(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. C12N 1/67 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet 12.. (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato () Prioritet , EP, , EP, , EP, (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR Utpekte samarbeidende stater AL BA MK RS (73) Innehaver Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Binger Straße 173, 216 Ingelheim am Rhein, DE-Tyskland (72) Oppfinner KAUFMANN, Hitto, Boehringer Ingelheim GmbHCD PatentsBinger Str. 173, 216 Ingelheim Am Rhein, DE-Tyskland FLORIN, Lore, Boehringer Ingelheim GmbHCD PatentsBinger Str. 173, 216 Ingelheim Am Rhein, DE-Tyskland BECKER, Eric, Boehringer Ingelheim GmbHCD PatentsBinger Str. 173, 216 Ingelheim Am Rhein, DE-Tyskland OLAYIOYE, Monilola, Boehringer Ingelheim GmbHCD PatentsBinger Str. 173, 216 Ingelheim Am Rhein, DE-Tyskland HAUSSER, Angelika, Boehringer Ingelheim GmbHCD PatentsBinger Str. 173, 216 Ingelheim Am Rhein, DE-Tyskland FUGMANN, Tim, Boehringer Ingelheim GmbHCD PatentsBinger Str. 173, 216 Ingelheim Am Rhein, DE-Tyskland (74) Fullmektig Bryn Aarflot AS, Postboks 449 Sentrum, 04 OSLO, Norge (4) Benevnelse Forbedring av proteinproduksjon (6) Anførte publikasjoner EP-A ALPY FABIEN ET AL: "Give lipids a START: The StAR-related lipid transfer (START) domain in mammals" JOURNAL OF CELL SCIENCE, vol. 118, no. 13, July 0 (0-07), pages , XP ISSN: HANADA KENTARO ET AL: "Molecular machinery for non-vesicular trafficking of ceramide." NATURE (LONDON), vol. 426, no. 6968, 03, pages , XP ISSN: KAWANO MIYUKI ET AL: "Efficient trafficking of ceramide from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus requires a VAMP-associated protein-interacting FFAT motif of CERT" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 281, no. 40, October 06 (06-), pages , XP ISSN: TOTH BALAZS ET AL: "Phosphatidylinositol 4-kinase III beta regulates the transport of ceramide

2 between the endoplasmic reticulum and Golgi" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 281, no. 47, November 06 (06-11), pages , XP ISSN:

3 FORBEDRING AV PROTEINPRODUKSJON 1 BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN TEKNISK OMRÅDE Oppfinnelsen vedrører området cellekulturteknologi. Den vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av proteiner så vel som en fremgangsmåte for å danne nye ekspresjonsvektorer og vertceller for biofarmasøytisk fremstilling. Oppfinnelsen vedrører videre farmasøytiske preparater og metoder for behandling. 1 BAKGRUNN Markedet for biofarmasøytika for anvendelse innen human terapi fortsetter å vokse i stor grad og med 270 nye biofarmasøytika som evalueres i kliniske studier, og det er estimert salg på billioner i 03 (Werner 04). Biofarmasøytika kan fremstilles fra forskjellige vertcellesystemer, som inkluderer bakterieceller, gjærceller, insektceller, planteceller og pattedyrceller som inkluderer humanavledede cellelinjer. Et økende antall biofarmasøytika produseres nå fra eukaryotiske celler på grunn av deres evne til korrekt å prosessere og modifisere humane proteiner. Vellykket produksjon og produksjon med høyt utbytte av biofarmasøytika fra disse celler er således avgjørende, og avhenger i stor grad av egenskapene til den rekombinante monoklonale cellelinjen som anvendes i prosessen. Der er derfor et presserende behov for å danne nye vertcellesystemer med forbedrede egenskaper og å etablere metoder for å dyrke produksjonscellelinjer med høye spesifikke produktiviteter som en basis for høyutbytteprosesser. 2 Tidligere prosedyrer fokuserte på prosess design og reaktor design. Nå er de viktigste forbedringene drevet ved utvikling av medium formulering og genmanipulering av vertceller. De mest vanlige industrielle pattedyrvertcellesystemer for produksjon av biofarmasøytika er udødeliggjorte kinesisk hamster ovarie (CHO) cellelinjer (Wurm, 04). 3 Initiale metabolske manipuleringsstrategier for å forbedre pattedyrproduksjonscellelinjer fokuserte på deres evne til å vokse i suspensjon i serumfrie medier. Stabil ekspresjon av transferring og insulinlignende vekstfaktor 1 (IGF-1) i CHO-K1 celler resulterte i en cellelinje i stand til å prolifere under proteinfrie betingelser (Pak et al., 1996). Videre metoder for å forbedre produksjonscellelinjene inkluderte anvendelsen av regulerende DNA elementer på transfeksjonsvektorene som har til formål å målsøke eller danne transkripsjonelle populære steder. Regulerende elementer slik som S/MAR er (Scaffold/matrix-assosierte områder) som påvirker kromatinstruktur og

4 2 UCOE er ( Ubiquitous chromatin opening elements ) avledet fra husholdningsgener ble begge vist til positivt å påvirke spesifikke produktiviteter av rekombinante proteiner fremstilt fra CHO cellelinjer (Barnes and Dickson, 06). Da apoptose er blitt vist til å være den dominerende årsaken til celledød i prosesser for produksjon av pattedyrcellekultur (al-rubeai and Singh, 1998) ble effekten av ekspresjon for anti-apoptotiske gener i pattedyr vertceller på kulturlevedyktighet inngående undersøkt. De fleste antiapoptose teknikk strategier er fokusert på overekspresjon av anti-apoptotiske gener av bcl-2 familien (f.eks. bcl-1 eller bcl-xl; (Kaufmann and Fussenegger, 03)). Ved å øke cellulær resistens mot apoptotiske stimuli under fermentering, slik som næringsstoffutarming og akkumulering av avfallsbiprodukt, viste produksjonsprosesser med apoptose-konstruerte cellelinjer forlenget kulturlevedyktighet og i noen tilfeller en økning i produktutbytte (Chiang and Sisk, 0). 1 Da de fleste biofarmasøytiske produkter er proteiner som utskilles fra cellene under produksjonsprosessen, er det sekretoriske transportmaskineri i produksjonscellelinjen et annet interessant mål for nye vertcellekonstruksjonsstrategier. 2 Proteinsekresjon er en kompleks flertrinnsmekanisme: Proteiner bestemt til å bli transportert til det ekstracellulære rom eller den ytre plasmamembran blir først kotranslasjonelt importert inn i den endoplasmatiske retikulum. Derfra pakkes de i lipidvesikler og transporteres til Golgi apparatet og endelig fra trans-golgi nettverket (TGN) til plasmamembranen hvor de frigis inn i dyrkingsmediet (Seth et al., 06). Utbytte av en hvilken som helst biofarmasøytisk produksjonsprosess avhenger i stor grad av mengden av proteinprodukt som de produserende celler utskiller per tidspunkt når dyrket under prosessbetingelser. Mange komplekse biokjemiske intracellulære prosesser er nødvendige for å syntetisere og utskille et terapeutisk protein fra en eukaryotisk celle. Alle disse trinn slik som transkripsjon, RNA transport, translasjon, posttranslasjon modifikasjon og proteintransport er inngående regulert i villtype vertcellelinjen og vil påvirke den spesifikke produktiviteten hos en hvilken som helst produksjonscellelinje avledet fra verten. 3 En rekke tekniske tilnærminger har benyttet den voksende forståelse av det molekylære nettverket som driver prosesser slik som transkripsjon og translasjon for å øke utbyttet fra disse trinn ved proteinproduksjon. Som for en hvilken som helst flertrinns produksjonsprosess vil åpning av en flaskehals i løpet av tidligere trinn i

