(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. C12Q 1/68 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato (30) Prioritet , US, P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver TrovaGene, Inc., 1 Flintkote Avenue, San Diego, CA 92121, USA (72) Oppfinner SHEKHTMAN, Eugene, M., Schalks Crossing Rd.Apt. 01, Plainsboro, NJ 0836, USA MELKONYAN, Hovsep, S., 46 Ewing Street, Princeton, NJ 0840, USA UMANSKY, Samuil, R., 3 Orchid Ct., Princeton, NJ 0840, USA SCHEINKER, Vladimir, S., 14 Beachwood Drive,Congers, New York 9, USA (74) Fullmektig Oslo Patentkontor AS, Postboks 7007 Majorstua, 0306 OSLO, Norge (4) Benevnelse Fremgangsmåter for anvendelse av mirna for påvisning av in vivo celledød (6) Anførte publikasjoner CHIM STEPHEN S C ET AL: "Detection and characterization of placental micrornas in maternal plasma." CLINICAL CHEMISTRY MAR 08, vol. 4, no. 3, March 08 (08-03), pages , XP ISSN: , FLEISCHHACKER ET AL: "Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer-a survey" BBA - REVIEWS ON CANCER, vol. 177, no. 1, 13 December 06 ( ), pages , XP ISSN: X LAWRIE CHARLES H ET AL: "Detection of elevated levels of tumour-associated micrornas in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma." BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY MAY 08, vol. 141, no., May 08 (08-0), pages , XP ISSN: , LICHTENSTEIN A V ET AL: "Circulating nucleic acids and apoptosis." ANNALS OF THE NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES SEP 01, vol. 94, September 01 (01-09), pages , XP ISSN: , LU JUN ET AL: "MicroRNA expression profiles classify human cancers" NATURE, NATURE PUBLISHING GROUP, GB, vol. 43, no. 7043, 9 June 0 ( ), pages , XP00248, MELKONYAN HOVSEP S ET AL: "Transrenal nucleic acids: from proof of principle to clinical tests." ANNALS OF THE NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES AUG 08, vol. 1137, August 08 (08-08), pages 73-81, XP ISSN: , MITCHELL PATRICK S ET AL: "Circulating micrornas as stable blood-based markers for cancer detection." PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA 29 JUL 08, vol., no. 30, 29 July 08 ( ), pages 13-18, XP ISSN: SU YING-HSIU ET AL: "Transrenal DNA As A Diagnostic Tool - Important Technical Notes" ANNALS OF THE NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES, vol. 3RD, 9 September 03 ( ), pages 81-89, XP ISSN: , SWARUP ET AL: "Circulating (cell-free) nucleic acids - A promising, noninvasive tool for early detection of several human diseases" FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 81, no., 24 February 07 ( ), pages , XP ISSN: , TONG ET AL: "Diagnostic developments involving cell-free (circulating) nucleic acids" CLINICA CHIMICA ACTA, ELSEVIER BV, AMSTERDAM, NL, vol. 363, no. 1-2, 1 January 06 ( ), pages , XP ISSN:

2 1 Beskrivelse OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN Oppfinnelsen fremskaffer ikke-invasive fremgangsmåter for isolering og påvisning av cellefritt lite RNA, spesielt mikro-rna (mirna) sekvenser i kroppsvæsker valgt fra blod, serum og urin. Mer spesielt omfatter foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for påvisning av in vivo celledød ved å analysere urin, blod eller serum for mirna-nivåer for klinisk diagnose og behandlingsovervåking BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN Celledød er en normal komponent av utviklingen og funksjonen av flercellede organismer. Idet dette er en naturlig prosess er celledød involvert i patologien av mange sykdommer forårsaket av innvendige faktorer. Celledød følger også sykdommer forårsaket av utvendige fysiske, kjemiske eller biologiske midler Det eksisterer to hovedtyper celledød, nekrose og apoptose, markert med forskjellige morfologiske og molekylære særtrekk (Kerr et al., Br. J. Cancer. 26, (1972); Umansky, Theor. Biol. 97, (1982); Umansky et al., Adv. Pharmacol. 41, (1997); Ameisen, Cell Death Differ. 11, 4- (04), Lockshin et al. Int. J. Biochem Cell Biol. 36, 0-19 (04); G. Kroemer et al., Cell Death and Differntiation 12, (0)). Nekrose er betraktet å være katastrofal metabolsk svikt som stammer direkte fra alvorlig molekylær og/elelr strukturell skade og fører til inflammasjon og sekundær skade på omliggende celler. Apoptose er et mye hyppigere forekommende fenomen enn nekrose og kan bli indusert av spesifikke signaler så som hormoner, cytokiner, ved fravær av spesifikke spesifikke signaler så som vekst- eller adhesjonsfaktorer eller ved molekylær skade som ikke gir noe katastrofalt tap av integritet. Apoptose er et resultat av en aktiv cellerespons som involverer initiering av en ordnet og spesifikk kaskade av molekylære hendelser. Apoptose fører til opptreden av distinkt kromatinkondenasjon og marginering, kjernefragmentering, cellekrymping, membranutposning og enzymatisk internukleosomal fragmentering av kjerne-dna (Umansky et al., Biochim. Biophys. Acta, 6, 9-17 (1981); Arends et al., Am. J. Pathol. 136, (1990). Andre og sjeldnere former for celledød som er særpreget ved spesiell morfologi, f.eks. såkalt autofag celledød, har også blitt beskrevet (Bredesen et al., Stroke. 38 (2. Suppl.): (07).

3 2 Uavhengig av en spesifikk mekanisme og type av celledød er metoder for påvisning av døende celletyper viktig for diagnose av forskjellige sykdommer, er kritisk for sykdom- og behandlingsovervåkning og er hjelpsomme for differensiell diagnose. Dessuten er metoder som er ii stand til påvisning av spesifikk celledød in vivo nyttige for utvikling av medikamenter som sikter mot å forhindre eller indusere celledød så vel som for analyse av cytotoksisiteten av nylig utviklede medikamenter. 1 Det finnes enkelte kliniske tester for diagnose a sykdomsrelatert overdreven celledød basert på påvisning av vevsspesifikke markører så som f.eks. antigener, enzymer og andre proteiner i blod eller andre kroppsvæsker. Måling av aktiviteten av f.eks. lever-spesifikke enzymer i blod er en bredt benyttet metode for evaluering av hepatocytt-død (Amacher, et al., Regul. Toxicol. Pharmacol. Apr. 27(2): (1988); Salaspuro, et al., Enzyme, 37: 87-7 (1897); Herlong, Hosp. Pract. (Off. Ed.) 29(11): (1994))). Vurdering av nivået av kardiomyocytt-spsifikke antigener har også blitt brukt for diagnose av myokardialt infarkt (Mair et al., Clin. Chem. Lab. Med. 37: (1999); Nunes et al., Rev. Port. Cardiol. : (01)). Imidlertid er antallet av like teknikker begrenset ti sykdommer hvor en markør og en påvisningsmetode er kjent for at analysen skal gi meningsfulle, vevsspesifikke resultater, (Oh S. et al., Curr. Gastroenterol Rep. 3: (01); Rochling et al., Clin. Cornerstone. 3(6): 1-12 (01). Andre metoder krever invasive inngrep av spesifikke vev som er mistenkt for å ha en syndomstostand for å oppnå en prøve for analyse Det er velkjent at apoptose eller programmert celledød, som er en hovedform for celledød hos pattedyrorganismen, er fulgt av internukleosomal fragmentering av kjerne-dna. Mange laboratorier at en del av dette DNA opptrer i blodet (Lo Y. M. Ann. N.Y. Acad. Sci. 94: 1-7 (01); Lichtenstein et al., Ann. N.Y. Acad Sci. 94: (01); Taback et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 6: (04); Bischoff et al., Hum. Reprod. Update. 8: , (02)). Det har også blitt vist at dette fragmenterte DNA, kalt transrenalt DNA (Tr-DNA) krysser nyrebarrieren og kan bli påvist i urin. (Botezatu et al., Clin. Chem. 46: 78-84, (00); Su et al., J. Mol. Diagn. 6: 1-7 (04); Su et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 22: (04). 3 Su Y. et al., (03) Annals of the New York Academy of Sciences 3. Vol, s beskriver at en liten del av DNA fra apoptotiske celler unngår fullstendig nedbrytning, opptrer i blod som oligonuklosomalstørrelsesfragmenter, utskilles i urinen og kan bli brukt til diagnostiske formål.

