Kvalitetssikring av molekylærgenetiske metoder Fredrik Müller Avdeling for mikrobiologi Oslo universitetssykehus - Rikshospitalet
oen presiseringer Kvalitetssikring: I henhold til akkreditering (ISO 15189) Molekylærgenetiske metoder: Identifikasjon, resistensbestemmelse og typing av mikroorganismer basert på undersøkelse av DA/RA
«Medisinsk mikrobiologi i et nøtteskall» Påvisning og identifikasjon av mikroorganismer Dyrkning Mikroskopi Påvisning av protein/antigen ukleinsyrepåvisning Resistensbestemmelse Fenotypiske metoder Genotypiske metoder Typing av mikroorganismer - epidemiologi Vertsrespons Antistoffrespons (serologi) Cellulær immunrespons
Medisinsk mikrobiologi molekylærgenetiske metoder Påvisning og identifikasjon av mikroorganismer Dyrkning Mikroskopi Påvisning av protein/antigen ukleinsyrepåvisning Resistensbestemmelse Fenotypiske metoder Genotypiske metoder Typing av mikroorganismer - epidemiologi Vertsrespons Antistoffrespons (serologi) Cellulær immunrespons
In-house analyse Validering/verifisering av metoder y metode? Planlegging Utviklingsarbeid Valideringsplan Valideringsrappport Utprøving Verifiseringssplan Verifiseringsrappport Kommersiell analyse
Validering/verifisering av metoder Inndeling: Planleggingsfase Gruppe. Valideringsansvarlig. Hvem gjør hva? Utviklingsarbeid (In-house)? Utprøving (CE/IVD)? Valideringsplan, hhv verifiseringsplan Velg og begrunn parametre Gjennomføring Validerings-/verifiseringsrapport Konklusjon
Validering - planleggingsfase Definere et behov Vurdere aktuelle metoder metode fra scratch? publisert metode? kommersiell metode? Oppfyller planlagt metode definert behov? Vil den kunne fungere i laboratoriet? I hvilken grad foreligger dokumentasjon fra produsent? Foreligger det data fra andre laboratorier som kan inngå i validering? Valideringsansvarlig. Oppgavefordeling
Valideringsplan og gjennomføring Hensikt og problemstilling Godkjenningskriterier for metoden Planlegging: Personell- og tidsbruk Typer av prøvemateriale Antall prøver Valideringsparametre Litteraturgjennomgang Gjennomføring: Kronologisk beskrivelse av eksperimenter, resultater Sammendrag
Validering: Konklusjon Konklusjon: Valideringen har vist at metoden er velegnet for formålet og fyller de godkjenningskriterier som er satt i valideringsplanen. Er prosedyre for ny/endret metode skrevet? JA Skal det gjøres endringer andre steder i kvalitetssystemet som følge av innføring av ny metode? JA/EI Er relevant personell opplært? JA På dette grunnlag kan metoden tas i bruk fra (dato). Signatur fra valideringsansvarlig: Signatur fra medisinsk-faglig ansvarlig:
Fra ISO 15189, punkt 5.5.2: Valideringene skal være så omfattende som nødvendig for å oppfylle behovene i den gitte anvendelsen eller det gitte anvendelsesområdet.
Valideringsparametre Viktige egenskaper ved målemetoden må bestemmes. Følgende parametre kan være aktuelle: Linearitet PCR effektivitet Måleområde Deteksjonsgrense og kvantiteringsgrense Spesifisitet Riktighet Presisjon Repeterbarhet Reproduserbarhet Interferens Sporbarhet Robusthet
Oppsett av standardkurve: tifold-fortynninger av standard Eksempel: adenovirusplasmid 10 0-10 8 kopier/reaksjon Teoretisk avstand i Ct-verdi mellom kurver: ca 3,3. 2 3,3 ~10
Linearitet Def: Den del av en metodes måleområde der det er en lineær sammenheng mellom måleresultater (x) og standard (y), slik at sammenhengen kan angis på formen y=ax+b der a og b er konstanter.
