COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test

Transkript

1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVCAP 72 Tests P/N: CMV Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: Wash Reagent TILTENKT BRUK COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen er en in vitro-nukleinsyreamplifikasjonstest for kvantitering av cytomegalovirus-dna i humant EDTA-plasma ved bruk av COBAS AmpliPrepinstrumentet for automatisk prøvebehandling og COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren for automatisk amplifikasjon og deteksjon. Testen kan kvantitere CMV-DNA i området kopier/ml. Én kopi av CMV-DNA (som definert av COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen) tilsvarer 0,91 internasjonale enheter (IU) [1,1 kopier/iu] basert på den første WHO internasjonale standard for humant cytomegalovirus for nukleinsyreamplifikasjonsteknikker (NAT) (NIBSC 09/162) 40. Testen skal brukes sammen med kliniske funn og andre laboratoriemarkører til diagnostisering og behandling av CMV-infeksjon hos pasienter med risiko for CMV-sykdom. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen skal ikke brukes som screeningtest for tilstedeværelse av CMV i blod eller blodprodukter eller som en diagnostisk test for å bekrefte tilstedeværelse av CMVinfeksjon. Resultatene fra COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen må tolkes i sammenheng med alle relevante kliniske funn og laboratoriefunn. SAMMENDRAG OG BESKRIVELSE AV TESTEN Humant cytomegalovirus (HCMV eller CMV) er et humant viruspatogen som tilhører herpesvirusfamilien og finnes i både utviklede industrisamfunn og i isolerte urbefolkningsgrupper. 1,2 Det kan overføres via blod, orofarynkssekret, urin, cervikalt og vaginalt sekret, sædvæsker, brystmelk, tårer og avføring. 3-9 Primærinfeksjoner med CMV hos immunkompetente personer er vanligvis asymptomatiske og forårsaker ofte uoppdagede latente infeksjoner. Mononukleære celler i perifert blod og endotelceller er tilsynelatende de mest fremtredende infeksjonsstedene. CMV forblir på et latent stadium i monocytter/makrofager hos mennesker. 2 Latent infiserte personer kan periodevis spre viruset med kroppsvæsker og på den måten infisere andre. Personer med svekket immunforsvar, deriblant nyfødte, transplantatpasienter og AIDSpasienter, har høy risiko for å utvikle alvorlige CMV-infeksjoner, som kan medføre en økt sykdoms- og dødelighetsrate. 10 Alvorlige kliniske manifestasjoner av CMV-sykdom omfatter CMV-syndrom, retinitt, gastroenteritt, hepatitt, encefalitt, øsofagitt, enterokolitt, pankreatitt og lungebetennelse Laboratoriemetoder som brukes til å diagnostisere disseminert infeksjon og aktiv sluttorgansykdom på grunn av humant cytomegalovirus, omfatter isolering av virus ved dyrkning fra leukocytter fra perifert blod (PBL), histologi av biopsier, serologiske metoder, måling av pp65-antigen og deteksjon av CMV-DNA ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR). 14 Dyrkningsmetoder har dårlig prediktiv verdi. De tar fra 48 timer til 3 uker å gjennomføre og har begrenset nytteverdi, spesielt for pasienter med svekket immunforsvar. pp65-antigenemianalysen er arbeidskrevende og krever at blodet behandles innen seks timer etter prøvetaking, fordi antigennivået synker ved lagring. 15,22 pp65-analysen er også vanskelig å utføre på pasienter med fremskreden nøytropeni. Utviklingen av direkte deteksjon av CMV-DNA i plasma ved hjelp av PCR har vist seg å korrelere godt med positive resultater ved PBL-dyrkning og med økt risiko for å utvikle systemisk CMV-sykdom. En rekke undersøkelser har vist sammenhengen mellom CMV-virusmengde og risikoen for å utvikle CMVsykdom Avsnittet for informasjon om dokumentrevisjon er plassert ved slutten av dette dokumentet NO 1 Doc Rev. 2.0

2 Risikoen for CMV-sykdom blir klart definert ved høy virusmengde, noe som understreker at virustiter spiller en viktig rolle i sykdomspatogenese. 18,27,30,31 Undersøkelser av transplantatmottakere og AIDS-pasienter har vist at PCR-deteksjon av CMV-DNA er svært prediktivt for senere utvikling og klinisk sykdomsutfall. 17,23-26 Kvantitative vurderinger av CMV-DNA-nivåer har vist at høye virusmengder samt økning i virusmengde over tid korrelerer med dårligere kliniske prognoser for flere CMV-risikotilstander. 18,27,28 Kvantitative PCR-analyser gjør det også mulig å følge med på effekten av antiviral 26,29,30, 32 behandling og indirekte vurdere virusresistens. Gjeldende behandlingsretningslinjer anbefaler måling av CMV-virusmengde hos organtransplanterte pasienter for å monitorere risikoen for utvikling av CMV-sykdom og se om det er behov for forebyggende behandling, og for monitorering av pasienter med aktiv CMV-sykdom for å registrere deres respons på behandlingen. 21,22 Dette anbefales også i de diagnostiske kriteriene for identifisering av CMV-sykdom hos pasienter som har fått transplantasjon av hematopoietiske stamceller. 33 TESTPRINSIPPER COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen er en nukleinsyreamplifikasjonstest for kvantitering av cytomegalovirus-dna (CMV-DNA) i humant plasma. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen er basert på to hovedprosesser: (1) prøvepreparering for å isolere CMV-DNA og (2) samtidig PCRamplifikasjon av mål-dna og deteksjon av splittede dobbelmerkede og målspesifikke oligonukleotiddeteksjonsprober. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen muliggjør automatisk prøvepreparering etterfulgt av PCR-amplifikasjon og deteksjon av mål-cmv-dna og CMV-kvantiteringsstandard-DNA (QS-DNA). Master Mix-reagenset inneholder primere og prober som er spesifikke for både CMV-DNA og CMV-QS- DNA. Deteksjonen av amplifisert DNA utføres ved hjelp av målspesifikke og QS-spesifikke dobbelmerkede oligonukleotidprober som gir uavhengig identifisering av CMV-amplicon og CMV-QS-amplicon. Kvantiteringen av CMV-virus-DNA utføres ved hjelp av CMV QS. Dette kompenserer for hemmingseffekter og kontrollerer preparerings- og amplifikasjonsprosessene slik at kvantiteringen av CMV-DNA blir korrekt i hver prøve. CMV-QS er en ikke-infeksiøs DNA-konstruksjon som inneholder identiske primerbindingsregioner som mål-cmv-dna og en unik probebindingsregion, som gjør det mulig å skille CMV-QSamplicon fra mål-cmv-amplicon. Et kjent kopiantall av CMV-QS tilsettes i hver prøve og medføres gjennom trinnene med prøvepreparering og samtidig PCR-amplifikasjon og deteksjon av splittede dobbelmerkede oligonukleotiddeteksjonsprober. COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren beregner CMV-DNA-nivåene i testprøvene ved å sammenligne CMV-signalene med CMV-QS-signalene for hver prøve og kontroll. Valg av mål Generisk silisiumbasert prøvepreparering blir benyttet til å binde CMV-DNA og CMV-QS-DNA, og definerte oligonukleotider brukes som primere ved amplifikasjon av CMV-DNA og CMV-QS-DNA. En målspesifikk og en QS-spesifikk dobbelmerket oligonukleotidprobe gjør det mulig med uavhengig identifikasjon av CMV-ampliconet og CMV-QS-ampliconet. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVtesten bruker to amplifikasjonsprimere for PCR. En signalgenererende dobbelmerket probe hybridiserer til en av de to trådene og splittes av Z05-DNA-polymerase under forlenging av primerne. Prøvepreparering COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen benytter automatisert prøvepreparering i COBAS AmpliPrep-instrumentet ved hjelp av en generisk silisiumbasert bindingsteknikk. I prosedyren blir 500 μl plasma bearbeidet. CMV-viruspartiklene lyseres gjennom inkubasjon ved forhøyet temperatur med en protease og kaotropisk lyserings-/bindingsbuffer som frigjør nukleinsyrer og beskytter det frigjorte CMV- DNA fra DNaser i plasma. Protease og et kjent antall CMV-QS-DNA-molekyler tilsettes til hver prøve sammen med lyseringsreagens og magnetiske glasspartikler. Deretter blir blandingen inkubert, og CMV- DNA og CMV-QS-DNA bindes til overflaten av de magnetiske glasspartiklene. Ubundne substanser, slik som salter, proteiner og andre cellulære forurensninger, fjernes ved å vaske de magnetiske glasspartiklene. Etter separasjon av de magnetiske glasspartiklene og fullføring av vasketrinnene, elueres de adsorberte nukleinsyrene ved forhøyet temperatur i en vandig løsning. Den behandlede prøven, som inneholder det frigjorte CMV-DNA og CMV-QS-DNA, tilsettes til amplifikasjonsblandingen og overføres til COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren NO 2 Doc Rev. 2.0

