COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, version 2.0

Transkript

1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, version 2.0 FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HI2CAP 48 Tests P/N: HIV-1 Test, v2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: Wash Reagent TILTENKT BRUK COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test, versjon 2.0 (v2.0) er en in vitro nukleinsyreamplifikasjonstest for kvantitering av HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus Type 1)-RNA i humant plasma ved bruk av COBAS AmpliPrep Instrument til automatisk prøveanalysering og COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer til automatisk amplifikasjon og deteksjon. Testen kan kvantitere HIV-1-RNA i området fra 20 til kopier/ml (33 til 1,67 x 10 7 internasjonale enheter [IU]/ml). Én kopi av HIV-1-RNA tilsvarer 1,67 IU (internasjonale enheter) basert på WHOs 1. internasjonale standard for HIV-1-RNA for NAT (nukleinsyrebaserte teknikker) (NIBSC 97/656) 36. Testen skal brukes sammen med kliniske funn og andre laboratoriemarkører for sykdomsprogresjon i forbindelse med klinisk oppfølging av pasienter som er smittet med HIV-1 gruppe M og HIV-1 gruppe O. Testen kan brukes til å vurdere pasientens prognose ved å måle baseline-hiv-1-rna-nivået eller til å overvåke effekten av antiretroviral behandling ved å måle endringer i HIV-1-RNA-nivåer i EDTA-plasma i løpet av den antiretrovirale behandlingen. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test v2.0 skal ikke brukes som screeningtest av blod eller blodprodukter for tilstedeværelse av HIV-1 eller som en diagnostisk test for å bekrefte tilstedeværelse av HIV-1-infeksjon. OPPSUMMERING OG FORKLARING AV TESTEN HIV (Human Immunodeficiency Virus) er det etiologiske agenset som forårsaker AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) 1-3. HIV-infeksjon kan overføres ved seksuell kontakt, via infisert blod eller infiserte blodprodukter eller fra en infisert mor til fosteret 4. Tre til seks uker etter HIV-eksponering utvikler den smittede personen vanligvis et kortvarig akutt syndrom som kjennetegnes av influensalignende symptomer og høye nivåer av viremi i perifert blod 5-8. For de fleste smittede personer blir dette etterfulgt av en HIV-spesifikk immunreaksjon og en reduksjon i plasmaviremi, vanligvis innen fire til seks uker fra symptomstart 9,10. Etter serokonvertering kommer smittede personer til å gå inn i en typisk klinisk fase som er stabil og symptomfri. Denne fasen kan vare i flere år Den asymptomatiske perioden kjennetegnes av persisterende, lavt virusnivå i plasma 14 og en gradvis reduksjon av CD4 + T-lymfocytter, noe som fører til en alvorlig immundefekt, multiple opportunistiske infeksjoner, maligniteter og død 15. Selv om virusnivået i perifert blod er relativt lavt under den asymptomatiske fasen av infeksjonen, ser virusreplikering og clearance ut til å være dynamiske prosesser der en høy aktivitet av virusproduksjon og infeksjon av CD4 + -celler balanseres av virusclearance, celledød blant infiserte celler og nyproduksjon av CD4 + -celler i like stor grad, noe som fører til relativt stabile nivåer av både virus i plasma og CD4 + -celler Avsnittet for informasjon om dokumentrevisjon er plassert ved slutten av dette dokumentet NO 1 Doc Rev. 13.0

2 Kvantitative målinger av HIV-virus i det perifere blodet har vist at høyere virusnivåer kan korrelere med økt risiko for klinisk progresjon av HIV, og at reduksjon av virusnivå i plasma kan assosieres med nedsatt risiko for klinisk progresjon Virusnivået i perifert blod kan kvantiteres ved måling av HIV p24-antigenet i serum, ved kvantitativ dyrking av HIV fra plasma, eller ved direkte måling av virus-rna i plasma ved hjelp av nukleinsyreamplifikasjons- eller signalamplifikasjonsteknologier p24-antigenet er det primære kjerneproteinet i HIV og finnes enten fritt eller bundet til anti-p24-antistoff i serum. Fritt p24-antigen kan måles med kommersielt tilgjengelige enzymimmunanalyser (EIA-tester), selv om nytteverdien av p24-antigenet som markør for virusmengde er begrenset, da antigenet kun kan påvises hos 20 % av de symptomfrie pasientene og hos % av pasientene med symptomer. Prosedyrer for å spalte antigen-antistoff-komplekser forbedrer sensitiviteten til p24-antigentestene, men virusproteinet kan fortsatt ikke påvises hos de fleste symptomfrie pasientene 22. Infeksiøst HIV i plasma kan dyrkes ved inokulasjon i aktiverte mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) fra normale donorer. Kvantitering oppnås ved inokulering av PBMC med serielle fortynninger av plasmaprøven. Kvantitativ dyrkning har begrenset nytteverdi for overvåking av virusnivåer hos smittede personer, da kun en brøkdel av viruspartikler er infeksiøse in vitro. Infeksiøse virus kan ofte ikke påvises hos symptomfrie individer 22. HIV RNA i plasma kan kvantifiseres ved hjelp av nukleinsyreamplifikasjon, som f.eks. polymerasekjedereaksjon (PCR) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test, v2.0 bruker PCR-teknologi for å oppnå maksimal sensitivitet og dynamisk område for kvantitativ påvisning av HIV-1-RNA i plasma antikoagulert med EDTA. TESTPRINSIPPER COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test v2.0 er en nukleinsyreamplifikasjonstest for kvantitering av HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus Type 1)-RNA i humant plasma. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test v2.0 er basert på tre hovedprosesser: (1) prøvepreparering for å isolere HIV-1-RNA, (2) revers transkripsjon av mål-rna for å generere komplementær DNA (cdna) og (3) samtidig PCR-amplifikasjon av mål-cdna og deteksjon av splittede dobbelmerkede og målspesifikke oligonukleotiddeteksjonsprober. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test v2.0 muliggjør automatisert prøvepreparering etterfulgt av automatisert revers transkripsjon, PCR-amplifikasjon og deteksjon av mål-hiv-1-rna og HIV-1-kvantiteringsstandard (QS) armored ("pansret") RNA. Master Mix-reagenset inneholder primere og prober som er spesifikke for både HIV-1-RNA og HIV-1-QS-RNA. Master Mix-reagenset er utviklet for å sikre en likeverdig kvantitering av gruppe M-subtyper av HIV-1 og av HIV-1 gruppe O. Deteksjonen av amplifisert DNA utføres ved å benytte målspesifikke og QS-spesifikke dobbelmerkete oligonukleotidprober som gir uavhengig identifisering av HIV-1-amplicon og HIV-1-QS-amplicon. Kvantiteringen av HIV-1-RNA-virus utføres ved hjelp av HIV-1-QS. Kvantiteringsstandarden kompenserer for hemmingseffekter og kontrollerer prepareringen og amplifikasjonsprosessene slik at kvantiteringen av HIV-1-RNA blir korrekt i hver prøve. HIV-1-QS er en ikke-infeksiøs armored ("pansret") RNA-konstruksjon som inneholder HIV-sekvenser med identiske primerbindingsregioner som mål-hiv-1-rna og en unik probebindingsregion som gjør det mulig å skille HIV-1-QS-standardamplicon fra mål-hiv-1-amplicon. Et kjent kopiantall av HIV-1-QS tilsettes i hver prøve og medføres gjennom trinnene med prøvepreparering, revers transkripsjon, samtidig PCR-amplifikasjon og deteksjon av splittede dobbelmerkede oligonukleotiddeteksjonsprober. COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer beregner HIV-1-RNAnivåene i testprøvene ved å sammenligne HIV-1-signalene med HIV-1-QS-signalene for hver prøve og kontroll NO 2 Doc Rev. 13.0

