(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP 2492 B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. A61K 48/00 (06.01) C12N 1/113 (.01) C12N 1/86 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag.07. (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato () Prioritet , EP, (84) Utpekte stater AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK SM TR (73) Innehaver Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), 3, rue Michel-Ange, 7794 Paris Cedex 16, FR-Frankrike (72) Oppfinner CABON, Florence, 8 bis rue Louise Aglaé Cretté, F Vitry, FR-Frankrike FIRLEJ, Virginie, 41 rue Danton, F Kremlin Bicetre, FR-Frankrike GALLOU-KABANI, Catherine, 1 rue Alphonse Pécard, F Gif-sur-Yvette, FR- Frankrike PREVARSKAYA, Natalia, 72 rue Morimetz, F-9226 Rumegies, FR-Frankrike (74) Fullmektig Zacco Norway AS, Postboks 03 Vika, 012 OSLO, Norge (4) Benevnelse OLIGONUKLEOTIDER SOM INHIBERER CELLULÆR MIGRERING (6) Anførte publikasjoner WO-A1-06/0492 KAREN O YEE ET AL: "The effect of thrombospondin-1 on breast cancer metastasis" BREAST CANCER RESEARCH AND TREATMENT, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, BO, vol. 114, no. 1, 13 April 08 ( ), pages 8-96, XP ISSN: KANG JUNG-HOON ET AL: "Inhibition of trichostatin A-induced antianglogenesis by smallinterfering RNA for thrombospondin-1" EXPERIMENTAL & MOLECULAR MEDICINE, vol. 39, no. 3, June 07 (07-06), pages , XP ISSN: DE FRAIPONT FLORENCE ET AL: "Thrombospondins and tumor angiogenesis" TRENDS IN MOLECULAR MEDICINE, vol. 7, no. 9, September 01 (01-09), pages , XP ISSN:

2 OLIGONUKLEOTIDER SOM INHIBERER CELLULÆR MIGRERING 1 Den foreliggende oppfinnelsen vedrører oligonukleotider som inhiberer cellulær migrering, invasjon eller metastase. Den vedrører særlig anvendelse av dobbelttrådede oligonukleotider for produksjon av legemiddel for forebygging eller behandling av humane patologier, slik som tumorer. Formålet med oppfinnelsen er nærmere bestemt å inhibere ekspresjonen av gener, hvorav produktene deltar i utløsningen eller fastholdelsen av patologiske tilstander. 1 Oppfinnelsen vedrører også de farmasøytiske sammensetningene for inhibering av ekspresjonen av gener, hvorav produktene deltar i utløsningen eller fastholdelsen av patologiske tilstander. 2 Trombospondin -1 (TSP1) er et stort -40 kda- trimert kalsiumbindende molekyl satt sammen av flere domener (Carlson et al., 08) som binder til tallrike ligander og reseptorer, inkludert flere integriner og scavengerreseptoren CD36. TSP1, som var det første antiangiogene molekylet som ble karakterisert (Good et al., 1990), inhiberer migreringen in vitro og induserer apoptose av endotelceller (Jimenez et al., 00). TSP1-ekspresjon inhiberes i et stort antall tumorer (Ren et al., 06; Zhang and Lawler, 07), inkludert primære brysttumorer og androgenavhengige prostatatumorer, hvor det er en invers korrelering mellom TSP1-ekspresjon og blodkardensiteten (MVD) (Colombel et al., 0; Fontana et al., 0b). Det er tidligere rapportert at TSP1-ekspresjonen er høy og ikke lenger assosiert med en redusert MVD, begge i brystmetastaser (Fontana et al., 0a) og i invasive eller metastatiske prostatatumorer som blir refraktære overfor hormonal ablasjon (Colombel et al., 0). En funksjonell involvering av TSP1 i tumorutviklingen er imidlertid ikke blitt etablert. 3 Det er nå veletablert at kalsium, som binder til type III-repetisjoner av TSP1 og modifiserer dets folding og egenskaper (Adams, 04; Carlson et al., 08), regulerer prolifereringen, differensieringen og apoptosen av cancerceller (Abeele et al., 02; Lehen'Kyi et al., 07; Thebault et al., 06). De sykliske morfologiog adherensendringene observert under cellemigrering ledsages av repetitive endringer i [Ca 2+ ] i avhengig av Ca 2+ -innstrømning gjennom kanaler lokalisert på

3 2 plasmamembrankanalene. Disse kanalenes molekylære art i migrerende celler, og enda mer for metastatiske cancerceller, er fremdelens i høy grad ukjent. RNA-interferens (RNAi) er en posttranskripsjonal gensilencingmekanisme hvor introduksjonen av dobbelttrådet RNA i en celle inhiberer genekspresjon på en sekvensavhengig måte. RNAi er blitt observert i et antall organismer slik som pattedyr, bananflue, rundormer, sopp og planter, RNAi kan utløses i pattedyrceller, særlig ved introduksjon av syntetisk sirna (Carthew and Sontheimer, 09) Ett av formålene med oppfinnelsen er å tilveiebringe inhibitorer av molekyler som letter utvikling av primære tumorer, eller tumorinvasjon eller metastase. 1 Et annet formål med den foreliggende oppfinnelsen er å tilveiebringe inhibitorer av molekylene som styrer eller medierer de ovennevnte molekylenes aktivitet. Et annet formål med den foreliggende oppfinnelsen er å tilveiebringe farmasøytiske sammensetninger omfattende inhibitorene. Et annet formål med den foreliggende oppfinnelsen er å tilveiebringe farmasøytiske sammensetninger som rasjonelt inhiberer progresjon av både primære tumorer og invasive eller metastatiske tumorer. 2 Oppfinnelsen bygger på de uventede forsøksresultatene i samsvar med hvilke TSP1-ekspresjonen stimulerer migreringen av tumorcellene ut av det hypoksiske miljøet og dets inhibering således produserer antitumoreffekter. 3 I en generell utførelsesform vedrører oppfinnelsen således anvendelse av minst: - én inhibitor av proteinekspresjon, hvilken inhiberer ekspresjonen av: - TSP1-protein, eller - et protein som styrer ekspresjonen av TSP1 eller medierer aktiviteten av TSP1, eller - én inhibitor av proteinaktivitet, idet inhibitoren inhiberer aktiviteten av: - TSP1-proteinet, særlig aktiviteten som er ansvarlig for stimulering av cellemigrasjon, eller

4 3 - ett protein som styrer ekspresjonen eller medierer aktiviteten av TSP1, for produksjon av et legemiddel for forebygging eller behandling av primær tumorer, eller invasive eller metastatiske tumorer. 1 Oppfinnelsen vedører således dobbelttrådet oligonukleotid valgt fra paret (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2), paret (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22), paret (SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4) eller paret (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24), for produksjon av et legemiddel for forebygging eller behandling av primære tumorer eller invasive eller metastatiske tumorer. Tumorer avhenger av en tilstrekkelig blodtilførsel for å vokse. For fagmannen er inhiberingen av angiogenese derfor en fremgangsmåte for å inhibere tumorutvikling. Et antall antiangiogene forbindelser er blitt utviklet tidligere for å nå dette målet. Inhibering av en inhibitor av angiogenese slik som TSP1 bør tvert imot øke blodkardensiteten og forventes således å fremme tumorutvikling. Det kunne foreløpig ikke omfattes for fagmannen å inhibere ekspresjonen eller aktiviteten av TSP1-protein for å inhibere tumorutvikling. Oppfinnerne har her vist at selv om inhibering av TSP1 i tumorer øker blodkardensiteten, resulterer TSP1-inhibering i en sterk antitumoral effekt. 2 Når tumorer utvider seg, forekommer hypoksiske regioner ofte i tumorer. Hypoksi stimulerer produksjonen av angiogene faktorer slik som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), som er en sterk utløsende faktor ved angiogenese. Nye blodkar irrigerer deretter tumoren og tilveiebringer oksygen, hvilket således reduserer hypoksi. Når hypoksi reduseres, stimuleres ikke VEGF-produksjon lenger, hvilket produserer en feedbackmekanisme. Ingen slik feedbackmekanisme forekommer for å styre TSP1-produksjon i tumorer: Oppfinnerne har vist her at hypoksi induserer TSP1 som inhiberer angiogenese og således øker hypoksi. 3 Oppfinnerne har også vist her at TSP1 kan induseres av en andre mekanisme: Farmakologiske molekyler slik som kamfer eller tapsigargin som øker konsentrasjonen av cytosolisk kalsium, induserer TSP1-sekresjon og/eller - produksjon. En slik økning i kalsiumkonsentrasjon kan produseres av en deregulering av kalsiumkanaler. Oppfinnerne viser at flere kalsiumkanaler i

5 4 TRP-familien regulerer TSP1-ekspresjon. Det skal bemerkes at flere av disse kanalene ble vist å bli oppregulert i cancerceller (Prevarskaya et al., 07). Induksjoner av TSP1 ved hypoksi eller ved en modifisering av intracellulær kalsiumkonsentrasjon er to prosesser som kan forekomme uavhengig. Men noe krysstale kan forekomme mellom disse prosessene idet oppfinnerne viser at minst én av TRP-kanalene, TRPV3, oppreguleres av hypoksi. Oppfinnerne viser i tillegg at hypoksi induserer en økning i den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen. Oppfinnerne har viktig nok også vist at i prostatatumorer er TSP1 en viktig stimulator av cellemigrering in vitro og av tumorutvikling in vivo idet dens silencing i høy grad inhiberte tumorutvikling. 1 En inhibitor av proteinekspresjon betyr et biologisk molekyl, slik som et oligonukleotid eller et peptid, eller et protein, eller hvilke som helst slags organiske eller uorganiske molekyler, som inhiberer transkripsjonen av genet som koder proteinet, eller translasjonen av mrna-et av genet som koder for proteinet. Et protein som styrer ekspresjonen av TSP1, vedrører et protein som styrer transkripsjonen av TSP1-gen eller translasjonen av TSP1-gentranskript. Det er for eksempel tatt hensyn til flere ikke-spenningsavhengige kationkanaler i TRPfamilien, slik som TRPV2, TRPV3, TRPV6, TRPM8 i illustrasjonen av den foreliggende oppfinnelsen. 2 Et protein som medierer aktiviteten av TSP 1, betyr et protein, slik som reseptorene av TSP1-protein, som kunne mediere den biologiske aktiviteten av TSP1-protein. Det er for eksempel tatt hensyn til reseptorene CD36- og B3- integrin i illustrasjonen av den foreliggende oppfinnelsen. En inhibitor av proteinaktivitet betyr et biologisk molekyl, slik som et oligonukleotid, eller et peptid, eller et protein, eller hvilke som helst andre slags organiske eller uorganiske molekyler som inhiberer den biologiske aktiviteten av proteinet i in vivo- eller in vitro-tester. 3 Stimuleringen av cellemigrering betyr en situasjon hvor prosentandelen av migrerende celler i den behandlede gruppen er statistisk høyere enn i kontrollgruppen.

