløselig menneskelig IL-4. Det bindende medlemmet kan ha en IC 0 geometrisk gjennomsnitt for hemming av menneskelig IL-4 (hil-4) indusert cellespredning på mellom 1 til 0pM, 1 til 3pM, 2 til 30pM, 2 til 2pM, 2 til 12 pm, ved bruk av 18pM oppløselig menneskelig IL-4 i en metode som beskrives heri (f.eks. eksempel 3.2.1) eller som er kjent for faglærte personer på feltet. [0049] Binding til cyil-4rα kan måles ved bruk av hvilken som helst egnet metode [000] På samme måte kan bindende medlemmer ha et IC 0 geometrisk gjennomsnitt for hemming av menneskelig IL-13 (hil-13)-formidlet TF-1 spredning (via nøytralisering av hil-4rα) på mindre enn 0pM ved bruk av 400pM oppløselig menneskelig IL-13 (hil-13). IC 0 geometrisk gjennomsnitt for hemming av menneskelig IL-13 (hil-13)-formidlet TF-1 spredning (via nøytralisering hil-4rα) ved bruk av 400pM oppløselig menneskelig IL-13 (hil-13) kan være mellom og 7pM eller mellom og 4pM. [001] Bindende medlemmer som beskrives heri er hovedsakelig ikke i stand til å binde til rotte-il-4rα. Med dette mener vi at et bindende medlem er kapabelt til minst 00-ganger (som f.eks. minst 00-ganger, minst 00-fold, minst 0-ganger, minst 00-ganger, minst 3000-ganger, minst 4000-ganger) større binding til menneskelig interleukin-4 reseptor alpha enn til rotte IL-4Rα (dvs. binding til rotte IL-4Rα er minst 00-ganger svakere enn til menneskelig IL-4Rα). Dette kan måles, for eksempel ved HTRF-konkurranseanalysen som beskrives i eksempel.1.2.

13 11 1 [002] Geometrisk gjennomsnitt, som brukt heri betyr gjennomsnittet av de logaritmiske verdier av datasett, konvertert tilbake til et base nummer. Dette krever at det utføres minst to målinger, f.eks. minst 2 fortrinnsvis minst, mer fortrinnsvis replikat. En person som er faglært på feltet vil forstå at jo større antall replikater, jo mer robust vil det geometriske gjennomsnittet være. Valg av replikatantall kan overlates til en person som er faglært på feltet. [003] Hemming av biologisk aktivitet kan være delvis eller total. Bindende medlemmer er beskrevet heri som hemmer IL-4Rα biologisk aktivitet med minst 9 %, minst 90%, minst 8%, minst 80%, minst 7%, minst 70%, minst 60%, eller minst 0% av aktiviteten i fravær av det bindende medlemmet. Graden som et bindende medlem nøytraliserer IL-4Ra refereres til som dets nøytraliseringspotens. Potens kan fastslå eller måles ved bruk av en eller flere analyser som er kjent for faglærte personer på feltet og/eller som beskrevet eller referert til heri. Potens kan for eksempel måles i: Reseptor-ligand-bindende analyser i fluorescent (f.eks. HTRF eller DELFIA) eller radioaktivt format. Fluorescent (f.eks. HTRF eller DELFIA) epitop konkurranseanalyse Celle-basrte funksjonsanalyser inkluderer STAT6-fosforylering av menneskelig eller makak-pbmcer, spredning av TF-1-celler, eotaksin-utslipp fra menneskelige eller makak-fibroblast-cellelinjer, VCAM-1oppjustering på menneskelige endotel-åreceller eller spredning av menneskelige T-celler [004] Noen av disse analysemetodene er beskrevet i eksemplene. [00] Nøytraliseringspotensen til et bindende medlem som kalkulert i en analyse ved bruk av IL-4Rα fra en første art (f.eks. menneske) kan sammenlignes med nøytraliseringspotensen til det bindende medlemmet i samme analyse ved bruk av IL- 4Rα fra en andre art (f.eks. makak-ape), for å bedømme graden av kryssreaktivitet til det bindende medlemmet for IL-4Rα til de to artene. Det er store fordeler ved å ha et bindende medlem, f.eks. et antistoff eller et antistoff-fragment, som binder både det menneskelige målet og det ortologe målet fra andre arter. En hovedfordel oppstår når det bindende medlemmet blir fremført som et behandlende produkt og sikkerhetstudier (f.eks. toksisitet) må utføres i andre arter. Potens eller affinitet til andre arter, som f.eks. er mindre enn -ganger annereldes enn den menneskelige aktiviteten, kan være egnet for en slik evaluering. [006] Det finnes forskjellige måter for å fastslå forhold mellom bindingen til de