3 Valg av mål Valget av mål-rna-sekvensen for HIV-1 avhenger av identifikasjon av regioner i HIV-1-genomet som viser maksimal sekvenskonservering mellom de ulike gruppe-m-subtypene av HIV-1 og HIV-1 gruppe-oprøvene. For å adressere den høye genetiske variabiliteten av virus blir to regioner av HIV-genom samtidig mål for amplifikasjon og deteksjon av COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test, v2.0. To målspesifikke og en QS-spesifikk dobbeltmerket oligonukleotidprobe gir uavhengig identifisering av HIV-1-amplicon og HIV-1-QS-amplicon. Derfor er riktig valg av primere og dobbelmerket oligonukleotidprobe avgjørende for testens evne til å amplifisere og detektere HIV-1 gruppe-m-subtyper og HIV-1-gruppe-O. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test, v2.0 bruker revers transkripsjonsog PCR-amplifikasjonsprimere som definerer en sekvens innen de høykonserverte regionene i HIV-1 gag-genet 32 og i HIV-1 LTR-regionen. Prøvepreparering COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test v2.0 benytter automatisert prøvepreparering i COBAS AmpliPrep Instrument ved hjelp av en generisk silisiumbasert bindingsteknikk. I prosedyren blir 850 μl plasma bearbeidet. HIV-1-viruspartiklene lyseres gjennom inkubasjon ved forhøyet temperatur med en protease og kaotropisk lyserings-/bindingsbuffer som frigjør nukleinsyrer og beskytter det frigjorte HIV-1-RNA fra RNaser i plasma. Protease og et kjent antall HIV-1-QS armored ("pansrede") RNA-molekyler tilsettes i hver prøve sammen med lyseringsreagens og magnetiske glasspartikler. Deretter blir blandingen inkubert, og HIV-1-RNA og HIV-1-QS-RNA bindes til overflaten av de magnetiske glasspartiklene. Ubundne substanser, slik som salter, proteiner og andre cellulære forurensninger, fjernes ved å vaske de magnetiske glasspartiklene. Etter separasjon av de magnetiske glasspartiklene og fullføring av vasketrinnene, elueres de adsorberte nukleinsyrene ved forhøyet temperatur i en vandig løsning. Den preparerte prøven, som inneholder magnetiske glasspartikler i tillegg til det frigjorte HIV-1-RNA og HIV-1-QS-RNA, tilsettes i amplifikasjonsblandingen og overføres til COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer. Mål-HIV-1-RNA og HIV-1-QS-RNA blir deretter reverstranskribert, amplifisert og samtidig detektert gjennom oppsplitting av to målspesifikke og en QS-spesifikk dobbelmerket oligonukleotidprobe. Revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon Revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon utføres med det termostabile rekombinante enzymet Thermus specie Z05 DNA polymerase (Z05). I nærvær av mangan (Mn 2+ ) og under passende bufferforhold har Z05 både revers transkriptase- og DNA-polymeraseaktivitet 30,31. Dermed kan både revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon finne sted sammen med sanntidsdeteksjon av ampliconet. Bearbeidede prøver tilsettes amplifikasjonsblandingen i amplifikasjonsrør (K-rør) der både revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon skjer. Reaksjonsblandingen varmes opp for å gjøre det mulig for nedstrømsprimerne å hybridisere spesifikt til mål-hiv-1-rna og til HIV-1-QS-RNA. I nærvær av Mn 2+ og deoksynukleotidtrifosfater (dntp) i overskudd, inkludert deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksycytidin-, deoksyuridin- og deoksytymidintrifosfater, forlenger Z05-polymerasen den hybridiserte primeren og danner DNA-tråder som er komplementær til mål-rna. Målamplifikasjon Preparerte prøver tilsettes amplifikasjonsblandingen i amplifikasjonsrør (K-rør) der PCR-amplifikasjon skjer. Etter revers transkripsjon av HIV-1-mål-RNA og HIV-1-QS-RNA varmes reaksjonsblandingen opp i termoblokken i COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer for å denaturere RNA:cDNA-hybridene og eksponere de spesifikke primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, hybridiseres primerne til mål-dna. Ved tilstedeværelse av Mn 2+ og overskytende deoksynukleotidtrifosfater (dntp), inkludert deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksycytidin-, deoksyuridin- og deoksytymidintrifosfater, forlenger Z05 de hybridiserte primerne langs måltemplatene og danner dobbelttrådede DNA-molekyler som kalles amplicon. COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer gjentar denne prosessen automatisk i et bestemt antall sykluser, der hver syklus skal doble mengden amplicon-dna. Ønsket antall sykluser er forhåndsprogrammert i COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer. Amplifikasjonen skjer kun i HIV-1-genomets to regioner mellom primerne. Hele HIV-1-genomet amplifiseres ikke NO 3 Doc Rev. 13.0

