Interferens i immunologiske metoder

Transkript

1 Interferens i immunologiske metoder Siri B. Mortensen, seksjonsleder Immunologisk seksjon, TLMB, Ahus Disposisjon Min bakgrunn og innfallsvinkel til temaet Kilder til interferens i analysemetoder Interferens i immunologiske metoder Våre erfaringer med interferens case Hva kan vi gjøre med interferens? Forebygging Bidrag og referanser 1

2 Administrerende direktør på Ahus er juridisk ansvarlig for foretakets virksomhet. Godkjent av Janne Pedersen (Dir. DDT) okt EQS id 9542 v Organisering TLMB - Tverrfaglig laboratoriemedisin og medisinsk biokjemi Avdelingsleder NOKLUS* Avdelingsoverleger * Ekstern finansiering Medisinsk fag, forskning og utvikling (MFFU) Prøvetaking (PT) Prøvemottak (PM) Klinisk kjemi (Kjemi) Hematologi, koagulasjon, flow (Hemat) Immunologi (Imm) Genteknologi (Gentek) Medisinsk biokjemi NOKLUS Prøvemottak Automatisk prøvehåndtering Syrebase og småanalyser Hematologi Morfologi Koagulasjon Flowcytometri Kromatografi Prøvetaking og desentralisert prøvetaking Pasientnær analysering Merkantile tjenester Forskningsbioingeniør Medisinsk biokjemi Elektroforese og proteinanalyser Medikament og misbruksanalyser Urinveiskonkrementer Kromatografi Sporelementer Medisinsk biokjemi Allergologi Autoimmune analyser Infeksjonsimmunologi Rådgiver for sykehjemmene og PHT Genteknologiske analyser for fagområdene: Immunologi og transfusjonsmedisin Mikrobiologi Medisinsk biokjemi Patologi Immunologi Tverrfaglig analyseseksjon Metodefellesskap for immunometriske analyser. Stort analyserepertoar innen fagområdene medisinsk immunologi (allergi og autoimmunitetanalyser) Infeksjonsimmunologi (blodgiverscreening, gravidscreening og pasientserologi) medisinsk biokjemi (hormoner, vitaminer, hjerte tumor og demensmarkører) Akkrediterte analyser innen alle fagområder Medisinsk faglig ansvar fra tre avdelinger TLMB Tverrfaglig laboratoriemedisin og medisinsk biokjemi IMTRA Immunologisk og transfusjonsmedisinsk avdeling MIKS Avdeling for mikrobiologi og smittevern 2

3 Tverrfaglig samarbeid også inn mot klinikken Medisinskfaglig ansvarlige er valideringsansvarlige, og er involvert i all endring og utvikling av analyser, metoder og instrumenter. Har jevnlig møter med klinikken der blant annet bruk av analyser, usikkerhet i metoder og valg av referanseområde er temaer. Vi har opplæring av Leger i Spesialisering (LIS), med hospitering i aktuelle seksjoner. I tillegg til laboratorielege utdanningen, er også LIS i infeksjonsmedisin med på hospiteringen i forbindelse med sitt år i praksis på MIKS. Akkrediteringsstandarden har et stort fokus på klinikere og deres nytte av laboratorietester, veiledning og tolkning av prøvesvar, og forståelse av usikkerhet i metoder. Det er også vi opptatt av å formidle. Alle fire laboratorieavdelinger på AHUS er akkreditert og det er en stor fordel at vi jobber etter det samme kvalitetssystemet. Immunologiske analyseinstrumenter på AHUS Phadia 250 ImmunoCap Cobas e801 Liaison XL 3

4 Kilder til interferens i analysemetoder HIL Hemolyse, icterus og Lipemi Matrixeffekt Kryssreaktivitet Heterofile antistoffer Rheumatoide faktorer Biotin eller Streptavidin antistoffer Makroprolaktin Monoklonal komponent Matriks og kryssreaktivitet Generelle kommentarer til resultatene Hvis det er markerte forskjeller mellom metodegruppene, kan disse som regel forklares med forskjeller i spesifisitet, kalibrering eller matrikseffekter. Ved vurdering av resultatene bør spesielt metodens spesifisitet tas i betraktning. Mens enkelte metoder er spesifikke for komponenten i én molekylær form, kan andre metoder medbestemme komponenten hvis den forekommer i andre former, eventuelt metabolitter eller liknende substanser, og dermed forårsake tydelige metodeforskjeller. I en del tilfeller kan en interfererende substans kryssreagere og dermed forårsake ganske feilaktig resultat. 4