5 3 prosesskjeden eventuelt danne flaskehalser lenger ute, særlig etter translasjon. Opp til en viss grense, er den spesifikke produktiviteten av en produksjonscelle blitt rapportert til å korrelere lineært med nivået av produkt gen transkripsjon (Barnes et al., 07). Videre økning av produkt ekspresjon ved mrna nivået kan imidlertid føre til en overbelastning av proteinsyntesen, folding eller transportmaskineri, som resulterer i intracellulær akkumulering av proteinproduktet. Dette kan faktisk ofte observeres i nåværende produksjonsprosesser (FIGUR 1). Spesifikke målrettede tekniske tilnærminger som har til formål å ta opp dette problemet og effektivt forbedre sekresjon av proteinprodukter fra eukaryotiske celler, er hindret ved den nåværende mangel på forståelse av det komplekse regulerende nettverket som driver transporten av proteiner til plasmamembranen. 1 2 De første studier angående modifisering av den intracellulære transport av utskilte terapeutiske proteiner ble konsentrert rundt overekspresjon av molekylære chaperoner slik som bindingsprotein BiP/GRP78, protein disulfid isomerase (PDI). Chaperoner er cellulære proteiner som hører hjemme i den endoplasmatiske retikulum (ER) og understøtter folding og sammenstilling av nylig syntetiserte proteiner. I motsetning til hva som kunne forventes, er BiP overekspresjon i pattedyrceller blitt vist til å redusere heller enn øke sekresjonen av proteiner det assosierer med (Dorner and Kaufman, 1994). Likeledes reduserte PDI overekspresjon i CHO celler ekspresjonen av et TNFR: FC fusjonsprotein (Davis et al., 00), mens den spesifikke produksjonsraten av et antistoff ble økt med 40 % (Borth et al., 0). En mulig forklaring av disse overraskende funn, at økningen i cellens proteinfoldingskapasitet danner en produksjonsflaskehals lenger ute, er understøttet av en rapport som beskriver ER til cis-golgi transportproblemer for IFNgamma produksjon i en CHO cellelinje (Hooker at al., 1999). 3 En annen senere tilnærming for å øke sekresjonskapasiteten for pattedyrceller er den heterologe overekspresjonen av transkripsjonsfaktoren X-boks bindingsprotein 1 (XBP-1). XBP-1 er ett av master-regulatorene ved differensieringen av plasmaceller, en spesialisert celletype som er optimalisert for høynivå produksjon og sekresjon av antistoffer (Iwakoshi et al., 03). XBP-1 regulerer denne prosess ved binding til de såkalte ER stress responsive elementer (ERSE) i promoterne til et omfattende spekter av sekresjons-spor gener, resulterende i (i) fysisk ekspansjon av ER, (ii) økt mitokondrial masse og funksjon, (iii) større cellestørrelse og (iv) økt total proteinsyntese (Shaffer et al., 04).

6 4 Nylig ble forsøk beskrevet for å øke proteinsekresjon ved overekspresjon av XBP-1 i ikke-plasmaceller, særlig produksjonscellelinjer. I CHO-K1 celler, ble produksjonsnivået av to reporterproteiner (utskilt alkalisk fosfatase (SEAP) og utskilt alfaamylase (SAMY)) vis til å øke etter XBP-1 introduksjon i CHO-K1 celler. Ingen effekt kunne imidlertid demonstreres i transiente studier med andre cellelinjer slik som HEK293, HeLa eller HT-80 celler (Tigges and Fussenegger, 06). I patentsøknad WO av Ailor Eric er det søkt patent på overekspresjon av XBP-1 eller ATF6 for dannelsen av høyproduktive cellelinjer. 1 Særlig XBP-1 regulerer ikke bare plasmacelledifferensiering, men spiller også en viktig rolle i den ufoldede proteinresponsen (UPR) (Brewer and Hendershot, 0) UPR representerer et komplekst signaltransduksjonsnettverk som aktiveres ved inhibering av proteinfolding i det endoplasmatiske retikulum (ER). UPR koordinerer adaptive responser overfor denne stressituasjon, som inkluderer induksjon av ER resident molekylært chaperon og protein foldase ekspresjon for å øke protein foldingskapasitet i ER, induksjon av fosfolipidsyntese, svekkelse av generell translasjon og oppregulering i ER-assosiert degradering for å nedsette belastning av ufoldet protein i ER. Ved alvorlig eller forlenget ER stress, vil UPR til sist indusere apoptotisk celledød (Schroder, 06). 2 Prosessen med terminal differensiering, slik som maturasjonen fra en lymfocytt til en plasmacelle, er vanligvis ansett som et apoptoselignende program under hvilket cellen taper dens proliferative kapasitet for å fremkalle en terminalt differensiert sekretorisk celle. Nærmest alle celletyper som er spesifikt designet for høynivå proteinsekresjon (glandulære celler, pankreas-betaceller) er i realiteten terminalt differensiert, er ikke i stand til å proliferere og har en begrenset levetid før de til slutt gjennomgår programmert celledød (Chen-Kiang, 03). Overekspresjon av XBP-1 som en regulator av både plasmacelledifferensiering og UPR er derfor potensielt ufordelaktig som skyldes den iboende risiko for å inhibere proliferasjon og/eller indusere apoptose. 3 Sett under ett, er der et behov for å forbedre den sekretoriske kapasiteten til vertceller for rekombinant proteinproduksjon. Dette vil til og med bli viktigere i kombinasjon med nye transkripsjonsøkende teknologier og ved høy-titer prosesser for å forhindre posttranslasjonsflaskehalser og intracellulær akkumulering av proteinproduktet (FIGUR 1). For øyeblikket er der imidlertid to viktige hindre på veien til målrettet manipulering av det sekretoriske transportmaskineri: Den fremdeles begrensede kunnskapen om de underliggende regulerende mekanismer og