4 Selektiv amplifikasjon Selektiv amplifikasjon av målnukleinsyre fra prøven oppnås i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test, v2.0 ved hjelp av AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzym og deoksyuridintrifosfat (dutp). AmpErase LD-enzymet gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin 33, men ikke DNA som inneholder deoksytymidin. Deoksyuridin finnes ikke i naturlig forekommende DNA, men finnes alltid i amplicon på grunn av bruken av deoksyuridintrifosfat som en av dntp-ene i Master Mix-reagenset. Det er derfor kun amplicon som inneholder deoksyuridin. Deoksyuridin gjør kontaminerende amplicon mottakelig for destruksjon av AmpErase-enzymet forut for amplifikasjon av mål-dna. I tillegg vil uspesifikke produkter som oppstår etter innledende aktivering av Master Mix med mangan, ødelegges av AmpErase-enzymet. AmpErase-enzymet, som inngår i Master Mix-reagenset, katalyserer nedbrytningen av DNA som inneholder deoksyuridin, ved å bryte deoksyuridingruppens deoksyribosekjede ved C1-posisjonen. Ved temperaturøkning i det første varmetrinnet brytes amplicon- DNA-kjeden der deoksyuridinet finnes, noe som igjen fører til at DNA ikke lenger er amplifiserbart. AmpErase-enzymet forblir inaktivt i lengre tid når det utsettes for temperaturer over 55 ºC, dvs. gjennom alle termosykliske trinn, og derfor blir ikke målamplicon som dannes under amplifikasjonen ødelagt. Deteksjon av PCR-produkter i en COBAS TaqMan -test Resultater for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test, v2.0 bruker sanntids 34,35 PCR-teknologi. Bruken av dobbel-fluoroscensmerkede prober sørger for sanntidsdeteksjon av akkumulert PCR-produkt ved å måle emisjonsintensiteten av rapporteringsfluorescensen som frigjøres under amplifikasjonsprosessen. Probene består av HIV-1- og HIV-1-QS-spesifikke oligonukleotider med et rapporteringsfluorofor og en slukkerfluorofor. I COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-testen, v2.0 er HIV-1- og HIV-1-QS-probene merket med ulike rapporteringsfluoroforer. Når disse probene er intakte, undertrykkes rapporteringsfluoroforenes fluorescens på grunn av nærheten til slukkerfluoroforen gjennom energioverføringer av Förster-type. Under PCR hybridiserer proben til en målsekvens og splittes av 5' 3' nukleaseaktivitet hos den termostabile Z05 DNA-polymerasen. Så snart rapporterings- og slukkerfluoroforene er frigjort og separert, forekommer det ikke lenger slukking, og rapporteringsfluoroforenes fluorescerensaktivitet øker. Amplifikasjonen av HIV-1-RNA og HIV-1-QS-RNA måles uavhengig av hverandre og ved ulike bølgelengder. Denne prosessen gjentas et visst antall sykluser, der hver syklus effektivt øker emisjonsintensiteten hos de individuelle rapporteringsfluoroforene og gir en uavhengig identifikasjon av HIV-1-RNA og HIV-1-QS-RNA. Den PCR-syklusen hvor starten på en eksponentiell vekstkurve inntreffer, er relatert til mengden kildemateriale ved starten av PCR-reaksjonen. Grunnleggende informasjon om kvantitering med COBAS TaqMan -testen COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test v2.0 gir et nøyaktig kvantitativt resultat i et stort dynamisk område ettersom måling av amplicon utføres under amplifikasjonens eksponentielle fase. Jo høyere HIV-1-titer i prøven, jo tidligere øker fluorescenssignalet fra HIV-1-probens rapporteringsfluorofor over fluorescensnivåets baseline (se figur 1). Ettersom mengden av HIV-1-QS-RNA er konstant i alle prøver, skal HIV-1-QS-probenes rapporteringsfluorescens bli påvisbar i samme syklus for alle prøver (se figur 2). I tilfeller der QS-fluorescensen påvirkes, justeres konsentrasjonen tilsvarende. Påvisningen av de spesifikke fluorescenssignalene rapporteres som en kritisk terskelverdi (Ct). Ct defineres som det relative syklusnummeret der rapporteringsfluorescensen overskrider en forhåndsbestemt terskelverdi (det tillagte fluorescens-terskelnivået) og starter signalets eksponentielle vekstfase (se figur 3). En høyere Ct-verdi indikerer et lavere titer av det opprinnelige mål-hiv-1-materialet. En 2-folds økning i titer korrelerer med en reduksjon på 1 Ct for mål-hiv-1-rna, mens en 10-folds økning i titer korrelerer med en reduksjon på 3,3 Ct NO 4 Doc Rev. 13.0

5 Figur 1 viser målvekstkurvene for en fortynningsserie som spenner over et område på 5-log 10. Når viruskonsentrasjonen øker, forskyves vekstkurvene mot tidligere sykluser. Derfor tilsvarer vekstkurven lengst til venstre det høyeste virustiternivået, mens vekstkurven helt til høyre tilsvarer det laveste virustiternivået. Figur 1 Målvekstkurvene for en fortynningsserie som spenner over et område på 5-Log 10 Normalisert fluorescens 10 5 Høyeste titer Laveste titer Syklusnummer Figur 2 viser vekstkurvene for kvantiteringsstandarden for prøver fra en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-log 10. Mengden kvantiteringsstandard som tilsettes hver prøve er konstant for hver reaksjon. Kvantiteringsstandardens Ct-verdi er lik uavhengig av virustiter. 50 Figur 2 Vekstkurvene for kvantiteringsstandarden for en fortynning av virus som spenner over et område på 5-Log 10 Normalisert fluorescens Laveste titer Høyeste titer Syklusnummer NO 5 Doc Rev. 13.0

6 Figur 3 viser et eksempel på hvordan fluorescensverdiene i hver syklus normaliseres for hver vekstkurve. Det relative syklusnummeret (Ct) beregnes når fluorescenssignalet krysser det tillagte fluorescensterskelnivået. 1,0 Figur 3 Fluorescensverdier i hver syklus normaliseres for hver vekstkurve 0,8 Normalisert fluorescens 0,6 0,4 0,2 Tilordnet fluorescens-terskelnivå Ct-verdi = 28,2 0, ,2 Syklusnummer HIV-1-RNA-kvantitering COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test v2.0 kvantiterer HIV-1-viralt RNA ved å benytte en annen målsekvens (HIV-1-kvantiteringsstandard) som tilsettes hver prøve i kjent konsentrasjon. HIV-1-QS er en ikke-infeksiøs armored ("pansret") RNA-konstruksjon som inneholder fragmenter av HIV-1- sekvenser med primerbindingsregioner som er identiske med dem i HIV-1-gag-målsekvensen. HIV-1-QS inneholder HIV-1-primerbindingsregioner og produserer et amplifikasjonsprodukt av samme lengde- og basesammensetning som gag-mål-hiv-1-rna. Deteksjonsprobebindingsregionen for HIV-1-QS er modifisert for å differensiere HIV-1-QS fra gag-mål-hiv-1-amplicon. Under PCR-hybridiseringsfasen i COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer, blir prøvene belyst og eksitert med filtrert lys, og filtrert emisjonsfluorescensdata registreres for hver prøve. Avlesningene fra hver prøve korrigeres deretter for instrumentvariasjoner. Instrumentet sender disse fluorescensavlesningene til AMPLILINK-programvaren, og de blir lagret i en database. Forhåndsdefinerte kontrollkriterier brukes for å avgjøre om resultatsettene for HIV-1-RNA og HIV-1-QS-RNA kan aksepteres som valide resultater. Dersom resultatsettene ligger utenfor de forhåndsbestemte akseptkriteriene, vil de bli flagget. Etter at alle forhåndskontroller er fullført og godkjent, behandles fluorescensresultatene for å generere Ct-verdier for HIV-1-RNA og HIV-1-QS-RNA. De lotspesifikke kalibreringsverdiene som leveres sammen med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test v2.0 brukes til å beregne titerverdier for prøver og kontroller basert på HIV-1-RNAs og HIV-1-QS-RNAs Ct-verdier. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-testen, v2.0 er standardisert i henhold til internasjonal WHO-standard for HIV-1-RNA. Titerresultatene rapporteres i kopier/ml eller internasjonale enheter/ml (IU/ml). Omregningsfaktoren mellom rapporterte HIV-1-RNA-kopier/ml og HIV-1-IU/ml er bestemt av Roche Molecular Systems, Inc. til å være 0,6 kopier/iu (1,67 IU/kopier) NO 6 Doc Rev. 13.0

