PCX. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, version 2.0. Tiltenkt bruk. Oppsummering og forklaring av testen FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK.

Transkript

1 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, version 2.0 PCX FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. Bestillings- COBAS AmpliPrep/ PCX 96 Tests P/N: informasjon COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 Tiltenkt bruk COBAS AmpliPrep System PWR 4 Liters P/N: Wash Reagent COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: Wash Buffer ART: US: COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus (HCV)-test, versjon 2.0 (v2.0) er en kvalitativ in vitro-test for deteksjon av hepatitt C-virus-RNA i humant serum og plasma ved hjelp av COBAS AmpliPrep-instrumentet for prøveopparbeiding og COBAS AMPLICOR -analysatoren for amplifikasjon og deteksjon. Tilstedeværelse av HCV-RNA er en bekreftelse på pågående HCVinfeksjon hos pasienter med kliniske og/eller biokjemiske tegn på leversykdom. Testen benytter revers transkripsjon av mål-rna for å generere komplementær-dna (cdna), amplifikasjon av mål-cdna ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR) og nukleinsyrehybridisering for å detektere HCV-RNA i humant serum eller plasma. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0 skal ikke brukes til screening av blod eller blodprodukter for tilstedeværelse av hepatitt C-virus. Oppsummering og forklaring av testen Hepatitt C-viruset infiserer 170 millioner mennesker over hele verden og er beskrevet som en en viruspandemi med fem ganger så høy prevalens som HIV-1- infeksjoner 1. HCV er et enkelttrådet, positive sense RNA-virus med et genom som består av ca nukleotider som koder for aminosyrer 2. HCV er et blodbåret virus som kan overføres via blod og blodprodukter. Utstrakt bruk av metoder for HCV-blodscreening har i vesentlig grad redusert risikoen for transfusjonsassosiert hepatitt. Insidensen av HCV-infeksjon er størst i forbindelse med intravenøst stoffmisbruk og noe mindre ved annen perkutan eksponering 4. Den globale prevalensen av HCV-infeksjon, vurdert ut fra immunserologi, varierer mellom 6 % til 28 % i Egypt, 1,8 % i USA 1 og 1,1 % til 1,2 % i Frankrike 3. Mellom 75 % og 80 % av seropositive pasienter er også viremiske 1,3. P/N: /2007, Revision 4.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 1/47

2 Tilstedeværelsen av anti-hcv-antistoffer hos pasienter som er smittet med HCV, har ført til utviklingen av immunserologiske tester som er spesifikke for disse antistoffene 4,5. Allerede etter implementering av disse testene ble forekomsten av post-transfusjonshepatitt redusert i hele verden. Supplerende analysering er blitt utført med RIBA (Recombinant Immunoblot Assay) for videre evaluering av prøver som er gjentatt reaktive i antistoff-screeninganalysen. Nylige undersøkelser har vist at tolkningen av denne supplerende testen er avhengig av pasientens risikostatus. I en lavrisikopopulasjon av blodgivere ble kun 50 % av RIBA-reaktive prøver bekreftet med en HCV-RNA-test 6,7,8. Et positivt RIBA-resultat er dermed ikke en sikker indikator på aktiv HCV-infeksjon, da pasienter som er blitt friske, kan forbli anti- HCV-positive i årevis 5. I tillegg har usikre supplerende testresultater blitt observert både hos nylig smittede personer som er under serokonvertering, så vel som hos personer med kronisk HCV-infeksjon 9,10. Immunserologisk analysering er et mål for nylig og/eller tidligere eksponering for HCV-infeksjon, men testen kan ikke skjelne mellom disse to. På det nåværende tidspunkt finnes det ingen immunologisk analyse for direkte deteksjon av HCVantigen. Ved tilfeller av akutt HCV-infeksjon kan også enkeltpersoner være ute av stand til å produsere antistoff mot HCV 11, og hos disse blir det umulig å diagnostisere pågående HCV-infeksjon med immunserologiske teknikker. Som et alternativ kan deteksjon av HCV-RNA med nukleinsyretester brukes for påvisning av en pågående infeksjon. Ved bruk av nukleinsyretester er det mulig å påvise HCV-viremi før immunologisk serokonvertering 12,13. I og med at nukleinsyretester kan påvise HCV- RNA direkte, dvs. uavhengig av pasientens immunologiske status, er en nukleinsyretest viktig for å påvise HCV-RNA hos pasienter med svekket immunforsvar 8. Testprinsipper COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus (HCV)-test, versjon 2.0 (v2.0), er en nukleinsyreamplifikasjonstest for deteksjon av hepatitt C- virus-rna i humant plasma eller serum. Prøveprepareringsprosedyren er automatisert ved hjelp av COBAS AmpliPrep-instrumentet, og amplifikasjon og deteksjon er automatisert ved hjelp av COBAS AMPLICOR -analysatoren. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-testen, v2.0 er basert på fem hovedprosesser: prøvepreparering for å isolere HCV-RNA, revers transkripsjon av mål-rna for å generere komplementært DNA (cdna) 1, PCR-amplifikasjon 1 av mål-cdna ved hjelp av HCV-spesifikke komplementære primere, hybridisering av de amplifiserte produktene til målspesifikke oligonukleotid-deteksjonsprober samt deteksjon av probebundne amplifiserte produkter ved kolorimetrisk bestemmelse. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0 muliggjør automatisert prøveprepareringsprosedyre etterfulgt av automatisert revers transkripsjon, PCR-amplifikasjon, hybridisering og deteksjon av mål-hcv-rna og HCV-internkontroll-RNA. Master Mix-reagenset inneholder et primerpar som er spesifikt for både HCV- og HCV-internkontroll-RNA. Deteksjon av amplifisert DNA utføres med målspesifikke oligonukleotidprober som gir en uavhengig identifikasjon av HCV-amplicon og HCV-internkontrollamplicon. Deteksjon av amplifisert HCV-internkontroll-DNA er valgfri, og utføres etter brukers ønske. Valg av mål Valget av mål-rna-sekvensen for HCV avhenger av identifisering av regioner i HCV-genomet som viser maksimal sekvenskonservering mellom de ulike HCVgenotypene Forskjellige oligonukleotider blir brukt ved prøvepreparering for å binde HCV-RNA og HCV-internkontroll-RNA, som primere i revers transkripsjon og amplifikasjon av HCV-RNA og HCV-internkontroll-RNA, og i deteksjon for å binde amplicon som produseres under amplifikasjonen av reverstranskribert HCV- RNA og HCV-internkontroll-RNA. 2/47 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 3/2007, Revision 4.0