Korrelasjonskoeffisient, R 2 : ideelt 1 Slope = - 3,396 Krav: -3,6 - -3,1 Error = 0,03 Krav: < 0,2
PCR effektivitet PCR-reaksjonens effektivitet (Efficiency; E): Teoretisk = 2 I praksis er E ofte < 2. En optimalisert PCR-reaksjon har en effektivitet nær 2. E = 10-1/slope I eksemplet fra foregående bilde: slope = - 3,396 E = 10-1/-3,396 = 10 0,294 = 1,97 Krav: >1,9
Måleområde ( range, dynamic range ) Relevant for kvantitative metoder. Område der måleresultat kan kvantiteres på et gitt konfidensnivå, altså med akseptabel variasjon. Real-time PCR: stort måleområde ~ 6-8 log.
Deteksjonsgrense ( Limit of detection ; LOD) Laveste måleresultat med en gitt måleprosedyre som kan godtas som forskjellig fra målemengden som oppnås med en 0-prøve
Deteksjonsgrense Laveste mengde DA som kan påvises Limit of Detection (LOD) is the lowest amount of analyte that can be detected 95% of the time as a positive PCR signal (LOD95). Probit (predicted proportion positive) analysis
Beregning av deteksjonsgrense, et eksempel ær antatt deteksjonsgrense: Kjør 20 replikater i fortynninger. Fortynning der 19/20 (95%) er positive definerer deteksjonsgrensen Eksempel: Bestemmelse av deteksjonsgrense for CMV PCR (fra valideringsrapport) Kopi/ brønn Kopi/ µl 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Antall pos Pos % CV % 100 20 34,37 34,36 50 10 35,66 36,19 25 5 35,87 36,27 12,5 2,5 37,11 36,46 6,3 1,25 38,44 37,00 3,15 0,63 37,67 40,00 1,6 0,32 40,00 0,8 0,16 40,00 40,00 0,4 0,08 0,2 0,04 34,46 34,27 34,86 35,06 35,95 36,02 36,71 36,24 37,98 40,00 39,71 34,02 34,67 35,41 34,85 36,34 36,05 37,70 37,88 38,79 37,37 40,00 40,00 40,00 34,08 34,53 34,84 35,04 37,75 36,21 36,83 37,96 38,02 37,34 40,00 40,00 40,00 33,34 33,90 34,30 33,93 34,42 36,05 37,27 36,81 37,31 38,09 38,30 40,00 38,95 33,21 33,98 35,30 35,29 36,04 36,14 37,11 36,81 40,00 39,53 40,00 40,00 40,00 40,00 34,41 34,00 35,12 35,22 36,25 36,55 36,61 37,94 38,56 38,91 36,69 38,00 34,00 33,78 34,07 35,03 35,30 35,88 36,65 37,01 37,14 36,88 37,64 40,00 40,00 40,00 40,00 33,94 34,30 35,40 34,70 36,35 35,36 36,62 37,33 37,28 38,68 40,00 33,83 33,25 35,02 34,71 36,47 37,71 37,76 36,28 37,83 37,77 39,06 40,00 38,70 39,52 40,00 20/20 100 1,2 20/20 100 1,5 20/20 100 2 20/20 100 1,5 16/20 80 15/20 75 8/20 40 8/20 40 4 /20 20 1/20 5
Kvantiteringsgrense (Limit of quantification; LOQ) edre grense for måleområdet: Kun relevant for kvantitative metoder. 1.Standardkurve må være lineær (nøyaktighet) Samsvar mellom målt verdi og verdi på standarder. 2. Spredningen må være under en definert grense (presisjon) Limit of Quantitation (LOQ) is the minimum concentration of the analyte that can be quantified with an acceptable level of precision (spredning; lav CV% ved gjentatt måling) and accuracy (forskjell mellom målt og oppgitt konsentrasjon: Er kurven lineær?).