14 12 bindende medlemmene som beskrives heri til menneske og de "andre artene" (f.eks. makak-ape) IL-4Rα. En metode er reseptor-ligand-bindingsanalyse, som den som ble brukt i eksempel [007] For bindende medlemmer som er beskrevet heri, er bindingsforholdet for det bindende medlemmet når en scfv til hil-4rα og til cyil-4rα målt ved bruk av reseptor-ligand bindende analyse er minst 6:1. Som brukt her, "minst" 6:1, inkluderer 8:1, :1 etc; heller enn 2:1, 1:1. [008] Bindende medlemmer som beskrives heri binder menneskelig IL-4Rα og makak-ape IL-4Ra, og kan ha en mindre enn -ganger f.eks. mindre enn -, 0-, 7-, 0-, 2-, -, 1-, -ganger forskjell i potensen for å nøytralisere menneskelig og makak-il-4rα som fastslått i reseptor-ligand-bindende analyse, med det bindende medlemmet i scfv-format, som i eksempel 4.3. [009] For eksempel indikerer dataen heri at antistoff-numrene: 2, 4-8, 12, 16, 19,, 22, 23, 24, 26, 28, 32, 33, 34, 37 og 37GL, for eksempel har en mindre enn eller lik 2- ganger forskjell i potens for nøytralisering av menneskelig og makak IL-4Rα henholdsvis, når i scfv-format i reseptor-ligand-bindende analyse som beskrives heri. Data er presentert i eksempel 4.3 og tabell 1. Dermed kan nøytraliseringspotensen til bindende medlemmer (når de er i scfv-format) for menneskelig og makak-il-4rα, målt ved bruk av reseptor-ligand bindende analyse, være innen 2-ganger. Spesielle eksempler på antistoffer som er beskrevet heri som viser mindre enn eller lik -ganger nøytraliseringspotens for menneskelig og makak-il-4rα inkluderer antistoffnr. 2, 4,, og 22. Nøytraliseringspotensen til de bindende medlemmene for menneskelig og makak IL-4Rα kan være innen 2-ganger, dvs. binding til menneskelig IL-4Rα er ikke større enn 2-ganger det mot makak IL-4Rα. Nøytraliseringspotensen kan være :1 og 2:1, som f.eks. mellom :1 og 0: [0060] For funksjonelle cellebaserte analyser uttrykker potensen vanligvis som en IC 0 - verdi, i nm, hvis ikke annet er oppgitt. I funksjonelle analyser er IC 0 den molare konsentrasjonen av et bindende medlem som reduserer en biologisk (eller biokjemisk) respons med 0 % av dens maksimum. IC 0 kan kalkuleres ved å plotte % av maksimal biologisk respons som en funksjon av loggen av det bindende medlemmets konsentrasjon, og ved bruk av programvare som Prism (GraphPad) eller Origin (Origin Labs) for å tilpasse en sigmoidal funksjon til dataen for å generere IC 0 -verdier. [0061] For reseptor-ligand-bindende analyser, uttrykkes potens vanligvis som Ki (hemmingskonstanten), konsentrasjonen til det bindende medlem som ville oppta 0 %