3 HCV, v2.0 Derfor er riktig valg av prepareringsprobe, primere og deteksjonsprobe avgjørende for testens evne til å gjenfinne og detektere alle HCV-genotyper. Den 5' ikketranslaterte regionen (UTR) av HCV-genomet har vist seg å ha maksimal konservering av RNA-sekvens blant kjente HCV-genotyper 18,19. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-testen, v2.0 bruker en biotinylert prepareringsprobe, ST101BP, for å binde RNA under prøveprepareringen. Til revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon brukes primerne KY78 og KY80 som definerer en sekvens på 244 nukleotider innenfor det høykonserverte 5'-UTR for HCVgenomet 13. Sekvensen for prepareringsproben ST101BP ligger utenfor det amplifiserte området og er lokalisert i det høyest konserverte området innenfor 5'- UTR 19. Preparering av prøver Revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0 benytter automatisert prøvepreparering i COBAS AmpliPrep-instrumentet ved hjelp av DNAprobebindingsteknikk. COBAS AmpliPrep-instrumentet benytter forhøyet temperatur og et kaotropisk stoff til å frigjøre HCV-RNA fra viruspartikler og for å beskytte RNA fra RNaser i plasma eller serum. Et kjent antall HCV-internkontroll- RNA-molekyler tilsettes til hver prøve sammen med lyseringsreagenset og det biotinylerte prepareringsprobereagenset. Deretter senkes temperaturen for å muliggjøre hybridisering av HCV-RNA og HCV-internkontroll-RNA til den biotinylerte prepareringsproben, ST101BP. Hybridiserte ST101BP:HCV-RNA- og ST101BP:HCV-internkontroll-RNA-komplekser binder seg deretter til streptavidinbelagte magnetiske partikler. COBAS AmpliPrep-instrumentet separerer de streptavidinbelagte magnetiske partiklene med bundet RNA fra resten av reaksjonsblandingen og vasker de magnetiske partiklene før den preparerte prøven resuspenderes. Den preparerte prøven, som inneholder streptavidinbelagte magnetiske partikler med bundet HCV-RNA og HCV-internkontroll-RNA, tilsettes til amplifikasjonsblandingen. Mål-HCV-RNA og HCV-internkontroll-RNA blir deretter reverstranskribert, amplifisert og detektert i COBAS AMPLICOR - analysatoren ved hjelp av amplifikasjons- og deteksjonsreagensene som leveres med testkitet. Revers transkripsjon Revers transkripsjon og amplifikasjonsreaksjoner utføres med det termostabile rekombinante enzymet Thermus hermophilus DNA-polymerase (rtth pol). I nærvær av mangan (Mn 2+ ) og under passende bufferforhold, har rtth pol både revers transkriptase og DNA-polymeraseaktivitet 1. Dermed kan både revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon finne sted i samme reaksjonsblanding. Preparerte prøver tilsettes til amplifikasjonsblandingen i amplifikasjonsrør (A-rør) der både revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon skjer. Nedstrøms- eller antisense-primeren (KY78) er biotinylert ved den 5'-enden. Oppstrøms- eller senseprimeren (KY80) er ikke biotinylert. Reaksjonsblandingen varmes opp for å gjøre det mulig for nedstrømsprimeren å hybridisere spesifikt til mål-hcv-rna og til HCVinternkontroll-RNA. I nærvær av Mn 2+ og deoksynukleosidtrifosfater (dntp) i overskudd, inkludert deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksycytidin- og deoksyuridin- (i stedet for tymidin-) trifosfater, forlenger rtth pol den hybridiserte primeren og danner en DNA-tråd (cdna) som er komplementær til mål-rna. Målamplifikasjon Etter revers transkripsjon av mål-hcv-rna og HCV-internkontroll-RNA, varmes reaksjonsblandingen opp for å denaturere RNA:cDNA-hybriden og eksponere primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, hybridiseres oppstrøms-primeren (KY80) spesifikt til cdna-tråden, rtth pol forlenger primeren, og en ny DNA-tråd syntetiseres. Dette avslutter den første PCR-syklusen og gir en dobbelttrådet DNAkopi av HCV-RNAs og HCV-internkontroll-RNAs målregion. Reaksjonsblandingen varmes opp på nytt for å separere dette dobbelttrådete DNA-et og eksponere primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, vil primerne KY78 og KY80 hybridiseres til mål-dna. I nærvær av Mn 2+ og dntp i overskudd, forlenger rtth pol de hybridiserte primerne langs måltemplatene og produserer et dobbelttrådet DNA-molekyl med 244 basepar som kalles et amplicon. COBAS AMPLICOR - 3/2007, Revision 4.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 3/47

4 analysatoren gjentar denne prosessen automatisk i et bestemt antall sykluser, der hver syklus effektivt dobler mengden amplicon-dna. Ønsket antall sykluser er forhåndsprogrammert i COBAS AMPLICOR -analysatoren. Amplifikasjonen skjer kun i HCV-genomets region mellom primerne; hele genomet amplifiseres ikke. Internkontrollamplifikasjon I enzymbaserte amplifikasjonsprosesser som PCR, kan hemmere som kan finnes i prøvene, redusere effektiviteten. HCV-internkontroll er kommet som et tillegg til COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-testen, v2.0 for å gi mulighet for å identifisere behandlede prøver som inneholder substanser som kan interferere i PCR-amplifikasjonen. HCV-internkontroll er et RNA-transkript med primerbindingsregioner som er identiske med dem i mål-hcv-sekvensen, en randomisert intern sekvens med tilsvarende lengde og basesammensetning som mål- HCV-sekvensen, og en unik probebindende region som gjør det mulig å skille HCVinternkontroll fra målamplicon. Disse egenskapene ble valgt for å sikre en likeverdig amplifikasjon av HCV-internkontroll og mål-hcv-rna. HCV-internkontroll-RNA tilsettes hver prøve sammen med lyseringsreagenset og fungerer som en ekstraksjons- og amplifikasjonskontroll for hver enkelt prøve som behandles. Selektiv amplifikasjon Selektiv amplifikasjon av målnukleinsyre fra prøven oppnås i COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-testen, v2.0 ved hjelp av AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzym og deoksyuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin 20, men ikke DNA som inneholder deoksytymidin. Deoksyuridin finnes ikke i naturlig forekommende DNA, men finnes alltid i amplicon på grunn av bruken av deoksyuridintrifosfat i stedet for tymidintrifosfat som en av dntp-ene i Master Mix-reagenset. Derfor er det kun amplicon som inneholder deoksyuridin. Deoksyuridin gjør kontaminerende amplicon mottakelig for destruksjon av AmpErase-enzymet forut for amplifisering av mål-dna. AmpErase-enzymet, som inngår i Master Mix-reagenset, katalyserer nedbrytning av DNA som inneholder deoksyuridin, ved å bryte deoksyuridingruppens deoksyribosekjede ved C1- posisjonen. Ved temperaturøkning i det første varmetrinnet ved alkalisk ph i Master Mixen, brytes amplicon-dna-kjeden der deoksyuridinet finnes, noe som fører til at DNA ikke lenger er amplifiserbart. AmpErase-enzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 ºC, dvs. gjennom alle termosykliske trinn, og derfor blir ikke målamplicon ødelagt. Etter amplifikasjon denatureres eventuelle rester av enzymet ved å tilsette denatureringsløsning, og dermed hindres nedbryting av målamplicon. AmpEraseenzym i COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-testen, v2.0 har vist seg å kunne inaktivere minst 10 3 kopier av deoksyuridin-inneholdende HCV-amplicon per PCR. Hybridiseringsreaksjon Etter PCR-amplifikasjonen tilsetter COBAS AMPLICOR -analysatoren automatisk denatureringsløsning i A-rørene for kjemisk denaturering av HCVamplicon og HCV-internkontrollamplicon for å danne enkelttrådet DNA. Porsjoner av denaturert amplicon overføres deretter til deteksjonskoppene (D-kopper). En suspensjon av magnetiske deteksjonspartikler som er belagt med en oligonukleotid deteksjonsprobe som er spesifikk for HCV (KY150) eller HCV-internkontrollamplicon (SK535) tilsettes til hver enkelt D-kopp. Det biotinmerkede HCV- og HCV-internkontroll-ampliconet hybridiseres til de målspesifikke oligonukleotiddeteksjonsprobene som er bundet til de magnetiske deteksjonspartiklene. Denne hybridiseringen av amplicon til den målspesifikke proben øker testens samlede spesifisitet. 4/47 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 3/2007, Revision 4.0