7 kravet til å forhindre en samtidig vekstinhiberende eller apoptotisk respons av produksjonscellen. Den foreliggende oppfinnelse beskriver en ny og overraskende rolle for ceramidoverføringsproteinet CERT i transporten av utskilte proteiner til plasmamembranen og tilveiebringer videre en fremgangsmåte for effektivt å forbedre produksjonen av proteiner som transporteres via det sekretoriske spor fra eukaryotiske celler. CERT (også kjent som Goodpasture antigen-bindingsprotein) er et cytosolisk protein som er essensielt for den ikke-vesikulære avlevering av ceramid fra dets produksjonssted i det endoplasmatiske retikulum (ER) til Golgi membraner, hvor omdannelse til sfingomyelin (SM) finner sted (Hanada et al., 03). 1 2 To CERT isoformer eksisterer: den mere rikelig uttrykte, alternativt spleisede formen som mangler en 26-aminosyre, serin-rik region (SEKV ID NR:, 11) og fullengde 624 aminosyreproteinet, betegnet CERT L (SEKV ID NR: 12, 13) (Raya et al., 00). Begge CERT isoformer utviser et karboksyterminalt steroidogenisk akutt regulerene (StAR)-relatert lipidoverføring (START) domene som er nødvendig og tilstrekkelig for ceramidbinding og transport (Hanada et al., 03) START domener er i stor grad bevart fra flue og orm/mark til mennesker (FIGUR 2). De har en lengde ~2 aminosyrer og danner en hydrofob tunnel som akkomoderer et monomert lipid (Alpy and Tomasetto, 0; Soccio and Breslow, 03) START domener er funnet i 1 pattedyrproteiner, hvor CERT er det som er mest beslektet med fosfatidylcholinoverføringsproteinet Pctp, som binder og beveger fosfatidylcholin (PC) mellom membraner, og StarD, et lipidoverføringsprotein som er spesifikt for PC og PE (Olayioye et al., 0; Soccio and Breslow, 03; Wirtz, 06). I tillegg til START domenet, inneholder CERT proteinene videre et aminoterminalt PH domene med spesifisitet for PI(4)P som er ansvarlig for Golgi lokalisering (Hanada et al., 03: Levine and Munro, 02) og et FFAT motiv (to fenylalaniner i en surt område) som målretter proteinet mot ER via interaksjon med ER resident transmembran proteinene VAP-A og VAP-B (Kawano et al, 06; Loewen et al., 03). 3 Den fundamentale rollen til CERT i lipid trafikkering ble vist i kinesisk hamsterovarie cellelinjen LY-A, hvor ekspresjonen av et mutant ikke-funksjonelt CERT protein svekket ceramidtransport, som resulterer i reduserte cellulære nivåer av sfingomyelin (Hanada et al., 03). Ikke-vesikulær lipidoverføring menes å forekomme ved såkalte membrankontaktsteder (MCS), hvorved ER kommer i nær opposisjon med andre organeller (Levine and Loewen, 06). CERT kan således bevege seg en svært kort distanse mellom ER og Golgi membraner, eller kanskje kontakte begge

8 6 seksjoner samtidig. Når overuttrykt, er START domenet av CERT tilstrekkelig for ceramid overføring til Golgi apparatet (Kawano et al., 06). Under fysiologiske betingelser, er imidlertid både Golgi og ER målrettingsmotiver essensielle for CERT funksjon. I LY-A celler, ble CERT identifisert til å inneholde mutasjon i sitt PH domene (G67E), som gjør proteinet mangelfullt med hensyn til PI(4)P binding (Hanada et al., 03). Kravet om PI(4)P for CERT funksjon er videre understøttet av en nylig rapport om at PI4KIII-beta aktivitet er nødvendig for effektiv ceramid trafikkering til Golgi (Toth et al., 06), den enzymatiske aktiviteten som er stimulert ved proteinkinase D (PKD). PKD tilhører en subfamilie av serin-/treonin-spesifikke proteinkinaser (som omfatter 1 PDK1/PKC, PKD2 og PKD3/PKC ) og ble nylig identifisert til å være av avgjørende viktighet for regulering av proteintransport fra Golgi membranen til plasmamembranen (gjennomgått i (Rykx et al., 03; Wang, 06)). Rekruttering og aktivering av PKD i TGN er mediert ved lipidet diacylglyserol (DAG; (Baron and Malhotra, 02)), hvis samling er dannet ved sfingomyelin syntase fra ceramid og fosfatidylcholin. Den foreliggende oppfinnelse viser av PDK fosforylerer CERT på serin 132 i umiddelbar nærhet av PH domenet, hvorved PI(4)P binding, Golgi målretting og ceramid overføringsaktivitet er negativt regulert. Videre ved overføring av ceramid som er nødvendig for DAG produksjon til Golgi membraner, stimulerer CERT PKD aktivitet, og etablerer således en regulerende feedbacksløyfe som sikrer opprettholdelsen av konstitutiv sekretorisk transport. 2 3 Først og fremst viser de tilveiebrakte dataene videre at i forskjellige eukaryotiske cellelinjer (COS7 og HEK293), vil introduksjon av genet som koder for CERT signifikant øke sekresjonen av et heterologt protein i dyrkingsmediet. Denne effekt er til og med mere fremtredende når det anvendes en CERT mutant som ikke kan fosforyleres med PKD. Delesjon av fosforyleringsakseptorsetet innen CERT avbryter den negative kontrollen av PKD på CERT, men lar den positive feedback en av CERT på PKD være intakt gjennom understøttelsen av ceramidomdannelse til sfingomyelin og DAG. Det kan derfor spekuleres om den sekresjonsøkende mekanismen ifølge oppfinnelsen kan anvendes ikke bare med villtype CERT men også med alle mutanter av CERT som frakobler CERT fra den negative innvirkning av PKD, som inkluderer punktmutasjoner av akseptoren serin, delesjoner som inkluderer denne rest så vel som mutasjon eller delesjon av PKD dokking stedet innen CERT eller til og med START domenet alene.

9 7 CERT tilhører familien av StAR-relaterte lipidoverføringsproteiner (Soccio and Breslow, 03) som er kjennetegnet ved deres START domener for lipidbinding. Da START domenet av CERT er blitt vist til å være både nødvendig og tilstrekkelig for CERT virking (Hanada et al., 03), er det mulig at den sekresjonsfremmende effekten av CERT likeledes kan observeres når man overuttrykker et annet medlem av denne proteinfamilien. Dette er særlig sannsynlig for nær beslektede medlemmer av PCTP-subfamilien, omfattende PCTP (SEKV ID NR: 26, 27), GERT/GPBP som sådan, StarD7 og StarD. Disse proteiner har distinkte lipid-bindingsspesifisiteter og kan i like stor grad påvirke funksjonen av organeller involvert i sekresjonen av heterologe proteiner. Videre kan ekspresjonen av de relaterte proteiner STARD4 (SEKV ID NR:, 21) og STARD (SEKV ID NR:22, 23), som er indusert ved ER stress, virke til å oppfylle det økte kravet om lipidoverføring av celler under en produksjonsprosess. 1 Eksistensen av START domene proteiner i eukaryotiske organismer fra flue, orm/mark og mus til mennesker indikerer at de grunnleggende mekanismene i lipidtrafikkering er bevart blant dem innen det eukaryotiske riket. Videre foreslår dette at prinsippet som beskrevet i den foreliggende oppfinnelse, som er økende sekresjon ved forsterket ekspresjon av CERT, godt kan anvendes på alle eukaryotiske celler, som inkluderer gjær. 2 Oppsummert tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å øke den sekretoriske transport av proteiner i eukaryotiske celler ved heterolog ekspresjon av CERT, CERT mutanter eller annet medlem av START proteinfamilien. Denne fremgangsmåte er særlig anvendbar for dannelsen av optimaliserte vertcellesystemer med økt produksjonskapasitet for ekspresjonen og produksjonen av rekombinante proteinprodukter. 3 Fremgangsmåten beskrevet ved den foreliggende oppfinnelse er fordelaktig i en rekke aspekter: For det første har man vist at heterolog ekspresjon av CERT er en strategi for å øke rekombinant proteinproduksjon ved å øke den sekretoriske kapasiteten til vertcellen. Øking av spesifikk produktivitet av produksjonsceller omdannes til høyere produktutbytter i industrielle proteinproduksjonsprosesser. Med den nåværende trend mot høytiterprosesser og mere sofistikerte ekspresjonsøkende teknologier, vil posttranslasjonsflaskehalser bli det åpenbare ratebegrensende trinn i proteinproduksjon og vil således rette økende oppmerksomhet mot sekresjonsmodifiserende tilnærmingsmåter.