Kvantiteringsgrense Michelin BDA et al.:
Spesifisitet Def: Den andel av sanne negative prøver som identifiseres som negative av metoden. OBS falske positive prøver! Sjekke metoden (ved bioinformatikk, eksperimentelt) mot: Humant DA Genetisk nærstående mikroorganismer Andre mikroorganismer som er særlig relevant i aktuelt prøvemateriale
Riktighet ( Accuracy ) og Presisjon ( Precision ) Presisjon: Overensstemmelse mellom uavhengige måleresultater oppnådd med en måleprosedyre under spesifiserte betingelser Praktisk: Gjentatte målinger Riktighet: Grad av overensstemmelse mellom gjennomsnittsverdi oppnådd fra en stor serie måleresultater og en sann verdi. Praktisk: Sjekk mot SLP, internasjonale standarder
Repeterbarhet ( Repeatability ) Def: Overensstemmelse mellom resultatene av påfølgende målinger av samme målestørrelse utført under samme målebetingelser. Intra-assay variasjon Gjentatte målinger av samme prøve, gjerne samme dag og samme person. Ofte gunstig å måle > en målestørrelse (eks lav, middels, høy). Gjennomsnitt =
Reproduserbarhet ( Reproducibility ) Def: Overensstemmelse mellom resultatene av påfølgende målinger av samme målestørrelse utført under endrete målebetingelser. Inter-assay variasjon Gjentatte målinger av samme prøve, gjerne på ulike dager, ulike personer,.. Ofte gunstig å måle > en målestørrelse (f eks lav, middels, høy). Eventuelt undersøke mer enn én type positive kontroller dersom metoden påviser mange beslektede mikroorganismer.
Reproduserbarhet, eksempel: HHV-6 PCR: reproduserbarhet Dato: Ct-verdier: 04.02.09 26,85 05.02.09 27,09 05.02.09 27,35 06.02.09 27,23 06.02.09 26,97 06.02.09 27,73 09.02.09 27,07 09.02.09 27,49 09.02.09 28,25 09.02.09 26,96 10.02.09 27,03 13.02.09 27,27 Gj. Snitt 27,27 SD 0,4 CV % 1,5 Reproduserbar ved kvalitativ PCR (Ct-verdi): typisk CV %< 3 % Reproduserbarhet ved kvantitativ PCR (kopitall): typisk CV %~30-35 %
Interferens ( Interference ) Def: Systematisk målefeil som skyldes en komponent i prøven annen enn den som skal måles. Interferens kan avhenge av type prøvemateriale, f eks ved tilstedeværelse av PCR-inhibitorer. oen aktuelle inhibitorer: Blod: Hemoglobin, IgG Fæces: gallesalter Muskelvev: myoglobin Vev: kollagen Urin: urea Matriks: Alle deler av et prøvemateriale unntatt det som skal måles.
Sporbarhet ( Traceability ) Def: Egenskap ved resultatet av en måling eller verdien for en standard slik at den kan relateres til angitte standarder gjennom en ubrutt kjede av sammenlikninger alle med angitte usikkerheter. Sporbarhet til: Referansestandarder (kvantitative analyser), f eks WHO-standarder Stammer fra anerkjente stammebanker (eks ATCC, CCUG)
Robusthet ( Robustness ) Def: En metodes evne til å motstå påvirkning fra ytre forhold. Vurdering av hvordan mindre endringer av ulike trinn i metodeprosedyren påvirker analyseresultatet. F eks endring i: temperatur inkuberingstid konsentrasjon av reagenser endring av prøvemateriale
Smeltepunktanalyser Tm kan drifte over tid og kan eventuelt følges jevnlig L. longbeachae L. pneumophila
Metodevalidering et eksempel: Kvantitativ påvisning av adenovirus
s. 230 Design av primere og probe
s. 231 Deteksjonsgrense, måleområde og linearitet s. 235 PCR effektivitet
s. 229 Spesifisitet Ikke undersøkt Riktighet/sporbarhet Riktighet: anvendt typestammer.
Variabilitet s. 233 Reproduserbarhet ( Interassay variability ) Er dette også bestemmelse av deteksjonsgrense?