5 HCV, v2.0 Deteksjonsreaksjon Etter hybridiseringsreaksjonen vasker COBAS AMPLICOR -analysatoren de magnetiske deteksjonspartiklene i D-koppen for å fjerne ubundet materiale, og deretter tilsettes avidin-hrp-konjugat (Avidin Horseradish-Peroxidase Conjugat). Avidin-HRP binder seg til det biotinmerkede ampliconet som er hybridisert til de målspesifikke oligonukleotide deteksjonsprobene bundet til de magnetiske deteksjonspartiklene. COBAS AMPLICOR -analysatoren fjerner ubundet konjugat ved å vaske de deteksjonsmagnetiske partiklene og tilsetter deretter en substratløsning som inneholder hydrogenperoksid og 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) i hver D-kopp. I nærvær av hydrogenperoksid katalyserer det partikkelbundne HRP oksidering av TMB, som danner et farget kompleks, og absorbansen av dette måles av COBAS AMPLICOR -analysator ved en bølgelengde på 660 nm. Reagenser COBAS AmpliPrep/ PCX 96 tester P/N: COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 Prøvepreparerings- og kontrollreagenser HCV CS1, v2.0 (HCV reagenskassett med mikropartikler, versjon 2.0) Natriumfosfatbuffer Natriumklorid <5 % suspensjon av Dynabeads (paramagnetiske partikler) belagt med streptavidin < 0,05 % detergent 0,09 % natriumazid HCV CS2, v2.0 (HCV lyseringsreagenskassett, versjon 2.0) Tris-HCl-buffer 44 % guanidintiocyanat 2,5 % ditiotreitol < 10 % polyetylenglykol < 0,5 % detergent + Xn 44 % (v/v) guanidintiocyanat 2 x 48 tester 2 x 48 tester Helseskadelig HCV CS3, v2.0 HCV multireagenskassett inneholder: HCV PROBE, v2.0 (HCV probereagens, versjon 2.0) Tris-HCl-buffer < 0,001 % HCV-spesifikk oligonukleotid prepareringsprobe ST101BP EDTA 0,09 % natriumazid 1 x 96 tester 1 x 4,8 ml 3/2007, Revision 4.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 5/47

6 HCV IC, v2.0 1 x 4,8 ml (HCV-internkontroll, versjon 2.0) Tris-HCl-buffer < 0,001 % aurintrikarboksylsyre < 0,001 % ikke-infeksiøst in vitro-transkribert RNA (mikrobielt) som inneholder HCV-prepareringsprobe- og HCV-primerbindingssekvenser og en unik deteksjonsprobebindingsregion < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,09 % natriumazid HCV DIL, v2.0 (HCV fortynningsløsning, versjon 2.0) Tris-HCl-buffer < 0,001 % aurintrikarboksylsyre < 0,005 % biotin < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,09 % natriumazid 1 x 7,2 ml HCV (+) C, v2.0 8 x 0,9 ml (HCV positiv kontroll, versjon 2.0) < 0,001 % Armored ( pansret ) RNA -konstruksjon som inneholder HCV-sekvenser (ikke-infeksiøs RNA i MS2 bakteriofag) Negativt Humant Plasma, ikke-reaktivt med US FDAlisensierte tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA er ikke detekterbart med PCR-metoder. 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske CAP ( ) C [COBAS AmpliPrep negativ kontroll (humant plasma)] Negativt Humant Plasma, ikke-reaktivt med US FDAlisensierte tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA er ikke detekterbart med PCR-metoder. 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske 8 x 0,9 ml Amplifikasjons- og deteksjonsreagenser HCV MMX, v2.0 8 x 0,7 ml (HCV Master Mix, version 2.0) Bicine-buffer 16 % DMSO Glyserol < 0,01 % rtth DNA-polymerase (rtth pol, mikrobiell) Kaliumacetat < 0,001 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,005 % KY78- og KY80-primere (KY78 er biotinylert) < 0,01 % AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzym (mikrobielt) 0,05 % natriumazid 6/47 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 3/2007, Revision 4.0

7 HCV, v2.0 HCV Mn 2+, v2.0 (HCV manganløsning, versjon 2.0) < 2 % mangan Eddiksyre Amarantfarge 0,05 % natriumazid CX PS1, v2.0 (HCV probesuspensjon 1, versjon 2.0) MES-buffer < 0,4 % suspensjon av Dynabeads (paramagnetiske partikler) belagt med HCV-spesifikk oligonukleotid-bindingsprobe KY150 0,09 % natriumazid CX4, v2.0 (HCV probesuspensjon 2, versjon 2.0) Natriumfosfatbuffer < 0,2 % solubiliserende middel 42,2 % natriumtiocyanat + Xn 42,2 % (v/v) natriumtiocyanat 8 x 0,1 ml 1 x 100 tester 1 x 100 tester Helseskadelig IC PS1 (Internkontroll probesuspensjon 1) MES-buffer < 0,4 % suspensjon av Dynabeads (paramagnetiske partikler) belagt med internkontroll-spesifikk oligonukleotid-bindingsprobe SK535 0,09 % natriumazid IC4 (Internkontroll probesuspensjon 2) Natriumfosfatbuffer < 0,2 % solubiliserende middel 24,9 % natriumtiocyanat DN4 (Denatureringsløsning) 1,6 % natriumhydroksid EDTA Tymolblått + Xi 1,6 % (v/v) natriumhydroksid 1 x 100 tester 1 x 100 tester 1 x 100 tester Irriterende 3/2007, Revision 4.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 7/47