3 PCR-amplifikasjon PCR-amplifikasjonsreaksjonen utføres med det termostabile rekombinante enzymet Thermus specie Z05 DNA Polymerase (Z05). I nærvær av magnesium (Mg 2+ ) og under passende bufferforhold har Z05 DNApolymeraseaktivitet. 34 Dermed kan PCR-amplifikasjon finne sted sammen med sanntidsdeteksjon av ampliconet. Preparerte prøver tilsettes amplifikasjonsblandingen i amplifikasjonsrør (K-rør) der PCR-amplifikasjon skjer. Ved nærvær av Mg 2+ og deoksynukleotidtrifosfater (dntp) i overskudd, inkludert deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksycytidin-, deoksyuridin- og deoksytymidintrifosfater, forlenger Z05-polymerasen de hybridiserte primerne og danner DNA -tråder. Målamplifikasjon Termocycleren i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren varmer opp reaksjonsblandingen for å denaturere det dobbelttrådete DNA-et og eksponere de spesifikke primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, hybridiseres primerne til mål-dna. Ved nærvær av Mg 2+ og deoksynukleotidtrifosfater (dntp) i overskudd forlenger Z05 de hybridiserte primerne langs måltemplatene og produserer dobbelttrådede DNA-molekyler som kalles et amplicon. COBAS TaqMan - analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren gjentar denne prosessen automatisk i et bestemt antall sykluser, der hver syklus skal doble mengden amplicon-dna. Ønsket antall sykluser er forhåndsprogrammert i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren. Amplifikasjonen skjer kun i CMV-genomets region mellom primerne. Hele CMV-genomet amplifiseres ikke. Selektiv amplifikasjon Selektiv amplifikasjon av målnukleinsyre fra prøven oppnås i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVtesten ved hjelp av AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzym og deoksyuridintrifosfat (dutp). AmpEraseenzymet gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin, 35, men ikke DNA som inneholder deoksytymidin. Deoksyuridin finnes ikke i naturlig forekommende DNA, men finnes alltid i amplicon på grunn av bruken av deoksyuridintrifosfat som en av dntp-ene i Master Mix-reagenset. Det er derfor kun amplicon som inneholder deoksyuridin. Deoksyuridin gjør kontaminerende amplicon mottakelig for destruksjon av AmpErase-enzymet forut for amplifikasjon av mål-dna. I tillegg vil uspesifikke produkter som oppstår etter innledende aktivering av Master Mix med magnesium, ødelegges av AmpErase-enzymet. AmpErase-enzymet, som inngår i Master Mix-reagenset, katalyserer nedbrytningen av DNA som inneholder deoksyuridin, ved å bryte deoksyuridingruppens deoksyribosekjede ved C1-posisjonen. Ved temperaturøkning i det første varmetrinnet brytes amplicon-dna-kjeden der deoksyuridinet finnes, noe som igjen fører til at DNA ikke lenger er amplifiserbart. AmpErase-enzymet forblir inaktivt i lengre tid når det utsettes for temperaturer over 55 ºC, dvs. gjennom alle termosykliske trinn, og derfor blir ikke målamplicon som dannes under amplifikasjonen, ødelagt. Deteksjon av PCR-produkter med en COBAS TaqMan -test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen anvender sanntids 36,37 PCR-teknologi. Bruken av dobbel-fluorescensmerkede prober sørger for sanntidsdeteksjon av akkumulert PCR-produkt ved å måle emisjonsintensiteten av rapporteringsfluorescensen som frigjøres under amplifikasjonsprosessen. Probene består av CMV- og CMV-QS-spesifikke oligonukleotidprober med en rapporteringsfluorofor og en slukkerfluorofor. I COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen er CMV- og CMV-QS-probene merket med ulike rapporteringsfluoroforer. Når disse probene er intakte, undertrykkes rapporteringsfluoroforenes fluorescens på grunn av nærheten til slukkerfluoroforen gjennom energioverføringer av Förster-type. Under PCR hybridiserer proben til en målsekvens og splittes av 5' 3' nukleaseaktivitet hos den termostabile Z05 DNA-polymerasen. Så snart rapporterings- og slukkerfluoroforene er frigjort og separert, forekommer det ikke lenger slukking, og rapporteringsfluoroforenes fluorescensaktivitet øker. Amplifikasjonen av CMV-DNA og CMV-QS-DNA måles uavhengig av hverandre og ved ulike bølgelengder. Denne prosessen gjentas et visst antall sykluser, der hver syklus effektivt øker emisjonsintensiteten hos de individuelle rapporteringsfluoroforene og gir en uavhengig identifikasjon av CMV-DNA og CMV QS-DNA. Den PCR-syklusen hvor starten på en eksponentiell vekstkurve inntreffer, er relatert til mengden kildemateriale ved starten av PCR-reaksjonen NO 3 Doc Rev. 2.0