15 13 av reseptorer hvis ingen merket ligand var til stede. Mens IC 0 kan variere mellom eksperimenter avhengig av ligandkonsentrasjon, er Ki en absolutt verdi kalkulert fra Cheng Prusoff-ligningen. 1 [0062] Et bindende medlem beskrevet heri kan ha en nøytraliseringspotens eller Ki på opp til nm i menneskelig IL-4RαHTRF analyse som beskrevet heri. Denne analysen kan brukes for å fastslå Ki for bindende medlemmer i scfv-format. Ki kan for eksempel være opp til.0, 4.0, 3.0, 2.0, 1.0, 0., 0.2, 0.1, 0.0 eller 0.02nM. Eksempler på Ki-data presenteres i eksempel 4.3 (se tabell 1), der en endelig konsentrasjon på 0,12 nm menneskelig IL-4Rα og 2nM IL-4 brukes i HTRF reseptor-ligandbindende analyse og en detaljert metode er gitt. [0063] I tillegg kan bindingskinetikk og affinitet (uttrykt som likevektsdissosiasjonkonstant, KD) av IL-4Rα bindende medlemmer for IL-4Rα kan fastslås, f.eks. ved bruk av overflateplasmonresonans som BIAcore, eller Kd estimeres ut fra pa 2 -analyse [0064] Overflateplasmon-resonans er en veletablert teknikk for å avgjøre affiniteten til et bindende medlem for et mål. Det innebærer a føre en analytt i væskefase over en ligand som er festet til en støtte, og avgjøre bindingen mellom analytt og ligand. Overflateplasmon-resonans kan for eksempel utføres ved at rekombinant IL-4Rα føres i væskefase over et bindende medlem festet til en støtte. Overfletplasmon-resonansdata kan festet til en bivalent analytt-datamodell eller en monovalent analytt-datamodell Som vist i eksemplene heri, ble en monovalent analytt-datamodell funnet å være spesielt godt egnet for å fastslå affiniteten for bindende medlemmer til IL-4Rα. En affinitetskonstant Kd kan beregnes fra forholdet mellom hastighetskonstanter kd1/ka1 som fastslått av overflateplasminresonans ved bruk av en 1:1 Langmuir bindingsmodell. [006] Eksempler på estimerte KD-verdier for binding av IL-4Rα beregnet ved bruk av overflateplasmonresonans er presentert i eksempel 4.7 (se tabell 4). Disse dataene viser gode bindingsegenskaper av antistoff 37GL for rekombinantprodusert menneskelig og makak-il-4ra. Binding til IL-4Rα fra HEK-EBNA-celler demonstrerer at antistoffet binder naturlig glykosylert menneskelig IL-4Rα. Fordi antistoff 37GL binder til den naturlige glykosylerte menneskelige IL-4Rα-formen gir mulighet til forutse at alle antistoffene som beskrives heri (f.eks.antistoffer 1 til 42) kan binde naturlig glykosylert menneskelig IL-4Rα, gitt at alle disse antistoffene ble avledet fra ett enkelt foreldreantistoff (antistoff 1) og dermed antas å alle binde samme eller svært lik epitop av IL-4Rα.

16 14 [0066] Dermed er de spesifikke bindende medlemmene beskrevet heri kapable til å binde til glykosylert hil-4rα. 1 2 [0067] Som illustrert i eksempel 4.7 og tabell 4, ble en god kryssreaktivitet i bindende menneskelig og makak IL-4Rα fastslått via overflateplasmonresonans for et representativt panel av antistoffer avledet fra antistoff 1. [0068] Bindende medlemmer kan alternativt være spesifikke for IL-4Rα over andre strukturelt relaterte molekyler (f.eks. andre interleukin-reseptorer) og dermed binde IL- 4Rα selektivt. For eksempel kryssreagerer kanskje ikke bindende medlemmer med noen av IL-13Rα1 eller IL-13Rα2 og den vanlige gammakjeden (γc). Dette kan fastslås eller demonstreres, for eksempel i en DELFIA epitop-konkurranseanalyse som vist i eksempel 4.6. [0069] Et bindende medlem kan bestå av et antistoffmolekyl, f.eks. et menneskelig antistoffmolekyl. Det bindende medlemmet består av et antistoff VH og/eller VLdomene. VH-domene med bindende medlemmer er også beskrevet heri. Innen hvert av VH- og VL-domenene er komplementaritetsbestemmende regioner ("CDRer"), og rammeverksregioner, ("FRer"). Et VH-domene består av et sett med HCDRer, og et VL-domene består av et sett med LCDRer. Et antistoffmolekyl kan bestå av et antistoff VH-domene som består av en VH CDR1, CDR2 og CDR3 og et rammeverk. Det kan alternativt også bestå av et antistoff VL-domene som