10 8 For det andre er START domenet av CERT i stor grad konservert i eukaryoter fra C. elegans til mennesker. Dette foreslår på det sterkeste at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ikke bare kan anvendes i pattedyr vertcellesystemer, men kan likeledes anvendes for proteinproduksjon i alle eukaryotiske celler, som inkluderer insektsceller og gjærceller. Som et tredje viktig trekk, er CERT som en cytosolisk faktor ikke del av den ufoldede proteinresponsen og således ikke involvert i et cellulært stressresponsprogram som induserer stopp for proteintranslasjon og, om ikke løst, som fører til cellecyklusstans eller til og med apoptose. I motsetning, ved å spille en uavhengig rolle i lipid trafikkering, kan CERT målretting gi økt proteinsekresjon uten samtidig induksjon av apoptose. Således kan overekspresjon av CERT i produksjonsvertceller være fordelaktig i forhold til genmanipuleringstilnærminger som er XBP-1 baserte. 1 For det fjerde, er det vist i den foreliggende oppfinnelse at mutasjon av Ser132 i CERT svekker fosforyleringen av CERT ved PDK som frigir CERT fra en negativ regulerende innvirkning. I mellomtiden er den positive stimulering av PKD ved CERT via DAG etterlatt intakt (FIGUR 3A). Dette funn plasserer CERT i signalsporet oppstrøms for PGD, som er blitt publisert til å være kritisk involvert i reguleringen av de sene stadier av sekretorisk transport, nemlig transporten fra trans-golgi nettverket til plasmamembranen (Linjedahl et al., 01). Med hensyn til proteintransport, betyr dette at CERT virker nedstrøms for ER som gjør CERT det foretrukne mål for manipulering sammenlignet med XBP-1 eller spesifikke ERresiderende proteiner (FIGUR 3B). 2 Siden CERT kan innvirke selv på de siste trinnene av det sekretoriske spor, kan man spekulere i om heterolog ekspresjon av CERT har potensialet til å øke sekresjon uten å danne flaskehalser videre nedstrøms. Så langt vi kjenner er CERT til nå det mest nedstrømsvirkende mål for genmanipulering av det sekretoriske spor for å øke heterolog proteinproduksjon. 3 Sett under ett, vil innvirkningen av lipid-overføringsproteinet CERT på den sekretoriske transport fra ER til Golgi og fra Golgi apparatet til plasmamembranen, uten den ufordelaktige forbindelsen til en vekstinhiberende eller apoptoseinduserende stressrespons gjøre CERT, CERT mutanter og andre START familieproteiner svært attraktive og lovende som mål for genmanipuleringstilnærminger som har til formål å øke den sekretoriske kapasiteten til eukaryotiske celler.

11 9 ANVENDBARHET Den målrettede manipulering av CERT som er beskrevet i den foreliggende oppfinnelse kan anvendes innen et stort anvendelsesområde. Særlig to grunnleggende tilnærminger utmerker seg: (i) overekspresjon og/eller økning av aktiviteten av CERT eller et CERT derivat for å øke den sekretoriske transportkapasiteten til en celle, eller (ii) redusere CERT aktivitet og/eller ekspresjon som et genterapi middel for å redusere cancercelleproliferasjon og/eller invasjon. 1 Anvendbarhet av CERT overekspresjon Den beskrevne oppfinnelsen beskriver en fremgangsmåte for å danne forbedrede eukaryotiske vertceller for fremstilling av heterologe proteiner ved å introdusere genet som koder for CERT, CERT mutanter eller andre proteiner av START proteinfamilien. Dette vil gjøre det mulig å øke proteinutbyttet i produksjonsprosesser basert på eukaryotiske celler. Det vil derved redusere de nødvendige kostnader for slike prosesser og samtidig redusere antallet batcher som må produseres for å danne materialet som er nødvendig for forskningsstudier, diagnostika, kliniske studier eller markedstilbud av et terapeutisk protein. Oppfinnelsen vil videre akselerere legemiddelutvikling da dannelsen av tilstrekkelige mengder av material for prekliniske studier ofte er en kritisk arbeidspakke med hensyn til tidsaspektet. 2 Oppfinnelsen kan anvendes for å øke egenskapen til alle eukaryotiske celler anvendt for dannelsen av ett eller flere spesifikke proteiner for enten diagnostiske formål, forskningsformål (målidentifikasjon, ledende identifikasjon, ledende optimalisering) eller produksjon av terapeutiske proteiner enten for markedet eller i klinisk utvikling. 3 Som vist i den foreliggende oppfinnelse, vil heterolog ekspresjon av CERT ikke bare øke proteinsekresjon, men har også en innvirkning på det store antall transmembranproteiner på celleoverflaten. Inhibering eller redusert ekspresjon av CERT fører til en dramatisk reduksjon i mengden av celleoverflate reseptorer slik som transferrin reseptoren (FIGUR 8). Da utskilte og transmembranproteiner deler det samme sekretoriske spor og transporteres i lik grad i lipidvesikler, fremhever disse data viktigheten av CERT i moduleringen av sekresjon så vel som transporten av membranbundne celleroverflatereseptorer. Fremgangsmåten beskrevet heri kan derfor også anvendes for akademisk og industriell forskningsformål med det mål å karakterisere funksjonen av celleoverflatereseptor. Den kan f.eks. anvendes for produksjon og påfølgende rensing, krystalli-