6 Cellemigreringsevnen kan måles in vitro ved anvendelse av et modifisert Boydenkammer. Boyden-kammeret består av to rom atskilt av en gjennomtrengelig membran. Celler plasseres i det øvre kammeret og de kjemotaktiske faktorene i det nedre kammeret. Celler som migrerer gjennom membranen, telles. Et detaljert migreringsassay gis under Eksempel. En primær tumor betyr en tumor som vokser på det anatomiske stedet hvor tumorprogresjon begynte og fortsatte for å gi en cancerøs masse. 1 En invasiv tumor betyr en cancer som har brutt gjennom sin opprinnelige begrensende membran, slik som prostataens kapsel. Denne canceren sprer seg utenfor vevet hvor den opprinnelig utvikler seg og vokser inn i nærliggende, friske vev. «Invasiv» antyder ikke at canceren allerede har spredt seg utenfor prostataen. «Invasiv» har samme betydning som infiltrerende. En metastatisk tumor vedrører en cancer som har spredt seg fra sitt opprinnelige sted til ett eller flere ytterligere kroppssteder. I en annen utførelsesform inhiberer proteinekspresjonens inhibitor ekspresjonen av proteiner valgt fra gruppen omfattende TSP1, TRPV2, TRPV3, TRPV6, TRPM8, CD36 eller B3-integrin. 2 TRPV2, TRPV3, TRPV6, TRPM8 tilhører ikke-spenningsavhengige kationkanaler i TRP-familien. Disse proteinene styrer ekspresjonen av TSP1-protein. CD36 og B3-integrin er reseptorer av TSP1. Det er kjent at TSP1 binder til et antall reseptorer (Roberts, 08). Disse reseptorene kan mediere aktiviteten av TSP1-protein. 3 I en annen utførelsesform inhiberer proteinekspresjonens inhibitor in vivo- og in vitro-ekspresjonen av proteiner valgt fra gruppen omfattende TSP1, TRPV2, TRPV3, CD36 eller B3-integrin. In vivo-tester involverer levende dyr, inkludert mennesker, mus og rotter. I den foreliggende oppfinnelsen kan in vivo-inhiberingen av proteinekspresjon måles ved

7 6 veksten og volumet av tumoralt vev som xenograftes inn i nakne mus. Reduksjonen av volumet av et tumoralt vev etter injeksjon av proteinekspresjonens inhibitor, eller proteinaktivitetens inhibitor, betyr in vivo-inhibering av proteinekspresjonen. In vitro-tester betyr for eksempel anvendelse av celler i kultur, eller sanntids- RT-PCT osv., for å måle inhiberingen av proteinekspresjon. I en annen utførelsesform inhiberer proteinekspresjonens inhibitor in vivoekspresjonen av proteiner valgt fra gruppen omfattende TSP1, TRPV2, TRPV3. I en annen utførelsesform er proteinekspresjonens inhibitor et dobbelttrådet oligonukleotid eller et enkelttrådet oligonukleotid. 1 Betegnelsen «oligonukleotid» betyr et polynukleotid fra 2 til 0, og nærmere bestemt fra til 0, og foretrukket 13 til 2 nukleotider, og særlig 19,, 21 oligonukleotider, av typen ribonukleotider, deoksyribonukleotider eller blandingen av dem. Et dobbelttrådet oligonukleotid kan bety et sirna. Et enkelttrådet oligonukleotid kan bety et microrna eller hvilket som helst antisens-enkelttrådet oligonukleotid som anvendes for å inhibere ekspresjonen av målgen. 2 Anvendelsen av et dobbelttrådet oligonukleotid er mer rasjonelt enn andre tidligere anti-rna-strategier slik som ribozym eller enkelttrådet antisensdeoksynukleotider fordi det spalter sitt mål-mrna gjentatte ganger. Et dobbelttrådet oligonukleotid er videre mer stabilt enn et enkelttrådet oligonukleotid. 3 Det er beskrevet at proteinekspresjonens inhibitor er: - et dobbelttrådet oligonukleotid bestående av to oligonukleotidsekvenser, (a) og (b), som danner et hybrid, - hvori oligonukleotidsekvensen (a) - enten er komplementær til oligonukleotidsekvensen (b), - eller presenterer mindre enn 40 % uoverensstemmelse med oligonukleotidsekvensen (b), og

8 7 - hvori oligonukleotidsekvensen (a) - enten er komplimentær til en målsekvens som tilhører RNA- eller DNAmolekylet som koder for ett av proteinene definert ovenfor, idet ekspresjonen av dette skal inhiberes, - eller presenterer mindre enn 40 % uoverensstemmelser med en målsekvens som tilhører RNA-e eller DNA-molekylet som koder for ett av proteinene definert ovenfor, hvorav ekspresjonen skal inhiberes, - eller et fragment av de ovenfor definerte dobbelttrådede oligonukleotidene (a) og (b), bestående av to komplementære fragmenter av de respektive ovenfor definerte oligonukleotidsekvensene (a) og (b), forutsatt at fragmentet fastholder egenskapen med å inhibere ekspresjonen av det ene av proteinene definert ovenfor. 1 Oligonukleotidsekvensen (a) er foretrukket komplementær til oligonukleotidsekvensen (b), men kan omfatte 1 8 uoverensstemmelser, særlig, nærmere bestemt 3 uoverensstemmelser, enda nærmere bestemt 1 uoverensstemmelse med oligonukleotidsekvensen (b). Oligonukleotidsekvensen (a) er foretrukket komplementær til målsekvensen, men kan omfatte 1 8 uoverensstemmelser, særlig, nærmere bestemt 3 uoverensstemmelser, enda nærmere bestemt 1 uoverensstemmelse med målsekvensen; denne anvendelsen er særlig når målsekvensens lengde er 21 nukleotider. 2 3 Det er beskrevet at proteinekspresjonens inhibitor er: - et dobbelttrådet oligonukleotid bestående av to oligonukleotidsekvenser, (a) og (b), som danner en hybrid, hvori hver oligonukleotidsekvens i én av sine 3'- eller '-ender omfatter ett til fem uparede nukleotider som danner enkelttrådede ender som løper forbi hybriden, hvori delen inne i oligonukleotidsekvensens (a) hybrid - enten er komplementær til oligonukleotidsekvensen (b), - eller presenterer mindre enn 40 % uoverensstemmelser med oligonukleotidsekvensen (b), og hvori oligonukleotidsekvensen (a) - enten er komplimentær til en målsekvens som tilhører RNA- eller DNAmolekylet som koder for ett av proteinene definert ovenfor, hvorav ekspresjonen skal inhiberes,

9 8 - eller presenterer mindre enn 40 % uoverensstemmelser med en målsekvens som tilhører RNA eller DNA-molekylet som koder for ett av proteinene definert ovenfor, hvorav ekspresjonen skal inhiberes, - eller et fragment av de ovenfor definerte dobbelttrådede oligonukleotidene (a) og (b), bestående av to komplementære fragmenter av de respektive ovenfor definerte oligonukleotidsekvensene (a) og (b), forutsatt at fragmentet fastholder egenskapen med å inhibere ekspresjonen av det ene av proteinene definert ovenfor. Oligonukleotidsekvensen (a) er foretrukket komplementær til oligonukleotidsekvensen (b), men kan omfatte 1 8 uoverensstemmelser, særlig, nærmere bestemt 3 uoverensstemmelser, enda nærmere bestemt 1 uoverensstemmelse med oligonukleotidsekvensen (b). 1 Oligonukleotidsekvensen (a) er foretrukket komplementær til målsekvensen, men kan omfatte 1 8 uoverensstemmelser, særlig, nærmere bestemt 3 uoverensstemmelser, enda nærmere bestemt 1 uoverensstemmelse med målsekvensen; denne anvendelsen er særlig når målsekvensens lengde er 21 nukleotider. I en fordelaktig utførelsesform omfatter oligonukleotidsekvensen komplementær til målsekvensen fra 1 til 2 nukleotider. 2 Oligonukleotidsekvensen komplementær til målsekvensen er en antisens-tråd, og hvori den andre oligonukleotidsekvensen komplementær til den første sekvensen er en sens-tråd. 3 Arten av nukleotidene omfattet i oligonukleotidsekvensen ifølge den foreliggende oppfinnelsen er ribonukleotid, deoksyribonukleotid eller begge deler. Nukleotidene omfattet i oligonukleotidsekvensen ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være naturlige nukleotider (A, T, G, C, U), eller kjemisk modifiserte nukleotider, eller en blanding av dem, særlig kjemisk modifiserte nukleotider omfattende en reaktiv gruppe, eller et bindingsmiddel, slik som - metylcytidin, xantinosinpseudouridin, dihydrouridin, inosin, ribotymidin, 7- metylguanosin eller låste nukleinsyrer (LNA).

10 9 Oligonukleotidsekvensen som er komplementær til målsekvensen, også konstruert av antisens-tråden, omfatter foretrukket i det vesentlige naturlige ribonukleotider, og sens-tråden kan omfatte ribonukleotider, deoksyribonukleotider eller begge deler. Den ovennevnte definisjonen vedrører også de nærmere beskrevne farmasøytiske sammensetningene og oligonukleotidsekvensene. I en fordelaktig utførelsesform omfatter det dobbelttrådede oligonukleotidet i 3'-enden av hver av de to oligonukleotidsekvensene 1 til nukleotider, foretrukket 2 til 3 nukleotider, som løper forbi hybriden. 1 I en mer fordelaktig illustrasjon av den foreliggende oppfinnelsen er nukleotidene som løper forbi hybriden, deoksytymidiner. I en særlig illustrasjon av den foreliggende oppfinnelsen inhiberes ekspresjonen av målsekvensen representert av SEQ ID NO: 41 (TSP1) av det dobbelttrådede oligonukleotidet beskrevet i den foreliggende oppfinnelsen. I en annen særlig illustrasjon av den foreliggende oppfinnelsen inhiberes ekspresjonen av målsekvensen representert av SEQ ID NO: 42 (TRPV3) av det dobbelttrådede oligonukleotidet ifølge de foreliggende kravene. 2 I en annen særlig utførelsesform er det dobbelttrådede oligonukleotidet valgt fra ett av de følgende parene bestående av (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2);(SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4); (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22); (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24); Tabell 1 gir listen over sekvensene av dobbelttrådet oligonukleotid beskrevet i den foreliggende patentsøknaden. Genet som målrettes hos mennesker av hver tilhørende sekvens av dobbelttrådede oligonukleotider, er gitt i den første kolonnen i tabellen. For TSP1, TRPV3, TRPM8 vises 4 forskjellige par av oligonukleotider, og to for CD36, integrin B3, TRPV2, TRPV6. 3 Tabell 1

11 Oligonukleotidets mål Med dtdt Uten dt dt TSP1 SEQ ID NO 1: CCUUGACAACAACGUGGUGdTdT SEQ ID NO 21: CCUUGACAACAACGUGGUG Sekvens TSP1a, kryssart SEQ ID NO 2: CACCACGUUGUUGUCAAGGdTdT SEQ ID NO 22: CACCACGUUGUUGUCAAGG TSP1 SEQ ID NO 3: UACCCGAGACGAUUGUAUGdTdT SEQ ID NO 23: UACCCGAGACGAUUGUAUG Sekvens TSP1b SEQ ID NO 4: CAUACAAUCGUCUCGGGUAdTdT SEQ ID NO 24: CAUACAAUCGUCUCGGGUA TRPV3 SEQ ID NO : CAAGGAGAGCGAACGCAUCdTdT SEQ ID NO 2: CAAGGAGAGCGAACGCAUC Sekvens TRPV3a SEQ ID NO 6: GAUGCGUUCGCUCUCCUUGdTdT SEQ ID NO 26: GAUGCGUUCGCUCUCCUUG TRPV3 SEQ ID NO 7: AUGUACAGCGUCAUGAUCCdTdT SEQ ID NO 27: AUGUACAGCGUCAUGAUCC Sekvens TRPV3b, kryssart SEQ ID NO 8: GGAUCAUGACGCUGUACAUdTdT SEQ ID NO 28: GGAUCAUGACGCUGUACAU TRPM8 SEQ ID NO 9: UCUCUGAGCGCACUAUUCAdTdT SEQ ID NO 29: UCUCUGAGCGCACUAUUCA Sekvens TRPM8a SEQ ID NO : UGAAUAGUGCGCUCAGAGAdTdT SEQ ID NO : UGAAUAGUGCGCUCAGAGA TRPM8 SEQ ID NO 11: UAUUCCGUUCGGUCAUCUAdTdT SEQ ID NO 31: UAUUCCGUUCGGUCAUCUA Sekvens TRPM8b SEQ ID NO 12: UAGAUGACCGAACGGAAUAdTdT SEQ ID NO 32: UAGAUGACCGAACGGAAUA CD36 SEQ ID NO 13: UACAGACAGUUUUGGAUCUdTdT SEQ ID NO 33: UACAGACAGUUUUGGAUCU

12 11 Oligonukleotidets mål Med dtdt Uten dt dt SEQ ID NO 14: AGAUCCAAAACUGUCUGUAdTdT SEQ ID NO 34: AGAUCCAAAACUGUCUGUA integrin B3 SEQ ID NO 1: GGAGAAUCUGCUGAAGGAUdTdT SEQ ID NO 3: GGAGAAUCUGCUGAAGGAU SEQ ID NO 16: AUCCUUCAGCAGAUUCUCCdTdT SEQ ID NO 36: AUCCUUCAGCAGAUUCUCC TRPV2 SEQ ID NO 17: UAAGAGUCAACCUCAACUAdTdT SEQ ID NO 37: UAAGAGUCAACCUCAACUA SEQ ID NO 18: UAGUUGAGGUUGACUCUUAdTdT SEQ ID NO 38: UAGUUGAGGUUGACUCUUA TRPV6 SEQ ID NO 19: GGAAGACAGGCAAGAUCUCdTdT SEQ ID NO 39: GGAAGACAGGCAAGAUCUC SEQ ID NO : GAGAUCUUGCCUGUCUUCCdTdT SEQ ID NO 40: GAGAUCUUGCCUGUCUUCC Oligonukleotidsekvensene beskrevet i den foreliggende patentsøknaden nummerert fra 1 til omfatter i 3'-enden av hver av de to oligonukleotidsekvensene to deoksytymidiner som løper forbi hybriden. Oligonukleotidsekvensene nummerert fra 21 til 40 omfatter ikke noe nukleotid som løper forbi hybriden; den første oligonukleotidsekvensen (antisens-tråden) og den andre oligonukleotidsekvensen (sens-tråden) har den samme lengden, i tabell 1. TSP1-ekspresjonen hos mennesker kan inhiberes ved anvendelse av enten én av de følgende fire forskjellige dobbelttrådede oligonukleotidene som målretter TSP1 mrna: - det dobbeltrådede oligonukleotidet bestående av SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO:2, som målretter den porsjonen av TSP1 mrna som betegnes TSP1a i tabell 1