4 Grunnleggende informasjon om kvantitering med COBAS TaqMan -testen COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen gir et kvantitativt resultat i et stort dynamisk område, ettersom måling av amplicon utføres under amplifikasjonens eksponentielle fase. Jo høyere CMV-titer i prøven, desto tidligere øker fluorescenssignalet fra CMV-probens rapporteringsfluorofor utover fluorescensnivåets baseline (se figur 1). Ettersom mengden av CMV-QS-DNA er konstant i alle prøver, skal CMV-QS-probens rapporteringsfluorescens bli påvisbar i en lignende syklus for alle prøver (se figur 2). I prøver der QS-fluorescensen påvirkes justeres konsentrasjonen tilsvarende. Påvisningen av de spesifikke fluorescenssignalene rapporteres som en kritisk terskelverdi (Ct). Ct defineres som det relative syklusnummeret der rapporteringsfluorescensen overskrider en forhåndsbestemt terskelverdi (det tillagte fluorescens-terskelnivået) og starter signalets eksponentielle vekstfase (se figur 3). En høyere Ct-verdi indikerer et lavere titer av det introduserte mål-cmv-materialet. Generelt korrelerer en 2-folds økning i titer korrelerer med en reduksjon på 1 Ct for mål-cmv-dna, mens en 10-folds økning i titer korrelerer med en reduksjon på 3,3 Ct. Figur 1 viser eksempler på målvekstkurver for en fortynningsserie som spenner over et område på 5-log 10. Når viruskonsentrasjonen øker, forskyves vekstkurvene mot tidligere sykluser. Derfor tilsvarer vekstkurven lengst til venstre det høyeste virustiternivået, mens vekstkurven helt til høyre tilsvarer det laveste virustiternivået. Figur 1 Målvekstkurver for en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-log 10 Normalisert fluorescens Høyeste titer Laveste titer Syklusnummer NO 4 Doc Rev. 2.0

5 Figur 2 viser eksempler på vekstkurver for kvantiteringsstandarden for prøver fra en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-log 10. Mengden kvantiteringsstandard som tilsettes hver prøve, er konstant for hver reaksjon. Kvantiteringsstandardens Ct-verdi er lik uavhengig av virustiter. Figur 2 Vekstkurvene for kvantiteringsstandarden for en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-Log 10 Normalisert fluorescens Laveste titer Høyeste titer Syklusnummer Figur 3 viser et eksempel på hvordan fluorescensverdiene i hver syklus normaliseres for hver vekstkurve. Det relative syklusnummeret (Ct) beregnes når fluorescenssignalet krysser det tillagte fluorescensterskelnivået. Figur 3 Fluorescensverdier i hver syklus normaliseres for hver vekstkurve Normalisert fluorescens Tilordnet fluorescens-terskelnivå Ct-verdi = 27,3 Syklusnummer NO 5 Doc Rev. 2.0

6 CMV-DNA-kvantitering COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen foretar en kvantitering av CMV-virus-DNA ved å utnytte en annen målsekvens (CMV-kvantiteringsstandard), som tilsettes hver prøve i kjent konsentrasjon. CMV-QS er en ikke-infeksiøs DNA-konstruksjon som inneholder fragmenter av CMV-sekvenser med primerbindingsregioner som er identiske med dem i mål-cmv-sekvensen. CMV-QS inneholder CMVprimerbindingsregioner og genererer et amplifikasjonsprodukt av tilsvarende lengde og basesammensetning som mål-cmv-dna. CMV-QS' deteksjonsprobebindingsregion er modifisert for å kunne skille CMV-QS-amplicon fra mål-cmv-amplicon. Under PCR-hybridiseringsfasen i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48- analysatoren, blir prøvene belyst og eksitert med filtrert lys, og filtrerte emisjonsfluorescensdata registreres for hver prøve. Avlesningene fra hver prøve korrigeres deretter for instrumentvariasjoner. Instrumentet sender disse fluorescensavlesningene til AMPLILINK-programvaren, og de blir lagret i en database. Forhåndsdefinerte kontrollkriterier brukes for å avgjøre om resultatsettene for CMV-DNA og CMV-QS- DNA kan aksepteres som valide resultater. Dersom resultatsettene ligger utenfor de forhåndsbestemte akseptkriteriene, vil de bli flagget. Etter at alle forhåndskontroller er fullført og godkjent, behandles fluorescensresultatene for å generere Ct-verdier for CMV-DNA og CMV-QS-DNA. De lotspesifikke kalibreringsverdiene som leveres sammen med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen, brukes til å beregne titerverdier for prøver og kontroller basert på Ct-verdier for CMV-DNA og CMV-QS- DNA. Titerresultatene rapporteres i kopier/ml. REAGENSER COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: ) CMV CS1 (reagenskassett med magnetiske glasspartikler) Magnetiske glasspartikler Tris-base-buffer 0,09 % natriumazid 0,1 % metylparaben CMV CS2 (CMV lyseringsreagenskassett) Natriumsitratdihydrat 42,5 % guanidintiocyanat 3,6 % polydocanol 1,8 % ditiotreitol Xn 42,5 % (vekt per vekt) guanidintiocyanat CMVCAP 72 tester 1 x 72 tester 1 x 72 tester Helseskadelig R20/21/22-R52/53-R32: Farlig ved innånding, hudkontakt og svelging. Skadelig for vannlevende organismer, kan forårsake uønskede langtidsvirkninger i vannmiljøet. Ved kontakt med syre utvikles meget giftig gass. S24/25-S36/37/39-S61: Unngå kontakt med huden og øynene. Bruk egnede verneklær, vernehansker og vernebriller/ansiktsskjerm. Unngå utslipp til miljøet. Se helse-, miljø- og sikkerhetsdatablad (HMS-datablad) for ytterligere opplysninger NO 6 Doc Rev. 2.0