8 CN4 (Avidin-HRP-konjugat) Tris-HCl-buffer < 0,001 % avidin-hrp-konjugat Bovint serumalbumin (pattedyr) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1 % fenol 1 % ProClin 150 konserveringsvæske SB3 (Substrat A) Sitratløsning 0,01 % hydrogenperoksid 0,1 % ProClin 150 konserveringsvæske SB (Substrat B) 0,1 % 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) 40 % dimetylformamid (DMF) T 40 % (v/v) dimetylformamid (DMF) 3 x 100 tester 5 x 75 tester 5 x 5 ml Giftig R: 61-20/21-36 Kan gi fosterskader. Farlig ved innånding og hudkontakt. Irriterer øynene. S: Unngå direkte kontakt innhent spesielle opplysninger før bruk. Ved uhell eller illebefinnende er omgående legebehandling nødvendig; vis etiketten om mulig. COBAS AmpliPrep System PWR 4 liter P/N: Wash Reagent Tris-HCl-buffer < 2 % kaliumacetat < 0,05 % detergent 0,3 % natriumazid + Xn 0,3 % (v/v) natriumazid Helseskadelig COBAS AMPLICOR WB 500 tester P/N: Wash Buffer ART: US: WB (10X-vaskekonsentrat) < 2 % fosfatbuffer < 9 % natriumklorid EDTA < 2 % detergent 0,5 % ProClin 300 konserveringsvæske 2 x 250 tester 8/47 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 3/2007, Revision 4.0

9 HCV, v2.0 Advarsler og forholdsregler Denne testen skal kun brukes til humane serum- eller plasmaprøver med EDTA som antikoagulant. Heparin har vist seg å hemme PCR og må ikke brukes i denne prosedyren. Ikke pipetter med munnen. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. Unngå mikrobiell kontaminering og ribonukleasekontaminering av reagensene når du pipetterer ut porsjoner fra reagensflasker. Bruk av sterile engangspipetter og RNase-frie pipettespisser anbefales. Reagenser fra ulike lot eller ulike flasker fra samme lot må ikke blandes sammen. Ikke bruk reagenser (inkludert kassetter) fra ulike reagenslot i samme analyseserie. COBAS AmpliPrep-kassetter må ikke åpnes, flasker må ikke byttes om, fjernes eller settes til. Kast ubrukte reagenser og avfall i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. Kit som er utgått på dato må ikke brukes. Dataark om materialsikkerhet (MSDS) kan på forespørsel sendes fra ditt lokale Roche-kontor. Arbeidsflyten på laboratoriet må være unidireksjonal, og starte i preamplifikasjonsområdet og fortsette videre til postamplifikasjonsområdet (amplifikasjon/deteksjon). Preamplifikasjonsaktiviteter omfatter reagenstillaging og prøvepreparering. Forbruksmateriell og utstyr må være dedikert til hver preamplifikasjonsaktivitet og ikke brukes til andre aktiviteter eller flyttes mellom områdene. Hansker må brukes i alle områder og må byttes før området forlates. Utstyr og forbruksmateriell som brukes til reagenstillaging, må ikke brukes til prøveeller kontrollpreparering eller pipettering eller bearbeiding av amplifisert DNA eller andre kilder for mål-dna. Forbruksmateriell og utstyr for postamplifikasjon skal forbli i postamplifikasjonsområdet. Prøver og kontroller må håndteres som smittebærende, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 og CLSI-dokumentet M29-A 22. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. Merk: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. 3/2007, Revision 4.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 9/47

10 ADVARSEL: CAP ( ) C og HCV (+) C, v2.0 inneholder negativt humant plasma utskilt fra humant blod. Kildematerialet er testet med US FDA-godkjente tester og har vist seg å være ikke-reaktivt for antistoffer mot HCV, antistoffer mot HIV-1/2, HIV-p24-antigen og hepatitt B-overflateantigen (HBsAg). Poolede enheter fra donorer ble også testet. HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA ble ikke påvist i PCR, og det ble ikke påvist HBV-core-antistoff med en FDA-lisensiert test. Ingen kjente testmetoder kan fullstendig garantere at produkter fra humant blod ikke vil kunne overføre infeksiøse agens. Derfor må alt humant materiale betraktes som potensielt infeksiøst. CAP ( ) C og HCV (+) C, v2.0 må håndteres som infeksiøst materiale, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 og i CLSI-dokumentet M29-A 22. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. Løsningene i HCV CS1, v2.0 og HCV CS3, v2.0; og HCV MMX, v2.0; HCV Mn 2+, v2.0; CX PS1, v2.0; IC PS1 og PWR inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid helles i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå azidoppbygging. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker når du håndterer PWR, HCV CS2, v2.0; HCV MMX, v2.0; DN4, CX4, v2.0; IC4; CN4, SB3, SB og aktivt substrat (blandet SB3 og SB-reagens). Unngå kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra disse reagensene. Unngå at SB eller det aktive substratet kommer i kontakt med hud og slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. SB og aktivt substrat inneholder dimetylformamid som er rapportert å være giftig i høye orale doser og som kan gi fosterskader. Unngå hudkontakt, innånding av damp og svelging. Ved hudkontakt må du vaske grundig med såpe og vann og oppsøke lege umiddelbart. Ikke la HCV CS2, v2.0, som inneholder guanidintiocyanat, eller CX4, v2.0 og IC4, som inneholder natriumtiocyanat, komme i kontakt med natriumhypoklorittløsning (blekemiddel). Disse blandingene kan produsere en svært giftig gass. Ved avhending av brukte COBAS AmpliPrep SPU-er (Sample Processing Units) som inneholder guanidintiocyanat, må du unngå enhver kontakt med natriumhypoklorittløsning (blekemiddel). Disse blandingene kan produsere en svært giftig gass. Krav til oppbevaring og håndtering Ikke frys reagenser eller kontroller. Oppbevar HCV CS1, v2.0; HCV CS2, v2.0 og HCV CS3, v2.0 ved 2 8 ºC. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til angitt utløpsdato. Etter åpning er disse reagensene stabile i 30 dager ved 2 8 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. HCV CS1, v2.0; HCV CS2, v2.0 og HCV CS3, v2.0 kan brukes i maksimalt 6 instrumentsykluser (16 timer per syklus) enten kontinuerlig om bord eller lagret ved 2 8 C mellom sykluser, opptil maks. 96 timer i alt i COBAS AmpliPrep-instrumentet. Reagenser må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsyklusene. Oppbevar CAP ( ) C og HCV (+) C, v2.0 ved 2 8 ºC. Når disse kontrollene er uåpnet, er de stabile til utløpsdato. Etter åpning må alle ubrukte rester kastes. 10/47 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 3/2007, Revision 4.0