13 eller det dobbeltrådede oligonukleotidet bestående i SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22, som målretter den porsjonen av TSP1 mrna som betegnes TSP1a i tabell 1 - eller det dobbeltrådede oligonukleotidet bestående i SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4, som målretter den porsjonen av TSP1 mrna som betegnes TSP1b i tabell 1 - eller det dobbeltrådede oligonukleotidet bestående i SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24, som målretter den porsjonen av TSP1 mrna som betegnes TSP1b i tabell 1. Idet sekvensen som betegnes TSP1a i tabell 1, er fullstendig konservert mellom flere pattedyr, særlig mellom mennesker og mus, kan det dobbelttrådede oligonukleotidet bestående av SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2, eller det dobbelttrådede oligonukleotidet bestående av SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22 anvendes for å inhibere TSP1-ekspresjon hos mennesker, men også hos andre pattedyr. 2 Det er beskrevet at TRPV3-ekspresjonen hos mennesker kan inhiberes ved anvendelse av enten én av de følgende fire forskjellige dobbelttrådede oligonukleotidene som målretter TRPV3 mrna-et: - det dobbeltrådede oligonukleotidet bestående av SEQ ID NO: og SEQ ID NO: 6, som målretter den porsjonen av TRPV3 mrna som betegnes TRPV3a i tabell 1 - eller det dobbeltrådede oligonukleotidet bestående i SEQ ID NO: 2 og SEQ ID NO: 26, som målretter den porsjonen av TRPV3 mrna som betegnes TRPV3a i tabell 1 - eller det dobbeltrådede oligonukleotidet bestående i SEQ ID NO: 7 og SEQ ID NO: 8, som målretter den porsjonen av TRPV3 mrna som betegnes TRPV3b i tabell 1 - eller det dobbeltrådede oligonukleotidet bestående i SEQ ID NO: 27 og SEQ ID NO: 28, som målretter den porsjonen av TRPV3 mrna som betegnes TRPV3b i tabell 1 3 Idet sekvensen som betegnes TRPV3b i tabell 1, er fullstendig konservert mellom flere pattedyr, særlig mellom mennesker, idet det dobbelttrådede oligonukleotidet består av SEQ ID NO: 7 og SEQ ID NO: 8, eller det dobbelttrådede oligonukleotidet

14 13 bestående av SEQ ID NO: 27 og SEQ ID NO: 28 kan anvendes for å inhibere TRPV3-ekspresjon hos mennesker, men også hos andre pattedyr. Et dobbelttrådet oligonukleotid som ikke gjenkjenner noe mammalsk mrna som foreløpig er kjent, anvendes som kontroll i noen in vitro- og in vivo-forsøk. Dette dobbelttrådede oligonukleotidet består av det følgende paret av sekvenser: Tråd 1: '-GAUAGCAAUGACGAAUGCGUAdTdT-3' Tråd 2: '-UACGCAUUCGUCAUUGCUAUCdTdT-3' Det skal bemerkes at andre kontroller kan substitueres, og in vivo-injeksjon av vehikkelen (PBS) anvendes også som kontroll. 1 I en fordelaktig utførelsesform er det dobbelttrådede oligonukleotidet valgt fra de følgende parene bestående av (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2); (SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4); (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22); (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24). 2 For å utvikle et oligonukleotid som et terapeutisk legemiddel som inhiberer et gitt mrna hos mennesker, er det særlig fordelaktig at det dobbelttrådede oligonukleotidet målretter en sekvens som er fullstendig konservert mellom mennesker og mus. Denne egenskapen tillater evaluering av oligonukleotidets effekt og toksisitet i prekliniske modeller før dets administrering til mennesker. I en særlig fordelaktig utførelsesform er det dobbelttrådede oligonukleotidet valgt fra de følgende parene bestående av (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2); (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22). I en annen utførelsesform illustreres oppfinnelsen av anvendelsen av et produkt inneholdende eller bestående av: - minst et dobbelttrådet oligonukleotid definert ovenfor, - minst et antiangiogent middel, for produksjon av et kombinasjonsprodukt for en samtidig, separat eller periodisk anvendelse for forebygging eller behandling av primære tumorer eller invasive eller metastatiske tumorer. 3 I en annen utførelsesform vedrører oppfinnelsen et produkt inneholdende eller bestående av:

15 14 - minst et dobbelttrådet oligonukleotid valgt fra paret (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2), paret (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22), paret (SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4) eller paret (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24), - minst et antiangiogent middel og/eller et antitumoralt middel, for produksjon av et kombinasjonsprodukt for en samtidig, separat eller periodisk anvendelse for forebygging eller behandling av primære tumorer eller invasive eller metastatiske tumorer. 1 I en annen utførelsesform illustreres oppfinnelsen av et produkt inneholdende eller bestående av: - minst et dobbelttrådet oligonukleotid definert ovenfor, - minst et antitumoralt middel, for produksjon av et kombinasjonsprodukt for en samtidig, separat eller periodisk anvendelse for forebygging eller behandling av primære tumorer eller invasive eller metastatiske tumorer. 2 I en annen utførelsesform illustreres oppfinnelsen av anvendelsen av et produkt inneholdende eller bestående av: - minst et dobbelttrådet oligonukleotid definert ovenfor, - minst et antiangiogent middel, - minst et antitumoralt middel, for produksjon av et kombinasjonsprodukt for en samtidig, separat eller periodisk anvendelse for forebygging eller behandling av primære tumorer eller invasive eller metastatiske tumorer. I en fordelaktig utførelsesform kombineres legemiddelet med en antitumoral terapi, slik som radioterapi eller kjemoterapi. 3 I en annen utførelsesform vedrører oppfinnelsen: - et dobbelttrådet oligonukleotid valgt fra paret (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2), paret (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22), paret (SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4) eller paret (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24), - eller et produkt som inneholder eller består av: - minst et dobbelttrådet oligonukleotid valgt fra paret (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2), paret (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22), paret (SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4) eller paret (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24), - minst et antiangiogent middel og/eller et antitumoralt middel,

16 1 hvori legemiddelet kombineres med en antitumoral terapi, slik som radioterapi eller kjemoterapi. I en fordelaktig utførelsesform er det antiangiogene middelet valgt fra gruppen omfattende cilengitid, vandetanib, lenalidomid, talidomid, arsenikk, bevacizumab, anti-vegfr-1, anti-vegfr-2, anti-pdgfr, anti-fms-flt-3, anti-tk1. 1 I en fordelaktig utførelsesform er det antitumorale middelet valgt fra gruppen omfattende alkylerende middel, slik som bendamustin, temozolomid, mekloretamin, syklofosfamid, karmustin, cisplatin, busulfan, tiotepa eller dekarbazin, antimetabolittmiddel, slik som pentostatin, metotreksat, pemetreksed, floksuridin, fluorouracil, cytarain, merkaptopurin eller tiguanin, cytotoksiske antibiotika slik som rubitekan, mitomycin C, daunorubicin, doksorubicin, bleomycin, plicamycin, mitoksantron HCl eller oksaliplatin, plantederivater, slik som vinorelbin, BMS , vinkristinsulfat, vinblastin, docetakseltaksol. I en annen fordelaktig utførelsesform er den invasive eller metastatiske tumoren en fast tumor eller en lymfoproliferativ tumor. 2 I en mer fordelaktig utførelsesform er den faste tumoren en prostatatumor, en levertumor, hepatiske adenomer, fokal nodulær hyperplasi, en hjernetumor slik som gliom, en brysttumor, en nyretumor, en lungetumor slik som ikkesmåcellet lungekarsinom, småcellet lungekarsinom, pleuropulmonalt blastom og karsinoid tumor, en bentumor slik som osteom, osteokondrom, aneurysmal bencyste og fibrøs dysplasi, osteosarkom, kondrosarkom, Ewings sarkom, malignt fibrøst histiocytom, fibrosarkom, en magecancer, en tykktarmstumor, en tynntarmstumor, en spiserørstumor, en bukspyttkjerteltumor, et sarkom, en halstumor, en galleblæretumor, et melanom. I en annen mer fordelaktig utførelsesform er lymfoproliferativ tumor leukemi, lymfom eller et multippelt myelom. 3 I en annen utførelsesform vedrører den foreliggende oppfinnelsen: - et dobbelttrådet oligonukleotid valgt fra paret (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2), paret (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22), paret (SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4) eller paret (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24), - eller et produkt som inneholder eller består av:

17 minst et dobbelttrådet oligonukleotid valgt fra paret (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2), paret (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22), paret (SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4) eller paret (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24), - minst et antiangiogent middel og/eller et antitumoralt middel, hvori den primære tumoren eller den invasive eller metastatiske tumoren er en fast tumor eller en lymfoproliferativ tumor, hvori den faste tumoren er prostatatumor, en levertumor, hepatiske adenomer, fokal nodulær hyperplasi, en hjernetumor slik som gliom, en brysttumor, en nyretumor, en lungetumor slik som ikke-småcellet lungekarsinom, småcellet lungekarsinom, pleuropulmonalt blastom og karsinoid tumor, en bentumor slik som osteom, osteokondrom, aneurysmal bencyste og fibrøs dysplasi, osteosarkom, kondrosarkom, Ewings sarkom, malignt fibrøst histiocytom, fibrosarkom, en magecancer, en tykktarmstumor, en tynntarmstumor, en spiserørstumor, en bukspyttkjerteltumor, et sarkom, en halstumor, en galleblæretumor, et melanom, og hvori den lymfoproliferative tumoren er leukemi, lymfom eller et multippelt myelom. Det er beskrevet at proteinaktivitetens inhibitor kan være et antistoff mot TSP1- protein eller ett protein som styrer ekspresjonen eller medierer aktiviteten av TSP1, slik som for eksempel TRPV2, TRPV3, TRPV6, TRPM8, CD36, B3-integrin. I et annet trekk vedrører oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning. 2 3 Det er beskrevet at den farmasøytiske sammensetningen omfatter som aktivt stoff minst - én inhibitor av proteinekspresjon, hvilken inhiberer ekspresjonen av: - TSP1-protein, eller - et protein som styrer ekspresjonen av TSP1 eller medierer aktiviteten av TSP1, eller - én inhibitor av proteinaktivitet, idet inhibitoren inhiberer aktiviteten av: - TSP1-proteinet, særlig aktiviteten som er ansvarlig for stimulering av cellemigrasjon, eller - ett protein som styrer ekspresjonen eller medierer aktiviteten av TSP1, i assosiasjon med en farmasøytisk akseptabel vehikkel.