5 Matrikseffekt Forandringer i struktur på proteiner og peptider samt andre fysiske forandringer i prøvematerialet. Snakkes oftest om kontrollmaterialer som er spiket, frysetørret osv. Pasientprøver kan også ha ulik matriks, f.eks. ekstremt viskøse prøver fra dialysepasienter. Gallefargestoff eller andre endringer. Kryssreaktivitet i stor grad, kjent og dokumentert for Allergianalyser. hormoner som fremstår i ulike molekylære varianter f.eks HCG. medikament; f.eks. Fulvestrant og måling av Østradiol. pga metabolitter med lignende struktur som analytten, f.eks. VitD. I infeksjonsimmunologi er det også flere muligheter for kryssreaktivitet pga lignende strukturer. 5

6 Heterofile antistoffer Heterofile antistoffer er humane antistoffer rettet mot antistoffer fra dyr Antistoffer fra menneske ligner antistoffer fra dyr, og derfor vil noen heterofile antistoffer kunne binde humane antistoffer og samtidig være reumatoide faktorer. Som regel IgM antistoff Ikke kjent hvorfor noen danner heterofile antistoffer Kan oppstå etter eksponering for terapeutiske eller diagnostiske museantistoffer (HAMA). Behandling med biologiske medikamenter ( Mab). Antas også dannet etter nærkontakt med dyr, eller opphold i miljø med ekskrementer fra f.eks. mus. Rheumatoid faktor er humane antistoffer rettet mot humane antistoffer er polyklonale autoantistoffer som binder seg til Fc fragmentet på IgGmolekyler RF er oftest av type IgM, men det kan også være IgG eller IgA. Noen reumatoide faktorantistoffer reagerer med dyreantistoffer og vil derfor også kunne være heterofile antistoffer. 6

7 >Figur Fra Norsk Epidemiologi 2006;16 (1):29 33, Bjerner og Nustad Makroprolaktin Prolaktin kan forekomme i forskjellige molekylære former, bl.a. big big prolaktin (makroprolaktin). Det er et kompleks av prolaktin og bindeprotein, oftest IgG, som antas å ha liten eller ingen biologisk aktivitet. Ulike prolaktinanalyser medbestemmer makroprolaktin i ulik grad. Vår analyse medbestemmer i liten grad makroprolaktin. I alle førstegangsprøver med prolaktinkonsentrasjoner > 800 mie/l vil det likevel bli utført felling med PEG(polyetylenglykol) for å undersøke mulig tilstedeværelse av makroprolaktin. 7

8 Biotinin Streptavidin Biotin er et biologisk aktivt stoff Deltar i energiomsetningen av fett og karbohydrater Forekommer naturlig i blant annet nyre, lever, egg og avocado Benyttes i analyseprinsipper fordi bindingen til Streptavidin, er en av de sterkeste ikke kovalente bindingene som finnes Inngår i svært mange analysesystemer, bl.a. Roche analysene Paramagnetiske kuler dekket av streptavidin Biotinylerte antistoffer/analytter Biotin bruk Biotin markedsføres som vidundermiddel for hår og negler i skjønnhetsindustrien. Kan kjøpes på nett og i utlandet, i svært høye konsentrasjoner Biotinpreparater med lavere dosering finnes i apotekene, til behandling ved mangel 8

9 Biotin (vitamin B7, vitamin H) Hvem tar biotintilskudd? Ved biotinidasemangel (inngår i nyfødtscreening) I multivitamintablett, µg, i Norge maks 225 µg/d For hår og negler: Internett: 5 10 mg tbl. MS: Internett: 100 mg tbl., opptil 300 mg/d Obs analyseinterferens! Biotin bruk Meget høye doser av biotin er foreslått å gi positiv effekt i behandling av multippel sklerose (MS) ved å fremme myelinreparasjon gjennom aktivering av acetyl CoA karboksylase, og ved å øke energiproduksjonen i demyeliniserte neuroner gjennom aktivering av Krebs syklus. Biotin er beregnet for behandling av primær og sekundær progressiv MS og kan tas som tabletter. Er foreløpig ikke godkjent i Norge som MS medisin, men leger kan søke Statens legemiddelverk om godkjenningsfritak. 9