11 HCV, v2.0 Oppbevar HCV MMX, v2.0 og HCV Mn 2+, v2.0 ved 2 8 ºC. Disse reagensene er stabile til angitt utløpsdato. Etter åpning må alle ubrukte rester av reagensene kastes. Working Master Mix (tillages ved å tilsette HCV Mn 2+, v2.0 til HCV MMX, v2.0) må oppbevares ved 2 8 C og brukes innen 4 timer etter tillaging. Oppbevar CX PS1, v2.0 og CX4, v2.0 ved 2 8 C. Disse reagensene er stabile til angitt utløpsdato. Så snart CX PS1, v2.0 og CX4, v2.0 er blandet, er det aktive reagenset stabilt i 30 dager ved 2 8 C. Det aktive reagenset kan brukes i maks. 6 instrumentsykluser (12 timer per syklus) og må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsyklusene. Oppbevar IC PS1 og IC4 ved 2 8 C. Disse reagensene er stabile til angitt utløpsdato. Så snart IC PS1 og IC4 er blandet, er det aktive reagenset stabilt i 30 dager ved 2 8 C. Det aktive reagenset kan brukes i maks. 6 instrumentsykluser (12 timer per syklus) og må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsyklusene. Oppbevar DN4 ved 2 25 C. DN4 er stabil til angitt utløpsdato. Så snart DN4 er åpnet, er den holdbar i 30 dager ved 2 8 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. DN4 kan brukes i maks. 6 instrumentsykluser (12 timer per syklus) og må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsyklusene. Oppbevar CN4 ved 2 8 C. CN4 er stabil til angitt utløpsdato. Så snart CN4 er åpnet, er den holdbar i 30 dager ved 2 8 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. CN4 kan brukes i maks. 6 instrumentsykluser (12 timer per syklus) og må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsyklusene. Oppbevar SB3 og SB ved 2 8 C. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til angitt utløpsdato. Det aktive substratet må tillages hver dag ved å blande SB3 og SB. Det aktive substratet er stabilt i 16 timer i COBAS AMPLICOR - analysatoren. SB3, SB eller det aktive substratet må ikke utsettes for metaller, oksideringsmidler eller direkte lys. Oppbevar PWR ved 2 32 C. PWR er stabil til angitt utløpsdato. Så snart det er åpnet, er dette reagenset stabilt i 30 dager ved 2 32 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. Oppbevar WB ved 2 30 C. WB er stabil til angitt utløpsdato. Undersøk WB før fortynning og, om nødvendig, varm opp til C for å løse opp ev. bunnfall. Den aktive vaskebufferen (1X), som tillages ved å fortynne WB 1:10 med destillert eller deionisert vann, må oppbevares ved 2 25 C i COBAS AMPLICOR - vaskebufferbeholderen og er stabil i 2 uker fra tillagingsdato. Oppbevar delvis brukte prøvepreparerings- og deteksjonsreagenser ved 2 8 C mellom analyseseriene. Kontroller utløpsdatoen til brukte, åpne eller aktive reagenser før de settes inn i COBAS AmpliPrep-instrumentet eller COBAS AMPLICOR - analysatoren. 3/2007, Revision 4.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 11/47

12 Materiell som medfølger COBAS AmpliPrep/COBAS PCX P/N: AMPLICOR HCV Test, v2.0 Prøvepreparerings- og kontrollreagenser HCV CS1, v2.0 (HCV reagenskassett med mikropartikler, versjon 2.0) HCV CS2, v2.0 (HCV lyseringsreagenskassett, versjon 2.0) HCV CS3, v2.0 (HCV multireagenskassett, versjon 2.0) HCV (+) C, v2.0 (HCV positiv kontroll, versjon 2.0) CAP ( ) C [COBAS AmpliPrep negativ kontroll (humant plasma)] Amplifikasjons- og deteksjonsreagenser HCV MMX, v2.0 (HCV Master Mix, version 2.0) HCV Mn 2+, v2.0 (HCV manganløsning, versjon 2.0) CX PS1, v2.0 (HCV probesuspensjon 1, versjon 2.0) CX4, v2.0 (HCV probesuspensjon 2, versjon 2.0) IC PS1 (Internkontroll probesuspensjon 1) IC4 (Internkontroll probesuspensjon 2) DN4 (Denatureringsløsning) CN4 (Avidin-HRP-konjugat) SB3 (Substrat A) SB (Substrat B) COBAS AmpliPrep System PWR P/N: Wash Reagent COBAS AmpliPrep-system vaskreagens COBAS AMPLICOR WB P/N: Wash Buffer ART: COBAS AMPLICOR vaskebuffer US: WB (10X-vaskekonsentrat) 12/47 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 3/2007, Revision 4.0

13 HCV, v2.0 Materiell som kreves, men som ikke medfølger Merk: Ved bruk av AMPLILINK software v2.41, se operatørmanualen for COBAS AmpliPrep-instrumentet og operatørmanualen for AMPLILINK Software, v2.4 Series. Ved bruk av AMPLILINK software v3.2 Series, se instrumentmanualen for COBAS AmpliPrep-instrumentet for bruk sammen med COBAS TaqMan - analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren, COBAS AMPLICOR - analysatoren og AMPLILINK Software, Version 3.2 Series og applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software Version 3.2 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48- analysatoren og COBAS AMPLICOR - analysatoren. Preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområdet COBAS AmpliPrep-instrument AMPLILINK-programvare Operatørmanualen for AMPLILINK Software, v2.4 Series eller applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software Version 3.2 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysator, COBAS TaqMan 48-analysator og COBAS AMPLICOR -analysator Metodemanual for COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0 Datastasjon for AMPLILINK-programvare, med skriver Operatørmanual for COBAS AmpliPrep-instrument eller instrumentmanual for COBAS AmpliPrep-instrument for bruk sammen med COBAS TaqMan - analysator eller COBAS TaqMan 48-analysator, COBAS AMPLICOR - analysator og AMPLILINK Software, Version 3.2 Series Prøveprepareringsenheter (SPU-er) Rør for innmating / input av prøver (S-rør) med strekkodeetiketter (P/N: ) Stativ med rør for prøveutbytte (P/N: ) K-spiss racks (P/N: ) Pipetter med aerosolbarriere- eller positive displacement RNase-frie spisser (kapasitet 1000 µl)* Vortexmikser Engangshansker, uten pudder Preamplifikasjon reagensklargjøringsområdet COBAS AMPLICOR -A-ring utstyrt med 12 A-rør (P/N: ) COBAS AMPLICOR -A-ringholder Eppendorf Multipette -pipette med 1,25 ml Combitip -reservoar (steril, individuelt pakket) Pipetter med aerosolbarriere- eller positive displacement RNase-frie spisser (kapasitet 50 µl og 100 µl)* Forseglbare plastposer Engangshansker, uten pudder Postamplifikasjon amplifikasjons-/deteksjonsområdet COBAS AMPLICOR -analysator koblet opp mot datastasjonen for AMPLILINK-programvaren og en skriver.** Operatørmanual for COBAS AMPLICOR -analysator 3/2007, Revision 4.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 13/47