18 17 I en fordelaktig utførelsesform inhiberer proteinekspresjonens inhibitor ekspresjonen av proteiner valgt fra gruppen omfattende TSP1, TRPV2, TRPV3, TRPV6, TRPM8, CD36 eller B3-integrin. Det er beskrevet at proteinekspresjonens inhibitor inhiberer ekspresjonen av proteiner valgt fra gruppen omfattende TSP1, TRPV2, TRPV3, CD36 eller B3- integrin. Det er beskrevet at proteinekspresjonens inhibitor inhiberer ekspresjonene av proteiner valgt fra gruppene omfattende TSP1, TRPV2, TRPV3. Det er beskrevet at proteinekspresjonens inhibitor er et dobbelttrådet oligonukleotid eller et enkelttrådet oligonukleotid Det er beskrevet at inhibitoren av proteinekspresjonen i den farmasøytiske sammensetningen er: - et dobbelttrådet oligonukleotid bestående av to oligonukleotidsekvenser, (a) og (b), som danner en hybrid, - hvori oligonukleotidsekvensen (a) - enten er komplementær til oligonukleotidsekvensen (b), - eller presenterer mindre enn 40 % uoverensstemmelse med oligonukleotidsekvensen (b), og - hvori oligonukleotidsekvensen (a) - enten er komplimentær til en målsekvens som tilhører RNA- eller DNAmolekylet som koder for ett av proteinene definert ovenfor, idet ekspresjonen av dette skal inhiberes, - eller presenterer mindre enn 40 % uoverensstemmelser med en målsekvens som tilhører RNA- eller DNA-molekylet som koder for ett av proteinene definert ovenfor, hvorav ekspresjonen skal inhiberes, - eller et fragment av de ovenfor definerte dobbelttrådede oligonukleotidene (a) og (b), bestående av to komplementære fragmenter av de respektive ovenfor definerte oligonukleotidsekvensene (a) og (b), forutsatt at fragmentet fastholder egenskapen med å inhibere ekspresjonen av det ene av proteinene definert ovenfor. Oligonukleotidsekvensen (a) er foretrukket komplementær til oligonukleotidsekvensen (b), men kan omfatte 1 8 uoverensstemmelser,

19 18 særlig, nærmere bestemt 3 uoverensstemmelser, enda nærmere bestemt 1 uoverensstemmelse med oligonukleotidsekvensen (b). Oligonukleotidsekvensen (a) er foretrukket komplementær til målsekvensen, men kan omfatte 1 8 uoverensstemmelser, særlig, nærmere bestemt 3 uoverensstemmelser, enda nærmere bestemt 1 uoverensstemmelse med målsekvensen; denne anvendelsen er særlig når målsekvensens lengde er 21 nukleotider. 1 2 Det er beskrevet at inhibitoren av proteinekspresjonen i den farmasøytiske sammensetningen er: - et dobbelttrådet oligonukleotid bestående av to oligonukleotidsekvenser, (a) og (b), som danner en hybrid, hvori hver oligonukleotidsekvens i én av sine 3'- eller '-ender omfatter ett til fem uparede nukleotider som danner enkelttrådede ender som løper forbi hybriden, hvori delen inne i oligonukleotidsekvensens (a) hybrid - enten er komplementær til oligonukleotidsekvensen (b), - eller presenterer mindre enn 40 % uoverensstemmelse med oligonukleotidsekvensen (b), og - hvori oligonukleotidsekvensen (a) - enten er komplimentær til en målsekvens som tilhører RNA- eller DNAmolekylet som koder for ett av proteinene definert ovenfor, hvorav ekspresjonen skal inhiberes, - eller presenterer mindre enn 40 % uoverensstemmelser med en målsekvens som tilhører RNA- eller DNA-molekylet som koder for ett av proteinene definert ovenfor, hvorav ekspresjonen skal inhiberes, - eller et fragment av de ovenfor definerte dobbelttrådede oligonukleotidene (a) og (b), bestående av to komplementære fragmenter av de respektive ovenfor definerte oligonukleotidsekvensene (a) og (b), forutsatt at fragmentet fastholder egenskapen med å inhibere ekspresjonen av det ene av proteinene definert ovenfor. 3 Oligonukleotidsekvensen (a) er foretrukket komplementær til oligonukleotidsekvensen (b), men kan omfatte 1 8 uoverensstemmelser, særlig, nærmere bestemt 3 uoverensstemmelser, enda nærmere bestemt 1 uoverensstemmelse med oligonukleotidsekvensen (b).

20 19 Oligonukleotidsekvensen (a) er foretrukket komplementær til målsekvensen, men kan omfatte 1 8 uoverensstemmelser, særlig, nærmere bestemt 3 uoverensstemmelser, enda nærmere bestemt 1 uoverensstemmelse med målsekvensen; denne anvendelsen er særlig når målsekvensens lengde er 21 nukleotider. I de farmasøytiske sammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatter oligonukleotidsekvensen komplementær til målsekvensen fra 1 til 2 nukleotider. I en fordelaktig utførelsesform omfatter det dobbelttrådede oligonukleotidet i 3'-enden av hver av de to oligonukleotidsekvensene 1 til nukleotider, foretrukket 2 til 3 nukleotider, som løper forbi hybriden. 1 Nukleotidene som løper forbi hydriden, kan være komplementære eller ikke til målsekvensen. Nukleotidene som løper forbi hydriden, kan være et hvilket som helst nøytralt nukleotid. I en mer fordelaktig utførelsesform er nukleotidene som løper forbi hybriden, deoksytymidiner. 2 I en særlig illustrasjon av den foreliggende oppfinnelsen inhiberes ekspresjonen av målsekvensen representert av SEQ ID NO: 41 (TSP1) av det dobbelttrådede oligonukleotidet ifølge den foreliggende patentsøknaden. I en annen særlig utførelsesform omfatter den farmasøytiske sammensetningen som aktivt stoff det dobbelttrådede oligonukleotidet valgt fra de følgende parene bestående av (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2);(SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4); (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22); (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24). 3 I en annen utførelsesform omfatter den farmasøytiske sammensetningen ifølge den foreliggende oppfinnelsen som aktivt stoff minst et dobbelttrådet oligonukleotid valgt fra de følgende parene bestående av (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2); (SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4); (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22); (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24) i assosiasjon med en farmasøytisk akseptabel vehikkel.

21 I en fordelaktig utførelsesform er den farmasøytisk akseptable vehikkelen en saltløsning. I en annen fordelaktig utførelsesform er det dobbelttrådede oligonukleotidet anvendt i den farmasøytiske sammensetningen ifølge den foreliggende oppfinnelsen koblet med kolesterol eller stoffer som muliggjør penetrering av det dobbelttrådede oligonukleotidet i cellene. I en annen mer fordelaktig utførelsesform er stoffene som muliggjør penetrering av det dobbelttrådede oligonukleotidet inn i cellene, for eksempel liposomer, lipidbaserte middel, nanopartikler, magnetiske sfærer eller polyetyleneiminderivater. 1 I en fordelaktig utførelsesform formuleres det aktive stoffet for administrering ved en dose i området fra 0,0 til 0 mg/kg, særlig 0, 1 til mg/kg. Det aktive stoffet omfattende det dobbelttrådede oligonukleotidet kan administreres ved en modifisert, men tilstrekkelig dose ifølge administreringsmåten eller det aktive stoffets form. I en fordelaktig utførelsesform er det aktive stoffet formulert for én av de følgende administreringene: intravenøs, intraperitoneal, subkutan, intramuskulær, nasal instillering, sublingval, intrarektal, direkte injeksjon i tumoren, topisk eller oral. 2 Oligonukleotidene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan enten transfekteres i celler som deretter injiseres i vevene, eller injiseres direkte i vevene ved for eksempel lokal eller systemisk vei eller aerosolvei. 3 I en fordelaktig illustrasjon av den foreliggende oppfinnelsen omfatter den farmasøytiske sammensetningen som aktivt stoff et produkt inneholdende eller bestående av: - minst et dobbelttrådet oligonukleotid definert ovenfor og anført i kravene ifølge den foreliggende oppfinnelsen - minst et antiangiogent middel, som kombinasjonsprodukt for en samtidig, separat eller periodisk anvendelse.

22 21 I en foretrukket utførelsesform omfatter den farmasøytiske sammensetningen som aktivt stoff et produkt inneholdende eller bestående av: - minst et dobbelttrådet oligonukleotid definert ovenfor og anført i kravene ifølge den foreliggende oppfinnelsen - minst et antitumoralt middel, som kombinasjonsprodukt for en samtidig, separat eller periodisk anvendelse. 1 I en foretrukket illustrasjon av den foreliggende oppfinnelsen omfatter den farmasøytiske sammensetningen som aktivt stoff et produkt inneholdende eller bestående av: - minst et dobbelttrådet oligonukleotid definert ovenfor og anført i kravene ifølge den foreliggende oppfinnelsen - minst et antiangiogent middel, - minst et antitumoralt middel, som kombinasjonsprodukt for en samtidig, separat eller periodisk anvendelse. 2 3 I en annen utførelsesform vedrører den foreliggende oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning omfattende som aktivt stoff et produkt inneholdende eller bestående av: - minst et dobbelttrådet oligonukleotid valgt fra paret (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2), paret (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22), paret (SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4) eller paret (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24), - minst et antiangiogent middel og/eller et antitumoralt middel, som kombinasjonsprodukt for en samtidig, separat eller periodisk anvendelse. Det antiangiogene middelet i den farmasøytiske sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan velges fra gruppen omfattende cilengitid, vandetanib, lenalidomid, talidomid, arsenikk, bevacizumab, anti-vegfr-1, anti-vegfr-2, anti-pdgfr, anti-fms-flt-3, anti-tk1. Det antitumorale middelet i den farmasøytiske sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan velges fra gruppen omfattende alkylerende middel, slik som bendamustin, temozolomid, mekloretamin, syklofosfamid, karmustin, cisplatin, busulfan, tiotepa eller dekarbazin, antimetabolittmiddel, slik som pentostatin, metotreksat, pemetreksed, floksuridin, fluorouracil, cytarain, merkaptopurin eller tiguanin, cytotoksiske antibiotika slik som rubitekan, mitomycin C, daunorubicin, doksorubicin, bleomycin, plicamycin, mitoksantron HCl eller

23 22 oksaliplatin, plantederivater, slik som vinorelbin, BMS , vinkristinsulfat, vinblastin, docetakseltaksol. I en annen utførelsesform vedrører oppfinnelsen oligonukleotidsekvensen valgt fra de følgende sekvensene: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24. I en annen utførelsesform vedrører oppfinnelsen dobbelttrådede oligonukleotider valgt fra de følgende parene bestående av (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2); (SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4); (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22); (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24). BESKRIVELSE AV FIGURENE 1 Figur 1A representerer TSP1 mrna-nivå i androgenavhengige (LNCaP), kastreringsresistente (C4-2 og 22RV1) eller androgenuavhengige (PC3) prostatatumorceller. Resultatene (gjennomsnitt ± SEM, n>3) normaliseres til syklofilin A mrna-nivået og uttrykkes i vilkårlige enheter (LNCaP satt til 1). Figur 1B representerer tilhørende TSP1-proteinnivå i androgenavhengige (LNCaP), kastreringsresistente (C4-2 og 22RV1) eller androgenuavhengige (PC3) prostatatumorceller. Tubulin ble anvendt som lastekontroll. 2 Figur 1C representerer TSP1 mrna-nivå i C4-2-celler 48 h etter transfeksjon med to forskjellige sirna-er som målretter TSP1 mrna. Resultatene, normalisert til syklofilin A mrna-nivået i de samme cellene, uttrykkes som vilkårlig enhet, gjennomsnitt ± SEM av 3 uavhengige forsøk. Figur 1D representerer TSP1-ekspresjonen, visualisert ved indirekte immunfluorescens i C4-2-celler 48 h etter transfeksjon med TSP1a- eller TSP1b-siRNA. 3 Figur 1E representerer den metabolske aktiviteten av C4-2-celler etter transfeksjon av TSP1a- eller TSP1b-siRNA.