består av en VH CDR1, CDR2 og CDR3 og et rammeverk. Et VH- eller VL-domenerammeverk består av fire rammeverkregioner, FR1, FR2, FR3 og FR4, innfelt med CDRer i følgende struktur: 30 3 Eksempler på antistoff VH- og VL-domener, FRer og CDRer er listet i den vedlagte sekvenslistingen som danner en del av den nåværende presentasjonen. Som beskrevet heri, består et "sett med CDRer" av CDR1, CDR2 og CDR3. Dermed referer HCDRs til HCDR1, HCDR2 og HCDR3, og et sett med LCDRer referer til LCDR1, LCDR2 og LCDR3. Hvis ikke annet er oppgitt, inkluderer "et fullt sett med CDRer" HCDR og LCDRer. Vanligvis er de bindende medlemmene av oppfinnelsen monoklonale antistoffer. [0070] Et videre aspekt er et antistoffmolekyl som består av et VH-domene som har minst 7, 80, 8, 90, 9, 98 eller 99% aminosyresekvensidentitet med et VH-domene av hvilket som helst av antistoffer 1 til 42 som vises i den vedlagte sekvenslistingen og/eller som består av et VL-domene som har minst 7, 80, 8, 90, 9, 98 eller 99%

17 1 aminosyresekvensidentitet med et VL-domene av hvilket som helst av antistoffer 1 til 42 som vises i den vedlagte sekvenslistingen. Accelerys' "MacVector "-program kan brukes for å kalkulere % identiteten til to aminosyresekvenser. 1 2 [0071] Et bindende medlem kan bestå av et antigenbindende område innen et ikkeantistoffmolekyl, vanligvis gitt av ett eller flere CDRer, f.eks. en HCDR3 og/eller LCDR3, eller et sett med CDRer, i en ikke-antistoff-proteinavledning, som diskutert videre under. [0072] Som beskrevet i mer detalj i det eksperimentelle avsnittet, isolerte oppfinnerne et foreldreantistoffmolekyl (antistoff 1) med et sett med CDR-sekvenser som vist i figurer 1 (VH-domene) og 2 (VL-domene). Gjennom en optimeringsprosess genererte de et panel av antistoffkloner, inkludert de som er nummerert 2 til, med CDR3- sekvenser avledet fra foreldre-cdr3-sekvensene og har erstatninger ved posisjonene som er indikert i figur 1 (VH-domene) og figur 2 (VL-domene). Dermed for eksempel, kan det ses fra figur 1 (a og b), at antistoff 2 har foreldre HCDR1, HCDR2, LCDR1 og LCDR2-sekvenser der Kabat-rest 9 er erstattet av Q, Kabat-rest 9A, 9B og 96 alle er estattet av P og Kabat-rest 97 er erstattet av L, og har en foreldre HCDR3-sekvens der Kabat-rest 1 er erstattet av Y og Kabat-rest 2 er erstattet av N. [0073] Foreldre-antistoffmolekylet, og antistoffmolekyler 2 til, som beskrevet heri, referer henholdsvis til antistoffmolekyler med CDRer av foreldreantistoffmolekylet og til antistoffmolekyler med CDRer av antistoffmolekyler 2 til. Gjennom en videre optimeringsprosess genererte oppfinnerne et panel med antistoffkloner nummerert 21-42, med ekstra erstatninger gjennom VH- og VL-domener. Dermed har for eksempel antistoff 21 samme LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1 og HCDR3 som antistoff, den har foreldre-hcdr2-sekvensen til antistoff, men med Kabat-rest 7 erstattet med A, og den har Kabat-rester 8 og 87 (i LFW3) erstattet av V og F, henholdsvis [0074] Beskrevet heri er et referanse-bindende medlem som består av antistoff -sett med CDRer som vist i figurer 3 (VH) og 4 (VL), der HCDR1 er SEQ ID NO: 193 (Kabat-rester 31-3), HCDR2 er SEK ID NR: 194 (Kabat rester 0-6), HCDR3 er SEK ID NR: 19 (Kabat rester 9-2), LCDR1 er SEK ID NR: 198 (Kabat rester 24-34), LCDR2 er SEK ID NR: 199 (Kabat rester 0-6), LCDR3 er SEK ID NR: 0 (Kabat-rester 89-97). Ytterligere bindende medlemmer kan beskrives med referanse til sekvensen i det bindende referansemedlemmet. [007] Et bindende medlem kan bestå av en eller flere CDRer (dvs. minst en, minst 2, minst 3, minst 4, minst, og minst 6) som beskrevet heri, f.eks. en CDR3, og valgfritt