4 3 Swarup V. et al,. (07) Letters vol. 81, nr., s beskriver hvordan økede nivåer av sirkulerende (celle-frie) plasma nukleinsyrer har blitt rapportert i et antall kliniske forstyrrelser og antyder at dette kunne gi et ikke-invasivt verktøy for tidlig påvisning av flere sykdommer hos mennesket. 1 Selv om både celle-fritt plasma-dna og Tr-DNA kan bli brukt som diagnostiske verktøy gir de en relativt begrenset mulighet til evaluering av vevs-spesifikke hendelser så som celledød. Således ville analytiske metoder som er ikke-invasive og som gir et bredere område av indikasjoner på spesifikk patologi grunnet deres egenskap å påvise nivåer av døende celler, spesielt vev og organer, være nyttige for diagnostisering og overvåkning av tilstanden av forskjellige sykdommer eller patologisk tilstander hos pasienter. I tillegg ville vevs-spesifikke analytiske metoder som gir mulighet til å overvåke reaksjonen hos en pasient på sykdomsbehandling, være nyttige til å bestemme behandlingseffektiviteten, og i tilfelle av medikamentbehandling den optimale dose som er nødvendig for medikamentadministrasjon. 2 For å ta for seg disse problemer er foreliggende oppfinnelse fokusert på anvendelsen av mikro-rna (mirna) som et diagnostisk verktøy til å overvåke celledød i kroppsvæsker så som for eksempel serum og urin. Ulikt cellefritt plasma-dna og Tr-DNA oppviser mange mrna celle-, vevs- og organspesifikke ekspresjonsprofiler (Lang et al., Genomics, 8: 166 (07); Lukiw et al., Neuroreport, 18: (07); Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12: (02); Chen et al., Nat. Genet. 38: (06); Beuvink et al., J. Nucleic Acids Res. 3: e2 (07)). Videre har korrelasjon mellom mrna celle- og vevsspesifikke profiler med forskjellige sykdommer og tumortyper blitt vist (Visone R. et al., Oncogene, 26: (07); Nelson et al., Neuropathol. Exp. Neurol. 66: (07); Negrini et al., J. Cell Sci. 1: (07); Chang et al., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 8: (07); Jay et al., Cell Biol. 26: (07)). 30 Således gir foreliggende fremgangsmåter for å måle in vivo celledød ved påvisning av vevsspesifikk mirna, og som er karakteristisk for en spesiell sykdom, i kroppsvæsker valgt fra blod, serum og urin. Foreliggende fremgangsmåter som er basert på bestemmelse av mirna i kroppsvæsker, blir brukt til videre utvikling av diagnostiske eller overvåkende tester. OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

5 4 Foreliggende oppfinnelse angår en ny fremgangsmåte for påvisning og måling av in vivo celledød ved å analysere nivåene av spesifikke mirna-sekvenser i celle-fri nukleinsyrer isolert fra kroppsvæsker valgt fra blod, serum og urin, hvor nevnte mirna stammer fra celler som dør i kroppen, og å bruke det oppnådde analytiske resultat til å bestemme tilstanden av en sykdom eller abnormal medisinsk tilstand hos en pasient. 1 Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er basert på absorpsjon av cellefrie nukleinsyrer på og eluering fra anionebyttere som gjør det mulig å konsentrere og isolere nukleinsyrefragmenter som er større enn nukleotider. Spesielt viser foreliggende oppfinnelse (i) tilstedeværelse av mirna i nevnte kroppsvæsker; (ii) påvisning i urin av mirna som stammer fra organer beliggende utenfor urinsystemet, noe som betyr at de har krysset nyrebarrieren, så som for eksempel transrenat mirna (Tr-miRNA); (iii) påvisning av mirna i serum (iv) sykdom assosiert med celledød i en spesiell celle, vev og/eller organ blir fulgt av endringer i nivåene av mirna som er spesifikke for nevnte organ. 2 Foreliggende oppfinnelse fremskaffer en fremgangsmåte for påvisning og mengdebestemming av celle-, vev og/eller organspesifikk cellefri mirna i nevnte kroppsvæsker for evaluering av in vivo celledød i forskjellige vev og organer, hvori in vivo celledød er assosiert med en sykdom av et spesielt vev og/eller organ omfattende å innhente en kroppsvæskeprøve fra et individ og analysere nevnte kroppsvæskeprøve for en eller flere spesifikke sekvenser av mirna, hvor nevnte analyse omfatter trinnet å påvise nevnte mirna med en primer og/eller probe som er i hovedsak komplementær til en del av nevnte spesifikke mirna-sekvenser. I enkelte utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er overdreven eller utstrekkelig in vivo celledød assosiert med en sykdom hos et spesielt vev. 30 I en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er kroppsvæsken urin. I en annen utførelsesform innbefatter foreliggende analysemetode av en urinprøve en teknikk valgt fra gruppen bestående av hybridisering, cyklisk probereaksjon, polymerase kjedereaksjon, nestet polymerase kjedereaksjon, PCR for å analysere enkeltkjedet konformasjonspolymorfier og ligase kjedereaksjon. I enda en annen utførelsesform er nukleinsyrenedbrytning i nevnte urinprøve redusert. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter reduserende nukleinsyrenedbrytning omfattende inhibering av nukleaseaktivitet ved tilsetning av RNAse-inhibitor(er), varmeinaktivering eller ved å behandle nevnte urinprøve med