24 23 Figur 1F representerer den enzymatiske aktiviteten av kaspasene 3 og 7 målt 48 h etter transfeksjon av C4-2-celler med TSP1a- eller TSP1b-siRNA. Resultatene er ikke statistisk forskjellige mellom kontroll og TSP1-siRNA-transfekterte celler. Figur 1 G representerer migreringsevnen mot ferskt kulturmedium av C4-2 (svarte stolper) eller PC3-celler (grå stolper) transfektert med de indiserte sirna-ene. To dager etter transfeksjon ble celler utsådd i den øvre delen av Boyden-kammeret, og antall celler som hadde migrert mot ferskt medium, ble talt 18 h senere. Resultatet uttrykkes som prosentandelen av migrerende celler sammenlignet med celler som migrerer under kontrollbetingelsen (gjennomsnitt ± SEM, n=3). Forsøket ble gjentatt 3 ganger med sammenlignbare resultater. 1 Figur 1H representerer migreringsevnen hos LNCaP mot kondisjonert medium fra LNCaP- eller C4-2-celler. LNCaP- (svarte stolper) eller C4-2-celler (grå stolper) ble plassert i den nedre delen av Boyden-kamrene. 2 dager senere ble LNCaP-celler utsådd i det øvre kammeret, og antall migrerende celler ble talt 18 h senere. Resultatene uttrykkes som i G. Figur 1I representerer TSP1-ekspresjon, målt ved Western blotting, i cellulære homogenater og i det kondisjonerte mediet av JT8-celler dyrket i 2 dager i nærvær (dox+) eller fravær (dox-) av doksysyklin. JT8-celler er fibrosarkomceller stabilt transfektert med et tet-repressibelt plasmid som koder for TSP1. 2 Figur 1J representerer migreringen av C4-2-celler mot mediet kondisjonert av TSP1-indusible JT8-celler dyrket i nærvær av doksysyklin for å undertrykke TSP1-ekspresjon eller i fravær av doksysyklin for å indusere TSP1. Resultatene uttrykkes som i G. Figur 1K representerer migreringsevnen hos C4-2-celler transfektert med de indiserte sirna-ene. To dager etter transfeksjon ble celler plassert i den øvre delen av Boyden-kammeret, og antall celler som hadde migrert mot ferskt medium, ble talt 2 dager senere. Resultater uttrykkes som i figur 1C. 3 Figur 1L representerer migreringsevnen hos C4-2 mot C4-2-kondisjonert medium i fravær eller nærvær av et antistoff som inhiberer bindingen av TSP1 til CD36. C4-2-celler ble plassert i den nedre delen av Boyden-kamre. 2 dager senere ble C4-2-celler plassert i det øvre kammeret i kontrollmediet eller i

25 24 medium inneholdende 1 µg/ml TSP1-antistoff Ab1 (klon A4.1 fra neomarkører, Thermo Scientific, Fremont, Ca, USA). Når TSP1-Ab1-antistoffet ble tilsatt i det øvre kammeret, ble det også tilsatt ved den samme konsentrasjonen i det nedre kammeret. Etter en 18 h inkubering ble migrerende celler talt. Figur 2A representerer TSP1-ekspresjon i C4-2-celler behandlet i 2 h med vehikkel (t.v.) eller tapsigargin (1 µm) (t.h.). TSP1-ekspresjon visualiseres ved indirekte immunfluorescens. Figur 2B representerer TSP1-sekresjon i cellekulturmediet ved C4-2-celler behandlet i 2 h med vehikkel (t.v.) eller tapsigargin (1 µm) (t.h.). Det sekreterte TSP1 måles ved hjelp av Western blotting i cellekulturmediet. 1 Figur 2C representerer TSP1-ekspresjon i C4-2-celler behandlet i 2 h med kamfer ved de indiserte dosene. TSP1-ekspresjon visualiseres ved indirekte immunfluorescens. Figur 2D representerer TSP1-sekresjon i cellekulturmediet ved C4-2-celler behandlet i 2 h med vehikkel eller kamfer ved de indiserte dosene. Det sekreterte TSP1 måles ved hjelp av Western blotting i cellekulturmediet. 2 Figur 2E representerer TSP1 mrna-nivå i C4-2-celler etter 6 h behandling med kamfer ved de indiserte dosene (gjennomsnitt ± SEM, n=3). mrna-nivået normaliseres til syklofilin A. Figur 2F viser TRPV3 (svarte stolper) og TRPM8 (grå stolper) mrna-nivåer målt i de indiserte prostatatumorcellelinjer. Resultatene (gjennomsnitt ± SEM, n>3) normaliseres til syklofilin A mrna-nivå og uttrykkes i vilkårlige enheter. Figur 2G representerer detekteringen ved Western blotting av TRPV3-protein i indiserte prostatacellelinjer. Tubulin ble anvendt som lastekontroll. 3 Figur 2H representerer TSP1- og TRPV3-ekspresjon i C4-2-celler 48 h etter transfeksjon av TRPV3a sirna.

26 2 Figur 2I representerer TSP1 mrna-nivået av C4-2-celler transfektert av de indiserte sirna-ene. Resultatene, normalisert til syklofilin A mrna-nivå, måles 2 dager etter transfeksjon (gjennomsnitt ± SEM, n>3). Figur 2J representerer migreringsevnen mot ferskt kulturmedium hos C4-2- celler transfektert med de indiserte sirna-ene. Celler ble utsådd i det øvre kammeret 2 dager etter transfeksjon, og antallet celler som hadde migrert, ble talt 18 h senere. Resultatet uttrykkes som prosentandelen av migrerende celler sammenlignet med celler som migrerer i kontrolltilstanden (gjennomsnitt ± SEM, n=3). Forsøket ble gjentatt 3 ganger med sammenlignbare resultater. 1 Figur 3A representerer effektene av TRPM8- og TRPV3-silencing på C4-2- celleproliferering. C4-2-celler ble transfektert med de indiserte sirna-ene. Deres proliferering måles av et metabolsk assay (gjennomsnitt ± SEM, n=3, representativt for 3 separate forsøk). Figur 3B representerer effektene av TRPV3-silencing på migreringen av C4-2 (svarte stolper) eller PC3-celler (grå stolper). Celler ble transfektert av kontroll, eller 2 forskjellige TRPV3 sirna-er som indisert og et migreringsassay utført som i fig. 1G. Figur 3C representerer migreringsevnen hos C4-2-celler transfektert 2 dager før med et kontroll- eller TRPC4- eller TRPC6-siRNA. 2 Figur 3D representerer Western blotting-detektering av TSP1 i kulturmediet av C4-2-celler transfektert med kontroll- eller TSP1-siRNA 48 h etter transfeksjon. 3 Figur 3E representerer effektene av TSP1 på C4-2-cellers migreringsevne. C4-2-celler plassert i den nedre delen av et Boyden-kammer ble transfektert av enten kontroll- (notert C) eller TSP1-siRNA (TSP). Samme dag ble en separat batch med celler transfektert av enten kontroll-, TSP1- eller TRPV3-siRNA (TRP). Tre dager senere ble disse sistnevnte cellene trypsinisert og utsådd inn i den øvre delen av Boyden-kammeret som indisert. Migrering ble kvantifisert 18 h senere, og resultatene ble uttrykt som en prosentandel av celler som migrerer under kontrollbetingelsen (celler transfektert med et kontroll-sirna i den øvre og nedre delen) (gjennomsnitt ± SEM, n = 3).

27 26 Figur 4A representerer TRPV3 (lysegrå stolper) og TSP1 mrna-nivåer (mørkegrå stolper) målt i C4-2-celler inkubert i normoksi eller i nærvær av koblotklorid 0 µm for å etterligne hypoksi. mrna-nivåer kvantifiseres og normaliseres til syklofilin A. Resultatene uttrykkes som forholdet mellom mrna-nivåer i hypoksi og dem i normoksi satt til 1. Resultatene fra 2 uavhengige forsøk vises. 1 Figur 4B representerer intracellulær kalsiumkonsentrasjon i C4-2-celler dyrket under kontrollbetingelser (cont) eller i nærvær av 0 µm CoCl 2 i minutter eller 48 timer (gjennomsnitt ± SEM, n > 1 celler per betingelse). Figur 4C representerer VEGF- og TSP1 mrna-nivåer i C4-2-celler inkubert i % (normoksi) eller 1 % oksygen (hypoksi) i opptil 72 h. Lysegrå stolper representerer VEGF i normoksi; mørkegrå stolper representerer VEGF i hypoksi; hvite stolper representerer TSP1 i normoksi; svarte stolper representerer TSP1 i hypoksi. Resultatene normaliseres til syklofilin A mrnanivået og uttrykkes i vilkårlige enheter, T0 satt til 1. Figur 4D representerer VEGF- og TSP1-proteininnhold i C4-2-cellehomogenater målt ved ELISA og normalisert til totalt proteininnhold. Lysegrå stolper representerer VEGF i normoksi; mørkegrå stolper representerer fargekode som i C. 2 Figur 4E representerer VEGF- og TSP1-proteininnhold i C4-2- cellekulturmedium, målt ved ELISA og normalisert til totalt proteininnhold i cellehomogenater. Fargekode som i C. Fig. 4F representerer TSP1-, Hif1 alfa- og TRPV3-proteininnhold i C4-2- cellehomogenater i celler dyrket for de indiserte periodene i normoksi (N) eller hypoksi (H). Tubulin ble anvendt som lastekontroll. Fig. 4G representerer induksjonen av VEGF (grå) og TSP1 (svart) mrna-nivåer normalisert til syklofilin A-nivåer i PC3-celler dyrket for de indiserte periodene i koboltklorid sammenlignet med de respektive mrna-nivåene i kontrollmediet på samme tidspunkt. 3 Figur 4H representerer TSP1-immundetektering i PC3-celler dyrket i 48 h under kontrollbetingelser (N) eller i nærvær av 0 µm CoCl2 for å etterligne hypoksi (H).

28 27 Figur A representerer tumorvolum hos mus som bærer eksponensielt voksende C4-2-tumorer. Mus ble behandlet daglig med i.p.-injeksjoner av PBS (trekanter), kontroll- (svarte firkanter) TRPV3- (lysegrå diamanter) eller TSP1-siRNA (mørkegrå diamanter). Alle sirna-er ble fortynnet (1 µg/kg) i PBS. Tumorvolum uttrykkes i cm 3 (gjennomsnitt ± SEM, 6 mus per gruppe). Figur B representerer tumorvolum hos mus som bærer eksponensielt voksende PC3-tumorer. Mus ble behandlet daglig med i.p.-injeksjoner av kontroll- (svarte firkanter) TRPV3- (lysegrå diamanter) eller TSP1-siRNA (mørkegrå diamanter). Alle sirna-er ble fortynnet (1 µg/kg) i PBS. Tumorvolum uttrykkes i cm 3 (gjennomsnitt ± SEM, 6 mus per gruppe). 1 Figur C representerer TRPV3 og TSP1 mrna-nivåer, normalisert til syklofilin A og uttrykt i vilkårlige enheter, i PC3-tumorer samlet inn i slutten av forsøket vist i figur B. TSP1 mrna-nivået ble plottet mot TRPV3 mrna-nivået i den samme tumoren fra mus behandlet med kontroll-sirna (svarte firkanter), TRPV3-siRNA (grå diamanter) eller TSP1-siRNA (hvit sirkler). Figur D representerer TSP1 mrna-nivået, normalisert til syklofilin A mrna-nivå, i tumorer samlet inn i slutten av forsøk vist i fig. A (C4-2, diamanter) og B (PC3, trekanter). Tumorer ble behandlet med kontroll-sirna (svarte symboler), eller TRPV3-siRNA (lysegrå symboler) eller TSP1-siRNA (mørkegrå symboler). 2 Figur E representerer TRPV3 mrna-nivået, normalisert til syklofilin A mrnanivået, i tumorer samlet inn i slutten av forsøk vist i fig. 4A (C4-2, diamanter) og 4B (PC3, trekanter). Tumorer ble behandlet med kontroll-sirna (svarte symboler), eller TRPV3-siRNA (lysegrå symboler) eller TSP1-siRNA (mørkegrå symboler). Figur F representerer kvantifiseringen av mikrokardensitet (MVD) på varme punkter med vaskularisering fra C4-2 (grå stolper)- eller PC3 (svarte tolper)- tumorer samlet inn i slutten av forsøket beskrevet i figur A og figur B. 3 Figur G representerer VEGF mrna-nivået, normalisert til syklofilin A mrna-nivået, i tumorer samlet inn i slutten av forsøk vist i fig. 4A (C4-2, diamanter) og 4B (PC3, trekanter). Tumorer ble behandlet med kontroll-sirna (svarte symboler), eller TRPV3-siRNA (lysegrå symboler) eller TSP1-siRNA (mørkegrå symboler).

29 28 Figur H representerer mrna-nivå av de indiserte genene hos avlivede nakne mus timer etter en i.p.-injeksjon av PBS (svarte stolper), eller 4000 µg/kg av enten poly(i:c), en kjent ligand av TLR3 (mørkegrå stolper), eller TRPV3bsiRNA (lysegrå stolper) eller TSP1a-siRNA (hvite stolper), alle fortynnet i PBS. mrna-nivået av de indiserte genene, normalisert til syklofilin A, ble kvantifisert ved sanntids-rt-pcr i milten. Resultatene (gjennomsnitt ± SEM, n=4) uttrykkes i vilkårlige enheter, normalisert til verdien i PBS-kontroller satt i 1. 1 Figur 6A representerer TSP1 mrna-nivå, normalisert til aktin-mrna, i peritumorale (N) og tumorale (T) vev fra fryste prøver av radikal prostatektomi i forskjellige kliniske stadier (pt2, pt3a, pt3b/pt4) tatt før eventuell annen behandling. Hvert kassediagram er sammensatt av tre horisontale linjer som viser 2-, 0- (median) og 7-prosentilene. De høyeste og laveste verdiene vises ved hjelp av feilstolper. P-verdi vises når den er relevant. Figur 6B representerer sammenligningen av TSP1 mrna-nivå, normalisert til aktin-mrna, i prøver fra pasienter som ikke viser tegn på tumorrekurrens under minst måneder etter kirurgi (n = 8), eller som opplevde PSAtilbakefall (n = 11) etter kirurgi. Eksempel De følgende eksemplene er blitt utført ifølge forsøksprosedyrene beskrevet heri nedenfor. 2 Reagenser og sirna-er Kamfer og tapsigargin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, Frankrike). TSP1-antistoffer (Ab1, Ab-4 og Ab-11) var fra Neomarkers (Thermo Scientific, Fremont, Ca, USA), TRPV3-antistoffer fra TEBU (Le Perray en Yvelines, Frankrike) og Tubulin fra Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, Frankrike). Alexa- Fluor-anti-kanin 488 fra geit og Alexa-Fluor-anti-mus 68 fra geit ble kjøpt fra Molecular Probes. SiRNA-er ble kjøpt av Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, Frankrike). De anvendte sekvensene er angitt i den supplerende tabellen 1. 3 Cellelinjer Cellelinjen LNCaP er en human androgenavhengig prostatacellelinje. Den uttrykker den androgene reseptoren og avhenger av androgen for å vokse.