Interferens Undersøkt kliniske prøver, ulikt prøvemateriale: s. 229 Ikke undersøkt negativt materiale med tilsatt virus
Robusthet Ikke undersøkt Spørsmål: Med denne artikkelen som grunnlag hva bør inkluderes i den lokale validering på laboratoriet? Synspunkter?
The MIQE Guidelines: minimumskrav til beskrivelse av kvantitative PCR-metoder
Lokaler PCR-laboratoriet deles i soner med reagenspreparering, prøvepreparering, amplifisering og eventuelt post-pcr sone. Eksempel:
Lokaler Påkledning Rutiner i ulike soner Renhold Renhold fra ren til skitten sone Vask av benker med middel som fjerner nukleinsyrer, eks DAZap Personell Fortrinnsvis fra ren til skitten sone Kalibreringer Loggbøker
Utstyr Pipetter Regelmessig kontroll/kalibrering. Separate sett for ulik aktivitet. PCR instrumenter, ekstraktorer,.. Mottakskontroll Vedlikeholdsavtale Servicerapporter Kalibreringer Loggbøker
Reagenser Obs kontaminering, særlig relevant ved brede metoder som 16S rda sekvensering: Eks: Batch med Bacteria lysis buffer: Pseudomonas poae Kontaminering av polymerase med E coli Kontaminering av kolonner med Legionella Teste batcher med reagenser før de settes i bruk Renhetsgrad på primere? Kontaminering av PCR-produkt fra tidligere oppsett: Benytte UG (uracil--glykosylase) og dutp i PCR-miks. Degraderer tidligere PCR-produkt (unngå carryover kontaminering)
Preanalytiske forhold Prøvetakingsutstyr Eks: Calciumalginat i pensler hemmer PCR-reaksjonen Heparin kan hemme PCR-reaksjonen Transporttid- og temperatur Obs RA-virus som HIV og hepatitt C virus Postanalytiske forhold Teknisk validering Sjekk kontroller Real-time PCR: Vurdere kurver Medisinsk validering Tolkning og vurdering vs kliniske opplysninger etc
Del II
Oppfølging av metoden IVD-direktivet: «Post-marketing surveillance» år metoden er tatt i bruk skal den overvåkes: Kontroller ved hvert oppsett Sammenliknende laboratorieprøver (SLP) Eventuelt annen regelmessig oppfølging år noe er galt, evt mistanke om dette: Feilsøking God sporbarhet letter feilsøking!
Standarder og kontroller Referansestandard («kvantitativ») Standard («kvalitativ») Positiv kontroller egative kontroller Internkontroller
Referansestandard (kvantitative analyser) Positiv prøve med definert verdi produsert av en anerkjent organisasjon: WHO UK ational Institute of Biological Standards and Control (IBSC) Fra www.nibsc.org World Health Organisation (WHO) biological reference materials (WHO international standards and reference materials) provide a common set of standards which are used to ensure the quality of biological medicines world-wide. These international standards are considered to be the gold standard against which regional, national and international laboratories and manufacturers calibrate their own working standards. They are calibrated in units of biological activity which are assigned following extensive studies involving multiple international laboratories.