12 sering og/eller analyse av overflateproteiner. Dette er av avgjørende viktighet for utviklingen av nye humane legemiddelterapier da celleoverflatereseptorer er en dominerende klasse av legemiddelmål. Det vil dessuten være fordelaktig for studiet av intracellulære signaleringskomplekser assosiert med celleoverflate reseptorer eller analysen av celle-celle-kommunikasjon som delvis er mediert ved interaksjonen av oppløselige vekstfaktorer med deres tilsvarende reseptorer på den samme eller annen celle. Anvendbarhet av å redusere/inhibere CERT I den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt bevis for at reduksjonen av CERT ekspresjon fører til redusert sekresjon av oppløselige ekstracellulære proteiner så vel som et lavere antall av celleoverflatereseptorer. Dette gjør at CERT er et attraktivt mål for terapeutisk manipulering. 1 2 Ett av kjennetegnene i omdannelsen av en normal frisk celle til en cancercelle er ervervelsen av uavhengighet fra tilstedeværelsen av eksogene vekstfaktorer (Hanahan and Weinberg, 00). I motsetning til den normale cellen, er tumorcellene selv i stand til å produsere alle vekstfaktorer som er nødvendig for deres overlevelse og proliferasjon. I tillegg til denne autokrine mekanismen viser cancerceller ofte en oppregulert ekspresjon av vekstfaktor-reseptorer på deres overflate, som fører til en økt responderbarhet overfor parakrin-virkende vekst og overlevelsesfaktorer utskilt fra celler i det omgivende vev. Ved å målsøke CERT i tumorceller, f.eks. ved å anvende sirna tilnærminger, kan det være mulig å ødelegge autokrine så vel som parakrine vekststimulerende og/eller overlevelsesmekanismer på to måter: (i) Ved å redusere vekstfaktor transport og sekresjon og(ii) ved å nedsette mengden av den tilsvarende vekstfaktor-reseptor på tumorceller. Derved vil både mengden av vekststimulerende signal og cancercellens evne til å oppfatte og respondere på disse signaler reduseres. Inhibering av CERT ekspresjon i cancerceller vil derfor representere et kraftig verktøy for å forhindre cancercelleproliferasjon og overlevelse. 3 CERT kan videre være et potent terapeutisk mål for å undertrykke tumorinvasjon og metastase. Under de siste stadier av de fleste typer av human cancer, vil primære tumorer avle pionerceller som beveger seg ut, invaderer nærliggende vev og som beveger seg til fjerne steder hvor de kan lykkes med å danne nye kolonier, kjent som metastaser. Som en forutsetning for vevsinvasjon, uttrykker cancerceller en hel samling av proteaser som gjør det mulig for dem å migrere gjennom det omkringliggende friske

13 11 vev, og krysse basalmembranen, for å nå inn i blodstrømmen og til slutt invadere destinasjonsvevet. Noen av disse proteaser er uttrykt som membranbundne proteiner, f.eks. MT-MMP er (Engeblad and Werb, 02) og ADAM er (Blobel, 0). På grunn av deres avgjørende rolle ved matriks remodellering, frigivelse av vekstfaktorer og tumorinvasjon, er proteaser selv omtalt som legemiddelmål for cancerterapi (Overall and Kleinfeld, 06). Vi har en hypotese om at inhibering av CERT ekspresjon og/eller aktivitet i tumorceller vil redusere mengden av membranbundne proteaser på overflaten av de målsøkte celler. Dette vil nedsette eller til og med svekke den invasive kapasiteten til tumorcellen så vel som dens evne til vekstfaktor frigivelse, som resulterer i nedsatt invasivitet og metastatisk potensial av tumoren. Målsøking av CERT vil således gi en ny måte å forhindre sen-stadium tumorgenese, særlig omdannelsen fra en benign/fast knute til en aggressiv, metastaserende tumor. 1 For terapeutiske anvendelser er således målet å redusere og/eller inhibere aktiviteten og/eller ekspresjonen av CERT. Dette kan oppnås ved enten en nukleotid sammensetning som anvendes som humant terapeutika for å behandle en sykdom ved å inhibere CERT funksjon hvorved legemiddelet er sammensatt av et RNAi, og sirna eller et antisense RNA som spesifikt inhiberer CERT gjennom binding av et sekvensmotiv av CERT RNA. Reduksjon/inhibering av CERT aktivitet/ekspresjon kan også oppnås ved en legemiddelsubstans som inneholder nukleotider som binder og bringer til taushet promoteren for CERT genet. 2 Videre kan en legemiddelsubstans eller produkt være sammensatt av en ny kjemisk entitet eller peptid eller protein som inhiberer CERT ekspresjon eller aktivitet. I tilfelle at et protein er den aktive farmasøytiske forbindelsen, kan den være et (i) protein som binder til CERT promoter for derved å inhibere CERT ekspresjon, (ii) protein som binder til CERT eller PKD og således forhindrer binding av PKD og CERT og hindrer CERT fosforylering ved PKD, (iii) et protein som er lignende CERT som imidlertid ikke oppfyller CERT funksjoner, som betyr en dominant-negativ CERT variant, eller (iv) et protein som virker som scaffold for både CERT og PKD, som resulterer i irreversibel binding av CERT til PKD (= et stabilt PKD/CERT kompleks) som ikke er funksjonelt på grunn av den inhiberende fosforylering av CERT ved PKD og hindringen av dissosiasjon av CERT fra nevnte kompleks. 3 Oppsummering av oppfinnelsen Den foreliggende oppfinnelse er ikke nærliggende sett ut fra den kjente teknikk. Opp til dette tidspunkt pekte de eneste eksperimentelle data tilgjengelige for proteinet CERT mot en rolle i transport av ceramid fra det endoplasmatiske retikulum til Golgi

14 12 apparatet som en sfingomyelin forløper. Kun dataene beskrevet i denne oppfinnelse fører til en ny arbeidsmodell for en rolle for CERT i protein transport fra Golgi til plasmamembranen i eukaryotiske celler. Den kjente teknikk gir ikke noe hint om muligheten for å øke grad av sekretorisk transport av proteiner i eukaryotiske cellelinjer ved å introdusere genet som koder for CERT eller et annet medlem av START domene proteinfamilien. Den overraskende og uventede arbeidsmodellen ifølge foreliggende oppfinnelse identifiserer CERT som et nytt in vivo PKD substrat og avgjørende regulator av Golgi funksjon. PKD er kjent fra teknikkens stand. Det er en familie av serin/treonin-spesifikke proteinkinaser som omfatter tre strukturelt relaterte medlemmer: PKD1/PKC, PKD2 1 og PKD3/PKC. PKD inneholder to aminoterminale sinkfingerlignede cysteinrike motiver som binder DAG, et plekstrin homologi (PH) domene som negativt regulerer PKD enzymatisk funksjon og et karboksyterminalt kinasedomene. 2 De tre PKD isoformene lokaliserer til cytosolen, kjernen, Golgi komplekset og plasmamembranen, hvorved de regulerer ulike celleprosesser, som strekker seg fra proliferasjon, differensiering, apoptose, cytoskjelett reorganisering og metastase til vesikkel trafikkering, (som omtalt i (Rykx et al., 03; Wang, 06)). Kun noen få fysiologiske PKD substrater er til nå kjent, som inkluderer neuronalt protein Kidins2, Ras effektor RIN1, histon deacetylase, E-kadherin (Inglesias et al., 00; Jaggi et al., 0; Vega et al., 04; Wang et al., 02). På TGN, er PKD kritisk involvert i fisjonen av transportbærere på vei til celleoverflaten (Liljedahl et al., 01, Yeaman et al., 04). PKD er rekruttert til TGN ved sine cysteinrike regioner (Baron and Malhotra, 02, Hausser et al., 02, Maeda et al., 01), hvor den aktiveres ved PKC -mediert fosforylering (az Anel and Malhotra, 0). 3 Nylig ble PI4KIIIã identifisert, en sentral aktør i struktur og funksjon i Golgi apparatet, som et PKD substrat på denne organell (Hausser et al., 0). PKDmediert fosforylering av PI4KIIIã i serin 294 stimulerer dets lipid kinaseaktivitet som resulterer i økt fosfatidylinositol 4-fosfat (PI(4)P) produksjon og vesikulær stomatitt virus G-protein transport til plasmamembranen (Hausser et al., 0). Protein kinase D (PKD) er blitt identifisert som en viktig regulator av sekretorisk transport i trans-golgi-nettverket (TGN). Rekruttering og aktivering av PKD ved TGN er mediert ved lipidet diacylglyserol (DAG), hvis samling derav er dannet ved