7 CMV CS3 CMV multireagenskassett inneholder: Pase (proteinaseløsning) Tris-buffer < 0,05 % EDTA Kalsiumklorid Kalsiumacetat 7,8 % proteinase Glyserol Xn 7,8 % (vekt per vekt) proteinase 1 x 72 tester 1 x 3,8 ml Helseskadelig R36-R42: Irriterer øynene. Kan gi allergi ved innånding. S23-S45: Unngå innånding av damp. Ved uhell eller illebefinnende er omgående legebehandling nødvendig. Vis etiketten om mulig. EB (elueringsbuffer) Tris-base-buffer Natriumhydroksid 0,09 % natriumazid CMV CS4 CMV-testspesifikk reagenskassett inneholder: CMV QS (CMV kvantiteringsstandard) Tris-HCl-buffer EDTA < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) < 0,001 % ikke-infeksiøst plasmid-dna (mikrobielt) som inneholder CMV-primerbindingsekvenser og en unik probebindingsregion 0,05 % natriumazid CMV MMX (CMV Master Mix) Trisinbuffer Kaliumacetat Kaliumhydroksid < 20 % dimetylsulfoksid Glyserol < 0,05 % datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,01 % oppstrøms og nedstrøms CMV-primere < 0,01 % oligonukleotidaptamer < 0,01 % fluoroformerkede oligonukleotidprober spesifikke for CMV og CMV-kvantiteringsstandard < 0,05 % Z05 DNA-polymerase (mikrobiell) < 0,1 % AmpErase (uracil-n-glykosylase) enzym (mikrobiell) 0,09 % natriumazid MgCl 2 (CAP/CTM magnesiumløsning) < 0,6 % magnesiumklorid 0,09 % natriumazid 1 x 8,1 ml 1 x 72 tester 1 x 6,2 ml 1 x 3,2 ml 1 x 9,8 ml NO 7 Doc Rev. 2.0

8 CMV H(+)C (CMV høy positiv kontroll) < 0,001 % Lambda-fag som inneholder CMV-DNA Humant plasma, ikke-reaktivt med US FDA-lisensierte tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2 og HIV p24-antigen eller HIV-1-RNA, HBsAg. CMV-DNA er ikke detekterbart med PCR-metoden. 6 x 0,65 ml 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske Xi (3:1) blanding av 5-kloro-2-metyl-2H-isotiasol-3-en og 2-metyl-2H-isotiasol-3-en Irriterende S24-S37: Unngå hudkontakt. Bruk egnede vernehansker. R43: Kan gi allergi ved hudkontakt. CMV L(+)C (CMV lav positiv kontroll) < 0,001 % Lambda-fag som inneholder CMV-DNA i en gjennomsnittskonsentrasjon som er ca. 100-fold lavere enn gjennomsnittskonsentrasjonen av CMV-DNA i CMV H(+)C Humant plasma, ikke-reaktivt med US FDA-lisensierte tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2 og HIV p24-antigen eller HIV-1-RNA, HBsAg. CMV-DNA er ikke detekterbart med PCR-metoden. 6 x 0,65 ml 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske Xi (3:1) blanding av 5-kloro-2-metyl-2H-isotiasol-3-en og 2-metyl-2H-isotiasol-3-en Irriterende S24-S37: Unngå hudkontakt. Bruk egnede vernehansker. R43: Kan gi allergi ved hudkontakt. CMV ( ) C (CMV negativ kontroll) Humant plasma, ikke-reaktivt med US FDA-lisensierte tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2 og HIV p24-antigen eller HIV-1-RNA, HBsAg. CMV-DNA er ikke detekterbart med PCR-metoden. 6 x 0,65 ml 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske Xi (3:1) blanding av 5-kloro-2-metyl-2H-isotiasol-3-en og 2-metyl-2H-isotiasol-3-en Irriterende S24-S37: Unngå hudkontakt. Bruk egnede vernehansker. R43: Kan gi allergi ved hudkontakt. CMV H(+)C Clip (strekkodeklips for CMV høy positiv kontroll) CMV L(+)C Clip (strekkodeklips for CMV lav positiv kontroll) CMV ( ) C Clip (strekkodeklips for CMV negativ kontroll) 1 x 6 klips 1 x 6 klips 1 x 6 klips NO 8 Doc Rev. 2.0

9 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens (P/N: ) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens) Natriumsitratdihydrat < 0,1 % N-metylisotiazolon-HCl PG WR 1 x 5,1 l ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. B. Denne testen skal kun brukes for humant plasma med EDTA som antikoagulant. C. Ikke pipetter med munnen. D. Det må ikke spises, drikkes eller røykes i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. E. Unngå mikrobiell kontaminering og nukleasekontaminering av reagensene når du pipetterer ut porsjoner fra kontrollflasker. F. Bruk av sterile engangspipetter og DNase-frie pipettespisser anbefales. G. Kontroller fra ulike lot eller ulike flasker fra samme lot må ikke blandes sammen. H. Reagenskassetter eller kontroller fra ulike kit må ikke blandes. I. COBAS AmpliPrep-kassetter må ikke åpnes, og flasker må ikke byttes om, fjernes eller settes til. J. Kast ubrukte reagenser, avfall og prøver i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. K. Kit som er utgått på dato, må ikke brukes. L. Dataark om materialsikkerhet (MSDS) kan på forespørsel sendes fra ditt lokale Roche-kontor. M. Prøver og kontroller skal håndteres som infeksiøst materiale, og sikre laboratorierutiner må følges, for eksempel de som er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 og i CLSI-dokumentet M29-A3. 39 Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater grundig med en fersk løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. Merk: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. N. ADVARSEL: CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C inneholder humant plasma utskilt fra humant blod. Kildematerialet er testet og har vist seg å være ikke-reaktivt for hepatitt B overflateantigen (HBsAg), antistoffer mot HIV-1/2 og HCV og HIV p24-antigen eller HIV-1-RNA. Testing av negativt humant plasma med PCR-metoden viste ikke detekterbart CMV-DNA. Ingen kjente testmetoder kan fullstendig garantere at produkter fra humant blod ikke vil kunne overføre infeksiøse agens. Derfor må alt humant materiale betraktes som potensielt infeksiøst. CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C skal håndteres som infeksiøst materiale, og sikre laboratorierutiner må følges, for eksempel de som er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 og i CLSI-dokumentet M29-A3. 39 Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater grundig med en fersk løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. O. MGP, EB, CMV QS, MgCl 2 og CMV MMX inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid, helles i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå oppsamling av azid. P. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker ved håndtering av reagenser. Unngå kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra reagensene NO 9 Doc Rev. 2.0