Tilgjengelige nukleinsyre-standarder fra IBSC/WHO (WHO International standards): Hepatitt A virus Hepatitt B virus Hepatitt C virus HIV-1 HIV-2 Humant parvovirus B19 HPV 16 og 18 Plasmodium falciparum Toxoplasma gondii Epstein-Barr virus Cytomegalovirus
Positive kontroller I. Kit-avhengige positive kontroller: del av kommersielle kits II. Kit-uavhengige positive kontroller Kit-uavhengige kontroller kan kjøpes eller produseres i laboratoriet Kontroll kan være en mikroorganisme, et plasmid, en positiv klinisk prøve (evt i fortynning),.. Kit-uavhengig positiv kontroll sjekker for oppsettets analytiske sensitivitet Kan i tillegg sjekke for smeltepunkt eller amplikon-størrelse (gel)
Kit-uavhengige positive kontroller Fordeler vs kit-avhengige positive kontroller: Kan kontrollere alle trinn i prosessen, ikke bare PCR-analysen Kan kontrollere med andre stammer enn i kitavhengig kontroll Bedre kjennskap til kontrollens beskaffenhet
Viktige krav til kit-uavhengige positive kontroller Kontroll: samme stabilitet som mikroorganisme. akent DA og spesielt RA brytes lettere ned av nukleaser enn inntakte mikroorganismer. For kontroll av RA-virus benytter noen Armoured RA ( Armert RA ): Target RA omgitt av plasmid-kappe. Bedre å bruke hel mikroorganisme enn ekstrahert nukleinsyre som kontroll
Viktige krav til kit-uavhengige positive kontroller Samme utbytte ved ekstraksjon som mikroorganisme. Kan avhenge av prøvemateriale (matriks-effekter) Korte DA-sekvenser gir annen binding til silika Kontroll bør dekke de varianter/subtyper som ønskes dekket, i det minste et visst utvalg av disse. Tilstrebe store batcher at positiv kontroll: kan brukes over lang tid Optimal lagring av positive kontroller Positive kontroller i egnet konsentrasjon, ikke for sterke (obs krysskontaminering), ikke for svake da dette kan gi falsk negative reaksjoner. 10x deteksjonsgrense er robust.
egative kontroller I. Kit-avhengige negative kontroller: del av kommersielle kits II. Kit-uavhengige negative kontroller Preparering: materiale som imiterer negativ prøve, ofte brukes vann i PCR-reaksjonen. Sjekker for oppsettets analytiske spesifisitet.
Internkontroller Inkludert internkontroll (del av prøvemateriale, f eks humant DA) Tilsatt internkontroll Tilsatt internkontroll i samme reaksjon Sekvens med identiske primerbindingssekvenser Sekvens med primerbindingssekvenser Sekvens med ulik probebindingsområde, probe med annen farge (duplex assay) Tilsatt internkontroll i parallell reaksjon Tilsatt internkontroll kan være: Fullprosesskontroll (tilsettes prøven før ekstraksjon) Amplifiseringskontroll
Adenovirus: Eksempel på tilsatt intern kontroll Internkontroll: Internkontroll har identiske primerbindingssekvenser ( kompetitiv internkontroll, men ulik probebindingssekvens. Adenovirusprobe merket med f eks FAM. Internkontrollprobe merket med f eks Yakima yellow (~VIC).
år skal kontroller introduseres? Positive og negative kontroller så tidlig som mulig. Eventuelt på ulike trinn, spesielt i forbindelse med feilsøking. Internkontroll før ekstraksjon eller i PCR-miks. Ulemper med internkontroll i samme reaksjon: Tar opp en kanal ved multipleksing Internkontroll konkurrerer ved amplifisering og kan påvirke deteksjonsgrense. Internkontroll bør titreres slik at den er svakt positiv i negative prøver
Oppfølging av kit-uavhengig positiv kontroll Sett opp positiv kontroll i hvert oppsett og følg Ctverdi over tid. Bestem standardavvik og CV %. Sett kriterier for akseptabel variasjon. Sett opp regler over hva som skal gjøres om kontroll ikke går inn
Tolkning av kontroller Resultat av kontroll Positivt prøveresultat egativt prøveresultat Internkontroll positiv Positiv egativ Internkontroll negativ Positiv Inkonklusiv Positiv kontroll positiv Positiv egativ Positiv kontroll negativ Positiv Inkonklusiv (alle negative prøver) egativ kontroll negativ Positiv egativ egativ kontroll positiv Inkonklusiv (alle positive prøver) egativ
Feilsøking 1. Internkontroll negativ Glemt å tilsette internkontroll? Glemt å tilsette evt probe som detekterer internkontroll? Tilstedeværelse av hemmere i prøvemateriale? y ekstraksjon, evt annen ekstraksjonsmetode Fortynne nukleinsyre-ekstrakt i ny PCR Om fortsatt negativ internkontroll: Inkonklusiv. Be om ny prøve! 2. Positiv kontroll negativ Glemt å tilsette positiv kontroll? Feil kontroll tilsatt? Ustabil kontroll, kontroll degradert? 3. egativ kontroll positiv Kontaminering fra annen, positiv prøve? Kontaminering pga dårlige rutiner (lokaler, reagenser,...)?