14 Metodemanual for COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0 Operatørmanual for AMPLILINK Software, v2.4 Series eller applikasjonsmanual for AMPLILINK Software Version 3.2 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrument, COBAS TaqMan - analysator, COBAS TaqMan 48-analysator og COBAS AMPLICOR - analysator D-koppstativer (P/N: ) Destillert eller deionisert vann 5 ml serologiske pipetter Vortexmikser Engangshansker, uten pudder * Pipettene må ha 3 % nøyaktighet for angitt volum. Aerosolbarriere- eller positive displacement RNase-frie spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering mellom prøver og amplicon. ** Hvis COBAS AMPLICOR -analysatoren ikke er koblet opp mot en datastasjon med AMPLILINK-programvaren, må en separat skriver kobles til COBAS AMPLICOR -analysatoren. Prøvetaking, transport og oppbevaring Merk: Prøvetaking Alle prøver og kontroller må behandles som om de er potensielt infeksiøse. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0 skal kun brukes for serum- eller plasmaprøver. Blodprøver må tas i serumseparatorrør eller sterile rør med EDTA (lyselilla topp) som antikoagulant. Prøver som er antikoagulert med heparin kan ikke brukes for denne testen. Oppbevar fullblod ved 2 25 C i maks. 6 timer. Separer serum eller plasma fra fullblod innen 6 timer etter prøvetaking ved å sentrifugere ved 1500 x g i 20 minutter i romtemperatur. Overfør serum eller plasma til et sterilt polypropylenrør. Transport av prøver Oppbevaring av prøver Transport av fullblod, serum eller plasma må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale 23. Fullblod må transporteres ved 2 25 C og behandles innen 6 timer etter prøvetaking. Serum eller plasma kan transporteres ved 2 8 C eller nedfrosset ved 70 C eller kaldere. Serum- eller plasmaprøver kan oppbevares ved 2 8 C i opptil 72 timer eller nedfrosset ved 70 C eller kaldere. Det er anbefalt at prøvene oppbevares i porsjoner à µl i sterile 1,5 ml polypropylenrør med skrukork (for eksempel Sarstedt ). Serum eller plasmaprøver kan fryses ned og tines opptil to ganger. Bruksanvisning Merk: For mer detaljert informasjon om bruk av instrumentet, utskrift av resultater og tolking av flagg, kommentarer og feilmeldinger, se (1) operatørmanualen for COBAS AmpliPrep-instrumentet eller instrumentmanualen for COBAS AmpliPrep-instrumentet for bruk sammen med COBAS TaqMan -analysator eller COBAS TaqMan 48-analysator, COBAS AMPLICOR -analysator og AMPLILINK Software, Version 3.2 Series og (2) operatørmanualen for AMPLILINK Software, v2.4 Series eller applikasjonsmanual for AMPLILINK Software Version 3.2 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrepinstrument, COBAS TaqMan -analysator, COBAS TaqMan 48-analysator og COBAS AMPLICOR -analysator. 14/47 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 3/2007, Revision 4.0

15 HCV, v2.0 Merk: Merk: Merk: Alle amplifikasjons- og deteksjonsreagenser må ha romtemperatur før bruk. Prøveprepareringsreagenser skal tas ut fra oppbevaringen ved 2 8 C minst 30 minutter før den første prøven skal prosesseres på COBAS AmpliPrepinstrumentet. Serum- og plasmaprøver må ha romtemperatur før bruk. Bruk pipetter med aerosolbarriere- eller positive displacement spisser der dette er angitt. Vær svært forsiktig og varsom for å unngå kontaminering. Størrelse på analyseserier Hvert kit inneholder reagenser som er tilstrekkelig for åtte analyseserier à 12 tester. Disse kan utføres simultant eller i opptil seks separate instrumentsykluser. Minst ett replikat hver av COBAS AmpliPrep negativ kontroll og HCV positiv kontroll, versjon 2.0 må inngå i hver analyseserie med opptil 24 prøver og kontroller (se Kvalitetskontroll ). Forpakningen av amplifikasjonsreagenser består av flasker à 12 tester for engangsbruk. For å få en mest mulig effektiv bruk av reagenser, bør prøver og kontroller kjøres i analyseserier bestående av et antall som er multipler av 12. Arbeidsflyt COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV-test, v2.0 kan fullføres i løpet av én dag eller over to dager. Følg instruksjonene som beskrevet under Prøve- og kontrollpreparering og Revers transkripsjon, amplifikasjon og deteksjon i tur og orden hvis analyseringen skal fullføres i løpet av én arbeidsdag. Analyseringen kan fullføres over 2 dager. Arbeidsflyten for håndtering av preparerte prøver og kontroller når dette skal foregå over to dager, er som følger: Merk: Preparerte prøver og kontroller kan stå i COBAS AmpliPrep-instrumentet over natten i opptil 20 timer, eller de kan tas ut av COBAS AmpliPrepinstrumentet og oppbevares ved 2 8 C i opptil 7 dager i utmatingsrørene. Preparerte prøver og kontroller som er tatt ut av COBAS AmpliPrepinstrumentet på dag 1 og oppbevart ved 2 8 C i opptil 7 dager: For å utføre prøve- og kontrollpreparering på dag 1 og revers transkripsjon, amplifikasjon og deteksjon på dag 2, må du fullføre Klargjøring av COBAS AmpliPrep-instrumentet (del A) og Innlasting, oppstart og kjøring av COBAS AmpliPrep-instrumentet (del B) og utføre trinn 1 og 2 under Håndtering av preparerte prøver og kontroller (del D) på dag 1 og oppbevare de preparerte prøvene og kontrollene som angitt under Preparering av prøver og kontroller (del D, trinn 1). Dag 2 starter med Tillaging av reagenser (del C). Varm opp de preparerte prøvene og kontrollene ved romtemperatur, og fortsett med Håndtering av preparerte prøver og kontroller (del D, trinn 3) og gå deretter gjennom Revers transkripsjon, amplifikasjon og deteksjon. Preparerte prøver og kontroller som har stått i COBAS AmpliPrepinstrumentet over natten og er tatt ut på dag 2: For å utføre prøve- og kontrollpreparering på dag 1 og revers transkripsjon, amplifikasjon og deteksjon på dag 2, må du fullføre Klargjøring av COBAS AmpliPrep-instrumentet (del A) og Innlasting, oppstart og kjøring av COBAS AmpliPrep-instrumentet (del B). Dag 2 starter med Tillaging av reagenser (del C) og fortsetter med Håndtering av preparerte prøver og kontroller (del D) og går deretter videre til Revers transkripsjon, amplifikasjon og deteksjon. 3/2007, Revision 4.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 15/47