6 en forbindelse valgt fra gruppen bestående av. guanidin-hcl, guanidinisotiocyanat, N-leurylsarkosin og natriumdodecylsulfat. I en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse har urinprøven blitt holdt i blæren i mindre enn 12 timer. I en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er kroppsvæsken serum. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter analyse av en serumprøve innbefattende en teknikk valgt fra gruppen bestående av hybridisering, cykliserende proberaksjon, polymerase kjedereaksjon, nestet polymerase kjedereaksjon, PCR for å analysere enkeltkjedet konformasjonspolymorfier og ligase kjedereaksjon. 1 I enda en annen utførelsesform involverer fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse påvisning av cellefri mirna som en spesifikk markør for den spesielle sykdommen som er assosiert med overdreven eller utilstrekkelig celledød i et vev eller organ. Eventuelt er nevnte sykdom en patogeninfeksjon. Fortrinnsvis er nevnte patogen et virus. Mer foretrukket er nevnte virus et Epstein-Barr-virus. Eventuelt er nevnte sykdom et hjerneslag, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, assosiert med graviditet og/eller foster eller Downs syndrom. Foreliggende oppfinnelse fremskaffer en fremgangsmåte for påvisning i urin av cellefri mirna som stammer fra forskjellige organer og vev, innbefattende områder som er forskjellige fra urinveissystemet, i et individ som et resultat av sykdom assosiert med overdreven eller utilstrekkelig celledød i et vev eller organ, omfattende å innhente en urinprøve fra et individ og analysere nevnte urinprøve for en eller flere spesifikke sekvenser av mirna hvor nevnte analyse omfatter trinnet å påvise nevnte mirna med en primer og/eller probe som er i hovedsak komplementær til en del av nevnte spesifikke mirna-sekvenser Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse fremskaffer en metode for sykdoms- og/eller behandlingsovervåkning i te individ ved kvantitativ analyse av spesifikke cellefrie mirna i en kroppsvæske valgt fra blod, serum og urin omfattende periodisk å innhente en kroppsvæskeprøve fra et individ og analysere nevnte prøve for en eller flere spesifikke sekvenser av mirna som er spesifikke/overuttrykt i celler, vev eller organ av interesse, hvor nevnte analyse omfatter trinnet å påvise nevnte mirna med primere og/eller probe som er i hovedsak komplementær til en del av nevnte spesifikke mirna-sekvenser. I en utførelsesform er kroppsvæsken urin. I en annen utførelsesform er kroppsvæsken serum.

7 6 KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE De foregående og andre mål, trekk og fordeler med oppfinnelsen vil bli forstått fra den mer spesielle beskrivelse av utførelsesformer av oppfinnelsen som illustrert i de medfølgende figurer. Figurene er ikke nødvendigvis i skala, hvor vekt er lat på å illustrere prinsippene av oppfinnelsen. Figur 1 er et fotografi av en polyakrylamid elektroforesegel av nukleinsyrer ekstrahert fra filtrert urin ved å bruke Q-Sepharose TM. Figur 2 er et fotografi av en polyakrylamidgel-analyse av EBV-avledet BART1 mirna-spesifikt RT-PCR-produkt. Figurer 3A til 3G er dot-plot-representasjoner av de normaliserte konsentrasjoner av mirna i urinprøver fra pasienter ved 12 og 24 timers tidspunkter etter hjerneslag. 1 Figur 4 er et diagram som representerer korrelasjonen mellom endringer i mirna 129 og 219-konsentrasjonerog hjerneslagresultat. Pasientene betegnet som O og forbedret sin kliniske status en måned etter slag og den kliniske status av pasienten merket x har forverret seg en måned etter et slag. Figur er en punktplottrepresentasjon av de normaliserte konsentrasjoner av mirna i ufiltrerte urinprøver fra pasienter med Alzheimers sykdom og alderstilpassede kontroller. Figur 6 er en punktplottrepresentasjon av de normaliserte konsentrasjoner av mirna i filtrerte urinprøver fra pasienter med Alzheimers sykdom og alderstilpassede kontroller. 2 Figur 7 re en punkplottrepresentasjon av de normaliserte konsentrasjoner av mirna i serumprøver fra pasienter med Alzheimers sykdom og alderstilpassede kontroller. Figur 8 er en punktplottrepresentasjon av de normaliserte konsentrasjoner av mirna i urinprøver fra pasienter med Parkinsons sykdom og aldertilpassede kontroller.

8 7 Figur 9 er en punktplottrepresentasjon av den normaliserte konsentrasjon av mirna-9 i urinprøver fra kvinner som er gravide og som har Downs syndrom og normale fostre. DETALJERT BSKRIVELSE AV OPPFINNELSEN Teknologien bak foreliggende oppfinnelse er basert på oppdagelsen at små RNA er, spesielt spesifikke mikro RNA er (mirna), innbefattende transrenalt mirna (TrmiRNA) r representert i kroppsvæsker og deres konsentrasjoner reflekterer celledød assosiert med organskade eller annen sykdom. Tilstedeværelsen av disse nukleinsyresekvenser ved nivåer som er lavere eller høyere enn den av en kontrollgruppe, er følgelig en indikasjon på at en abnormalitet eller patologisk tilstand trolig er til stede i pasienten fra hvilken prøven ble tatt. Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse tilbyr forbedringer i forhold til tidligere metoder for diagnose, påvisning og overvåkning grunnet deres iboende ikke-invasive natur. 1 For å lette forståelsen av oppfinnelsen er et antall uttrykk definert nedenfor: Uttrykket primer refererer til et oligonukleotid som er i stand til å fungere som et initieringspunkt for syntese under forhold hvor primerforlengelse bli initiert. En oligonukleotid primer kan opptre naturlig som i en renset retriksjonsspaltning, eller bli fremstilt syntetisk. 2 En primer blir valgt til å være i hovedsak komplementær til en kjede av spesifikk sekvens av templatet. En primer må være tilstrekkelig komplementær til å hybridisere med en templatkjede for at primerforlengelse skal inntreffe. En primersekvens behøver ikke å reflektere den nøyaktige sekvens av templatet. For eksempel kan et ikke-komplementært nukleotidfragment bli festet til ende av primeren hvor det gjenværende av primersekvensen er i hovedsak komplementær til kjeden. Ikke-komplementære baser eller lengre sekvenser kan bli satt inn i primeren forutsatt at primersekvensen har tilstrekkelig komplementaritet med sekvensen av templatet til å hybridisere og derved danne et templat-primerkompleks for syntese av forlengelsesproduktet av primeren.