7 REAGENSER COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 (P/N: ) HIV-1 v2.0 CS1 (HIV-1-reagenskassett med magnetiske glasspartikler) Magnetiske glasspartikler 93 % isopropanol HIV-1 v2.0 CS2 (HIV-1 lyseringsreagenskassett) Natriumsitratdihydrat 42,5 % guanidintiocyanat < 14 % polydocanol 0,9 % ditiotreitol HIV-1 v2.0 CS3 HIV-1 multireagenskassett inneholder: Pase (proteinaseløsning) Tris-buffer < 0,05 % EDTA Kalsiumklorid Kalsiumacetat 7,8 % proteinase Glyserol EB (elueringsbuffer) Tris-base-buffer 0,2 % metylparaben HIV-1 v2.0 CS4 HIV-1 testspesifikk reagenskassett inneholder: HIV-1 QS (HIV-1-kvantiteringsstandard) Tris-HCl-buffer EDTA < 0,005 % poly ra RNA (syntetisk) < 0,001 % armored ("pansret") HIV-1-RNA-konstruksjon som inneholder HIV-1-sekvenser og en unik probebindende region (ikke-infeksiøs RNA i MS2 bakteriofag) 0,05 % natriumazid HI2CAP 48 tester 1 x 48 tester 1 x 48 tester 1 x 48 tester 1 x 3,8 ml 1 x 7,0 ml 1 x 48 tester 1 x 3,6 ml NO 7 Doc Rev. 13.0

8 HIV-1 MMX (HIV-1 Master Mix) Trisinbuffer Kaliumacetat Kaliumhydroksid 20 % dimetylsulfoksid Glyserol < 0,04 % datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,003 % oppstrøms- og nedstrømsprimere for gag og LTR-regionen av HIV-1 < 0,003 % oligonukleotidaptamer < 0,003 % fluorescentmerket oligonukleotidprober spesifikke for HIV-1 og HIV-1 kvantiteringsstandard < 0,05 % Z05 DNA-polymerase (mikrobiell) < 0,1 % AmpErase (uracil-n-glykosylase) enzym (mikrobiell) 0,09 % natriumazid CAP/CTM Mn 2+ (CAP/CTM manganløsning) < 0,5 % manganeseacetat Isedikk 0,09 % natriumazid HIV-1 H(+)C, v2.0 (HIV-1 Høy positiv kontroll, v2.0) < 0,001 % armored ("pansret") HIV-1-RNA-konstruksjon som inneholder HIV-1-sekvenser (ikke-infeksiøs RNA i MS2 bakteriofag) Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA ikke detekterbart med PCR-metoder 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske HIV-1 L(+)C, v2.0 (HIV-1 Lav positiv kontroll, v2.0) < 0,001 % armored ("pansret") HIV-1-RNA-konstruksjon som inneholder HIV-1-sekvenser (ikke-infeksiøs RNA i MS2 bakteriofag) Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA ikke detekterbart med PCR-metoder 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske CTM ( ) C [COBAS TaqMan negativ kontroll (humant plasma)] Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA ikke detekterbart med PCR-metoder 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske HIV-1 H(+)C, v2.0 Clip (Strekkodeklips for HIV-1 høy positiv kontroll, v2.0) HIV-1 L(+)C, v2.0 Clip (Strekkodeklips for HIV-1 lav positiv kontroll, v2.0) HIV-1 ( ) C Clip (Strekkodeklips for HIV-1 negativ kontroll, v2.0) 1 x 2,5 ml 1 x 19,8 ml 4 x 1,0 ml 4 x 1,0 ml 4 x 1,0 ml 1 x 4 klips 1 x 4 klips 1 x 4 klips NO 8 Doc Rev. 13.0

9 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens (P/N: ) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens) Natriumsitratdihydrat < 0,1 % N-metylisotiazolon-HCl ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. PG WR 1 x 5,1 l B. Denne testen skal kun brukes for humant plasma med EDTA som antikoagulant. C. Ikke pipetter med munnen. D. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. E. Unngå mikrobiell kontaminering og ribonukleasekontaminering av reagensene når du pipetterer ut porsjoner fra kontrollflasker. F. Bruk av sterile engangspipetter og RNase-frie pipettespisser anbefales. G. Kontroller fra ulike lot eller ulike flasker fra samme lot må ikke blandes sammen. H. Reagenskassetter eller kontroller fra ulike kit må ikke blandes. I. COBAS AmpliPrep-kassetter må ikke åpnes, flasker må ikke byttes om, blandes, fjernes eller settes til. J. Kast ubrukte reagenser, avfall og prøver i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. K. Kit som er utgått på dato, må ikke brukes. L. Dataark om sikkerhet (SDS) kan på forespørsel sendes fra ditt lokale Roche-kontor. M. Prøver og kontroller må håndteres som infeksiøse, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 37 og CLSI-dokumentet M29-A3 38. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. Merk: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. N. ADVARSEL: CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 og HIV-1 H(+)C, v2.0 inneholder humant plasma utskilt fra humant blod. Kildematerialet er testet og har vist seg å være ikke-reaktivt for hepatitt B overflateantigen (HBsAg), antistoffer mot HIV-1/2 og HCV og HIV p24-antigen. Testing av Negativt Human Plasma med PCR-metoder viste ikke detekterbart HIV-1-RNA, HCV-RNA eller HBV-DNA. Ingen kjente testmetoder kan fullstendig garantere at produkter fra humant blod ikke vil kunne overføre infeksiøse agens. Derfor må alt humant materiale betraktes som potensielt infeksiøst. CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 og HIV-1 H(+)C, v2.0 må håndteres som infeksiøst materiale, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 37 og i CLSI-dokumentet M29-A3 38. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann NO 9 Doc Rev. 13.0