30 29 Cellelinjene C4-2 og 22RV1 er humane kastreringsresistente prostatatumorcellelinjer. De uttrykker den androgene reseptoren, men avhenger ikke lenger av androgener for å vokse. Cellelinjen PC3 er en human androgenuavhengig prostatacellelinje. PC3-celler uttrykker ikke lenger den androgene reseptoren. 1 Cellekultur og -transfeksjon LNCaP- og C4-2-celler ble dyrket i RMPI inneholdende % kalvefosterserum, PC-3-celler i DMEM inneholdende % kalvefosterserum. Hiperfect-reagenset (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike) ble anvendt for å transfektere celler i 24- brønners plater med de indiserte sirna-ene ( nm) som anbefalt av produsenten. Et assay for metabolsk aktivitet (WST1, Roche Diagnostics, Meylan, Frankrike) ble anvendt for å måle celleproliferering. For å etterligne hypoksi ble cellene dyrket i nærvær av 0 µm koboltklorid i 48 h. For hypoksiske tilstander ble celler dyrket ved 37 C med % CO2, 94 % N2 og 1 % 02 i en hypoksisk inkubator (Binder GmbH, Tuttligen, Frankrike). 2 3 Migreringsassay Migreringsevnen ble målt ved anvendelse av et modifisert Boyden-kammer. Celler (40 000) ble utsådd i RPMI 1 % FBS i den øvre delen av et cellekulturkammerinnskudds-system atskilt fra det nedre kammeret av en 8 µm PETmembran (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Frankrike). RPMI % FBS, eller kondisjonert medium ble tilsatt i den nedre rommet. Atten timer senere ble ikkemigrerende celler i det øvre rommet skrapet av med en vattpinne. Celler på den nedre siden av membranen ble fiksert med metanol ved - C og farget med Hoechst 3328 (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Frankrike). Membraner ble deretter eksidert og montert på en glasside med Glycergel (DAKO), og cellene ble talt. RT-PCR-siRNA- og mrna-analyse i sanntid Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av TRIzol-reagens (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrike). RNA ble retrotranskribert ved anvendelse av et høykapasitets cdna Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Frankrike). cdna ble kvantifisert ved sanntids-pcr ved anvendelse av Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems,

31 Courtaboeuf, Frankrike). Human syklofilin A ble anvendt som intern kontroll. Sekvensene av PCR-primerne er angitt i den supplerende tabellen 2. ELISA TSP1- og VEGF-proteininnhold i cellehomogenater og supernatant ble målt ved ELISA (quantikine, R&D, Lille, Frankrike). 1 Kalsiumavbildning Fluorescensavbildning ble utført i Hanks balanserte saltløsning (HBSS) inneholdende 142 mm NaCl,,6 mm KCl, 1 mm MgCl 2, 2 mm CaCl 2, 0,34 mm Na 2 HPO 4, 0,44 mm KH 2 PO4, mm HEPES og,6 mm glukose. Konsentrasjonen av cytosolisk kalsium ble målt ved anvendelse av Fura-2-lastede celler (2 µm) som tidligere beskrevet (Mariot et al., 02). Den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen ble avledet fra forholdet av fluorescensintensiteter for hver av magnetiseringsbølgelengdene (F340/F380) og fra Grynkiewicz-ligningen (Grynkiewicz et al., 198). 2 3 Dyr, sirna-injeksjon og tumorigenisitetsassayer Studier som involverer dyr, inkludert husvære og stell, eutanasimetode og forsøksprotokoller, ble utført i samsvar med den lokale dyreetiske komiteen i Institut André Lwoff i Villejuif i Frankrike. Tumorceller (2 6 celler/mus) ble injisert subkutant i 0 % (v:v) matrigel (BD biosciences, Le Pont de Claix, Frankrike) til 6 8 uker gamle nakne hannmus og målt hver dag. Når tumorer vokser eksponensielt, ble sirna fortynnet i PBS injisert i.p. på en daglig basis (1 µg/kg). Tumorvolum ble estimert ved anvendelse av formelen: lengde bredde 2 x 0,. Individer Prostatavevsprøver ble oppnådd fra 14 pasienter som undergikk radikal prostatektomi ved Centre Hospitalier Lyon Sud (Lyon, Frankrike) og 12 fra Cochin Hospital (Paris, Frankrike). Skriftlig samtykke ble innhentet fra hver pasient. Umiddelbart etter prostatafjerning ble små biter av vev grovt dissekert av patologen, hurtigfryst og lagret i flytende nitrogen inntil analyse i tumorbanker ved Centre hospitalier Lyon Sud og ved groupe hospitalier Cochin- Saint Vincent de Paul. Histologisk analyse av en fryst seksjon ble utført for hver prøve av samme patolog før RNA-ekstraksjon. Fragmentene fullstendig bestående av cancerøse kjertler ble valgt og kalt «tumor»-prøver, mens de som ikke inneholdt cancerøst vev, ble valgt og kalt «peritumoralt vev».

32 31 1 Eksempel 1: TSP1-ekspresjon økes i hormonrefraktære cancerprostataceller TSP1-promoteren metyleres i den androgenavhengige prostatacellelinjen LNCaP (Li et al., 1999), og TSP1 mrna- og proteinnivåene er følgelig svært lave i disse cellene (fig. 1A og fig. 1B). En vedvarende TSP1-ekspresjon ble interessant nok funnet i C4-2-celler, hvilket ble etablert fra LNCaP-tumorer som vendte tilbake hos mus etter kastrering (Thalmann et al., 1994). TSP1 ble også funnet uttrykt ved mrna (fig. 1A)- og protein (fig. 1B)-nivåene, i den kastreringsresistente prostatatumorcellelinjen R22RV1 (Sramkoski et al., 1999) og i den androgenuavhengige cellelinjen PC3. For å studere funksjonen til TSP1 i prostatakarsinomceller ble et første sirna konstruert for å målrette en sekvens som er fullstendig konservert mellom de murine og humane sekvensene (TSPla-siRNA) og en andre ble konstruert for spesifikt å målrette det humane mrna (TSP1b-siRNA). I C4-2-celler silencet de to sirna-ene TSP1- ekspresjon over 70 % ved mrna- (fig. 1C) og proteinnivået (fig. 1D), uten effekt på celleproliferering (fig. 1E) eller apoptose (fig. 1F). 2 Eksempel 2: TSP1 stimulerer migreringen av prostatatumorceller. Boyden-kamre ble anvendt for å studere en potensiell rolle hos TSP1 ved migreringen av prostatatumorceller. TSP1-silencing inhiberte i høy grad migreringen av C4-2-celler (fig. 1G). Denne effekten var ikke avhengig av ekspresjonen av den androgene reseptoren fordi migreringen av PC3-celler også ble sterkt påvirket av TSP1-silencing (fig. 1G). Migreringen av LNCaP-celler, som ikke uttrykker TSP1, ble motsatt stimulert når celler migrerte mot kondisjonert medium av C4-2-celler (fig. 1H). For ytterligere å etablere rollen til TSP1 ved migrering av prostatatumorceller, en cellelinje, ble det anvendt JT8, hvor produksjonen av TSP1 er under kontroll av en tetrasyklinrepressibel promoter (Filleur et al., 01). Kondisjonert medium av JT8-celler ble fremstilt i nærvær av doksysyklin for å undertrykke TSP1-ekspresjon, eller i dets fravær for å indusere TSP1-ekspresjon (fig. 1I). Migreringen av C4-2- celler mot disse to mediene ble deretter målt. Nærværet av TSP1 økte i høy grad cellenes evne til å migrere (fig. 1J). 3 Aktiviteten av TSP1 medieres av flere slags reseptorer, særlig integriner omfattende underenhetene β1 eller β3, og CD36-reseptoren. Binding av TSP1 til CD36 er vist å mediere de antiangiogene effektene av TSP1. I den foreliggende oppfinnelsen ble spesifikke sirna-er konstruert for å målrette henholdsvis CD36-, β1- og β3- integriner. Silencing av β1 hadde ingen effekt på C4-2-cellers migreringsegenskaper (fig. 1K). Silencing av CD36 eller β3 reduserte til sammenligning i høy grad C4-2-

33 32 migreringen i Boyden-assayet (fig. 1K). TSP1-antistoffer som inhiberer dets binding til CD36-reseptoren (TSP1 Ab1, klon A4.1), svekket i tillegg migreringen av C4-2- celler (fig. 1L), hvilket viser at bindingen av TSP1 til CD36 medierer de antiangiogene effektene av TSP1 og dets evne til å indusere migrering. De ovennevnte resultatene viser at TSP1 uttrykkes ved langt høyere nivåer (mrna og protein) i C4-2-, 22RV1- og PC3-celler enn i LNCaP-celler. Transfeksjon av C4-2-celler med nm TSP1a-siRNA eller TSP1b-siRNA reduserer vesentlig TSP1 mrna-nivået (fig. 1C) og proteinnivået (fig. 1D), uten at det påvirker celleproliferering (figur 1E). 1 2 Eksempel 3: TSP1-ekspresjon og -sekresjon reguleres av kalsium i prostatatumorceller. TSP1 inneholder et kalsiumbindingsdomene, og kalsium påvirker TSP1-folding (Adams, 04). Spørsmålet er hvorvidt en økning i konsentrasjonen av cytosolisk kalsium i prostatatumorceller kunne regulere TSP1-ekspresjon og/eller sekresjon. For dette formålet ble C4-2-celler behandlet med tapsigargin, en inhibitor av SERCA-pumpe, som øker den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen (Ca ++ i). En 2 h behandling med tapsigargin resulterte i en hurtig deplesjon av TSP1 fra cytosolet (fig. 2A) og sekresjon til kulturmediet (fig. 2B). Kalsiumkanalene TRPV2 (Monet et al., ), TRPV6 (Fixemer et al., 03), TRPM8 (fig. 2J) og TRPV3 (fig. 2F og 2G) uttrykkes i prostatatumorceller. Kamfer er en veletablert agonist for TRPV3-kanal (Moqrich et al., 0; Vogt-Eisele et al., 07) og stimulerte likeledes TSP1- sekresjon (fig. 2C og 2D). En 6 h behandling med kamfer induserte i tillegg en doseavhengig økning i TSP1 mrna-nivå (figur 2E). Disse resultatene etablerer at kalsium regulerer både TSP1 mrna-nivå og sekresjon i prostatatumorceller. 3 Eksempel 4: Ekspresjon av TRP-kanaler og regulering av TSP1 i prostatatumorceller. Ekspresjonen av to TRP-kanaler, TRPM8 og TRPV3 ble analysert i prostatacellelinjer. TRPM8 ble uttrykt i LNCaP- og C4-2-celler, men var udetekterbart i 22RV1 og ved et svært lavt nivå bare i PC3-celler (fig. 2F). TRPV3 ble til sammenligning uttrykt i alle disse 4 prostatacellelinjer (fig. 2F), inkludert de androgenuavhengige PC3-cellene. TRPV3 mrna-et ble oppregulert i den kasteringsresistente cellelinjen C4-2 sammenlignet med den parentale androgenavhengige cellelinjen LNCaP. Resultatene ifølge oppfinnelsen viser imidlertid klart at ved proteinnivået uttrykkes TRPV3 i høy grad i LNCaP-celler