10 Q. Ikke la CMV CS2 og flytende avfall fra COBAS AmpliPrep-instrumentet, som inneholder guanidintiocyanat, komme i kontakt med natriumhypoklorittløsning (blekemiddel). Disse blandingene kan produsere en svært giftig gass. R. Ved avhending av brukte COBAS AmpliPrep SPU-er (Specimen Processing Units), som inneholder guanidintiocyanat, må du unngå enhver kontakt med natriumhypoklorittløsning (blekemiddel). Disse blandingene kan produsere en svært giftig gass. OPPBEVARING OG HÅNDTERING A. Ikke frys reagenser eller kontroller. B. OppCbevar CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 og CMV CS4 ved 2 8 C. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til utløpsdato. Når de er åpnet, er disse reagensene stabile i 70 dager ved 2 8 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 og CMV CS4 kan brukes i maks. 6 instrumentsykluser, i maks. 100 timer totalt i COBAS AmpliPrep-instrumentet. Reagenser må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsykluser. C. Oppbevar CMV H(+)C, CMV L(+)C og CMV ( ) C ved 2 8 C. Kontrollene er stabile til angitt utløpsdato. Etter åpning må alle ubrukte rester kastes. D. Oppbevar strekkodeklips [CMV H(+)C Clip, CMV L(+)C Clip og CMV ( ) C Clip] ved 2 30 C. E. Oppbevar PG WR ved 2-30 C. PG WR er stabilt til angitt utløpsdato. Etter åpning er dette reagenset stabilt i 28 dager ved 2 30 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. MATERIELL SOM MEDFØLGER A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: ) CMVCAP CMV CS1 (CMV-reagenskassett med magnetiske glasspartikler) CMV CS2 (CMV lyseringsreagenskassett) CMV CS3 (CMV multireagenskassett) CMV CS4 (CMV-testspesifikk reagenskassett) CMV H(+)C (CMV høy positiv kontroll) CMV L(+)C (CMV lav positiv kontroll) CMV ( ) C (CMV negativ kontroll) CMV H(+)C Clip (strekkodeklips for CMV høy positiv kontroll) CMV L(+)C Clip (strekkodeklips for CMV lav positiv kontroll) CMV ( ) C Clip (strekkodeklips for CMV negativ kontroll) NO 10 Doc Rev. 2.0

11 B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens (P/N: ) PG WR PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens) MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Instrumentering og programvare COBAS AmpliPrep-instrument COBAS TaqMan -analysator eller COBAS TaqMan 48-analysator Tilleggsutstyr: dokkingstasjon Tilleggsutstyr: cobas p 630-instrument AMPLILINK-programvare, Versjon 3.3 Series Datastasjon for AMPLILINK-programvare, med skriver Manualer for AMPLILINK-programvare v3.3 Series: Instrumentmanual for COBAS AmpliPrep-instrument for bruk med COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren eller cobas p 630- instrumentet og AMPLILINK-programvaren, versjon 3.3 Series Instrumentmanual for COBAS TaqMan -analysator (pluss ev. dokkingstasjon) for bruk sammen med applikasjonsmanual for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.3 Series Instrumentmanual for COBAS TaqMan 48-analysatoren for bruk samen med applikasjonsmanualen for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.3 Series Applikasjonsmanual for AMPLILINK-programvaren versjon 3.3 Series for bruk med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren og COBAS AMPLICOR-analysatoren eller Applikasjonsmanual for AMPLILINK-programvaren versjon 3.3 Series for bruk med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren og cobas p 630-instrumentet Engangsartikler Prøvebehandlingsenheter: SPU-er Rør for innmating av prøver (S-rør) med strekkodeetiketter Stativ med K-spisser Stativ for K-rør NO 11 Doc Rev. 2.0

12 ANNET MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Prøvestativ (SK24-stativ) Reagensstativ SPU-stativ K-carrier K-carrier, løfteverktøy K-carrier-stativ (kun påkrevd for bruk med COBAS TaqMan 48-analysatoren) Pipetter med aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-frie spisser (kapasitet 1000 μl)* Engangshansker, uten pudder Vortexmikser * Pipettene må ha en nøyaktighet innenfor 3 % av angitt volum. Aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-frie spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering av prøver og amplicon. PRØVETAKING, PRØVETRANSPORT OG PRØVEOPPBEVARING Merk: Alle prøver og kontroller må behandles som om de er potensielt infeksiøse. Merk: Denne testen er kun validert for bruk sammen med humant plasma med EDTA som antikoagulant. Testing av andre prøvematerialer kan føre til feil resultat. A. Prøvetaking COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-test skal kun brukes for plasmaprøver. Blodprøver må tas i sterile rør med EDTA (lys lilla topp) som antikoagulant og blandet tilstrekkelig ifølge veiledningene fra glassprodusenten. B. Prøvetransport Oppbevar fullblod ved 2 25 C i maks. 6 timer. Separer plasma fra fullblod innen 6 timer etter prøvetaking ved å sentrifugere ved x g i 20 minutter ved romtemperatur. Overfør plasma til et sterilt polypropylenrør. Transport av fullblod, serum eller plasma må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale. 41 Fullblod må transporteres ved 2 25 C og sentrifugeres innen 6 timer etter prøvetaking. Plasma kan transporteres ved 2 8 C eller nedfryst ved 20 C. C. Prøveoppbevaring Plasmaprøver kan oppbevares ved 2 8 C i inntil 7 dager. Plasmaprøver har vist seg å være holdbare i 6 uker hvis de er nedfryst ved 20 C. Det anbefales at prøver oppbevares i porsjoner på μl i sterile, 2,0 ml polypropylrør med skrukorker (slik som Sarstedt ). Figur 4 viser holdbarhetsdata for prøver fra undersøkelser om prøveholdbarhet utført med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVtesten NO 12 Doc Rev. 2.0

13 Figur 4 CMV-stabilitet i EDTA-plasma Titer log 10 (kopier/ml) 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1, Prøve 2 8 ºC 0d 2 8 ºC 3d 2 8 ºC 7d 20 ºC 6u Plasmaprøver kan fryses ned og tines opptil 3 ganger uten betydelig tap av CMV-DNA. Figur 5 viser data fra en fryse/tine-studie utført på COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen. Figur 5 CMV-resultater etter inntil 3 fryse-tine-sykluser (F-T-sykluser) (EDTA-plasma) 3,50 Titer log10 (kopier/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1, Prøve 0x fryse/tine 1x fryse/tine 2x fryse/tine 3x fryse/tine NO 13 Doc Rev. 2.0