9 8 En mål -nukleinsyre er en mirna-sekvens som skal evalueres for hybridisering, amplifikering eller enhver annen metode for analysering av en nuklinsyresekvens innbefattende en kombinasjon av analysemetoder. Hybridiserings -metoder involverer tilkobling av en komplementær sekvens til målnukleinsyren (sekvensen som skal analyseres). Egenskapen hos to polymerer av nukleinsyre inneholdende komplementære sekvenser å finne hverandre og koble seg sammen via baseparingsinteraksjon, er et velkjent fenomen. De initiale observasjoner av hybridiserings -prosessen av Marmur og Lane, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 46: 43 (1960) og Doty et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 46: 461 (1960) har blitt fulgt av raffinering av prosessen til et essensielt verktøy av moderne biologi. Hybridisering omfatter, men er ikke begrenset til, slisse-, punkt- og blothybridiseringsteknikker. 1 Det er viktig for enkelte diagnostiske applikasjoner å bestemme hvorvidt hybridiseringen representerer fullstendig eller delvis komplementaritet. For eksempel enkelt å påvise tilstedeværelse eller fravær av patogent mirna, er det kun viktig at hybridiseringsmetoden sikrer hybridisering når den relevante sekvens er til stede; betingelser kan bli valgt hvor både delvis komplementære prober og fullstendig komplementære prober vil hybridisere. Andre diagnostiske applikasjoner kan imidlertid kreve at hybridiseringsmetoden skjelner mellom delvis og fullstendig komplementaritet. Det kan være av interesse å påvise genetiske polymorfier Uttrykket probe som benyttet heri, refererer til et oligonukleotid (dvs. en sekvens av nukleotider) uansett om de opptrer naturlig som i et renset restriksjonsspaltet produkt eller syntetisk fremstilt, og som danner en dupleksstruktur eller annet kompleks med en sekvens av en annen nukleinsyre, grunnet komplementariteten eller annen form for reproduserbar attraktiv interaksjon, av minst en sekvens i proben med en sekvens i en annen nukleinsyre. Prober er anvendelige i påvisningen, identifiseringen og isoleringen av spesielle gensekvenser. Det er ment at enhver probe benyttet i foreliggende oppfinnelse vil være merket med ethvert reporter-molekyl slik at det kan påvises i ethvert påvisningssystem innbefattende, men ikke begrenset til enzym (for eksempel ELISA så vel som enzym-baserte histokjemiske assays), fluorescente, radioaktive og luminescente systemer. Det er videre ment at oligonukleotidet av interesse (dvs. som skal påvises) vil være merket med et reportermolekyl. Det er også ment at både proben og

10 9 oligonukleotidet av interesse vil være merket. Det er ikke ment at foreliggende oppfinnelse er begrenset til noe spesielt påvisningssystem eller markør. Som benyttet heri, er uttrykket mirna en underklasse av lite ikke-kodende enkeltkjedet RNA omtrent nukleotider i lengde og som spiller en viktig rolle i regulering av metabolske prosesser, spesielt grunnet deres involvering i regulering i stabilitet og translasjon av mrna som koder for spesifikke proteiner. mirna deltar også i andre viktige prosesser lik heterokromatin-dannelse og genomrearrangering. Uttrykkene «overdreven» og «utilstrekkelig» in vivo celledød beskriver situasjonen når antallet celler som dør i et spesielt organ eller vev er henholdsvis høyere eller lavere enn i alders- og kjønnstilsvarende kontroller. Som benyttet heri refererer uttrykkene «renset», «dekontaminert» og «sterilisert» til fjerningen av forurensning(er) fra en prøve. 1 Som benyttet heri refererer uttrykkene «i hovedsak renset» og «i hovedsak isolert» til nukleinsyresekvenser som er fjernet fra sitt naturlige miljø, isolert eller separert, og er fortrinnsvis 60% fri, mer foretrukket 7% fri og mest foretrukket 90% fri for andre komponenter med hvilke de er naturlig assosiert. Et «isolert polynukleotid» er følgelig et i hovedsak renset polynukleotid. Det er ment at ved å praktisere metodene ifølge foreliggende oppfinnelse kan polynukleotider bli, men behøver ikke bli i hovedsak renset. En mengde metoder for påvisning av nukleinsyresekvenser i urenset form er kjent innen faget. 2 Som benyttet heri refererer uttrykkene «PCR-produkt» og «amplifikeringsprodukt» til den resulterende blanding av forbindelser etter to eller flere cykler av PCRtrinnene med denaturering, sammenkobling og forlengelse er fullstendige. Disse uttrykk omfatter tilfellet hvor det har vært amplifikering av et eller flere segmenter av en eller flere målsekvenser. Uttrykket «urinvei» som benyttet heri, refererer til organene og lederne som deltar i utskillelse og utstøtning av urin fra kroppen. 30 «Pasient» eller «individ», slik uttrykkene blir brukt heri, refererer til mottakeren av behandlingen. Pattedyr- og ikke-pattedyr-pasienter er innbefattet. I en spesiell utførelsesform er pasienten et pattedyr så som et menneske, hund, murin, katt,

11 bovin, ovin, gris eller kaprin. I en spesiell utførelsesform er pasienten et menneske. I en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse stammer de påviste mirna fra og er spesielt uttrykt i en spesiell celletype, vev eller organ i kroppen, hvor endringer i nivået av nevnte mirna er indikativt for akutt sykdom i nevnte vev, så som f.eks. akutt myokardialt infarkt assosiert med død av kardiomyocytter; hjerneslag assosiert med død av neuroner og glialceller; hepatitt eller leverchirrose assosiert med hepatocyttdød forårsaket av en viral eller annen infeksjon eller ved virkning av toksiske substanser; akutt pankreatitt assosiert med død av forskjellige pankreatiske celler; avstøtning av et transplantert organ assosiert med overdreven celledød av forskjellige miltceller; avstøtning av et transplantert organ assosiert med overdreven celledød i det transplanterte organ; traumatisk skade på forskjellige organer, flerfoldige akutte infeksjoner f.eks. tuberkulose assosiert med celledød i lunger og/eller andre infiserte organer. 1 2 I en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse stammer de påviste mirna fra og blir spesielt uttrykt i en spesifikk celletype, vev eller organ i kroppen, hvor endringer i nivået av nevnte mirna er indikatorisk for kronisk sykdom hos nevnte vev, så som f.eks. Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, frontotemporal demens og andre sykdommer i sentralnervesystemet som er forårsaket eller fulgt av neuronal død; kronisk hjertesvikt assosiert med død av kardiomyocytter, emfysem assosiert med død av lungeceller; diabetes type I assosiert med død av pankreatiske beta-celler, glomerulonefritt assosiert med død av nyreceller, prekancerøse tilstander assosiert med apoptotisk død av aktivt prolifererende prekancerøse celle, kreft assosiert med massiv nekrotisk celledød grunnet utilstrekkelig blodtilførsel og celledød i kronisk infiserte organer eller vev. 30 I enda en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse stammer de påviste mirna fra og blir spesielt uttrykt i en spesiell celletype, vev eller organ i kroppen, og endringer i nivået av nevnte mirna er indikatorisk for cytotoksiske effekter av fysiske og kjemiske midler så som f.eks. stråling assosiert med relativt lave doser som dreper benmargceller høyere doser som fører til død av epitelialceller av fordøyelsessystemet og til og med høyere doser som dreper hjerneneuroner; og kjemisk cytotoksisitet assosiert med celledød i forskjellige organer og vev indusert av naturlige eller syntetiske toksiske forbindelser.