34 33 (fig. 2G). Det ble deretter analysert hvorvidt ekspresjonen av TRP-kanaler kunne regulere TSP1-ekspresjon. Silencing av TRPV3 reduserte TSP1- proteinekspresjon (fig. 2H). Minst 4 kanaler i TRP-familien, TRPV2, TRPV3, TRPV6 og TRPM8, stimulerer TSP1, idet deres silencing resulterte i et redusert TSP1 mrna-nivå (fig. 2I). TRPC4 og TRPC6 undertrykket til sammenligning TSP1, og deres silencing økte mrna-nivået i C4-2-celler (fig. 2I, 2J). TRPC1, TRPC3 eller ORAI hadde ingen vesentlig effekt på TSP1-ekspresjon (fig. 2I). 1 Eksempel : TRPV3-kanalen er involvert i styringen av prostatacancercellemigrering For å ivareta den mulige rollen hos TRP-kalsiumkanaler ved migrering ble fokus rettet mot TRPV3 idet denne kanalen er vel uttrykt i prostatakarsinomceller, uavhengig av deres avhengighet av androgener, og fordi TRPV3-silencing, i motsetning til TRPM8, ikke påvirker celleproliferering (fig. 3A), en fenotype som kunne forvrenge tolkningen av migreringsassayer. TRPV3-silencing utløste en massiv inhibering av cellemigrering i C4-2- og PC3-celler (fig. 3B). sirna-er som målrettet TRPC4 eller TRPC6, stimulerte til sammenligning C4-2- cellemigrering (fig. 3C). Sammen antyder disse resultatene i høy grad at effektene av TRP-kanaler på migrering kunne medieres av TSP1. 2 Eksempel 6: Effektene av TRPV3 på cellemigrering medieres av TSP1 For ytterligere å studere de respektive rollene til TSP1 og TRPV3 i cellemigrering ble C4-2-celler plassert i den nedre delen av Boyden-kamre transfektert med enten kontroll- eller TSP1-siRNA-er. Tre dager senere ble TSP1-konsentrasjonen markant redusert i det kondisjonerte mediet av TSP1-siRNA-transfekterte celler (fig. 3D). Vi tilsatte deretter i den øvre delen av kamrene C4-2-celler transfektert 3 dager tidligere med kontroll-, TSP1- eller TRPV3-siRNA-er. Sammenlignet med kontrollbetingelser (celler transfektert av kontroll-sirna-er i de øvre og nedre kamrene) reduserte silencing av TSP1 samtidig i de to rommene migrering med 70 % (fig. 3E). Når TSP1 ble silencet i et enkelt rom, enten øvre eller nedre, ble migreringsevnen interessant nok bare delvis redusert, hvilket viser at migreringseffekten medieres av det sekreterte proteinet (fig. 3E). 3 Silencing av TRPV3 i det øvre rommet undertrykte drastisk migreringen av C4-2-celler som migrerer mot et medium depletert i TSP1. Men viktig nok ble denne inhiberingen fullstendig opphevet når TSP1 var til stede i den nedre delen av Boyden-kamrene (fig. 3E). Dette resultatet viser at TRPV3- stimuleringen av cellemigrering medieres av det sekreterte TSP1.

35 34 Eksempel 7: Hypoksi induserer ekspresjonen av TRPV3 og TSP1 og øker [Ca ++ ] i Resistens overfor hypoksiske tilstander er et vanlig trekk ved fremskredne tumorer. TSP1- og TRPV3 mrna-nivåene, og den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen, ble analysert i C4-2-celler under hypoksiske tilstander. En 48 h behandling med 0 µm koboltklorid, som induserer stabiliseringen av Hif1a- og Hif2a-proteiner (Yuan et al., 03) og etterligner effektene av hypoksi, induserte i høy grad TRPV3 og TSP1 mrna-nivåene (fig. 4A). Den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen ble målt i C4-2-celler dyrket under kontrollbetingelser eller i nærvær av koboltklorid. Hvilenivået, som ikke ble modifisert etter min, ble økt over to ganger i celler inkubert i 48 h i nærvær av koboltklorid (fig. 4B). 1 2 TSP1 induseres av hypoksi i humane fibroblaster og vaskulære glattmuskulaturceller (Distler et al., 07; Favier et al., 0; Mayuko Osada- Oka, 08). For å analysere hvorvidt dette også var tilfelle i prostatatumorceller, ble C4-2-celler dyrket i 1 % eller % oksygen, og VEGF- og TSP1-ekspresjon ble sammenlignet på forskjellige tidspunkter opp til 72 h. En tidsavhengig økning av både VEGF og TSP1 mrna ble observert i hypoksi ved mrna- (fig. 4C) og proteinnivået (fig. 4D). Så snart som 2 h etter eksponering for hypoksi ble sekresjonen av TSP1-protein indusert (fig. 4E). TRPV3 og Hif1-alfa-proteiner ble også indusert av hypoksi på en tidsavhengig måte (fig. 4F). Eksponering av PC3- celler for CoCl2, som etterligner effektene av hypoksi, induserte likeledes TSP1- ekspresjoner ved mrna- (fig. 4G) og proteinnivåene (fig. 4H). 3 Eksempel 8: In vivo-silencing av TRPV3 eller TSP1 inhiberer veksten av kastreringsresistente eller androgenuavhengige prostatatumorer. In vitro-dataene ifølge oppfinnelsen etablerer at migreringen av C4-2- eller PC3- celler blir svært svekket av TRPV3- eller TSP1-silencing, uten at det påvirker celleproliferering eller -overlevelse. For å ivareta rollen til TSP1 og TRPV3 in vivo ble C4-2-celler xenograftet inn i nakne mus. Straks tumorer vokste eksponensielt, ble mus randomisert for behandling og mottok daglig enten PBS i.p.-injeksjoner eller 1 µg/kg av hvert kontroll-, TSP1- eller TRPV3-siRNA fortynnet i PBS og injisert i.p. Veksten av tumorer hos mus behandlet med TSP1- eller TRPV3-siRNA ble vesentlig inhibert (fig. A). Både TRPV3- og TSP1-siRNAer inhiberte likeledes veksten av xenograftede PC3-tumorer (fig. B).

36 3 I kontroll-pc3-tumorer samlet inn i slutten av forsøket vist i fig. B ble det observert en høy grad av korrelering (r 2 = 0,83) mellom TRPV3 og TSP1 mrna-nivåene (fig. C). Sammenlignet med kontroller reduserte behandling med TSP1-siRNA vesentlig TSP1 mrna-nivået i PC3-tumorer (fig. C). Det skal bemerkes at silencing av TRPV3 resulterte i en reduksjon av TRPV3 mrna-nivå, men også i en reduksjon av TSP1 mrna-nivå (fig. C). Disse dataene bekrefter at både in vivo og in vitro regulerer TRPV3 TSP1-ekspresjon. I C4-2-tumorer reduserte behandling med TRPV3- eller TSP1-siRNA vesentlig det tilhørende mål-mrna-nivået sammenlignet med kontroller (fig. D, E). 1 Eksempel 9: TSP1 utøver fremdeles antiangiogene egenskaper i kastreringsresistente tumorer Selv om C4-2- og PC3-tumorer behandlet med TSP1- eller TRPV3-siRNA var mindre og svært nekrotiske, var deres mikrokarbloddensitet (MVD) i ikke-nekrotiske regioner vesentlig høyere enn i kontroller (fig. F), hvilket viser at TSP1 fremdeles undertrykte angiogenese i CRCaP- og AICaP-tumorer. Det økte MVD var parallelt med en redusert VEGF-ekspresjon i TSP1-siRNA-behandlede tumorer (fig. G), hvilket var indikativt for en redusert hypoksi. Dette resultatet etablerer at TSP1 fremdeles utøver antiangiogene egenskaper i C4-2- og PC3-tumorer. 2 3 Eksempel : Fravær av induksjon av ekspresjonen av interferon eller inflammatoriske cytokiner. For å bekrefte at de antitumorale effektene observert in vivo ikke var knyttet til en ikke-spesifikk immunrespons, ble mus gitt én injeksjon ved intraperitoneal vei med TSP1a-siRNA, eller med TRPV3b-siRNA, eller med Poly (I:C), en kjent ligand av TLR3, som anvendes som positiv kontroll. Alle injeksjonene ble utført med en dose på 4 mg/kg sirna fortynnet i PBS. Fem timer etter injeksjon ble mrna-er som koder for flere gener involvert i iboende immunrespons eller i inflammasjon, kvantifisert ved kvantitativ sanntids-rt-pct. Bare behandlingen med Poly (I:C) induserer en vesentlig økning av TLR3, TLR7, IL6, IL12b, IFNβ, IFNγ og IP, mens verken TSP1-siRNA eller TRPV3-siRNA ved samme dosering, 33 ganger høyere enn i tumorforsøk, induserte disse TLR og cytokinene (fig. H). Disse resultatene etablerer at antitumoreffekten observert ved injeksjoner av TSP1-siRNA eller TRPV3-siRNA in vivo ikke kan tilskrives en stimulering av iboende immunitet.

37 36 Eksempel 11: TSP1-ekspresjon er assosiert med patologisk stadium og cancerrekurrens etter radikal prostatektomi. TSP1 mrna-ekspresjon ble studert i 26 fryste prøver av radikal prostatektomi fra pasienter med klinisk lokalisert prostatacancer som ikke mottok radioterapi og/eller hormonal ablasjonsbehandling før kirurgi. Par av tumor og peritumoralt vev ble analysert i 18 prøver. Det gjennomsnittlige TSP1 mrna-nivået var vesentlig høyere i peritumoralt vev enn i tumorer (tabell 1), hvilket bekrefter at TSP1-ekspresjon undertrykkes i ubehandlede androgenavhengige tumorer. 1 Det var ingen vesentlig assosiasjon mellom tumoralt eller peritumoralt TSP1 mrna-nivå og pasientenes alder, Gleason-poeng eller serum-psa-nivå før kirurgi (tabell 1). I tumoralt vev var TSP1 mrna-nivået vesentlig lavere hos pasienter med lokalisert sykdom (pt2) enn hos dem med lokalt fremskreden prostatacancer (pt3) (tabell 1 og fig. 6A). I peritumoralt vev er det en trend mot høyere TSP1 mrna-nivå hos pasienter med sykdom på høyere stadium, selv om forskjellen ikke var statistisk signifikant. Av de 26 pasientene som er inkludert i denne studien, opplevde 11 PSA-tilbakefall, mens 8, fulgt i minst måneder etter kirurgi, ikke viste tegn på tumorrekurrens. TSP1 mrna-nivå, målt i tumoralt og peritumoralt vev på tidspunktet for radikal prostatektomi, var vesentlig assosiert med PSA-tilbakefall (tabell 1 og fig. 6B).