10 O. HIV-1-QS, CAP/CTM Mn 2+ og HIV-1 MMX inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid helles i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå azidoppbygging. P. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker ved håndtering av reagenser. Unngå kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra reagensene. Q. Ikke la HIV-1 v2.0 CS2 og flytende avfall fra COBAS AmpliPrep Instrument, som inneholder guanidintiocyanat, komme i kontakt med natriumhypoklorittløsning (blekemiddel). Disse blandingene kan produsere en svært giftig gass. R. Ved avhending av brukte COBAS AmpliPrep SPU-er (Specimen Processing Units) som inneholder guanidintiocyanat, må du unngå enhver kontakt med natriumhypoklorittløsning (blekemiddel). Disse blandingene kan produsere en svært giftig gass. OPPBEVARING OG HÅNDTERING A. Ikke frys reagenser eller kontroller. B. Oppbevar HIV-1 v2.0 CS1, HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 og HIV-1 v2.0 CS4 ved 2 8 ºC. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til utløpsdato. Når de er åpnet, er disse reagensene stabile i 28 dager ved 2 8 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. HIV-1 v2.0 CS1, HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 og HIV-1 v2.0 CS4 kan brukes i maks 4 instrumentsykluser, i maks. 64 timer totalt i COBAS AmpliPrep Instrument. Reagenser må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsykluser. C. Oppbevar HIV-1 H(+)C, v2.0, HIV-1 L(+)C, v2.0 og CTM ( ) C ved 2-8 ºC. Disse kontrollene er stabile til angitt utløpsdato. Etter åpning må alle ubrukte rester kastes. D. Oppbevar strekkodeklipsene [HIV-1 H(+)C v2.0 Clip, HIV-1 L(+)C v2.0 Clip og HIV-1 ( ) C Clip] ved 2 30 ºC. E. Oppbevar PG WR ved 2 30 C. PG WR er stabilt til angitt utløpsdato. Etter åpning er dette reagenset stabilt i 28 dager ved 2 30 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. MATERIELL SOM MEDFØLGER A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 (P/N: ) HIV-1 v2.0 CS1 (HIV-1-reagenskassett med magnetiske glasspartikler) HIV-1 v2.0 CS2 (HIV-1-kassett med lyseringsreagens) HIV-1 v2.0 CS3 (HIV-1-kassett med multireagens) HIV-1 v2.0 CS4 (HIV-1-kassett med testspesifikt reagens) HIV-1 H(+)C, v2.0 (HIV-1 høy positiv kontroll, v2.0) HIV-1 L(+)C, v2.0 (HIV-1 lav positiv kontroll, v2.0) HI2CAP NO 10 Doc Rev. 13.0

11 CTM ( ) C [COBAS TaqMan negativ kontroll (humant plasma)] HIV-1 H(+)C, v2.0 Clip (HIV-1 høy positiv kontroll, v2.0 strekkodeklips) HIV-1 L(+)C, v2.0 Clip (HIV-1 lav positiv kontroll, v2.0 strekkodeklips) HIV-1 ( ) C Clip (HIV-1 negativ kontroll strekkodeklips) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens (P/N: ) PG WR PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens) MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Instrumentering og programvare COBAS AmpliPrep Instrument COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer Valgfritt: cobas p 630 instrument Valgfritt: Dokkingstasjon AMPLILINK Software, versjon 3.3 eller versjon 3.4 Kontrollenhet for AMPLILINK Software, med skriver Instrument- og programvaremanualer: Instrumentmanual for COBAS AmpliPrep Instrument for bruk med AMPLILINK Software, versjon 3.3 og 3.4 Instrumentmanual for COBAS TaqMan Analyzer for bruk med AMPLILINK Software, versjon 3.3 og 3.4 Instrumentmanual for COBAS TaqMan 48 Analyzer for bruk med AMPLILINK Software, versjon 3.3 og 3.4 Applikasjonsmanual for AMPLILINK Software, versjon 3.3 for bruk med COBAS AmpliPrep Instrument, COBAS TaqMan Analyzer, COBAS TaqMan 48 Analyzer, COBAS AMPLICOR Analyzer og cobas p 630 instrument eller Applikasjonsmanual for AMPLILINK Software, versjon Valgfritt: operatørmanual for cobas p 630 instrument, programvareversjon 2.2 Testdefinisjonsfil (TDF). Se produktinformasjonskortet som følger med kitet for TDFnavn og gjeldende versjon NO 11 Doc Rev. 13.0

12 Engangsartikler Prøveprepareringsenheter: SPU-er Rør for innmating av prøver (S-rør) med strekkodeetiketter K-spiss rack K-rør, eske med 12 x 96 ANNET MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Prøvestativ (SK24-stativ) Reagensstativ SPU-rack K-rør åpner/lukker, motorisert K-rør åpner/lukker K-carrier K-carrier, løfteverktøy K-carrier, rack Pipetter med aerosolbarriere- eller "positive displacement" RNase-frie spisser (kapasitet 1000 μl)* Engangshansker, uten pudder Vortexmikser * Pipettene må ha 3 % nøyaktighet for angitt volum. Aerosolbarriere- eller "positive displacement" RNasefrie spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering mellom prøver og amplicon. TAKING, TRANSPORT OG OPPBEVARING AV PRØVER Merk: Merk: Alle prøver og kontroller må behandles som om de er potensielt infeksiøse. Denne testen er kun validert for bruk sammen med humant plasma med EDTA som antikoagulant. Testing av andre prøvematerialer kan føre til feil resultat. A. Taking av prøver COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test v2.0 skal kun brukes for plasmaprøver. Blodprøver må tas i sterile rør med EDTA (lys lilla topp) som antikoagulant og blandes tilstrekkelig i henhold til veiledning fra produsenten av prøvetakingsrør. Oppbevar fullblod ved 2 25 C i maks. 24 timer. Separer plasma fra fullblod innen 24 timer etter prøvetaking ved å sentrifugere ved x g i 20 minutter ved romtemperatur. Overfør plasma til et sterilt polypropylenrør. Figur 4 viser holdbarhetsdata for prøver fra undersøkelser om prøveholdbarhet utført på COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test (P/N: ) NO 12 Doc Rev. 13.0

13 Figur 4 HIV-1-stabilitet i fullblod; (tatt på rør for EDTA-plasma) Gjennomsnittlig (n=4) HIV-1-RNA-resultat log 10 HIV-1 RNA kopier/ml 5.0 5, , , , , ,0 Donor P1 Donor P2 Donor P3 < 1 time (T0) 24 timer, C 24 timer, 2 8 C Prøve-ID B. Transport av prøver Transport av fullblod eller plasma må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale 39. Fullblod må transporteres ved 2 25 C og sentrifugeres innen 24 timer etter prøvetaking. Plasma kan transporteres ved 2 8 C eller nedfrosset ved 20 C til 80 C. C. Oppbevaring av prøver Plasmaprøver kan oppbevares i romtemperatur (25 30 C) i opptil 1 dag eller ved 2 8 C i opptil 6 dager. Plasmaprøver viste seg å være holdbare i seks uker frosset ved 20 C til 80 C. Det anbefales at prøver oppbevares i μl deler i sterile, 2,0 ml polypropylrør med skrukorker (slik som Sarstedt ). Figur 5 viser holdbarhetsdataene for prøver fra en undersøkelse om prøveoppbevaring utført på COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test (P/N: ). Figur 5 HIV-1 holdbarhet i EDTA-plasma Gjennomsnittlig (n=4) HIV-1-RNA-resultat log 10 HIV-1 RNA kopier/ml 5.0 5, , , , , ,0 Donor P4 Donor P5 Donor P6 T=0 24 t, 28 C 6d, 2 8 C 6w, -20 C 6w, -80 C Prøve-ID Plasmaprøver kan fryses ned og tines opptil fem ganger uten signifikant tap av HIV-1-RNA. Figur 6 viser data fra fryse/tine-studier utført på COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-test (P/N: ) NO 13 Doc Rev. 13.0