15 13 sfingomyelin syntase fra ceramid og fosfatidylcholin. Den ikke-vesikulære overføring av ceramid fra den endoplasmiske retikulum til Golgi komplekset er mediert ved lipid-overføringsproteinet CERT. Dette er f.eks. beskrevet i Hanada et al, 03, Nature Vol 426, og Hanada 06, Molecular and Cellular Biochemistry 286, så vel som i de tilsvarende patentsøknader WO og EP162. I ingen av disse dokumenter viser eller peker imidlertid Hanada mot en implikasjon av modulering av CERT ekspresjon eller aktivitet (for ikke å si andre START domene proteiner) i en fremgangsmåte for fremstilling av proteiner for diagnose, forskning eller terapeutiske formål. Videre beskriver disse dokumenter/patentsøknader ikke på noen måte bruken av et blokkerende middel som reduserer eller fullstendig blokkerer CERT ekspresjon eller aktivitet i et farmasøytisk preparat. Hanada konkluderer heller med å bruke CERT som sådan som et legemiddel for å fremme ceramid transport. 1 Den foreliggende oppfinnelse identifiserer imidlertid CERT som et nytt in vivo PKD substrat. Fosforylering på serin 132 ved PKD nedsetter affiniteten av CERT mot sitt lipidmål fosfatidylinositol 4-fosfat i Golgi membraner og reduserer ceramid overføringsaktivitet, og identifiserer PKD som regulator av lipid homeostase. Den foreliggende oppfinnelse viser også at CERT i sin tur er kritisk for PKD aktivering og protein godstransport til plasmamembran. Den gjensidige avhengigheten av PKD og CERT er således en nøkkel til å vedlikeholde Golgi membran integritet og sekretorisk transport. 2 Beskrivelse av figurene FIGUR 1: INTRACELLULÆR PRODUKTAKKUMULERING. Økning av intracellulært produkt under Fed-batch fermenteringer vist for tre prosesser. Fed-batch fermentering ble gjennomført ved å anvende tre forskjellige CHO produksjonscellekloner som uttrykker humane IgG antistoffer: Henholdsvis prosess A (sirkler), B (firkanter) og M (trekanter). Hver annen dag ble celleprøver tatt, fiksert og underkastet direkte immunfluorescens for å detektere antistoff lett-kjeden. Mengden av produkt ble målt ved FACS og plottet i forhold til mengden på dag 1. 3 FIGUR 2: START DOMENE PROTEINFAMILIEN. Fylogenetisk sammenstilling av (A) humane START domeneproteiner, (B) deres domene organisering (4 TM, fire transmembran; pre, mitokondriell presekvens; tio, acyl-coa tioesterase), og (C) deres homologer i flue og mark, (tatt fra (Soccio and Breslow, 03)).

16 14 1 FIGUR 3: CERT ER EN KRITISK REGULATOR AV GOLGI FUNKSJON OG VIRKER NEDSTRØMS FOR XBP-1 I DET SEKRETORISKE SPOR. (A) CERT og PKD er koblet i en regulatorisk feedback-sløyfe. Skjemaet oppsummerer den nåværende arbeidshypotese hvor PKD aktiveres ved DAG og fosforylerer CERT. Fosforylert CERT dissemblerer fra PI(4)P og frigir ceramid på destinasjonsstedet. Ceramid i Golgi omdannes til sfingomylein og DAG som i sin tur er nødvendig for PKD aktivering. Denne krets kan avbrytes ved mutasjon av CERT fosforyleringssetet (S132A). (B) Den skjematiske tegning viser veien til et utskilt protein fra transkripsjon og translasjon gjennom ER og Golgi avdelinger til plasmamebranen hvor proteinet til slutt frigis fra cellen inn i mediet. Pilene representerer siste tilnærminger for genmanipulering som har til formål å øke proteinproduksjon. De fleste tiltak er fokusert på transkripsjonsøkende teknologier, få på translasjonsmanipulering, og i dag har kun tre eksempler blitt rapportert som målsøker proteiner involvert i posttranslasjon prosessering innen ER (BiP, PDI og XBP-1). CERT virker nedstrøms for ER i det sekretoriske spor, og således så langt vi vet representerer dette det første mål for manipulering i senere stadier av sekresjonsprosessen. 2 FIGUR 4: CERT DETEKTERES VED ET PKD SUBSTRAT ANTISTOFF. (A) HEK293T celler ble transfektert med ekspresjonsplasmider som koder for Flagmerket CERTL og CERT. Celler ble lysert 24 timer etter transfeksjon og CERT isoformer ble immunopresipitert med anti-flag antistoff. Immunopresipiterte proteiner ble underkastet SDS-PAGE, etterfulgt av immunblotting med PKD substrat antistoff (pmotif; topp-panel) og, etter stripping, med anti-flag antistoff (bunnpanel). (B) HEK293T celler ble transfektert med Flag-CERT ekspresjonsplasmid, sammen med GFP-PKD1 K612W (PKD-KD) eller tom vektor. CERT ble analysert ved Westert blotting som beskrevet i (A). Ekspresjon av PKD-KD ble verifisert ved immunblotting med et PKD-spesifikt antistoff (C; bunnpanel). (C) COS7 celler ble kotransfektert med Flag-CERT og PKD1-GFP ekspresjonssplasmider, fiksert og farget med Flag-spesifikt antistoff (rød). Bildene som vist er stabler av flere konfokale seksjoner. Skala stolpe, m. 3 FIGUR : PKD FOSFORYLERER CERT PÅ SERIN 132. (a) Sammenstilling av peptidsekvensene anvendt for å stimulere PKD substrat antistoffet og to potensielle PKD motiver i CERT. (B) HEK293T celler ble transfektert med ekspresjonsplasmider som koder for Flagmerket CERT villtype (WT), CERT-S132A og CERT-S272A. Cellene ble lysert og CERT proteiner ble immunopresipitert og analysert ved Western blotting som beskrevet i FIGUR 4.