16 Prøve- og kontrollpreparering Del A: Klargjøring av COBAS AmpliPrep-instrumentet Utføres i: Preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområdet A1. Slå COBAS AmpliPrep-instrumentet på (ON). Merk: COBAS AmpliPrep-instrumentet vil automatisk gjøre en gjennomskylling ( priming ) av systemet når det slås på. A2. Slå datastasjonen for AMPLILINK-programvaren på (ON). Klargjør datastasjonen på følgende måte: a. Logg deg på Windows NT (med AMPLILINK v2.41) eller Windows XP (med AMPLILINK v3.2 Series). b. Dobbeltklikk på ikonet for AMPLILINK-programvaren. c. Logg deg på AMPLILINK-programvaren ved å taste inn tildelt bruker-id og passord. A3. Kontroller beholdningen av systemvaskreagens (PWR) ved hjelp av skjermbildet Status. Skift ut om nødvendig. A4. Utfør alle vedlikeholdsprosedyrer som er angitt på Due-fliken. A5. Ved bruk av nedfrossede prøver tines prøvene ved romtemperatur. A6. Bestem antall COBAS AmpliPrep-reagenskassetter, prøveprepareringsenheter (SPU-er), prøverør (S-rør) og K-spisser som skal brukes. Én SPU, ett input S- rør, én K-spiss og ett output S-rør er nødvendig for hver prøve eller kontroll. A7. Plasser to HCV CS1, v2.0 i et reagensstativ. Plasser to HCV CS2, v2.0 og én HCV CS3, v2.0 i et eget reagensstativ. A8. Sett inn reagensstativet som inneholder HCV CS1, v2.0 i posisjon A i COBAS AmpliPrep-instrumentet. A9. Sett inn reagensstativet som inneholder HCV CS2, v2.0 og HCV CS3, v2.0 i posisjon B, C, D eller E i COBAS AmpliPrep-instrumentet. A10. Plasser SPU-ene i SPU-stativene, og sett stativene i COBAS AmpliPrepinstrumentet. A11. Sett inn et passende antall fulle stativer for output-rør i COBAS AmpliPrepinstrumentet. A12. Sett inn et passende antall fulle K-spiss rack(s) i posisjon M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep-instrumentet. A13. Fest en strekkodeklips til hver posisjon i prøvestativ(ene) der en prøve eller kontroll (S-rør) skal innsettes. Plasser ett input S-rør i hver posisjon som er merket med en strekkodeklips. 16/47 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 3/2007, Revision 4.0

17 HCV, v2.0 A14. Sett inn prøvestativ(ene) i posisjon F, G eller H i COBAS AmpliPrepinstrumentet, og skriv ut et arbeidsskjema. Tildel og skriv ned de posisjonene som vil bli brukt for kontroller og prøver, i arbeidsskjemaet. A15. Fjern prøvestativ(ene) fra COBAS AmpliPrep-instrumentet, og flytt stativene til det dedikerte området for preamplifikasjon prøve- og kontrollpreparering, for tilsetting av prøver og kontroller. Del B: Innlasting, oppstart og kjøring av COBAS AmpliPrep-instrumentet Utføres i: Preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområdet B1. Vortex hver prøve og kontroll [CAP ( ) C og HCV (+) C, v2.0] i 3 til 5 sekunder. Sentrifuger hver prøve og kontroll kort, slik at væsken samles i bunnen av hvert rør. Vær forsiktig, slik at hanskene ikke kontamineres når prøver og kontroller behandles. B2. Overfør cirka 700 µl, men maks. 1,1 ml av hver prøve og kontroll [CAP ( ) C og HCV (+)C, v2.0] til det korresponderende strekkodemerkede S-røret ved hjelp av en mikropipette med aerosolbarriere- eller positive displacement RNase-fri spiss. Unngå å overføre partikler og/eller fibrinklumper fra den opprinnelige prøven til input S-røret. Prøver og kontroller må overføres til de rørposisjonene som er tildelt og notert på arbeidsskjemaet i trinn A14. B3. Sett inn prøvestativ(ene) med prøver og kontroller, i posisjon F, G eller H i COBAS AmpliPrep-instrumentet. B4. Bruk datastasjonen for AMPLILINK-programvaren, og opprett prøvebestilling under Sample-fliken. Skriv inn lotnummer og utløpsdato for kontrollkitet under Quality Control-fliken. B5. Start COBAS AmpliPrep-instrumentet med AMPLILINK-programvaren. Prøve- og kontrollpreparering utføres automatisk i COBAS AmpliPrepinstrumentet. B6. Før du forlater prøve- og kontrollprepareringsområdet må du ta følgende forholdsregler for å unngå kontaminering: Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater som er brukt under overføring av prøver og kontroller nøye med en fersk løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. Vask hendene. Bytt hansker. Bytt laboratoriefrakk. Del C: Tillaging av reagenser Utføres i: Preamplifikasjon reagensklargjøringsområdet Merk: Tillaging av reagenser (del C) skal utføres på dag to hvis testingen skal fullføres i løpet av to dager. C1. Bestem antall A-ringer som er nødvendig for analysering av prøver og kontroller. Plasser A-ringen(e) i A-ringholderen(e). 3/2007, Revision 4.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 17/47

18 C2. Klargjør Working Master Mix ved å tilsette 100 µl HCM Mn 2+, v2.0 til en flaske HCM MMX, v2.0. Det er ikke nødvendig å måle Master Mix-volumet. Tilsett 100 µl HCV Mn 2+, v2.0 til hele flasken med HCV MMX, v2.0. Sett på plass korken og bland godt ved å vende røret opp ned ganger. Ikke vortex Working Master Mix. Det rosa fargestoffet i HCV Mn 2+, v2.0 brukes til visuell bekreftelse på at HCV Mn 2+, v2.0 er tilsatt i HCV MMX, v2.0. Kast resterende HCV Mn 2+, v2.0. Working Master Mix må oppbevares ved 2 8 C og brukes innen 4 timer etter tillaging. C3. Tilsett 50 µl Working Master Mix i hvert A-rør ved hjelp av en multistep-pipette eller en pipette med aerosolbarriere- eller positive displacement spiss. Ikke sett på lokkene på A-rørene i dette trinnet. C4. Plasser A-ringen(e) som inneholder Working Master Mix, i en forseglbar plastpose, og lukk posen godt. Flytt A-ringen(e) til preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområdet. Oppbevar A-ringen(e) som inneholder Working Master Mix, ved 2 8 C i preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområdet til prøve- og kontrollprepareringen i COBAS AmpliPrep-instrumentet er fullført. Working Master Mix er stabil i 4 timer ved 2 8 C når A-rørene oppbevares i den forseglede plastposen. Del D: Håndtering av preparerte prøver og kontroller Utføres i: Preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområdet Merk: Preparerte prøver og kontroller kan kan stå i COBAS AmpliPrep-instrumentet i opptil 20 timer hvis analyseringen skal fullføres over to dager. D1. Når prøve- og kontrollprepareringen på COBAS AmpliPrep-instrumentet er fullført, tas prøvestativene som inneholder de preparerte prøvene og kontrollene ut av instrumentet. Når preparerte prøver og kontroller er tatt ut fra COBAS AmpliPrep-instrumentet, kan de oppbevares i output-rørene ved 2 8 C i opptil 7 dager. Merk: La output S-rørene og strekkodeklipsene bli værende i samme prøvestativ. Ikke skill S-rør fra sin tilhørende klips, bortsett fra når en preparert prøve eller kontroll overføres til et A-rør. 18/47 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 3/2007, Revision 4.0