14 Figur 6 HIV-1-resultater etter opptil fem fryse-tine (F-T)-sykluser (EDTA-plasma) Gjennomsnittlig (n=4) HIV-1-RNA-resultat log 10 HIV-1 RNA kopier/ml 5.0 5, , , , , ,0 BRUKSANVISNING Donor P10 Donor P11 Donor P12 Prøve-ID Kontroll 3 F T 5 F T Merk: For detaljert bruksanvisning og informasjon om bruk av instrumentet, detaljert beskrivelse av mulige konfigurasjoner, utskrift av resultater og tolking av flagg, kommentarer og feilmeldinger, se: (1) instrumentmanualen for COBAS AmpliPrep Instrument for bruk med AMPLILINK Software, versjon 3.3 og 3.4; (2) instrumentmanualen for COBAS TaqMan Analyzer for bruk med AMPLILINK Software, versjon 3.3 og 3.4; (3) instrumentmanualen for COBAS TaqMan 48 Analyzer for bruk med AMPLILINK Software, versjon 3.3 og 3.4; (4) applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software, versjon 3.3 for bruk med COBAS AmpliPrep Instrument, COBAS TaqMan Analyzer, COBAS TaqMan 48 Analyzer, COBAS AMPLICOR Analyzer og cobas p 630 instrument eller applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software, versjon 3.4; (5) valgfritt: operatørmanualen for cobas p 630 instrument, programvareversjon 2.2. Størrelse på analyseserie Hvert kit inneholder reagenser som er tilstrekkelig for 48 tester, og disse kan utføres i analyseserier på 12 til 24 tester. Minst én av hver kontroll [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 og HIV-1 H(+)C, v2.0] må tas med i hver analyseserie (se "Kvalitetskontroll"). Arbeidsflyt Analyseringen med COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer må startes innen 120 minutter etter at preparering av prøver og kontroller er fullført. Merk: Preparerte prøver og kontroller må ikke fryses ned eller oppbevares ved 2 8 C. Prøve- og kontrollpreparering Merk: Ved bruk av frosne prøver må prøvene stå i romtemperatur til de er helt tinte og deretter vortexes i 3 5 sekunder før bruk. Kontrollene skal tas ut fra 2 8 C lagringssted og må oppnå romtemperatur før bruk NO 14 Doc Rev. 13.0

15 Innstilling av COBAS AmpliPrep Instrument Del A. Vedlikehold og gjennomskylling A1. COBAS AmpliPrep Instrument er klart for drift i stand-by-modus. A2. Slå kontrollenheten for AMPLILINK Software på ON. Klargjør kontrollenheten på følgende måte: 1. Logg på operativsystemet Microsoft Windows. 2. Dobbeltklikk på ikonet for AMPLILINK-software. 3. Logg deg på AMPLILINK-software ved å taste inn tildelt bruker-id og passord. A3. Kontroller beholdningen av PG WR ved hjelp av skjermbildet Status. Skift ut om nødvendig. A4. Utfør alle vedlikeholdsprosedyrer som er angitt på Due-fliken. COBAS AmpliPrep Instrument vil automatisk skylle igjennom ("prime") systemet. Del B. Merk: Innlasting av reagenskassetter Alle reagenskassetter skal tas ut fra 2 8 C lagringssted, umiddelbart lastes inn i COBAS AmpliPrep Instrument og skal stå i romtemperatur i instrumentet i minst 30 minutter før den første prøven skal analyseres. Ikke la reagenskassettene oppnå romtemperatur utenfor instrumentet, da det kan forårsake kondens på strekkodeetikettene. Ikke tørk av kondens fra strekkodeetikettene hvis dette skulle forekomme. B1. Plasser HIV-1 v2.0 CS1 i et reagensstativ. Plasser HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 og HIV-1 v2.0 CS4 i et eget reagensstativ. B2. Sett inn reagensstativet som inneholder HIV-1 v2.0 CS1 i posisjon A i COBAS AmpliPrep Instrument. B3. Sett inn reagensstativet som inneholder HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 og HIV-1 v2.0 CS4 i posisjon B, C, D eller E i COBAS AmpliPrep Instrument. (Se tabell 1 for ytterligere informasjon.) Del C. Merk: Innlasting av engangsartikler Bestem antall COBAS AmpliPrep-reagenskassetter, prøveprepareringsenheter (SPU-er), Input S-rør, K-spisser og K-rør som skal brukes. Én SPU, ett Input S-rør, én K-spiss og ett K-rør er nødvendig for hver prøve eller kontroll. Det finnes flere mulige arbeidsflyter for bruk av COBAS AmpliPrep Instrument med COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer. Se tabell 1 under for referanse. Avhengig av den valgte arbeidsflyt settes det inn passende antall reagenskassettstativer, prøvestativer med Input S-rør, SPU-stativer, K-spiss racks, K-rør racks og K-carriers på K-carrier racks i de respektive stativposisjonene i COBAS AmpliPrep Instrument (se tabell 1 for ytterligere informasjon). C1. Plasser SPU-ene i SPU-stativene, og sett stativene i posisjon J, K eller L i COBAS AmpliPrep Instrument. C2. Avhengig av den valgte arbeidsflyt settes fylte K-rør rack(s) i posisjon M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep Instrument. C3. Plasser fylte K-spiss rack(s) i posisjon M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep Instrument. C4. Til arbeidsflyt 3, ved bruk av COBAS TaqMan 48 Analyzer, settes K-carriers på K-carrier rack(s) i posisjon M & N eller O & P i COBAS AmpliPrep Instrument NO 15 Doc Rev. 13.0