14 BRUKSANVISNING Merk: For mer detaljert informasjon, en detaljert beskrivelse av de mulige konfigurasjonene, utskrift av resultat og tolking av flagg, kommentarer og feilmeldinger, se (1) instrumentmanualen for COBAS AmpliPrep-instrumentet for bruk med COBAS TaqMan - analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren eller cobas p 630-instrumentet, og AMPLILINK-programvaren, versjon 3.3 Series, (2) instrumentmanualen for COBAS TaqMan -analysatoren (pluss ev. dokkingstasjon) for bruk sammen med applikasjonsmanualen for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.3 Series, (3) instrumentmanualen for COBAS TaqMan 48-analysatoren for bruk sammen med applikasjonsmanualen for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.3 Series, (4) applikasjonsmanualen for AMPLILINKprogramvaren versjon 3.3 Series for bruk med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren og COBAS TaqMan 48-analysatoren eller AMPLILINKprogramvaren versjon 3.3 Series for bruk med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren og cobas p 630-instrumentet. Størrelse på analyseserie Hvert kit inneholder reagenser som er tilstrekkelig for 72 tester, og disse kan utføres i analyseserier på 12 til 24 tester. Minst ett replikat av henholdsvis CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C må tas med i hver analyseserie (se "Kvalitetskontroll"). Arbeidsflyt Analyseringen i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren må startes innen 120 minutter etter at preparering av prøver og kontroller er fullført. Merk: Preparerte prøver og kontroller må ikke fryses ned eller oppbevares ved 2 8 C. Prøve- og kontrollpreparering Merk: Ved bruk av frosne prøver må prøvene stå i romtemperatur til de er helt tinte og deretter vortexes i 3 5 sekunder før bruk. Kontrollene skal tas ut fra kjølelagringen på 2 8 C og oppnå romtemperatur før bruk. Klargjøring av COBAS AmpliPrep-instrumentet Del A. Vedlikehold og gjennomskylling A1. COBAS AmpliPrep-instrumentet er klart for drift i stand-by-modus. A2. Slå datastasjonen for AMPLILINK-programvaren på (ON). Klargjør datastasjonen på følgende måte: a. Logg på operativsystemet Windows XP. b. Dobbeltklikk på ikonet for AMPLILINK-programvaren. c. Logg deg på AMPLILINK-programvare ved å taste inn tildelt bruker-id og passord. A3. Kontroller beholdningen av PG WR fra skjermbildet Status. Skift ut om nødvendig. A4. Utfør alle vedlikeholdsprosedyrer som er angitt på fanen Due. COBAS AmpliPrep-instrumentet vil automatisk skylle igjennom ("prime") systemet NO 14 Doc Rev. 2.0

15 Del B. Lasting av reagenskassetter Merk: Alle reagenskassetter skal tas ut fra 2 8 C lagringsstedet, umiddelbart lastes inn i COBAS AmpliPrep-instrumentet og skal stå i romtemperatur i instrumentet i minst 30 minutter før den første prøven skal analyseres. Ikke la reagenskassettene oppnå romtemperatur utenfor instrumentet, da det kan forårsake kondens på strekkodeetikettene. Ikke tørk av kondens fra strekkodeetikettene hvis dette skulle forekomme. B1. Plasser CMV CS1 i et reagensstativ. Plasser CMV CS2, CMV CS3 og CMV CS4 i et eget reagensstativ. B2. Sett inn reagensstativet som inneholder CMV CS1, i stativposisjon A i COBAS AmpliPrepinstrumentet. B3. Sett inn reagensstativet som inneholder CMV CS2, CMV CS3 og CMV CS4, i stativposisjon B, C, D eller E i COBAS AmpliPrep-instrumentet. Se tabell 1 for ytterligere informasjon. Del C. Lasting av engangsartikler Merk: Bestem antall COBAS AmpliPrep-reagenskassetter, prøveprepareringsenheter (SPU-er), Input S-rør, K-spisser og K-rør som skal brukes. Én SPU, ett Input S-rør, én K-spiss og ett K-rør er nødvendig for hver prøve eller kontroll. Det finnes flere mulige arbeidsflyter for bruk av COBAS AmpliPrep-instrumentet med COBAS TaqMan - analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren. Se tabell 1 for mer informasjon. Avhengig av arbeidsflyten som brukes, settes det inn passende antall reagenskassettstativer, prøvestativer med Input S-rør, SPU-stativer, K-spiss-stativer, K-rørstativer og K-carrier på K-carrier-stativer i de respektive stativposisjonene i COBAS AmpliPrep-instrumentet (se tabell 1 for mer informasjon). C1. Plasser SPU-ene i SPU-stativene, og sett stativene i posisjon J, K eller L i COBAS AmpliPrepinstrumentet. C2. Avhengig av den valgte arbeidsflyten settes fylte K-rør-stativ(er) i posisjon M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep-instrumentet. C3. Plasser fylte K-spiss-stativ(er) i posisjon M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep-instrumentet. C4. Til arbeidsflyt 3 med COBAS TaqMan 48-analysatoren, settes K-carriers på K-carrier-stativ(er) i posisjon M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep-instrumentet NO 15 Doc Rev. 2.0

16 Tabell 1 Mulige arbeidsflyter ved bruk av COBAS AmpliPrep-instrumentet med COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren Arbeidsflyt COBAS AmpliPrepinstrumentet pluss dokkingstasjon pluss COBAS TaqMan - analysatoren COBAS AmpliPrepinstrumentet pluss COBAS TaqMan - analysatoren COBAS AmpliPrepinstrumentet pluss COBAS TaqMan 48-analysator(er) Overføringsmodus for COBAS TaqMan - analysator eller COBAS TaqMan 48- analysator Automatisert overføring av K-carrier Manuell overføring av K-rør via prøvestativ til COBAS TaqMan - analysatoren Manuell overføring av K-carrier via K-carrier-stativ(er) til COBAS TaqMan 48-analysatoren Stativer og engangsartikler K-rør i fulle K-rør-stativer K-spisser i fulle K-spiss-stativer Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ K-rør i fulle K-rør-stativer K-spisser i fulle K-spiss-stativer Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ Etter fullført prøvepreparering: K-rør i prøvestativ (klar for manuell overføring) K-rør i prøvestativ K-spisser i fulle K-spiss-stativer Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ Tom, strekkodemerket K-carrier i K-carrier-stativ Etter fullført prøvepreparering: K-rør i K-carrier i K-carrier-stativ Posisjon på COBAS AmpliPrepinstrumentet M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Samme som over (F H) F H M P F H J L A B E M P Samme som over (M P) NO 16 Doc Rev. 2.0