18 16 også en CDR1 og CDR2 for å danne et sett med CDRer. CDR eller sett med CDRer kan være en foreldere CDR eller foreldresett med CDRer, eller kan være en CDR eller sett med CDRer av hvilke som helst antistoffer 2 til 42, eller kan være en variant av disse som beskrevet heri. 1 [0076] For eksempel, et bindende medlem eller et VH-domene kan bestå av referanse- LCDR3 med en eller flere Kabat-rester erstattet for en annen aminosyre. Eksempel-erstatninger inkluderer: Kabat-rest 92 erstattet av Phe (F), Val (V) eller Ala (A); Kabat-rest 93 erstattet av Gly (G) eller Ser (S); Kabat-rest 94 erstattet av Thr (T) Kabat-rester 9 erstattet av Leu (L), GLn (Q), Pro (P) eller Ser (S); Kabat-rest 9a erstattet av Ser (S), Prol (P), Ala (A), Thr (T), His (H) eller Gly (G); Kabat-rest 9B erstattet av Ala (A), Pro (P), Ser (S), Tyr (Y), Met (M), Leu (L), Thr (T), Asp (D) eller Arg (R); Kabat-rest 9C erstattet av Asn (N), Gln (Q), His (H), Tyr (Y), Ile (I), Lys (K), Arg (R), Thr (T) eller Met (M); Kabat-rest 96 erstatter av Tyr (Y) eller Pro (P); Kabat-rest 97 erstattet av Val (V), Leu (L) eller Ile (I). 2 [0077] Et bindende medlem eller et VH-domene kan bestå av referanse-hcdr3 med en eller flere Kabat-rester 97-2 erstattet for en annen aminosyre. Eksempelerstatninger inkluderer: Kabat-rest 97 erstattet av Trp (W) eller Leu (L); Kabat-rest 98 erstattet av Leu (L); Kabat-rester 99 erstattet av Leu (L), Lys (K), Phe (F) eller Trp (W); Kabat-rest 1 erstattet av Asp (D), Asn (N) eller Gln (Q); Kabat-rester 2 erstattet av Tyr (Y), Asn (N), Pro (P) eller His (H) ] Bindende medlemmer kan bestå av en HCDR1, HCDR2 og/eller HCDR3 av hvilke som helst antistoffer 1 til 42 og/eller en LCDR1, LCDR2 og/eller LCDR3 av hvilke som helst av antistoffene 1 til 42, f.eks. et sett med CDRer av hvilke som helst av antistoffene 1 til 42 som vises i figur 1 eller 2. Et bindende medlem kan bestå av et sett med VH CDRer av ett av disse antistoffene. Alternativt kan det også består av et sett med VL CDRer av ett av disse antistoffene, og VL CDRer kan være fra samme eller et annet antistoff som VH CDRer. Et VH-domene som består av et sett med

19 17 HCDRer av hvilket som helst av antistoffene 1 til 42 og/eller et VL-domene som består av et sett med LCDRer av hvilket som helst av antistoffene 1 til 42 anbefales også. 1 [0079] Vanligvis parres et VH-domene med et VL-domene for å gi et antistoff-antigenbindende sted, selv om, som det blir diskutert videre under, et VH- eller VL-domene alene kan brukes for å binde antigenet. I en legemliggjøring parres antistoff 1 VHdomene med antistoff 1 VL-domene, slik at et antistoff-antigen-bindende område dannes som består av både antistoff 1 VH- og VL-domener. Analoge legemliggjøringer gis for de andre VH- og VL-domenene som beskrives heri. I andre legemliggjøringer parres antistoff 1 VH med et annet VL-domene enn antistoff 1 VL. Lettkjedepromiskuitet er velkjent på feltet. Igjen, analoge legemliggjøringer gis for de andre VH- og VL-domenene som beskrives heri. Dermed kan VH av forelderen (antistoff 1) eller hvilket som helst av antistoffene 2 til 42 kan parres med VL av forelderen eller hvilket som helst av antistoffene 2 til 42. [0080] Ett aspekt er et antistoff som består av et VH- og VL-domene der VH-domenet består av en sekvens som presenteres i figur 1 eller 3. [0081] Et annet aspekt er et antistoff som består av et VH- og VL-domene der VLdomenet består av en sekvens som presenteres i figur 2 eller 4. 