10 Streptavidin Kjent først og fremst pga. meget sterk binding til biotin dette benyttes innen bioteknologi, bl.a. i immunoassay Produseres av bakterien Steptomyces avidinii Funksjonen til streptavidin er antakelig å hemme vekst av bakterier Nært beslektet stoff: Avidin finnes i rå eggehvite (ca. 1,8 mg i et vanlig hønseegg) hvert molekyl binder opp til 4 molekyler biotin funksjon ukjent, men trolig hemming av bakterievekst (ved å binde biotin (vitamin B7), som bakteriene trenger) Hvorfor lager noen antistoffer mot streptavidin? Ukjent Ukjent om de lager antistoffer også mot avidin. Trolig ikke, pga.: Avidin har bare 30 % aminosyrelikhet med streptavidin Avidin er glykosylert (i motsetning til streptavidin) 10

11 Monoklonal komponent M komponenter i serum foreligger ved myelomatose, MGUS (monoclonal gammopathy of undetermined significance), Waldenstrøms sykdom, ALamyloidose, paraproteinemisk polynevropati, men forekommer også ved andre lymfoproliferative lidelser. Monoklonale proteiner er patologiske immunglobuliner som stammer fra én enkelt plasmacelleklon Eksempler fra et reagens pakningsvedlegg Begrensninger - interferens Effekten av følgende endogene stoffer og farmasøytiske preparater med tanke på ytelse av analysen ble testet. Interferens ble målt opp til de nevnte konsentrasjonene og det ble ikke observert noen innvirkning på resultatene 11

12 Eksempler fra et reagens pakningsvedlegg Eksempler fra et reagens pakningsvedlegg 12

13 Eksempler på interferens i vår laboratoriehverdag Telefon fra kliniker som stusser på et eller flere rare prøvesvar. En pasient har hatt helt andre prøvesvar ved analyse i OUS eller på Fürst. Vi har oppdaget et resultat som vi lurer på, som ikke stemmer med kliniske opplysninger. Resultater stopper til medisinsk vurdering fordi vi har lagt grenseverdier for å fange mulig interferens i TSH og T4FR Case EliA Phadia 250 8mnd gammel barn med Downs syndrom. Positiv på Elia GBM, PR3 og MPO analysert på Phadia 250. Immunfluorescense var negativ. Prøven ble sendt til OUS Ullevål for sammenligning. De fikk negativt resultat med Elisa og blot teknikk. Prøven ble sendt til Freiburg Thermo Fishers testlaboratorium. De fant samme resultater som på AHUS, men i tillegg at pasientprøven reagerer med EliA assay blocking solution. Det vil si at prøven inneholder antistoffer som binder uspesifikt til blocking reagenset brukt i de aktuelle EliA testene. Resultatene må derfor anses som falsk positive. Dette er en svært sjelden interferens, og det er uklart hva som er årsaken. 13

14 Kasuistikk fra 2013 Kvinne, født 1942, planlagt elektrokonvertering, så fort digoksin var seponert. Digoksin analysert ved Ahus på cobas e602 (Roche Diagnostics): Prinsipp for digoksinanalysen på cobas e602 fra Roche: Kompetitiv elektrokjemiluminescens 14

15 Prinsipp for digoksinanalysen på cobas e602 fra Roche: Kompetetiv elektrokjemiluminescens Prinsipp for digoksinanalysen på cobas e602 fra Roche: Kompetitiv elektrokjemiluminescens 15

16 Interferenser angitt for digoksinanalysen på cobas e602: Ikke analyseinterferens ved: Ikterus: bilirubinkonsentrasjoner < 1112 µmol/l Hemolyse: Hb < 1 g/dl (hemolyseindeks 1000) Lipemi/turbiditet: Intralipid < 15 g/l Biotinkonsentrasjon < 100 µg/l (ved behandling med høye doser biotin, > 5 mg/dag bør det gå minst 8 timer etter siste dose) Revmatoid faktor konsentrasjon < 1630 IU/mL Interferenser angitt for digoksinanalysen på cobas e602: Medikamenter Interferens ved medikamentinntak i anbefalt daglig dose: *Uzara: uregistrert anti diarémiddel Nabumeton: Relifex. NSAID *Hydrokortison *Pentoksifyllin: Trental. Kardilaterende, brukes ved claudicatio intermittens Kanrenon: Kanrenoat. Aldosteronantagonist/diuretikum, gis i.v, brukes ved hypertensjon og hjertesvikt. Foreskrives på godkjenningsfritak) Interferens ved høye doser: Spironolakton: Aldactone og Spirix. Aldosteronantagonist, kanrenon hovedmetabolitt. Brukes ved behandling av ødemer, hjertesvikt og hypertensjon *Interferer også i digoksin-analysen på cobas c 16