38 37 NO/EP2492

39 38 NO/EP2492

40 Referanser Abeele, F. V., Skryma, R., Shuba, Y., Van Coppenolle, F., Slomianny, C., Roudbaraki, M., Mauroy, B., Wuytack, F., and Prevarskaya, N. (02). Bcl-2- dependent modulation of Ca2+ homeostasis and store-operated channels in prostate cancer cells. 1, Adams, J. C. (04). Functions of the conserved thrombospondin carboxyterminal cassette in cell-extracellular matrix interactions and signaling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 36, Carlson, C. B., Lawler, J., and Mosher, D. F. (08). Structures of thrombospondins. Cell Mol Life Sci 6, Carthew, R. W., and Sontheimer, E. J. (09). Origins and Mechanisms of mirnas and sirnas. Cell 136, Colombel, M., Filleur, S., Fournier, P., Merle, C., Guglielmi, J., Courtin, A., Degeorges, A., Serre, C. M., Bouvier, R., Clezardin, P., and Cabon, F. (0). Androgens repress the expression of the angiogenesis inhibitor thrombospondin-1 in normal and neoplastic prostate. Cancer Res 6, 0 8. Filleur, S., Volpert, O. V., Degeorges, A., Voland, C., Reiher, F., Clezardin, P., Bouck, N., and Cabon, F. (01). In vivo mechanisms by which tumors producing thrombospondin 1 bypass its inhibitory effects. Genes Dev 1, Fixemer, T., Wissenbach, U., Flockerzi, V., and Bonkhoff, H. (03). Expression of the Ca2+-selective cation channel TRPV6 in human prostate cancer: a novel prognostic marker for tumor progression. Oncogene 22, Fontana, A., Filleur, S., Guglielmi, J., Frappart, L., Bruno-Bossio, G., Boissier, S., Cabon, F., and Clezardin, P. (0a). Human breast tumors override the antiangiogenic effect of stromal thrombospondin-1 in vivo. Int J Cancer. Fontana, A., Filleur, S., Guglielmi, J., Frappart, L., Bruno-Bossio, G., Boissier, S., Cabon, F., and Clézardin, P. (0b). Human breast tumors override the antiangiogenic effect of stromal thrombospondin-1 in vivo. International Journal of Cancer 116, Good, D. J., Polverini, P. J., Rastinejad, F., Le, B. M., Lemons, R. S., Frazier, W. A., and Bouck, N. P. (1990). A tumor suppressor-dependent inhibitor of angiogenesis is immunologically and functionally indistinguishable from a fragment of thrombospondin. Proc Natl Acad Sci U S A 87, Grynkiewicz, G., Poenie, M., and Tsien, R. (198). A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem 260,

41 Jimenez, B., Volpert, O. V., Crawford, S. E., Febbraio, M., Silverstein, R. L., and Bouck, N. (00). Signals leading to apoptosis-dependent inhibition of neovascularization by thrombospondin-1. Nat Med 6, Lehen'Kyi, V., Flourakis, M., Skryma, R., and Prevarskaya, N. (07). TRPV6 channel controls prostate cancer cell proliferation via Ca2+//NFAT-dependent pathways. Oncogene 26, Li, Q., Ahuja, N., Burger, P. C., and Issa, J. P. (1999). Methylation and silencing of the Thrombospondin-1 promoter in human cancer. Oncogene 18, Mariot, P., Vanoverberghe, K., Lalevee, N., Rossier, M. F., and Prevarskaya, N. (02). Overexpression of an alpha 1H (Cav3.2) T-type Calcium Channel during Neuroendocrine Differentiation of Human Prostate Cancer Cells. J Biol Chem 277, Monet, M., Lehen'kyi, V., Gackiere, F., Firlej, V., Vandenberghe, M., Roudbaraki, M., Gkika, D., Pourtier, A., Bidaux, G., Slomianny, C., et al. (). Role of cationic channel TRPV2 in promoting prostate cancer migration and progression to androgen resistance. Cancer Res 70, Moqrich, A., Hwang, S. W., Earley, T. J., Petrus, M. J., Murray, A. N., Spencer, K. S., Andahazy, M., Story, G. M., and Patapoutian, A. (0). Impaired thermosensation in mice lacking TRPV3, a heat and camphor sensor in the skin. Science 7, Prevarskaya, N., Zhang, L., and Barritt, G. (07). TRP channels in cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease 1772, Ren, B., Yee, K. O., Lawler, J., and Khosravi-Far, R. (06). Regulation of tumor angiogenesis by thrombospondin-1. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer 176, Roberts, D. D. (08). Thrombospondins: from structure to therapeutics. Cell Mol Life Sci 6, Sramkoski, R. M., Pretlow, T. G., 2nd, Giaconia, J. M., Pretlow, T. P., Schwartz, S., Sy, M. S., Marengo, S. R., Rhim, J. S., Zhang, D., and Jacobberger, J. W. (1999). A new human prostate carcinoma cell line, 22Rv1. In Vitro Cell Dev Biol Anim 3, Thalmann, G. N., Anezinis, P. E., Chang, S. M., Zhau, H. E., Kim, E. E., Hopwood, V. L., Pathak, S., von Eschenbach, A. C., and Chung, L. W. (1994). Androgen-independent cancer progression and bone metastasis in the LNCaP model of human prostate cancer. Cancer Res 4, Thebault, S., Flourakis, M., Vanoverberghe, K., Vandermoere, F., Roudbaraki, M., Lehen'kyi, V. y., Slomianny, C., Beck, B., Mariot, P., Bonnal, J.-L., et al.

42 41 (06). Differential Role of Transient Receptor Potential Channels in Ca2+ Entry and Proliferation of Prostate Cancer Epithelial Cells. Cancer Res 66, Vogt-Eisele, A. K., Weber, K., Sherkheli, M. A., Vielhaber, G., Panten, J., Gisselmann, G., and Hatt, H. (07). Monoterpenoid agonists of TRPV3. Br J Pharmacol 11, 40. Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., and Millhorn, D. E. (03). Cobalt Inhibits the Interaction between Hypoxia-inducible Factor-alpha and von Hippel-Lindau Protein by Direct Binding to Hypoxia-inducible Factor-alpha. J Biol Chem 278, Zhang, X., and Lawler, J. (07). Thrombospondin-based antiangiogenic therapy. Microvasc Res 74,

43 42 PATENTKRAV 1. Anvendelse av et dobbelttrådet oligonukleotid valgt fra paret (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2), paret (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22), paret (SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4) eller paret (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24), for produksjon av et legemiddel for forebygging eller behandling av primære tumorer eller invasive eller metastatiske tumorer Anvendelse av et produkt inneholdende eller bestående av: minst et dobbelttrådet oligonukleotid definert ovenfor ifølge krav 1, - minst et antiangiogent middel og/eller et antitumoralt middel, for produksjon av et kombinasjonsprodukt for en samtidig, separat eller periodisk anvendelse for forebygging eller behandling av primære tumorer eller invasive eller metastatiske tumorer. 3. Dobbelttrådet oligonukleotid for anvendelse ifølge krav 1 eller produkt for anvendelse ifølge krav 2, hvori legemiddelet kombineres med en antitumoral terapi, slik som radioterapi eller kjemoterapi Dobbelttrådet oligonukleotid for anvendelse eller produkt for anvendelse ifølge krav 3, hvori den primære tumoren eller den invasive eller metastatiske tumoren er en fast tumor eller en lymfoproliferativ tumor, hvori den faste tumoren er prostatatumor, en levertumor, hepatiske adenomer, fokal nodulær hyperplasi, en hjernetumor slik som gliom, en brysttumor, en nyretumor, en lungetumor slik som ikke-småcellet lungekarsinom, småcellet lungekarsinom, pleuropulmonalt blastom og karsinoid tumor, en bentumor slik som osteom, osteokondrom, aneurysmal bencyste og fibrøs dysplasi, osteosarkom, kondrosarkom, Ewings sarkom, malignt fibrøst histiocytom, fibrosarkom, en magecancer, en tykktarmstumor, en tynntarmstumor, en spiserørstumor, en bukspyttkjerteltumor, et sarkom, en halstumor, en galleblæretumor, et melanom, og hvori den lymfoproliferative tumoren er leukemi, lymfom eller et multippelt myelom. 3. Farmasøytisk sammensetning, omfattende som aktivt stoff minst et dobbelttrådet oligonukleotid valgt fra de følgende parene bestående av (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2); (SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4); (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22); (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24), i assosiasjon med en farmasøytisk akseptabel vehikkel.

44 43 6. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav, hvori det aktive stoffet er formulert for administrering ved en dose i området fra 0,0 til 0 mg/kg, særlig 0,1 til mg/kg. 7. Farmasøytisk sammensetning omfattende som aktivt stoff et produkt inneholdende eller bestående av: - minst et dobbelttrådet oligonukleotid definert ovenfor ifølge krav 1, - minst et antiangiogent middel og/eller et antitumoralt middel, som kombinasjonsprodukt for samtidig, separat eller periodisk anvendelse, 1 8. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 7, hvori det antiangiogene middelet er valgt fra gruppen omfattende cilengitid, vandetanib, lenalidomid, thalidomid, arsenikk, bevacizumab, anti-vegfr-1, anti-vegfr-2, anti-pdgfr, anti-fms-flt-3, anti-tk Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 8, hvori det antitumorale middelet er valgt fra gruppen omfattende alkylerende middel, slik som bendamustin, temozolomid, mekloretamin, syklofosfamid, karmustin, cisplatin, busulfan, tiotepa eller dekarbazin, antimetabolittmiddel, slik som pentostatin, metotreksat, pemetreksed, floksuridin, fluorouracil, cytarain, merkaptopurin eller tiguanin, cytotoksiske antibiotika slik som rubitekan, mitomycin C, daunorubicin, doksorubicin, bleomycin, plicamycin, mitoksantron HCl eller oksaliplatin, plantederivater, slik som vinorelbin, BMS , vinkristinsulfat, vinblastin, docetakseltaksol.. Oligonukleotidsekvens valgt fra de følgende sekvensene: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: Dobbelttrådede oligonukleotider valgt fra de følgende parene bestående av (SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2); (SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4); (SEQ ID NO: 21 og SEQ ID NO: 22); (SEQ ID NO: 23 og SEQ ID NO: 24).

45 1 SEKVENSLISTE <1> CNRS <1> Oligonucleotides inhibiting cellular migration <1> IOB 09 BG CNR SPON <160> 42 <170> PatentIn version 3. <2> 1 < 211> 21 <400> 1 ccuugacaac aacguggugt t 21 <2> 2 < 211> 21 <400> 2 caccacguug uugucaaggt t 21 <2> 3 < 211> 21 <400> 3 uacccgagac gauuguaugt t 21

46 <2> 4 < 211> 21 2 <400> 4 cauacaaucg ucucggguat t 21 <2> < 211> 21 <400> caaggagagc gaacgcauct t 21 <2> 6 < 211> 21 <400> 6 gaugcguucg cucuccuugt t 21 <2> 7 < 211> 21 <400> 7 auguacagcg ucaugaucct t 21 <2> 8 < 211> 21

47 3 <400> 8 ggaucaugac gcuguacaut t 21 <2> 9 < 211> 21 <400> 9 ucucugagcg cacuauucat t 21 <2> < 211> 21 <400> ugaauagugc gcucagagat t 21 <2> 11 < 211> 21 <400> 11 uauuccguuc ggucaucuat t 21 <2> 12 < 211> 21 <400> 12 uagaugaccg aacggaauat t 21

48 <2> 13 < 211> 21 4 <400> 13 uacagacagu uuuggaucut t 21 <2> 14 < 211> 21 <400> 14 agauccaaaa cugucuguat t 21 <2> 1 < 211> 21 <400> 1 ggagaaucug cugaaggaut t 21 <2> 16 < 211> 21 <400> 16 auccuucagc agauucucct t 21 <2> 17 < 211> 21

49 <400> 17 uaagagucaa ccucaacuat t 21 <2> 18 < 211> 21 <400> 18 uaguugaggu ugacucuuat t 21 <2> 19 < 211> 21 <400> 19 ggaagacagg caagaucuct t 21 <2> < 211> 21 <400> gagaucuugc cugucuucct t 21 <2> 21 < 211> 19 <400> 21 ccuugacaac aacguggug 19

50 <2> 22 < 211> 19 6 <400> 22 caccacguug uugucaagg 19 <2> 23 < 211> 19 <400> 23 uacccgagac gauuguaug 19 <2> 24 < 211> 19 <400> 24 cauacaaucg ucucgggua 19 <2> 2 < 211> 19 <400> 2 caaggagagc gaacgcauc 19 <2> 26 < 211> 19

51 7 <400> 26 gaugcguucg cucuccuug 19 <2> 27 < 211> 19 <400> 27 auguacagcg ucaugaucc 19 <2> 28 < 211> 19 <400> 28 ggaucaugac gcuguacau 19 <2> 29 < 211> 19 <400> 29 ucucugagcg cacuauuca 19 <2> < 211> 19 <400> ugaauagugc gcucagaga 19

52 <2> 31 < 211> 19 8 <400> 31 uauuccguuc ggucaucua 19 <2> 32 < 211> 19 <400> 32 uagaugaccg aacggaaua 19 <2> 33 < 211> 19 <400> 33 uacagacagu uuuggaucu 19 <2> 34 < 211> 19 <400> 34 agauccaaaa cugucugua 19 <2> 3 < 211> 19

53 9 <400> 3 ggagaaucug cugaaggau 19 <2> 36 < 211> 19 <400> 36 auccuucagc agauucucc 19 <2> 37 < 211> 19 <400> 37 uaagagucaa ccucaacua 19 <2> 38 < 211> 19 <400> 38 uaguugaggu ugacucuua 19 <2> 39 < 211> 19 <400> 39 ggaagacagg caagaucuc 19

54 <2> 40 < 211> 19 <400> 40 gagaucuugc cugucuucc 19 <2> 41 < 211> 8 < 213> human genome <400> 41

55 11 NO/EP2492

56 12 NO/EP2492

57 13 <2> 42 < 211> 3162 < 213> human genome <400> 42

58 14 NO/EP2492

59 1 NO/EP2492

60 1 NO/EP2492

61 2 NO/EP2492

62 3 NO/EP2492

63 4 NO/EP2492

64 NO/EP2492

65 6 NO/EP2492