2 [0082] Et annet aspekt er et isolert antistoffmolekyl som består av et VH-domene med VH-domene-aminosyresekvens som vises i SEK ID NR: 362, 442, 232, 422 eller 432 og et VL-domene med VL-domene-aminosyre-sekvens som vises i SEK ID NR: 367, 237, 447, 437 eller [0083] Et bindende medlem kan bestå av et sett med H og/eller L CDRer av foreldreantistoffet eller av antistoffer 2 til 42 med tolv eller ti eller ni eller færre, f.eks. ett, to, tre, fire eller fem, erstatninger innen det beskrevne settet med H og/eller L CDRer. For eksempel kan et bindende medlem bestå av antistoff 16- eller antistoff - sett med H og/eller L CDRer med 12 eller færre erstatninger, f.eks. sju eller færre erstatninger, f.eks. null, ett, to, tre, fire, fem eller seks erstatninger. Erstatninger kan potensielt lages ved hvilken som helst rest innen settet med CDRer, og kan være innen CDR1, CDR2 og/eller CDR3. [0084] Dermed gis et isolert bindende medlem for menneskelig interleukin-4 reseptor alpha (hil-4rα), som består av et sett med CDRer: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 og LCDR3, der settene med CDRer har 12 eller færre aminosyreendringer fra et referansesett av CDRer der:

20 HCDR1 har aminosyresekvens SEK ID NR: 13, HCDR2 har aminosyresekvens SEK ID NR: 14, HCDR3 har aminosyresekvens SEK ID NR: 1, LCDR1 har aminosyresekvens SEK ID NR: 18, LCDR2 har aminosyresekvens SEK ID NR: 19, og LCDR3 har aminosyresekvens SEK ID NR: 160. Referanseantistoffet i dette tilfellet er antistoff 16. [008] Det isolerende bindende medlemmet kan ha eller færre, 8 eller færre, 7 eller færre, f.eks. 6,, 4, 3, 2, 1 eller 0 aminosyreendringer fra referansesettet med CDRer. Spesielle endringer er aminosyre-erstatninger. [0086] I henhold til et aspekt av oppfinnelsen gis et isolert antistoff eller bindende fragment av dette for menneskelig interleukin-4 reseptor alpha (hil-4rα), der det bindende medlemmet også er kapabelt til å binde til makak-apens interleukin-4 reseptor alpha (cyil-4ra), som består av et sett med CDRer: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 og LCDR3, der: HCDR1 har aminosyresekvens SEK ID NR: 193, HCDR2 har aminosyresekvens SEK ID NR: 194, HCDR3 har aminosyresekvens SEK ID NR: 19, LCDR1 har aminosyresekvens SEK ID NR: 198, LCDR2 har aminosyresekvens SEK ID NR: 199, og LCDR3 har aminosyresekvens SEK ID NR: 0. For eksempel antistoff. [0087] I henhold til et aspekt av oppfinnelsen gis et isolert antistoff eller bindende fragment av dette for menneskelig interleukin-4 reseptor alpha (hil-4rα), der det bindende medlemmet også er kapabelt til å binde til makak-apens interleukin-4 reseptor alpha (cyil-4ra), som består av et sett med CDRer: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 og LCDR3, der: HCDR1 har aminosyresekvens SEK ID NR: 363, HCDR2 har aminosyresekvens SEK ID NR: 364, HCDR3 har aminosyresekvens SEK ID NR: 36, LCDR1 har aminosyresekvens SEK ID NR: 368, LCDR2 har aminosyresekvens SEK ID NR: 369, og LCDR3 har aminosyresekvens SEK ID NR: 370. For eksempel antistoff 37. [0088] Erstatninger kan være innen CDR3, f.eks. plasseringer som erstattet i hvilket