12 11 I enda en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse stammer de påviste mirna fra og er spesifikt uttrykt i en spesiell celletype, vev eller organ i kroppen og kan bli brukt til prognose av sykdomsutfall. Endringer i nivåene av respektive mirna som er indikatorisk for sykdomsprogresjon/regresjon, suksess av terapeutisk eller kirurgisk intervensjon, blir brukt for sykdoms- og behandlingsovervåkning. I en annen utførelsesform av oppfinnelsen stammer de påviste mirna fra transplanterte celler, vev eller organer og deres nivåer er indikatoriske for avstøtningsepisoder og tilsvarende behandling. I en annen utførelsesform av oppfinnelsen stammer de påviste mirna fra et patogen og blir brukt for infeksjonsdiagnose og overvåkning. I en spesiell utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er patogenet et virus, f.eks. Epstein- Barr-virus. 1 I enda en annen utførelsesform av oppfinnelsen stammer de påviste mirna fra celler av et infisert organ og kan bli brukt for diagnosestøtte, evaluering av infisert vevsskade og videre sykdom- og behandlingsovervåkning. I enda en annen utførelsesform av oppfinnelsen stammer de påviste mirna fra fosteret hos en gravid kvinne og er karakteristisk for en tilstand eller sykdom hos fosteret så som f.eks. pre-eklampsi som er særpreget av overdreven død av trofoblaster i placenta. I enda en annen utførelsesform stammer de påviste mirna fra et foster hos en gravid kvinne og er karakteristisk for en tilstand eller sykdom hos fosteret så som f.eks. Downs syndrom og andre trisomier fulgt av forsinkelsen i organutvikling og overdreven eller hemmet celledød. 2 I enda en annen utførelsesform av oppfinnelsen blir informasjonen omkring nivåene av vev eller cellespesifikke mirna alene eller i kombinasjon med andre markører brukt for diagnose eller overvåkning av kreft og pre-kancerøse tilstander så som f.eks. leverkreft, nyrekreft, prostatakreft, kolorektal kreft, pankreatisk kreft og andre kjente krefttyper. 30 I enkelte utførelsesformer blir nivåene av celle og/eller vevsspesifikke mirna normalisert ved å bruke nivåene av generell mirna i serum, nivåene av albumin eller kreatinin i urin eller nivåene av placenta-spesifikke mirna mirna for normalisering av andre vevsspesifikke føtale mirna.

13 12 I et aspekt av oppfinnelsen innbefatter trinnet å analysere nevnte urinprøve for å påvise spesifikke mirna en teknikk valgt fra gruppen bestående av hybridisering, cykliserende probereaksjon, polymerase kjedereaksjon, nestet polymerase kjedereaksjon, PCR for å analysere enkeltkjedete konformasjonspolymorfier og ligase kjedereaksjon. I visse aspekter av oppfinnelsen er nukleinsyrenedbrytningen i nevnte urinprøve redusert. Metoden for reduksjon av nukleinsyrenedbrytning omfatter å inhibere nukleaseaktivitet ved bruk av RNAse-inbhibitorer eller ved å behandle nevnte urinprøve med en forbindelse valgt fra gruppen bestående av guanidin-hcl, guanidin isotiocyanat, N-lauroylsarkosin og natriumdodecylsulfat. I et annet aspekt av oppfinnelsen har nevnte urinprøve blitt holdt i blæren i mindre enn 12 timer. 1 I en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er mirna-sekvensene som blir målt, spesifikt relatert til vev i kroppen som kan være valgt fra, men ikke er begrenset til lunge, hjerte, lever, nervesystem, hjerne, blod, nyrer, ben, øyne eller bukspyttkjertel. 2 Vevet valgt for analysen kan være normalt eller abnormalt (f.eks. ondartet). Ondartet vev og svulster innbefatter karsinomer, sarkomer, melanomer og leukemi generelt og mer spesielt valgt fra ondartete vev og tumorer assosiert med gallegangskreft, blærecellekarsinom, benkreft, hjerne- og CNS-kreft, brystkreft, cervikal kreft, choriokarsinom, kronisk myelogen leukemi, tarmkreft, bindevevskreft, kutan T-celle-leukemi, endometrial kreft, spiserørskreft, øyekreft, follikulært lymfom, magekreft, hårcelleleukemi, Hodgkins lymfom, intraepiteliale neoplasier, strupekreft, lymfomaer, leverkreft, lungekreft (f.eks. småcelle og ikkesmåcelle), melanoma, multippelt myelom, neuroblastomaer, munnhulekreft, ovariekreft, pankreatisk kreft, prostatakreft, endetarmskreft, nyrecellekarsinom, sarkomaer, hudkreft, skvamøst cellekarsinom, testikkelkreft, tyroid kreft og nyrekreft. Fremgangsmåtene kan bli brukt for å skjele mellom godartete og ondartete krefttyper. 30 Individer hvorfra slike vevsprøver kan bli tatt fra innbefatter dem som har risiko for å utvikle kreft. Et individ som har risiko for å utvikle kreft er en som har en høy sannsynlighet for å utvikle kreft (f.eks. en sannsynlighet som er større enn sannsynligheten innen den generelle populasjon). Disse individer innbefatter f.eks. individer som har en genetisk abnormalitet, hvis tilstedeværelse har blitt vist å ha et korrelasjonsforhold til sannsynligheten for å utvikle en krefttype som er større

14 13 enn sannsynligheten for den generelle populasjon, og individer eksponert for kreftforårsakende substanser (dvs. karsinogener) så som tobakk, asbest, eller andre kjemiske toksiner, eller et individ som tidligere har blitt behandlet for kreft og er i en åpenbar remisjon. Foreliggende fremgangsmåter innbefatter isolering av mirna fra kroppsvæskene fra pasienter hvor et mirna av interesse kan bli påvist i en kroppsvæske valgt fra blod, plasma, serum og urin. I et aspekt av foreliggende oppfinnelse blir de aktuelle mirna påvist i urin. I en annen utførelsesform blir de aktuelle mirna påvist i serum. Foreliggende metode for mirna-isolering ifølge foreliggende oppfinnelse kan benytte kommersielt tilgjengelige anionebyttermaterialer. Enten sterke eller svake anionebyttere kan bli benyttet. Ved å anvende utvalgte oppløsninger for adsorpsjon og eluering kan de aktuelle mirna bli renset, konsentrert og i hovedsak isolert. 1 Ved å benytte en oppløsning ved kjent ionestyrke for den initiale binding av det aktuelle mirna til anionebytter kolonnematerialer, kan de fleste av de vannløselige komponenter innbefattende endre elektronegative molekyler så som proteiner (svakt bundne forurensninger) bli vasket gjennom kolonnen. For eluering blir den nødvendige ionestyrke nådd ved å bruke kjente konsentrasjoner av et salt så som NaCl, som kan bli blandet med en buffer for å kontrollere ph, ideelt tilsvarende den laveste ionestyrke ved hvilken nukleinsyrene vil eluere fullstendig. Forurensende substanser bundet til anionebytterresinet med høyere stringens enn nukleinsyrene kan derved bli etterlatt i kolonnen, dvs. sterkere bundne forurensninger blir skilt bort fra nukleinsyrene En foretrukket svak ionebytter er en hvor primære, sekundære eller tertiære amingrupper (dvs. protoniserbare aminer) gir utbyttersteder. Den sterke base anionebyter har kvarternære ammoniumgrupper (dvs. ikke-protoniserbare og alltid positivt ladet) som utbyttersteder. Begge ionebyttermaterialer blir valgt i relasjon til sine respektive absorpsjons- og eluerings-ionestyrker og/eller ph for de mirna som blir separert. Oppløsningsstyrkene er høyere enn bindingsstyrkene. I et aspekt av oppfinnelsen er det fremskaffet en fremgangsmåte for isolering av tranrenalt mirna fra urin, hvor fremgangsmåten omfatter å fremskaffe urin fra et individ; eventuelt å separere celler og celleavfall fra urinen ved filtrering eller