17 1 (C) Rekombinant GST-Flag-CERT villtype (WT) og S132A fusjonsproteiner ble inkubert i kinasebuffer inneholdende [32P]-â-ATP i fravær (-) og nærvær (+) av renset PKD1 i minutter. Proteiner ble separert ved SDS-PAGE og overført til membran. Innlemmelse av radioaktivt fosfat ble analysert ved anvendelse av en phosphoimager (topp), etterfulgt av immunblotting med Flag-spesifikt antistoff for å verifisere lik lasting av CERT proteiner. (D) Rekombinante CERT proteiner ble underkastet en in vitro kinase med renset PKD1 som beskrevet i (C) i nærvær av kald ATP. Immunblotting ble gjennomført med pmotif antistoff og etter stripping med Flag-spesifikt antistoff for å verifisere lik lastning av CERT proteiner. PKD1 og CERT proteiner er markert med piler; hvor båndene med stjerner skyldes ikke-spesifikk binding. 1 FIGUR 6: CERT FOSFORYLERING PÅ SERIN 132 MODULERER PI(4)P BINDING OG CERAMID OVERFØRINGSAKTIVITET. HEK293T celler ble transfektert med ekspresjonsplasmider som koder for GFPmerket CERT villtype (WT, SEKV ID NR:, 12) og CERT-S132A (SEKV ID NR: 14). Celler ble høstet ved hypotonisk lysering 24 timer etter transfeksjon, og cytosolfraksjonen ble utvunnet etter sentrifugering ved xg. 2 Prøver som inneholdt like mengder av GFP fluorescens ble anvendt for (A) proteinlipid overlay analyser. Cytosol fra HEK293T celler som transient uttrykker CERT variantene ble inkubert med membraner flekket med en konsentrasjonsgradient av ulike fosfoinositider og bundne CERT proteiner ble detektert via deres GFP tag. (B) Donor liposomer inneholdende TNPPE og pyren-ceramid ble blandet med et - ganger overskudd av umerkede akseptor liposomer. Etter 60 sek. ble cytosol fra celler som transient uttrykker GFP-merket CERT villtype (WT), S132A eller GFP alene (kon) tilsatt og pyren fluorescens ved 39 nm ble registrert (eksitasjon: 340 nm). Spekteret ble normalisert til maksimum fluorescens i Triton X-0 og til maksimum GFP fluorescens. 3 FIGUR 7: CERT REGULERER PKD AKTIVERING OG SEKRETORISK TRANSPORT. (A) Western Blot av helcelle lysater fra HEK293T celler transfektert med enten Flagmerket CERT villtype (SEKV ID NR:, 12) eller CERT mutanten S132A (SEKV ID NR: 14). Blottet ble probet med henholdsvis fosforspesifikt ps916 PKD antistoff (topp-panel), et PKD-spesifikt antistoff (midtpanel) og et Flag-spesifikt antistoff (bunnpanel) for å verifisere ekspresjon av de Flag-merkede CERT konstrukter. (B) Måling av HRP-aktivitet i supernatanten av HEK293T celler kotransfektert med Flag-ss-HRP og tom vektor (sorte søyler), PKD1-GFP kinase død (KD, hvite søyler), Flag-CERT villtype (WT, skyggelagte søyler) eller Flag-CERT-S132A (mørke grå).

18 16 Relative lysenheter (RLU) ble plottet ved indikerte tidspunkter etter medium forandring. Verdiene tilsvarer gjennomsnittet av prøver in triplo, feilsøyler = SEM. (C) Konfokal immunfluorescens av GFP-CERT (grønn) og cis/medial-golgi markør GS28 (rød) i COS7 celler. Bildene viser stabler av flere konfokale seksjoner. Skala søyle, m. (D) Stabler av konfokale bilder viser ko-lokaliseringen av GFP-CERT (grønn) og HRP- Flag (rød) i COS7 celler. Skala søyle, m og m (forstørrelse). 1 FIGUR 8: CERT NEDREGULERING VED RNA INTERFERENS INHIBERER SEKRETORISK TRANSPORT. (A) Kvantitativ deteksjon av HRP aktivitet i supernatanten til COS7 celler behandlet med enten mock- (hvit) lacz- (lyse grå = lacz-spesifikk sirna SEKV ID NR:9) eller CERT-spesifikke sirna olignukleotider (mørke grå = sicert nr 1 SEKV ID NR: 7 og sort = sicert nr 2 SEKV ID NR:8). De relative lysenheter (RLU) av eksperimenter in triplo er vist, feilsøyler = SEM. (B) Western Blot av cellelysatene av (A) probet med et anti-transferring reseptor antistoff. Lik lasting ble bekreftet ved anvendelse av et anti-tubulin-spesifikt antistoff. 2 FIGUR 9: KONSENSUS BETINGELSER FOR STARTDOMENET. Konsensus er gitt i forhold til antall proteiner, som passer til denne konsensussekvens og ikke i forhold til antallet aminosyrer som passer. Dette betyr at for 80 % konsensussekvens har 80 % av start domeneproteinene som er sammenlignet den gitte aminosyren i en spesiell stilling, f.eks. en hydrofob aminosyre forkortet med h. Denne konsensussekvens ble dannet ved å anvende det WEB-baserte programmet SMART (se også Ponting & Aravind, 1999, TIBS 24, pages 1 132). (A) 80 % konsensussekvens (SEKV ID NR: 28) for START domene proteiner. (B) START domene konsensussekvens er blitt avledet fra en aminosyresammenstilling av START domene proteiner. Sammenstillingen inkluderer 0 %, 6 % og 80 % konsensussekvenser. Se den etterfølgende aminosyregruppering for hjelp med hensyn til forkortelser og de tilsvarende klasser. 3 Klasse nøkkelrester alkohol o alifatisk l hvilken som helst S,T I,L,V A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

19 aromatisk a ladet c hydrofob h negativ - polar p positiv + liten s bitte liten u turnlike t 17 F,H,W,Y D,E,H,K,R A,C,F,G,H,I,K,L,M,R,T,V,W,Y D,E C,D,E,H,K,N,Q,R,S,T H,K,R A,C,D,G,N,P,S,T,V A,G,S A,C,D,E,G,H,K,N,Q,R,S,T 1 FIGUR : INTRODUKSJON AV CERT ØKER MONOKLONAL ANTISTOFFPRODUKSJON Ekspresjonskonstrukter for Mock, CERT-WT eller mutant CERT-SA ble stabilt introdusert i en CHO produksjonscellelinje som utskiller et humant monoklonalt IgG-type antistoff. Effekten av transgener på den spesifikke IgG produktiviteten i disse stabile kloner ble deretter målt (A) i seriestamkulturer og (B) under produksjonsbetingelser med porsjonsvis tilførsel som i FIGUR 11 med n=3-4 hvor hver genotype. Feilsøyler indikerer standardavvik. Et representativt resultat av tre uavhengige forsøk er vist. 2 FIGUR 11: HETEROLOG CERT ØKER HSA SEKRESJON (A) Økt titer og spesifikk produktivitet i seriekulturer. CHO celler som utskiller humant serum albumin (HSA) ble stabilt transfektert med enten et tomt plasmid ( Mock ) CERT villtype (CERT-WT) eller CERT mutant S132A (CERT-SA). Fra de resulterende stabile cellepooler (n=3 per genotype), ble titeret for HSA bestemt i løpet av 3- sekvensielle passeringer. Den spesifikke produktiviteten for HSA (sorte søyler) og titere (grå søyler) ble beregnet for hver genotype og plottet som gjennomsnittsverdier for de tre pooler. Feilsøyler representerte standardavvik. (B) og (C) celler fra (A) ble dyrket i rystekobler i 7 døgn og matet hver 24. time fra det 3. døgnet. Prøver fra cellekulturfluidet ble tatt på dag 3, og 7 og underkastet titermåling av det rekombinante HSA produktet. Spesifikke produktiviteter (B) og titer (C) ble beregnet og plottet over tiden for fermentering. De etterfølgende celler ble sammenlignet: Mock (- -), CERT-WT (- -) og CERT-SA celler (- -); feilsøyler representerer standardavvik fra tre stabile pooler per genotype. 3 FORKLARING TIL SEKVENSLISTE SEKV ID NR 1: PCR primer for human DNA CERT-S132A SEKV ID NR 2: PCR primer for human DNA CERT-S132Arev SEKV ID NR 3: PCR primer for human DNA CERT-S272A SEKV ID NR 4: PCR primer for human DNA CERT-S272Arev SEKV ID NR : PCR primer for human DNA CERT-138trunkering