21 19 som helst av antistoffene 2 til 42, som vist i figurer 1 eller 3 (VH-domene) og 2 eller 4 (VL-domene). Dermed kan en eller flere erstatninger bestå av en eller flere erstatninger ved følgende rester: Kabat-rester 97, 98, 99, 1 eller 2 i HCDR3, eller Kabat-rester 92, 93, 94, 9, 9A, 9B, 9C, 96 eller 97 i LCDR3. [0089] Dermed kan for eksempel en CDR3 være en referanse-lcdr3 som har en eller flereerstatninger ved Kabat-rester 92, 93, 94, 9, 9A, 9B, 9C, 96 eller 97. [0090] Eksempler på erstatninger i foreldre-/referanse-cdrer er beskrevet andre steder heri. Som beskrevet kan erstatningene bestå av en eller flere erstatninger som vist i figur 1 til 4. 1 [0091] Et bindende medlem kan bestå av HCDR1, HCDR2 og/eller HCDR3 av referanse-antistoff, eller med ett eller flere av følgende erstatninger: HCDR2 der Kabat-rest 3 er Arg (R); HCDR2 der Kabat-rest 7 er Ala (A); HCDR3 der Kabat-rest 97 er Trp (W) eller Leu (L); Kabat-rest 98 er Leu; Kabat-rest 99 er Leu (L), Lys (K) eller Trp (W); Kabat-rest 1 er Asn (N) eller Gln (Q); og/eller Kabat-rest 2 er Tyr (Y), Asn (N), Pro (P) eller His (H) [0092] Et bindende medlem kan bestå av LCDR1, LCDR2 og/eller LCDR3 av referanse-antistoff, eller med ett eller flere av følgende erstatninger: LCDR1 der Kabat-rest 27 er Gly (G); Kabat-rest 27A er Thr (T); Kabat-rest 27B er Ser (S); Kabat-rest 31 er Asn (N); LCDR2 der Kabat-rest 6 er Pro (P); LCDR3 der Kabat-rest 92 er Phe (F), Val (V) eller Ala (A); Kabat-rest 93 er Gly (G) eller Ser (S); Kabat-rest 94 er Thr (T); Kabat-rester 9 er Leu (L), GLn (Q), Pro (P) eller Ser (S); Kabat-rest 9A er Ser (S), Pro (P), Ala (A), Thr (T), His (H) eller Gly (G); Kabat-rest 9B er Ala (A), Pro (P), Ser (S), Tyr (Y), Met (M), Leu (L), Thr (T), Asp (D) eller Arg (R); Kabat-rest 9C er Asn (N), Gln (Q), His (H), Tyr (Y), Ile (I), Lys (K), Arg (R), Thr (T) eller Met (M);

22 Kabat-rest 96 er Tyr (Y) eller Pro (P); og/eller Kabat-rest 97 er Val (V), Leu (L) eller Ile (I). 1 [0093] I en spesiell legemliggjøring med referanse til antistoff -sekvens, erstattes Kabat-rest 3 i HCDR2 med Arg (R); og/eller Kabat-rest 7 i HCDR2 er erstattet av Ala (A); og/eller Kabat-rest 27 i LCDR1 erstattes av Gly (G); og/eller Kabat-rest 27B i LCDR1 erstattes av Ser (S); og/eller Kabat-rest 9 i LCDR3 erstattes av Pro (P). [0094] I henhold til et annet spesielt aspekt av oppfinnelsen gis et isolert antistoff eller fragment av dette for menneskelig interleukin-4 reseptor alpha (hil-4rα), der det bindende medlemmet også er kapabelt til å binde til makak-apens interleukin-4 reseptor alpha (cyil-4ra), der det isolerte bindende medlemmet består av et sett med CDRer: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, der, HCDR1 har aminosyresekvens SEK ID NR: 233, HCDR2 har aminosyresekvens SEK ID NR: 234, HCDR3 har aminosyresekvens SEK ID NR: 23, LCDR1 har aminosyresekvens SEK ID NR: 238, LCDR2 har aminosyresekvens SEK ID NR: 239, og LCDR3 har aminosyresekvens SEK ID NR: 240, 2 30 [009] I et bindende medlem: HCDR1 kan være aminosyrer lang, og bestå av Kabat-rester 31-3, HCDR2 kan være 17 aminosyrer lang, og bestå av Kabat-rester 0-6, HCDR3 kan være 9 aminosyrer lang, og bestå av Kabat-rester 9-2, LCDR1 kan være 13 aminosyrer lang, og bestå av Kabat-rester 24-34, LCDR2 kan være 7 aminosyrer lang og bestå av Kabat-rester 0-6; og/eller, LCDR3 kan være 9 aminosyrer lang, og bestå av Kabat-rester [0096] Kabatnummerering av et sett med HCDRer og LCDRer, der HCDR1 er Kabatrester 31-3, HCDR2 er Kabat-rester 0-6, HCDR3 er Kabat-rester 9-2 vises i figurer 1 og 3, LCDR1 er Kabat-rester 24-34, LCDR2 er Kabat-rester 0-6 og LCDR3 er Kabat-rester 89-97, vises i figurer 2 og 4. [0097] I henhold til et annet aspekt gis et isolert bindende medlem for menneskelig interleukin-4 reseptor alpha (hil-4rα), som består av et sett med CDRer: HCDR1,