19 HCV, v2.0 D2. Etter at prøvene er tatt ut fra COBAS AmpliPrep-instrumentet, må følgende utføres: a. Sjekk om det er kommet opp flagg eller feilmeldinger. Prøver med flagg og kommentarer tolkes på følgende måte: Flagg Kommentar Hva du må gjøre Volumet som ble detektert i input S-røret, var enten for høyt eller for lavt. Prøven ble ikke preparert, og input S-røret (indikert ved input-rør med gjennomsiktig kork) ble returnert S SampleInputMissing til prøvestativet. Prøver som ikke er preparert, må ikke amplifiseres. Korriger problemet og preparer prøven på nytt hvis prøven har vært i COBAS AmpliPrep-instrumentet i mindre enn 3 timer. Hvis den har vært ombord lenger enn 3 timer, må en annen utpipettering av den opprinnelige prøven prepareres. Utilstrekkelig reagensvolum er detektert. Prøver med R - flagg må ikke amplifiseres. For preparerte prøver (indikert med ICIQSReagentMissing grå kork), må en annen utpipettering av den opprinnelige prøven LysisReagentMissing prepareres. Når det gjelder ikke-preparerte (indikert ved R ProbeReagentMissing input-rør med gjennomsiktig kork), skal disse prepareres på nytt SpecimenDiluentMissing hvis prøven har vært i COBAS AmpliPrep-instrumentet i mindre enn 3 timer. Hvis den har vært om bord lenger enn 3 timer, må en annen utpipettering av den opprinnelige prøven prepareres. InstrumentTempOutOfRange Instrument- eller inkubatortemperaturene er utenfor ReagentTempOutOfRange akseptabelt område. Prøver med I -flagg må ikke amplifiseres. I Incubation60OutOfRange Kontakt det lokale Roche-kontoret. Klargjør en annen Incubations37OutOfRange utpipettering av originalprøven med nye reagenser. IncubationTargetReleaseOutOfRange Testkitet har overskredet utløpsdatoen. Analyseserien må ikke E TestKitExpired fortsettes. Bytt ut det utløpte kitet med et kit som ikke er utløpt på dato, før prøven prepareres. b. Sammenlign output-rørene for de preparerte prøvene med output-rørene for de preparerte kontrollene: Preparerte prøver og kontroller skal ha sammenlignbart volum i outputrørene. Preparerte prøver og kontroller skal ha sammenlignbar konsentrasjon av mikropartikler i output-rørene. Preparerte prøver som viser sammenlignbart volum og konsentrasjon av mikropartikler i forhold til kontrollene, kan gå videre til amplifikasjonen. Preparerte prøver eller kontroller med lavt utbyttevolum eller redusert konsentrasjon av mikropartikler må prepareres i COBAS AmpliPrep-instrumentet på nytt. Hvis det fortsatt er lavt utbyttevolum eller redusert konsentrasjon av mikropartikler i den reprosesserte prøven, bør en ny prøve innhentes fra pasienten, og testen tas på nytt. Merk: Hvis de preparerte prøvene og kontrollene ble oppbevart ved 2 8 ºC forut for amplifikasjon, må de varmes ved romtemperatur i minst 10 minutter før trinn D3 påbegynnes. 3/2007, Revision 4.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 19/47

20 D3. Vortex output S-rør med preparert prøve eller preparert kontroll i cirka 5 sekunder for å resuspendere de magnetiske partiklene som inneholder bundet RNA, før prøvematerialet tilsettes til A-røret. D4. Tilsett 50 µl av hver godt blandede og preparerte prøve og kontroll til et korresponderende A-rør med Working Master Mix, ved hjelp av en pipette med aerosolbarriere- eller positive displacement spiss. Bruk følgende prosedyre. Plasser pipettespissen som inneholder preparert prøve eller preparert kontroll, cirka halvveis ned i Working Master Mix, midt i A-røret. Press ut løsningen ved trykke ned stempelet til den første stopposisjonen med så mye kraft at løsningene blandes. Aspirer løsningen tilbake i spissen. Press ut løsningen ved å trykke ned stempelet til den andre stopposisjonen. Kork A-røret. D5. Gjenta trinn D3 og D4 for hver behandlede prøve og preparerte kontroll til alle er overført til A-rørene. Bruk en ny spiss for hver preparerte prøve og preparerte kontroll. D6. Skriv ned A-ring-posisjonene for de preparerte prøvene og kontrollene på A-ring-kartet. Amplifikasjonen må startes innen 45 minutter fra det tidspunktet da de preparerte prøvene og preparerte kontrollene ble tilsatt A-rørene med Working Master Mix. Flytt A-ringene som inneholder Working Master Mix samt de preparerte prøvene og preparerte kontrollene til amplifikasjons-/ deteksjonsområdet. Merk: Gjenværende materiale fra preparerte prøver eller kontroller kan oppbevares ved 2 8 C i opptil 7 dager fra dato for preparering. Revers transkripsjon, amplifikasjon og deteksjon Merk: Del E: For å amplifisere tidligere preparerte prøver og kontroller, utfør først trinnene under tillaging av reagenser (del C). La de tidligere nedkjølte preparerte prøvene og kontrollene stå i romtemperatur i minst 10 minutter, og fortsett med Håndtering av preparerte prøver og kontroller, del D, trinn 3. Klargjøring av COBAS AMPLICOR -analysator Utføres i: Postamplifikasjon amplifikasjons-/deteksjonsområdet E1. Utfør daglig vedlikehold av instrumentet, inkludert: Tørk av initialiseringsposten med en lofri og fuktig klut. Tørk av griperedskapet for D-kopper med en lofri og fuktig klut. Kontroller vaskebufferbeholderen og etterfyll ved behov. Klargjør aktiv vaskebuffer (1X) på følgende måte. Inspiser WB, og om nødvendig, varm opp til C for å løse opp ev. bunnfall. Tilsett 1 del WB til 9 deler destillert eller deionisert vann. Bland godt. Det bør være minst 3 4 liter aktiv vaskebuffer (1X) i systemets vaskebufferbeholder til enhver tid. Tøm avfallsbeholderen. Prime systemet. Kontroller sprøyter og slanger under primingen. Kontroller pipetteringsnålen under primingen. 20/47 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 3/2007, Revision 4.0