15 14 sentrifugering; tilsette EDTA og Tris-HCl til urinen, tilsette silikafritt anionebytterresin til urinen, inkubere landingen, fjerne anionebyttermediet fra urinen og eluere mirna fra resinet. I en utførelsesform av fremgangsmåten for å isolere mirna fra urin er konsentrasjonen av EDTA og Tris-HCl etter det er tilsatt til urinen, i et område på -0 mm, og ph av oppløsningen er mellom omkring 8,0 og omkring 8,. I en ytterligere utførelsesform blir kroppsvæsken eventuelt forfiltrert gjennom en membran før adsorpsjon på anionebyttermediet. I en ytterligere utførelsesform er amionebyttermediet et sepharosebasert resin funksjonalisert med kationiske kvarternære ammoniumgrupper. Eksempler på sepharosebaserte resiner som er funksjonalisert med kvarternære ammoniumgrupper innbefatter Q-Sepharose TM ANX-4 Sepharose TM Fast Flow, DEAE- Sepharose TM og Q-Sepharose-XL TM DEAE Sepharose Fast Flow (GE Healthcare). 1 I en ytterligere utførelsesform er anionebyttermediet valgt fra sepharose-basert kvarternært ammonium anionebyttermedium så som Q-filters eller Q-resin. I en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen er anionebyttermediet immobilisert på en individualisert bærer hvor en slik bærer er en kolonne, patron eller bærbart filtreringssystem som kan bli brukt for transport eller lagring av det medium/nukleoproteinbundne kompleks. 2 I en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan periodisk analyse av mirna-sekvenser som er til stede f.eks. i urinprøvene fra samme person, gi tidlig informasjon omkring en patologisk prosess i et spesielt organ eller vev. F.eks. blir mirna1122 syntetisert i lever alene og økninger i dens mengde kan være en markør for hepatitt eller annen leversykdom. Alzheimers syndrom kan være fulgt av økning i konsentrasjonen av mirna som uttrykkes spesifikt i neuroner. I en annen utførelsesform vil en mer detaljert overvåkning av vevs-spesifikt mirna i kroppsvæskeprøven fra pasienten være anvendelig for estimering av alvorligheten av sykdommen og for evaluering av effektiviteten av behandlingsforsøk.

16 1 I enda en annen utførelsesform kan, i kombinasjon med analyse av tumorspesifikke mutasjoner i data angående det vevs-spesifikke mirna, hjelpe til med bestemmelse av svulstbeliggenhet. Andre aspekter av foreliggende oppfinnelse angår sykdommer forårsaket eller fulgt av endringer i en spesifikk mirna-eskpresjon. Den beskrevne teknikk vil hjelpe ved diagnose av slike typer sykdommer. I enda en annen utførelsesform kan applikasjonen av foreliggende fremgangsmåte bli utvidet til å overvåke farmakokinetikk av syntetisk sirna i pasientens urin for å øke optimalisering av sirna medikamentutformingen. 1 Med mindre annet er definert har alle tekniske og vitenskapelige uttrykk benyttet heri samme betydning som er vanlig forstått av fagpersonen til hvilken foreliggende oppfinnelse henvender seg. Selv om metoder og materialer som likner eller tilsvarer dem som er beskrevet heri, kan bli brukt ved utførelse av foreliggende, er egnete metoder og materialer beskrevet nedenfor. I tilfelle av konflikt vil foreliggende beskrivelse innbefattende definisjoner kontrollere. Dessuten er materialene, metodene og eksemplene som er beskrevet heri, kun illustrative og er ikke ment å være begrensende. EKSEMPLER Eksemplene er presentert for mer fullstendig å illustrere de forskjellige utførelsesformer av oppfinnelsen. Disse eksempler bør på ingen måte tolkes som begrensende for omfanget av oppfinnelsen som er angitt i de medfølgende krav. Eksempel 1 Ekstraksjon av mirna fra urin: 2 Urininnsamling: For disse forsøk ble urinprøver samlet inn fra pasienter eller frivillige i en steril 1 ml urininnsamlingskopp og ble umiddelbart supplementert med EDTA opp til en sluttkonsentrasjon på mellom og 10 mm, fortrinnsvis 0 mm. Prøver ble lagret i -0 ml alikvoter ved -80 C. Eventuell filtrering av urin ble utført på Stericup TM (Millipore, Vacuum Driven Filtration System, 0,4 μ. Durapore TM filter) umiddelbart etter prøveinnsamling før EDTA ble tilsatt.

17 16 Q-binding: I et 0 ml rør ble ml urin fortynnet med et likt volum av 0 mm EDTA (ph 8,0) og 0 mm Tris-HCl (ph 8,0) som så ble supplementert med 1-2 ml Q- Sepharose TM (GE Healtcare; 17-0-) oppslemming og blandet kraftig i 30 min ved romtemperatur. Resinet med bundne nukleinsyrer, ble samlet opp med sentrifugering ved 00 g i minutter ved romtemperatur i en klinisk bordsentrifuge ved å bruke en svingbøtte-rotor. Alt bortsett fra ~00 μl av supernatant ble fjernet med sug. Resinpelelten ble resuspendert i den gjenværende supernatant og overført til en Micro Bio-Spin kromatografikolonne (Bio-Rad) eller tilsvarende, som ble operert enten ved sentrifugering eller vakuum. Resinet i kolonnen ble vasket tre ganger med 00 μl 2xSSC (300 mm NaCl/30 mm natriumcitrat(ph 7,0)) eller med buffer med tilsvarende ionestyrke (f.eks. 300 mm NaCl eller LiCl). Nukleinsyrer kan bli eluert fra Q-Sepharose med høy ionestyrke (f.eks. 1 M NaCl eller LiCl), men metodene som er beskrevet nedenfor preserverer RNA bedre. 1 Eluering fra Q-Sepahrose TM og TRIzol TM fasesearasjon: Bundne nukleinsyrer ble videre eluert med 00 μl TRIzol TM -reagens (Invitrogen). Ekstraksjonen av nukleinsyrer fra TRIzol ble utført i henhold til produsentens anbefalinger. Kort angitt ble TRIzoleluat for faseseparasjon supplementert med 0 μl kloroform, blandet kraftig, inkubert ved romtemperatur i 3- minutter og sentrifugert ved x g i 1 min ved 4 C. Mens berøring av interfasen blir unngått, ble 300 μl av den øvre fase overført til et ferskt sentrifugerør. Derpå ble nukleinsyrene utfelt eller videre renset og avsaltet på en silikakolonne. 2 Nukleinsyreutfelling: For nukleinsyreutfelling ble det ovenfor beskrevne preparat supplementert med 1 μl av mg/ml glykogen (Roche) og 300 μl av 0% isopropylalkohol. Nukleinsyrer ble samlet opp med sentrifugering, pelleten ble vasket to ganger med 0 μl av 70% etanol, tillatt å lufttørke i min ved romtemperatur og derpå ble nukleinsyrene oppløst i 30 μl av 0,1 mm EDTA/1 x RNA Secure (Ambion). Prøvene ble inkubert ved 60 C i min for å inaktivere enhver gjenværende RNAse-aktivitet Silika kolonnerensing av nukleinsyrer: For binding til en silikakolonne (Qiagen PCR ren kolonne eller tilsvarende) ble 3 volumdeler av 96% etanol tilsatt til nukleinsyrepreparatet fra TRIzol øvre fase, og etter 3 minutters inkubering ved romtemperatur ble blandingen satt på kolonnen. Kolonnen ble vasket to ganger med 00 μl 2 M LiCl/80% etanol og to ganger emd 00 μl 80% etanol. Nukleinsyrer ble eluert med 0 μl av 0,1 mm EDTA/ 1x RNA Secure (Ambion).