16 Tabell 1 Mulige arbeidsflyter for bruk av COBAS AmpliPrep Instrument med COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer Arbeidsflyt COBAS AmpliPrep Instrument pluss dokkingstasjon pluss COBAS TaqMan Analyzer COBAS AmpliPrep Instrument pluss COBAS TaqMan Analyzer COBAS AmpliPrep Instrument pluss COBAS TaqMan 48 Analyzer(s) Overføringsmodus for COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer Automatisert overføring av K-carrier Manuell overføring av K-rør via prøverack på COBAS TaqMan Analyzer Manuell overføring av K-carrier via K-carrier rack til COBAS TaqMan 48 Analyzer Stativer og engangsartikler K-rør i fulle K-rør rack K-spisser i fulle K-spiss rack Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ K-rør i fulle K-rør rack K-spisser i fulle K-spiss rack Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ Etter fullført prøvepreparering: K-rør i prøvestativ (klar for manuell overføring) K-rør i prøvestativ K-spisser i fulle K-spiss rack Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ Tom, strekkodemerket K- carrier i K-carrier rack Etter fullført prøvepreparering: K-rør i K-carrier i K-carrier rack Posisjon på COBAS AmpliPrep Instrument M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Samme som over (F H) F H M P F H J L A B E M P Samme som over (M P) Del D. Bestilling og innlasting av prøver D1. Klargjør prøvestativene på følgende måte: Fest en strekkodeklips til hver prøvestativposisjon der en prøve (S-rør) vil bli plassert. Fest en av de spesifikke strekkodeklipsene for kontrollene [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 og HIV-1 H(+)C, v2.0] i hver prøvestativposisjon der kontrollene (S-rør) skal plasseres. Kontrollenes strekkodeklips skal ha samme kontrollotnummer som lotnummeret på kontrollflaskene i kitet. Sørg for å sette riktig kontroll i posisjonen med tilsvarende strekkodeklips. Plasser ett Input S-rør i hver posisjon som har en strekkodeklips. D2. Bruk AMPLILINK-programvaren til å opprette prøvebestillinger for hver prøve og kontroll i vinduet Orders i mappen Sample. Velg den korrekte testfil, og avslutt med å lagre. D3. Tildel prøve- og kontrollbestillinger til prøvestativposisjoner i vinduet Orders i mappen Sample Rack. Prøvestativnummeret må stemme overens med det stativet som ble klargjort i trinn D1. D4. Skriv ut rapporten Sample Rack Order og bruk den som arbeidsark. D5. Klargjør prøve- og kontrollstativ i det reserverte området for tilsetting av prøver og kontroller på følgende måte: Vortex hver prøve og kontroll [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 og HIV-1 H(+)C, v2.0] i 3 til 5 sekunder. Vær forsiktig, slik at hanskene ikke kontamineres når prøver og kontroller behandles NO 16 Doc Rev. 13.0

17 D6. Overfør 1000 til 1050 μl av hver prøve og kontroll [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 og HIV-1 H(+)C, v2.0] til det korresponderende strekkodemerkede Input S-røret ved hjelp av en mikropipette med aerosolbarriere- eller "positive displacement" RNase-fri spiss. Unngå å overføre partikler og/eller fibrinklumper fra originalprøven til input S-røret. Prøver og kontroller må overføres til de rørposisjonene som er tildelt og registrert på arbeidsarket i trinn D4. Kontrollenes strekkodeklips skal ha samme kontrollotnummer som lotnummeret på kontrollflaskene i kitet. Sørg for å sette riktig kontroll i posisjonen med tilsvarende kontrollstrekkodeklips. Vær forsiktig, slik at den øvre delen av S-rørene ikke kontamineres av prøver eller kontroller. Se i operatørmanualen til cobas p 630 instrument ved bruk av cobas p 630 instrument til klargjøring av prøver. D7. Til arbeidsflyt 1 og 2 settes prøvestativ med Input S-rør i posisjon F, G eller H i COBAS AmpliPrep Instrument. D8. Til arbeidsflyt 3 ved bruk av COBAS TaqMan 48 Analyzer, settes prøvestativ med Input S-rør og K-rør (ett til hvert Input S-rør, innsatt i posisjonen til høyre ved siden av Input S-rør), i posisjon F, G eller H i COBAS AmpliPrep Instrument. Del E. Start av analysering på COBAS AmpliPrep Instrument E1. Start COBAS AmpliPrep Instrument med AMPLILINK-software. Del F. Avslutning av analyseringen på COBAS AmpliPrep Instrument og overføring til COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer (kun for arbeidsflyt 2 og 3) F1. Sjekk om det kommer opp flagg eller feilmeldinger. F2. Ta ut de preparerte prøvene og kontrollene fra COBAS AmpliPrep Instrument på enten prøvestativ (for COBAS TaqMan Analyzer uten dokkingstasjon) eller K-carrier racks (for COBAS TaqMan 48 Analyzer), avhengig av valgt arbeidsflyt (se del G for ytterligere informasjon). F3. Fjern avfall fra COBAS AmpliPrep Instrument. Merk: Preparerte prøver og kontroller må ikke utsettes for lys etter at prøve- og kontrollprepareringen er fullført. Amplifikasjon og deteksjon Innstillinger for COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer Analyseringen med COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer må startes innen 120 minutter etter at preparering av prøver og kontroller er fullført. Merk: Del G. Preparerte prøver og kontroller må ikke fryses ned eller oppbevares ved 2 8 C. Innlasting av preparerte prøver G1. Avhengig av den valgte arbeidsflyt utføres de nødvendige trinn for å overføre K-rør til COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer: Arbeidsflyt 1: Automatisk overføring av K-carrier via dokkingstasjon til COBAS TaqMan Analyzer. Dette krever ikke manuelle inngrep fra brukeren. Arbeidsflyt 2: Manuell overføring av K-rør i prøverack til COBAS TaqMan Analyzer Arbeidsflyt 3: Manuell overføring av K-carrier på K-carrier rack til COBAS TaqMan 48 Analyzer. Manuell overføring av K-carriers til COBAS TaqMan 48 Analyzer ved hjelp av løfteverktøyet for K-carrier NO 17 Doc Rev. 13.0

18 Del H. Start av analysering på COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer H1. Start COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer ved å foreta et av valgene nedenfor avhengig av hvilken instrumentarbeidsflyt som er brukt: Arbeidsflyt 1: Arbeidsflyt 2: Arbeidsflyt 3: Krever ingen inngrep fra brukeren. Automatisk start av COBAS TaqMan Analyzer etter innsetting av prøverack. Fyll K-carrier med tomme K-rør hvis det er færre enn 6 K-rør i K-carrieren. AMPLILINK-programvaren veileder i fyllingen. Åpne termoblokkdekselet, sett inn K-carrier i termoblokken og steng lokket. Start analyseringen på COBAS TaqMan 48 Analyzer. Del I. Avslutning av analysering på COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer I1. Skriv ut resultatrapporten når analyseserien i COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer er fullført. Sjekk om det finnes flagg eller feilmeldinger i resultatrapporten. Prøver med flagg og kommentarer tolkes slik som beskrevet under Resultater. Lagre dataene i arkivet når de er godkjent. I2. Fjern brukte K-rør fra COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer. RESULTATER COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer beregner automatisk HIV-1-RNAkonsentrasjonen for prøvene og kontrollene. HIV-1-RNA-konsentrasjonen uttrykkes i kopier/ml eller IU/ml, avhengig av brukt testdefinisjonsfil. Omregningsfaktoren mellom HIV-1-RNA-kopier/ml og HIV-1-IU/ml er 0,6 kopier/iu, basert på WHOs 1. internasjonale standard for HIV-1-RNA for NAT (nukleinsyrebaserte teknikker) (NIBSC 97/656) 36. Denne omregningsfaktoren ble bestemt ved bruk av COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-test, v1.5, COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR-test, v1.5 og COBAS TaqMan HIV-1-test for bruk med High Pure System. AMPLILINK-programvaren: Bestemmer syklusterskelverdi (Cycle Threshold, Ct) for HIV-1-RNA samt HIV-1-QS-RNA. Bestemmer HIV-1-RNA-konsentrasjon basert på Ct-verdiene for HIV-1-RNA og HIV-1-QS- RNA samt de lotspesifikke kalibreringskoeffisientene angitt på kassettenes strekkoder. Kontrollerer at det beregnede kopier/ml for HIV-1 L(+)C, v2.0 og HIV-1 H(+)C, v2.0 faller innenfor de tillagte akseptgrensene. Validering av analyseserie AMPLILINK versjon 3.3 og versjon 3.4 For å sikre at analyseserien er gyldig, sjekk i resultatvinduet i AMPLILINK-programvaren eller på utskriften om det finnes flagg og kommentarer. For kontroller blir det foretatt en sjekk for å bestemme om kopier/mleller IU/ml-verdien for kontrollen er innenfor det angitte akseptområdet. Hvis kopier/ml- eller IU/mlverdien for kontrollen ligger utenfor området, blir det opprettet et flagg for å angi at kontrollen mislyktes. Analyseserien er gyldig hvis det ikke fremkommer flagg for kontrollene [HIV-1 L(+)C, v2.0; HIV-1 H(+)C, v2.0 og CTM ( ) C]. Analyseserien er ikke gyldig hvis noen av de følgende flaggene vises for HIV-1-kontrollene NO 18 Doc Rev. 13.0