17 Interferenser angitt for digoksinanalysen på cobas e602: *Digoksinlignende immunreaktive stoffer (DLIS) hos Nyresviktpasienter Leversviktpasienter Kvinner gravide i tredje trimester *Pasienter som får Digibind (antistoffragmentterapi ved digitalisforgiftning) Ekstremt høye titre av antistoff mot analytt spesifikke antistoffer, streptavidin eller rutenium. Disse effektene er minimert av egnet analysedesign. *Interferer også i digoksinanalysen på cobas c + andre analyser Digoksin casustikk Hos denne pasienten ble det konkludert med Streptavidin interferens 17

18 Kasuistikk thyreoideaprøver og VitD Pasienten hadde MS og brukte kjempedoser biotin Normale thyreoideaprøver på Fürst (Siemens) Roche sandwich analyse (bl.a. TSH) 18

19 Roche sandwich analyse (bl.a. TSH) Roche kompetitiv analyse (bl.a. FT4) 19

20 Roche kompetitiv analyse (bl.a. FT4) Biotininterferens 20

21 Case Hepatitt A IgM Det ble ved en feil rekvirert Hepatitt A total og Hepatitt A IgM på en pasient i sammenheng med utredning for mulig hepatitt B eller C. HAV IgM ble positiv HAV Total, som inneholder både IgG og IgM ble negativ HAV IgM ble bekreftet negativ med annen metode Pasienten viste seg å ha Monoklonal komponent og altså opphopning av IgM Lambda antistoffer, mulig Myelomatose. Sannsynlig interferens og dermed uspesifikk positiv HAV IgM ECLIA, μ capture analyse, interferens med uspesifikt IgM forekommer. Stigende mengder av uspesifikt IgM kan føre til et fall i gjenfinning av positive prøver med Elecsys HAV IgM analysen. Så skulle det kanskje ikke gitt falsk pos? Case under utredning Troponin T Mann, 57. Alkoholoverforbruk siste 2 år ellers "frisk" opp til innleggelse. Langvarig innleggelse preget av leversvikt, nyresvikt (dialysert i en kortere periode), sepsis og critical illness myopati. Trop T på vår metode tre påfølgende dager: 1685ng/L, 1132ng/L, 922 ng/l. Trop I Drammen: 15ng/L Vår Troponin T stemmer ikke med klinikken Prøven ble sendt til Roche testlaboratorium, som bekrefter funnet og definerer den høye Troponin T som reell. De har ikke kunnet påvise tilstedeværelse av interfererende faktorer i prøven Lege i avdelingen jobber fortsatt med å finne ut av dette, men vi har foreløpig ingen god forklaring. 21

22 Hva gjøres ved mistanke om interferens? Det kan være aktuelt å fortynne prøven Felle med polyetylenglycol PEG Tilsette MAK33( IgG antistoff fra mus) i prøven, for å binde heterofile antistoffer, før reanalyse. Sende prøven til en annen lab som har en annen analysemetode Ta vare på alt prøvemateriale slik at det kan sendes til utredning av interferensen. Forebygging av interferenskonsekvens Være bevisst at interferens i analyser forekommer Bevisstgjøring av klinikerne på mulige interferenser, slik at de kan følge opp pasientene bedre. Tett dialog med klinikerne, slik at de varsler dersom resultater ikke stemmer med klinikken. Bevissthet rundt økt bruk av biologiske legemidler, i behandling av kreft, alvorlige betennelsessykdommer og etter hvert flere indikasjoner. Fordel at ikke alle laboratorier har samme analysemetode, for mulighet til å kontrollere med en annen metode. Viktig å melde saker om interferens til leverandør/produsent Reagensprodusentene må jobbe kontinuerlig for å forbedre reagensene og blokkere for antistoffinterferens. Se på buffertilsetninger, modifiserte analyseantistoffer og analyseformat. 22

23 Bidrag og referanser Takk til avdelingsoverlege Gunnhild Kravdal, TLMB AHUS for lån av «slides» og gode tips. Artikkelreferanser: Norsk Epidemiologi 2006; 16 (1): 29 33Heterofile antistoffer en kilde til analyseinterferens, Johan Bjerner og Kjell Nustad, Sentrallaboratoriet, Det norske radiumhospital. Bioingeniøren 6/ Interferens fra heterofile antistoffer i immunometriske analyser. Bolstad og Nustad. Clin Chem Lab Med 2011;49(12)Bolstad et al:heterophilic antibody interference in commercial immunoassays Klinisk Biokemi i Norden nr Biotin interferens af laboratorieanalyser, Stefan Stender Takk for meg 23