17 Del D. Bestilling og innlasting av prøver D1. Klargjør prøvestativene på følgende måte: Fest en strekkodeklips til hver prøvestativposisjon der en prøve (S-rør) skal plasseres. Fest en av de spesifikke strekkodeklipsene for kontrollene [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C] i hver prøvestativposisjon der kontrollene (S-rør) skal plasseres. Kontrollenes strekkodeklips skal ha samme kontrollotnummer som lotnummeret på kontrollflaskene i kitet. Sørg for å sette riktig kontroll i posisjonen med tilsvarende strekkodeklips. Plasser ett Input S-rør i hver posisjon som har en strekkodeklips. D2. Bruk AMPLILINK-programvaren til å opprette prøvebestillinger for hver prøve og kontroll i vinduet Orders i mappen Sample. Velg den korrekte testfilen, og avslutt med å lagre. D3. Tildel prøve- og kontrollbestillinger til prøvestativposisjoner i vinduet Orders i mappen Sample Rack. Prøvestativnummeret må stemme overens med det stativet som ble klargjort i trinn D1. D4. Skriv ut rapporten Sample Rack Order og bruk den som arbeidsark. D5. Klargjør prøve- og kontrollstativ i det reserverte området for tilsetting av prøver og kontroller på følgende måte: Vortex hver prøve og kontroll [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C] i 3 til 5 sekunder. Vær forsiktig, slik at hanskene ikke kontamineres når prøver og kontroller behandles. D6. Overfør 500 μl av hver prøve og kontroll [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C] til det tilsvarende strekkodemerkede Input S-røret ved hjelp av en mikropipette med aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-fri spiss. Unngå å overføre partikler og/eller fibrinklumper fra den opprinnelige prøven til input S-røret. Prøver og kontroller må overføres til de rørposisjonene som er tildelt og registrert på arbeidsarket i trinn D4. Kontrollenes strekkodeklips skal ha samme kontrollotnummer som lotnummeret på kontrollflaskene i kitet. Sørg for å sette riktig kontroll i posisjonen med tilsvarende kontrollstrekkodeklips. Vær forsiktig, slik at den øvre delen av S-rørene ikke kontamineres av prøver eller kontroller. D7. Til arbeidsflyt 1 og 2 settes prøvestativ med Input S-rør i posisjon F, G eller H i COBAS AmpliPrepinstrumentet. D8. Til arbeidsflyt 3 ved bruk av COBAS TaqMan 48-analysatoren settes prøvestativ med Input S-rør og K-rør (ett til hvert Input S-rør, innsatt i posisjonen til høyre ved siden av Input S-rør) i posisjon F, G eller H i COBAS AmpliPrep-instrumentet. Del E. Start av kjøringen på COBAS AmpliPrep-instrumentet E1. Start COBAS AmpliPrep-instrumentet med AMPLILINK-programvaren. Del F. Avslutning av analyseserien på COBAS AmpliPrep-instrumentet og overføring til COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren (kun for arbeidsflyt 2 og 3) F1. Sjekk om det kommer opp flagg eller feilmeldinger. F2. Ta ut de preparerte prøvene og kontrollene fra COBAS AmpliPrep-instrumentet på enten prøvestativ (for COBAS TaqMan -analysatoren uten dokkingstasjon) eller K-carrier-stativ (for COBAS TaqMan 48-analysatoren), avhengig av valgt arbeidsflyt (se del G for ytterligere informasjon). F3. Fjern avfall fra COBAS AmpliPrep-instrumentet. Merk: Preparerte prøver og kontroller må ikke utsettes for lys etter at prøve- og kontrollprepareringen er fullført NO 17 Doc Rev. 2.0

18 Amplifikasjon og deteksjon Klargjøring av COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren Analyseringen i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren må startes innen 120 minutter etter at preparering av prøver og kontroller er fullført. Merk: Preparerte prøver og kontroller må ikke fryses ned eller oppbevares ved 2-8 C. Del G. Innlasting av preparerte prøver G1. Avhengig av den valgte arbeidsflyten utføres de nødvendige trinnene for å overføre K-rør til COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren: Arbeidsflyt 1: Automatisk overføring av K-carrier via dokkingstasjon til COBAS TaqMan -analysatoren. Dette krever ikke manuelle inngrep fra brukeren. Arbeidsflyt 2: Manuell overføring av K-rør i prøvestativ til COBAS TaqMan - analysatoren. Arbeidsflyt 3: Manuell overføring av K-carrier på K-carrier-stativ til COBAS TaqMan 48-analysatoren. Manuell overføring av K-carriers til COBAS TaqMan 48-analysatoren ved hjelp av løfteverktøyet for K-carrier. Del H. Start av kjøringen på COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48- analysatoren H1. Start COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren ved å foreta et av valgene nedenfor avhengig av hvilken arbeidsflyt som er brukt: Arbeidsflyt 1: Arbeidsflyt 2: Arbeidsflyt 3: Krever ingen inngrep fra brukeren. Automatisk start av COBAS TaqMan -analysatoren etter innsetting av prøvestativ. Fyll K-carrier med tomme K-rør hvis det er færre enn 6 K-rør i K-carrier. AMPLILINK-programvaren veileder i fyllingen. Åpne termoblokkdekselet, sett inn K-carrier i termoblokken og steng lokket. Start kjøringen på COBAS TaqMan 48-analysatoren. Del I. Avslutning av kjøringen på COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren I1. Skriv ut resultatrapporten når analyseserien i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren er fullført. Sjekk om det finnes flagg eller feilmeldinger i resultatrapporten. Prøver med flagg og kommentarer tolkes slik som beskrevet under "Resultater". Lagre dataene i arkivet når de er godkjent. I2. Ta ut brukte K-rør fra COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren NO 18 Doc Rev. 2.0

19 RESULTATER COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren beregner automatisk CMV-DNA-konsentrasjonen for prøvene og kontrollene. CMV-DNA-konsentrasjonen uttrykkes i kopier/ml. Konverteringsfaktoren mellom CMV-DNA-kopier/ml (som definert av COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen) og internasjonale enheter (IU)/mL er 1,1 kopier/iu [0,91 IU/kopi], ved bruk av den første WHO internasjonale standard for humant cytomegalovirus for nukleinsyreamplifikasjonsteknikker (NAT) (NIBSC 09/162) 40. Denne konverteringsfaktoren mellom "kopi" og "IU" kan være forskjellig for andre CMV-DNA-analyser. AMPLILINK-programvare: Bestemmer syklusterskelverdi (Cycle Threshold, Ct) for CMV-DNA og CMV-QS-DNA. Bestemmer CMV-DNA-konsentrasjon basert på Ct-verdiene for CMV-DNA og CMV-QS- DNA og de lotspesifikke kalibreringskoeffisientene som er angitt på kassettenes strekkoder. Bestemmer om beregnet kopier/ml for CMV L(+)C og CMV H(+)C faller innenfor de fastsatte akseptområdene. Validering av analyseserien AMPLILINK versjon 3.3 Series For å sikre at analyseserien er gyldig, sjekk i resultatvinduet i AMPLILINK-programvaren eller på utskriften om det finnes flagg og kommentarer. For kontrollbestillinger blir det foretatt en sjekk for å bestemme om kopier/ml-verdien for kontrollen er innenfor det angitte akseptområdet. Hvis kopier/ml-verdien for kontrollen ligger utenfor området, blir det opprettet et flagg for å angi at kontrollen ikke lyktes. Analyseserien er gyldig hvis det ikke fremkommer flagg for kontrollene [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C]. Analyseserien er ikke gyldig hvis noen av de følgende flaggene vises for CMV-kontrollene: Negativ kontroll Flagg Resultat Tolkning NC_INVALID CMV lav positiv kontroll Invalid Et ugyldig resultat eller et "gyldig" resultat som ikke var negativt for mål-cmv Flagg Resultat Tolkning LPCINVALID CMV høy positiv kontroll Invalid Et ugyldig resultat eller kontroll utenfor akseptområdet Flagg Resultat Tolkning HPCINVALID Invalid Et ugyldig resultat eller kontroll utenfor akseptområdet Hvis analyseserien er ugyldig, må hele oppsettet gjentas, inkludert preparering av prøver og kontroller, amplifikasjon og deteksjon NO 19 Doc Rev. 2.0