19 Negativ kontroll Flagg Resultat Tolkning Et ugyldig resultat eller et "gyldig" resultat som ikke NC_INVALID Invalid var negativt for mål-hiv-1 HIV-1 Lav positiv kontroll, v2.0 Flagg Resultat Tolkning Et ugyldig resultat eller kontroll utenfor LPCINVALID Invalid akseptområdet HIV-1 Høy positiv kontroll, v2.0 Flagg Resultat Tolkning Et ugyldig resultat eller kontroll utenfor HPCINVALID Invalid akseptområdet Hvis analyseserien er ugyldig, må hele oppsettet gjentas, inkludert preparering av prøver og kontroller, amplifikasjon og deteksjon. Tolking av resultater Hvis analyseserien er gyldig, må hvert prøvesvar kontrolleres for å se om det finnes noen flagg eller kommentarer på resultatutskriften. Tolk resultatene på følgende måte: En gyldig analyserunde kan omfatte både gyldige og ugyldige prøveresultater, avhengig av om varslingsflaggene og/eller kommentarene er innhentet fra de ulike prøvene NO 19 Doc Rev. 13.0

20 Prøveresultater tolkes på følgende måte: Titerresultat Target Not Detected < 2.00E+01 cp/ml Tolkning Ct-verdi for HIV-1 er høyere enn analysens måleområde, eller ingen Ct-verdi for HIV-1 er påvist. Rapporter resultatene som "HIV-1-RNA ikke detektert". Beregnet kopier/ml er lavere enn analysens deteksjonsgrense. Rapporter resultater som "HIV-1-RNA detektert, mindre enn 20 HIV-1-RNA kopier/ml". Kopier/ml Internasjonale enheter/ml 2.00E+01 cp/ml og 1.00E+07 cp/ml > 1.00E+07 cp/ml < 3.34E+01 IU/mL 3.34E+01 IU/mL og 1.67E+07 IU/mL > 1.67E+07 IU/mL Beregnede resultater er større enn eller lik 20 kopier/ml og mindre enn eller lik 1,00E+07 kopier/ml, og ligger innenfor analysens lineære område. Beregnet kopier/ml ligger over analysens måleområde. Rapporter resultater som "større enn 1,00E+07 HIV-1-RNA kopier/ml". Hvis det er ønskelig med et kvantitativt resultat, kan den opprinnelige prøven fortynnes i forholdet 1:100 med HIV-1-negativt humant EDTA-plasma og analyseres på nytt. Multipliser det rapporterte resultatet med fortynningsfaktoren. Beregnet IU/ml er lavere enn analysens deteksjonsgrense. Rapporter resultater som "HIV-1-RNA detektert, mindre enn 33,4 HIV-1-RNA IU/ml". Beregnet resultat er større enn eller lik 33,4 IU/ml og mindre enn eller lik 1,67E+07 IU/ml, og ligger innenfor analysens lineære område. Beregnet IU/ml ligger over analysens måleområde. Rapporter resultater som "større enn 1,67E+07 HIV-1 RNA IU/ml". Hvis det er ønskelig med et kvantitativt resultat, kan den opprinnelige prøven fortynnes i forholdet 1:100 med HIV-1-negativt humant EDTA-plasma og analyseres på nytt. Multipliser det rapporterte resultatet med fortynningsfaktoren. Merk: Merk: Merk: Prøver som ligger høyere enn analysens måleområde som gir et ugyldig resultat med flagget "QS_INVALID", må ikke rapporteres som > 1,00E+07 kopier/ml eller 1,67E +07 IU/ml. Den opprinnelige prøven bør fortynnes i forholdet 1:100 med HIV-1-negativt humant EDTA-plasma og analyseres på nytt. Multipliser det rapporterte resultatet med fortynningsfaktoren. Titerresultatet "Failed". Tolkning: Prøven er ikke behandlet på korrekt måte under klargjøring på COBAS AmpliPrep Instrument. Titerresultatet "Invalid". Tolkning: Et ugyldig resultat NO 20 Doc Rev. 13.0

21 KVALITETSKONTROLL Én CTM ( ) C, én HIV-1 L(+)C, v2.0 og én HIV-1 H(+)C, v2.0 må inkluderes i hver testbatch. Analyseserien er gyldig hvis det ikke fremkommer flagg for kontrollene [HIV-1 L(+)C, v2.0, HIV-1 H(+)C, v2.0 og CTM ( ) C]. Kontroller om det finnes flagg og kommentarer i analyseutskriften for å sikre at analyseserien er gyldig. Negativ kontroll CTM ( ) C skal vise resultatet "Target Not Detected". Hvis CTM ( ) C flagges som ugyldig, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøve- og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Roche-kontoret for teknisk hjelp hvis CTM ( ) C er ugyldig i flere gjentatte analyseserier. Positive kontroller Akseptområdet for HIV-1 L(+)C, v2.0 og HIV-1 H(+)C, v2.0 er spesifikt for hver reagenslot og angitt på strekkodene på COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-testens v2.0 reagenskassett. HIV-1-RNA kopier/ml for HIV-1 L(+)C, v2.0 og HIV-1 H(+)C, v2.0 må ligge innenfor det tillagte akseptområdet. Hvis en av eller begge de positive kontrollene flagges som ugyldige, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøve- og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Roche-kontoret for teknisk hjelp hvis HIV-1-RNA-titer for en av eller begge de positive kontrollene konsekvent er utenfor akseptområde i flere analyseserier. FORSIKTIGHETSREGLER Som for andre laboratorieprosedyrer, er god laboratorieteknikk essensielt for å sikre optimal ytelse for denne analysen NO 21 Doc Rev. 13.0