Eksterne kvalitetskontroller: SLP
Eksterne kvalitetskontroller: SLP
Sekvensering Formål: Identifikasjon av bakterier og sopp Genotypisk resistensbestemmelse Typingsmetoder 1. Validering av metoden 2. Bruk av interne kontroller 3. Deltakelse i SLP eller annen organisert, regelmessig utveksling av prøver med andre laboratorier
Typingsmetoder Formål: Kartlegging av slektskap/klonalitet: bakterier, sopp 1. Validering av metoden 2. Bruk av interne kontroller 3. Deltakelse i SLP eller annen organisert, regelmessig utveksling av prøver med andre laboratorier
Måleusikkerhet Måleusikkerhet: Et estimat som karakteriserer spredningen av verdier som inneholder den sanne verdi av målestørrelsen Måleusikkerhet er vanligvis knyttet til kvantitative målinger. De fleste molekylær-mikrobiologiske analyser gir kvalitative resultater. Ved slike analyser er det vanskelig å foreta metrologiske og statistiske beregninger. Kvalitative metoder: Usikkerhetsbidrag skal identifiseres og vektes. Ved kvantitative metoder skal måleusikkerhet beregnes.
CE-merking av in-house molekylærdiagnostikk Direktiv 98/79/EF om medisinsk utstyr, som omfattes av EØS-avtalen, trådte i kraft 07.12.98. Direktivet er implementert i Forskrift om medisinsk utstyr av 15. desember 2005, nr. 1690. I henhold til regelverket omfattes egenprodusert medisinsk utstyr, herunder medier, reagenser mv, som anvendes i diagnostikk når det tas betaling for undersøkelsene. Slike medier, reagenser mv skal meldes til utstyrsregisteret ved Helsedirektoratet.
Reglene for CE-merking opererer med ulike kategorier: Liste A Reagenser og reagensprodukter med tilhørende kalibrator- og kontrollmateriale til påvisning, bekreftelse og mengdebestemmelse i humant prøvemateriale av markører for HIV-infeksjon (HIV 1 og 2), HTLV I og II og hepatitt B, C og D. Liste B Reagenser og reagensprodukter med tilhørende kalibrator- og kontrollmateriale til påvisning og mengdebestemmelse i humant prøvemateriale av følgende medfødte infeksjoner: røde hunder, toksoplasmose. Reagenser og reagensprodukter med tilhørende kalibrator- og kontrollmateriale til bestemmelse av følgende infeksjoner hos mennesker: cytomegalovirus, chlamydia. Resten : ikke på spesifikk liste
Helsedirektoratets utstyrsdatabase
Samsvarserklæring Det er gjort en samsvarsvurdering i forhold til IVD-direktivet. De produkter som er angitt nedenfor er på bakgrunn av dette funnet å være i overensstemmelse med de relevante grunnleggende krav gitt i direktiv 98/79/EF/Forskrift om medisinsk utstyr av 15. desember 2005. De aktuelle prosedyrene er CEmerket. De aktuelle produktene er meldt til Sosial- og helsedirektoratet: (http://www.shdir.no/medisinskutstyr/ utstyrsregistrering)
Merking av aktuelle prosedyrer
Referanser MacKay IM. Real-time PCR in Microbiology. From Diagnosis to Characterization. Caister Academic Press, 2007. Jenum PA, Müller F, Tveten Y. Kvalitetssikring i bakteriologi. Strategirapport 2006, Folkehelseinstituttet. orsk Standard S-E ISO 15189:2012. Medisinske laboratorier. Særskilte krav til kvalitet og kompetanse. Standard orge 2012. A Dok. 48b. Medisinsk mikrobiologi. orsk akkreditering, 2010. www.akkreditert.no www.nibsc.org www.qcmd.org www.ukneqasmicro.org.uk www.equalis.se www.instandev.de
Takk for oppmerksomheten! J