20 Tolking av resultater For å validere analyseserien må hvert prøvesvar kontrolleres for å se om det finnes noen flagg eller kommentarer på resultatutskriften. Tolk resultatene på følgende måte: En gyldig analyseserie kan inkludere både gyldige og ugyldige prøveresultater, avhengig av om flagg og/eller kommentarer er kommet opp for de ulike prøvene. Prøveresultater tolkes på følgende måte: Titerresultat Tolkning Target Not Detected <1.50E+02 cp/ml 1.50E+02 cp/ml og 1.00E+07 cp/ml Rapporter resultatene som "CMV-DNA ikke detektert". Beregnet kopier/ml er under analysens nedre kvantiteringsgrense. Rapporter resultater som "CMV-DNA detektert, mindre enn 150 CMV- DNA kopier/ml". Beregnede resultater er større enn eller lik 150 kopier/ml og mindre enn eller lik 1,00E+07 kopier/ml og ligger innenfor analysens lineære område. > 1.00E+07 cp/ml Beregnet kopier/ml ligger over analysens måleområde. Rapporter resultater som "større enn 1,00E+07 CMV-DNA kopier/ml". Hvis det er ønskelig med et kvantitativt resultat, kan den opprinnelige prøven fortynnes med CMV-negativt humant EDTA-plasma og analyseres på nytt. Multipliser det rapporterte resultatet med fortynningsfaktoren. Merk: Prøver som ligger høyere enn analysens måleområde, og som gir et ugyldig resultat med flagget "QS_INVALID", skal ikke rapporteres som > 1.00E+07 cp/ml. Den opprinnelige prøven bør fortynnes med CMV-negativt EDTA-plasma og analyseres på nytt. Multipliser det rapporterte resultatet med fortynningsfaktoren. Merk: Titerresultat "Failed". Tolkning: Prøven ble ikke riktig behandlet. Merk: Titerresultat "Invalid". Tolkning: Et ugyldig resultat. KVALITETSKONTROLL Ett replikat hver av COBAS TaqMan negativ kontroll, CMV lav positiv kontroll og CMV høy positiv kontroll må tas med i hver analyseserie. Analyseserien er gyldig hvis det ikke fremkommer flagg for kontrollene [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C]. Sjekk om det finnes flagg og kommentarer i analyseutskriften for å sikre at analyseserien er gyldig. Negativ kontroll CMV ( ) C skal vise resultatet "Target Not Detected". Hvis CMV ( ) C flagges som ugyldig, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøve- og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Roche-kontoret for teknisk hjelp hvis CMV ( ) C er ugyldig i flere gjentatte analyseserier. Positive kontroller Det akseptable titerområdet for CMV L(+)C og CMV H(+)C er angitt på strekkodene for reagenskassettene for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen. CMV-DNA kopier/ml for CMV L(+)C og CMV H(+)C må ligge innenfor de akseptable titerområdene. Hvis en av eller begge de positive kontrollene flagges som ugyldige, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøve- og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Rochekontoret for teknisk hjelp hvis CMV-DNA-titer for en av eller begge de positive kontrollene konsekvent er utenfor angitt akseptområde i flere analyseserier NO 20 Doc Rev. 2.0

21 FORSIKTIGHETSREGLER Som for andre laboratorieprosedyrer, er god laboratorieteknikk essensielt for å sikre optimal ytelse for denne analysen. TESTENS BEGRENSNINGER 1. Denne testen er kun validert for bruk sammen med humant plasma med EDTA som antikoagulant. Testing av andre prøvematerialer kan føre til feil resultat. 2. Pålitelige resultater er avhengig av adekvat prøvetaking, transport, oppbevaring og håndtering. 3. Tilstedeværelse av AmpErase-enzymet i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testens Master Mix reduserer risikoen for kontaminering fra amplicon. Men kontaminering fra CMVpositive kontroller og kliniske prøver kan kun unngås ved å bruke gode laboratorierutiner og ved å følge anvisningene i dette pakningsvedlegget nøye. 4. Dette produktet må kun brukes av personell som er opplært i PCR-teknikk. 5. Dette produktet kan kun brukes sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet og COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren. 6. I sjeldne tilfeller kan mutasjoner innenfor de høykonserverte regionene av virusgenomer som er dekket av COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testens primere og/eller prober, føre til manglende evne til å påvise viruset. 7. Deteksjon av CMV-DNA avhenger av antall viruspartikler som er til stede i prøven, og kan påvirkes av metoden for prøvetaking og pasientfaktorer (dvs. alder, tilstedeværelse av symptomer og/eller infeksjonsstadium). 8. På grunn av de naturlige forskjellene mellom teknologier anbefales det at brukerne utfører metodekorrelasjonsstudier i laboratoriet for å kvantifisere de teknologiske forskjellene før en ny teknologi tas i bruk NO 21 Doc Rev. 2.0

22 INTERFERERENDE SUBSTANSER Økte nivåer av triglyserider (opptil 3300 mg/dl), konjugert bilirubin (opptil 20 mg/dl), ukonjugert bilirubin (opptil 20 mg/dl), hemoglobin (opptil 200 mg/dl) og humant DNA (opptil 0,4 mg/dl) i prøver samt nærvær av autoimmune sykdommer eller respektive markører slik som systemisk lupus erytematose (SLE), revmatoid artritt (RA) og antinukleært antistoff (ANA) har vist seg ikke å interferere med kvantiteringen av CMV-DNA eller påvirke spesifisiteten for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen. Evalueringen ble utført i henhold til CLSI-retningslinje EP7-A2 41 ved bruk av én lot med reagenser for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen. Følgende medikamenter som er testet ved 3 ganger høyeste plasmakonsentrasjonsnivå (Cmax), har vist seg ikke å interferere i kvantiteringen av CMV-DNA eller påvirke spesifisiteten for COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan CMV-testen: Immunsuppressive medikamenter Antibiotika Azatioprin Sulfametoxazol Cyklosporin Trimetoprim Mykofenolatmofetil Cefotetan Mykofenolatnatrium Piperacillin Sirolimus Tazobaktamnatrium Takrolimus Klavulanatkalium Everolimus Ticarcillindinatrium Prednison Vancomycin Anti-CMV Ganciklovir Valganciklovir Cidofovir Foscarnet Soppdrepende midler Flukonazol NO 22 Doc Rev. 2.0