20 18 1 SEKV ID NR 6: PCR primer for human DNA CERT-138trunkering rev SEKV ID NR 7: sirna/dna sicert-1 SEKV ID NR 8: sirna/dna sicert-2 SEKV ID NR 9: sirna/dna silacz SEKV ID NR : human CERT cdna SEKV ID NR 11: human CERT protein SEKV ID NR 12: human CERT L cdna SEKV ID NR 13: human CERT L protein SEKV ID NR 14: human CERT S132 cdna SEKV ID NR 1: human CERT S132A protein SEKV ID NR 16: human START domene CERT cdna SEKV ID NR 17: human START domene CERT protein SEKV ID NR 18: human START domene CERT L cdna SEKV ID NR 19: human START domene CERT L protein SEKV ID NR : human StarD4 cdna SEKV ID NR 21: human StarD4 protein SEKV ID NR 22: human StarD cdna SEKV ID NR 23: human StarD protein SEKV ID NR 24: human StarD6 cdna SEKV ID NR 2: human StarD6 protein SEKV ID NR 26: human PCTP cdna SEKV ID NR 27: human PCTP protein SEKV ID NR 28: START domene konsensus sekvens (figur 9) 2 3 DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN Posttranslasjonsmodifikasjon av proteiner ved fosforylering er en vanlig mekanisme for å indusere konformasjonsmessige forandringer som modulerer enzymatisk aktivitet, medierer protein-protein interaksjoner eller regulerer subcellulær lokalisering. PKD er en nøkkelregulator i Golgi komplekset med PI4KIII t eneste lokale substrat som er identifisert til nå. For å teste om det Golgi komplekslokaliserte CERT proteinet kan tjene som et substrat for PKD, ble det anvendt et fosfospesifikt substratantistoff, betegnet pmotif, fremkalt mot konsensus motiver fosforylert ved PKD (Doppler et al., 0). HEK293T celler ble transfektert med ekspresjonsvektorer som koder for Flag-merket CERT og CERT L. CERT isoformene ble immunopresipitert med Flag-spesifikke antistoffer og analyserte ved Western blotting med pmotif antistoffet (FIGUR 4A). Et pmotif signal som tilsvarer molekylvekten til CERT og, svakere, til den for CERT L ble detektert (FIGUR 4A). Den svake deteksjon av den fosforylerte CERT L isoformen kan være relatert til dens kjente opptreden til å danne aggregater, som kan innvirke på fosfitt tilgjengelighet overfor kinaser (Raya et al.,

21 ). For å undersøke om gjenkjenning av CERT ved pmotif antistoffet var avhengig av PKD, uttrykte man CERT sammen med en kinasedød variant av PKD1 (K621W) i HEK293T celler. Denne mutanten er blitt vist til å lokalisere til Golgi å en dominant negativ måte (Hausser et al., 0). Koekspresjon av inaktiv PKD opphevet deteksjon av CERT med pmotif antistoffet, som foreslår at pmotif signalet faktisk skyldes PKDmediert CERT fosforylering (FIGUR 4B). Lipid overføringsproteiner er ment å virke i MCS, som er dannet mellom ER og TGN (Levine and Loewen, 06), hvor PKD er lokalisert. Immunfluorescens farging av Flag-merket CERT i COS7 celler ko-uttrykte med GFP-merket PKD1 verfiserte at de to proteinene ko-lokaliserer i Golgi komplekset (FIGUR 4C). RNA interferens forsøk foreslår at samtidig knock-down av PKD1 og PKD2 var nødvendig for å redusere CERT fosforylering, som indikerer at disse to isoformer var primært ansvarlig for fosforylering av CERT, mens PKD3 synes å spille en mindre rolle (data ikke vist). Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporterte overlappende substrat spesifisiteter for PKD1 og PKD2. PKD1 og PKD2 var f.eks. bevist til å fosforylere å gjøre dette (Hausser et al., 0). 2 3 For å identifisere pmotif gjenkjenningsseter i CERT, søkte man etter potensielle PKD konsensusmotiver karakterisert ved en leucin, isoleucin eller valinrest i - og arginin i -3 stillingen i forhold til et serin eller treonin. To seriner i stilling 132 og 272, som matcher PKD konsensusmotivet og konservert over arter (FIGUR A), ble byttet med alaniner ved seterettet mutagenese. Disse mutanter ble uttrykt i HEK293T celler og testet for gjenkjenning ved pmotif antistoffet. Interessant nok avskaffet mutasjon av serin 132 til alanin deteksjon av CERT med pmotif antistoffet og bevirket en økning i elektroforetisk mobilitet, en indikasjon på tap av fosforylering, mens S272A mutasjonen ikke påvirket pmotif signalet (FIGUR B). Dette forslo at serin 132 er et PKD fosforyleringssete som er spesifikt gjenkjent ved PKD substrat antistoffet. For å bekrefte at PKD var i stand til direkte fosforylering av denne serinrest i CERT, ble det gjennomført in vitro kinaseanalyse med renset PKD1 og rekombinant CERT GST-fusjonsproteiner produsert i E. coli som omfatter de første 138 aminosyrene til proteinet. Når det trunkerte villtype CERT fusjonsproteinet ble inkubert med PKD1 i nærvær av [ - 32 P]-ATP, ble innlemmelse av radioaktivitet detektert (FIGUR C). Dette ble signifikant svekket i tilfellet av CERT-S132A fusjonsprotein. In vitro PKD fosforylering av villtype men ikke CERT- S132A er videre vist til å generere et gjenkjenningssete for pmotif antistoffet (FIGUR D). Sett under ett, beviser disse resultater at CERT er et genuint PKD substrat in vitro og in vivo og identifiserer serin 132 som et spesifikt PKD fosforyleringssete i CERT.