18 17 Prøvene ble inkubert ved 60 C i min for å inaktivere enhver gjenværende RNase. DNase I og RNase A-spaltning: For å bekrefte nukleinsyreidentiteten av materialet ekstrahert fra urin med den ovenfor beskrevne metode, ble foreliggende preparat spaltet med DNase I og/eller RNase A. DNase I-spaltning ble utført i DNase I Reaksjonsbuffer (NEB) inneholdende 2 enheter RNase-fritt DNase I (NEB). RNase A-spaltning ble utført i TE-buffer supplementert med 0 ng/ml kokt RNase A. Prøver ble inkubert ved 37 C i 60 min og ble etter tilsetning av påsatte fargeprøver underkastet elektroforese på % polyakrylamid 1 x TBE-geler og farget med 1/000 fortynnet SYBR Gold (Invitrogen). Som vist i Figur 1 representerer det isolerte materiale lavmolekylvekts nukleinsyrer, i hovedsak RNA og deres fragmenter. I tillegg (se Figur 1) ble for sammenligning nukleinsyrer fra Q-resin eluert med 3 M NaCl, spor 2 og 3, og Trizol TM spor 4 og. 1 I Figur 1 representerer spor 1 og nukleinsyrer isolert henholdsvis med høyt salt og TriZol-eluering fra Q-Sepharose; spor 2 og 6; 3 og 7; 4 og 8 representerer henholdsvis nukleinsyrer etter behandling med DNAse, RNAse eller DNAse pluss RNAse. Dessuten for å vise eksistens og molekylstørrelse av RNA, ble RNA-alikvoter av rensede nukleinsyrer spaltet med DNase I, spor 3 og. Ekstraksjon av RNA fra serum 2 30 For disse forsøk ble 1,2 ml av TRIzol LS satt til 0,4 ml serum og blandignen ble sentrifgugert ved rpm. Supernatanten ble overført til et 2 ml Eppendorfrør, 0,3 ml kloroform ble tilsatt og blandingen ble ristet i 1 sekunder. Etter sentrifugering ved rpm i 1 minutter ble supernatanten overført til et ml rør og etanol ble tilsatt opp til en sluttkonsentrasjon på 70%. Blandingen ble lastet på en Quiagen Quick-kolonne på en vakuum-manifold, og kolonnen ble vasket to ganger med 0, ml 2 M LiCl-80% EtOH, en gang med 0, ml 80% etanol- 80 mm natriumacetat (ph,0) og til slutt med 0, ml 9% etanol. Kolonnen ble sentrifugert i 1, ml Eppendorfrør 3 min ved rpm og RNA ble eluert med 40 μl H 2 O. Eksempel 2

19 18 Dette eksempelet viser at mirna fra døende celler, krysser nyrebarrieren og kan bli påvist i urinen fra en pasient. Påvisning av humane mirna-molekyler i urin Mikro RNA-sorter som ble analysert i dette eksempelet, kan bli gruppert i tre forskjellige typer, nemlig generelle mirna som blir uttrykt i alle eller flere vev, vevsspesifikke mirna og mirna hvor ekspresjonen er vesentlig endret i et spesielt vev eller celletype. Som vist av Tabell 1 ble forskjellige mirna oppnådd fra urin fra 16 friske frivillige og registrerte donorer og senere påvist med sanntids RT-PCR ved å bruke kommersielt tilgjengelig mirna ekspresjon analysesett (ABI). Tilsvarende syntetiske mirna oligonukleotider ble brukt som standarder. Reaksjoner ble utført nøyaktig som anbefalt av forhandler. Tabell 1. Påviste mirna

20 19 Alle tre typer mirna ble påvist i de fleste preparater av urin-rna. Det høyeste kopiantall var karakteristisk for generelt mirna. Imidlertid var vevsspesifikt mirna eller mirna overuttrykt i et spesielt vev eller celletype også påviselig. Det har blitt ugjenkallelig bevist at en del av mirna fra døende celler ikke blir nedbrutt, men opptrer i blodstrømmen og blir til slutt utskilt i urin. Eksempel 3 Eksempelet viser at mirna fra humane nasofaryngeale karsinomceller (NPC) kan krysse pasientens nyrebarriere og kan bli påvist i pasientens urin med sanntids RT- PCR. Virus-avledet mirna i urin 1 Det er kjent at enkelte virus også koder for og produserer mirna. Siden Epstein- Barr-virus (EBV) er involvert i utviklingen av nasofaryngealt karsinom (NPC) ble foreliggende system bentytet for å finne ut om viralt mirna fra NPC-celler kan nå pasientens urin og bli påvist der. Urinprøver fra NPC-pasienter ble samlet opp og lagret i henhold til prosedyrene beskrevet i Eksempel 1 av foreliggende søknad. EBV-infeksjon ble bekreftet ved påvisning av virus-spesifikke DNA-sekvenser i urin. Urin oppsamlet fra friske donorer var negative for EBV-spesifikke DNA-sekvenser. To EBV-spesifikke mirna BART3-3p og BART1-3p ble analysert i denne studien: Revers transkripsjon ble utført i 1 μl, en tiendedel av RT-reaksjonen ble underkastet PCR-amplifikering ved å bruke JumpStart DNA polymerase fra Sigma. De følgende primere ble brukt ved 0 nm konsentrasjon:

21 Produkter ble analysert i 1% polyakrylamidgel (PAAG). Som vist i Figur 2 ble både BART3 og BART1 mirna-typer påvist i urin fra NPCpasienter, men ikke i urinprøven far en frisk donor. Disse data indikerer igjen at mirna fra døende celler beliggende utenfor urinsystemet kan bli påvist i urin. I Figur 2, representerer spor 1 markører, spor 2 og 3 representerer pasienter med nasofaryngealt karsinom, spor 4 og representerer kontrollpasienter og spor 6 representerer positiv kontroll hvilke representerer respektive syntetiske mirna. Eksempel 4 Dette eksempelet viser at den neuronale død forårsaket av slag kan bli registrert in vivo ved målinger av konsentrasjonene av neuron-spesifikke mirna i pasientens urin. Hjerneslagdiagnose 1 For disse forsøkene ble pasienter med hjerneslag undersøkt for analyse av endringer i konsentrasjoner av hjernespesifikke mirna eller mirna som blir overuttrykt i hjernen etter slag. Siden det for tiden ikke er kjent i hvilke hjernecelletyper og i hvilke hjerneområder som disse mirna blir uttrykt, ble 9 forskjellige hjernespesifikke mirna studert. Pasienter: Urinprøver ble samlet inn fra pasienter inntatt ved et hospital via akuttmottaket. Diagnose på hjerneslag var basert på kliniske symptomer. Urinprøver ble samlet opp ved 12 og 24 timer etter slaget. Kontroll urinprøver ble donert fra aldersrelaterte frivillige, men uten slagsymptomer. Prøver ble samlet opp og lagret i henhold til prosedyrene beskrevet i Eksempel 1 i foreliggende søknad.

22 21 mirna-typer: mirna fra urin ble ekstrahert i henhold til fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 1. En mengde av RNA som er ekvivalent til den isolert fra 67 μl urin undergikk revers transkripsjon PCR og 1/ av RT-PCR-blandingen undergikk til slutt sanntids PCR som ble utført ved å bruke fremgangsmåten gitt av forhandler. Data som ble oppnådd, ble normalisert for individuell nyrefiltreringsgrader ved ny utregning per kreatininkonsentrasjon i urin. For disse forsøk ble urinprøver samlet opp fra friske donorer fra samme aldersgruppe brukt som basislinje. Forskjellige mirna er presentert som følger: Resultater oppsummert i Figurer 3A til 3G viser at etter hjerneslag er det en vesentlig økning i nivåene av flere hjernespesifikke mirna (128a, 129, 218, 219) noe som reflekterer kinetikken av hjernecelledød. Eksempel Dette eksempelet viser at kinetikken av mirna-konsentrasjonene i pasienters urin etter slag gir informasjon om sykdomsutfallet. 1 Hjerneslagovervåkning For forsøkene ble pasienter med hjerneslag undersøkt for analyse av korrelasjon mellom endinger i konsentrasjoner av hjernespesifikt mirna og sykdomsutvikling. Pasienter: Urinprøver ble samlet opp fra pasienter innlagt på et sykehus via akuttmottaket. Diagnose av hjerneslag var basert på kliniske symptomer og MRIanalyse. Urinprøver ble samlet opp ved 12, 24, 48 timer og en uke etter slaget.

23 22 Klinisk pasientstatus ble evaluert 30 dager etter slaget. Urin kontrollprøver ble gitt av alderstilsvarende frivillige, men uten slagsymptomer. Prøver ble samlet opp og lagret i henhold til prosedyrene beskrevet i Eksempel 1 av foreliggende søknad. mirna-typer: mirna fra urin ble ekstrahert i henhold til prosedyren beskrevet i Eksempel 1 og analysert med TaqMan mirna assays (Applied Biosystems). En mengde av RNA tilsvarende den isolert fra 400 μl urin undergikk revers transkripsjons PCR og 1/ av RT-PCR-blandingen undergikk til slutt sanntids-pcr som ble utført ved å bruke fremgangsmåten gitt av forhandler. Data som ble oppnådd, ble normalisert for individuelle nyrefiltreringsgrader ved ny utregning per kreatininkonsentasjon i urin. For disse forsøk ble urinprøver samlet fra friske donorer av samme aldersgruppe brukt som basislinje. 1 Resultater oppsummert i Figurer 4A og B viser klart at dynamikken av endringer i Tr-miRNA 129 og Tr-miRNA 219 etter hjerneslag er forskjellige i forskjellige pasienter og korrelerer med sykdomsutviklingen. Økningen i neuronal død en uke etter slaget i pasient #3 tilsvarer en forverring i pasientens kliniske status. På samme tid viste to pasienter hvis transrenale neuron-spesifikke mirna hadde en tendens til normalisering, vesentlig bedring. Eksempel 6 Alzheimers sykdomsdiagnose 2 Alzheimers sykdom er en progressiv neurologisk sykdom som er forårsaket av død av neuroner, spesielt i korteks og hippokampus. Diagnosen er basert på neurologisk undersøkelse og utelukkelse av andre årsaker til demens, mens den definitive diagnose kan kun bli foretatt ved autopsi. Foreliggende oppfinnelse viser at overdreven neuronal død som karakteriserer Alzheimers sykdom, akn bli overvåket ved å måle nivåene av spesifikke hjerne mirna isolert fra pasientens urin. For disse forsøk ble pasienter diagnostisert med Alzheimers sykdom undersøkt for analyse av endringer i konsentrasjoner av hjernespesifikke eller overuttrykte mirna som et resultat av neuronal død. 30 Pasienter: Urin- og serumprøver ble samlet inn fra pasienter diagnostisert med forskjellige stadier av Alzheimers sykdom. Urin og serum kontrollprøver ble donert

24 23 av alderstilsvarende frivillige, men uten symptomer på Alzheimers sykdom. Prøver ble samlet opp og lagret i henhold til prosedyrene beskrevet i Eksempel 1av foreliggende søknad. Enkelte urinprøver ble filtrert etter innsamling som beskrevet i Eksempel 1 for å fjerne celler og celleavfall. mirna-typer: RNA fra urin og serum ble ekstrahert i henhold til prosedyrene beskrevet i Eksempel 1. I et sett forsøk undergikk en mengde av RNA tilsvarende den isolert fra 70 μl urin, revers transkripsjons-pcr og 1/ av RT-PCR-blandingen undergikk en sluttlig sanntids PCR som ble utført ved å bruke fremgangsmåten gitt av forhandler (Applied Biosystems), Data som ble oppnådd, ble normalisert for individuell nyrefiltreringsgrader ved ny utregning per kreatininkonsentrasjon i urin. Figur viser klart at konsentrasjoner av flere hjernespesifikke mirna er øket i urinen fra Alzheimers-pasienter. 1 I et annet sett forsøk ble RNA isolert fra filtrert urin eller serum analysert. En mengde av RNA tilsvarende den isolert fra 0,6 ml urin eller 0 μl serum undergikk revers transkripsjons-pcr og 1/ av RT-PCR-blandingen undergikk en sluttlig sanntids-pcr som ble utført ved å bruke fremgangsmåten gitt av forhandler (Applied Biosystems). Data oppnådd fra urin mirna ble normalisert for individuelle nyrefiltreringsgarder ved ny utregning per kreatininkonsentrasjon i urin. Data oppnådd for plasma mirna ble normalisert per generelle mirna-16. Figur 6 og 7 viser at nivåene av enkelte neuron-spesifikke mirna er høyere i både filtrert urin og serum fra Alzheimers-pasienter i forhold til alderstilsvarende kontroller. Eksempel 7 Parkinsons sykdom 2 Parkinsons sykdom er en degenerativ forstyrrelse hos sentralnervesystemet og som ofte hemmer den sykes motoriske ferdigheter og tale. Foreliggende oppfinnelse viser at overdreven celledød av dopaminergiske neuroner, noe som karakteriserer Parkinsons sykdom, kan bli overvåket ved å måle nivåene av spesifikke hjernemirna isolert fra pasientens urin.