LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test

Transkript

1 LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. AmpliLute Liquid Media Extraction Kit EXTRN 50 Tests P/N: LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test LA HPV GT 48 Tests P/N: LINEAR ARRAY Detection Kit LA DK 96 Tests P/N: Well Tray with Lid 1 Each P/N: TILTENKT BRUK LINEAR ARRAY HPV (Human Papilloma Virus) Genotyping-testen er en kvalitativ in vitro-test for deteksjon av humant papillomavirus i kliniske prøver. Testen anvender amplifikasjon av mål-dna ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR) og nukleinsyrehybridisering for å detektere trettisju anogenitale HPV-DNA-genotyper [6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9), 81, 82 (MM4), 83 (MM7), 84 (MM8), IS39 og CP6108] i cervikale celleprøver tatt i cobas PCR-celleinnsamlingsmedium eller PreservCyt -løsning. OPPSUMMERING OG FORKLARING AV TESTEN Persisterende infeksjon med humant papillomavirus (HPV) er den viktigste årsaken til livmorhalskreft og forstadiet cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) 1 3. Tilstedeværelsen av HPV er blitt knyttet til mer enn 99 % av tilfellene av cervikale kreftformer over hele verden 3. HPV er et lite, ikke-innkapslet, dobbelttrådet DNAvirus med et genom på omtrent 8000 nukleotider. Det finnes mer enn 100 forskjellige genotyper av HPV og omtrent 40 forskjellige HPV-er som kan infisere genitale slimhinner hos mennesket. Men bare en mindre gruppe av disse seksuelt overførbare virusgenotypene er assosiert med høygradig cervikal dysplasi og Cancer Cervicis Uteri 3 5. Disse kalles høyrisiko-hpv, mens lavrisiko-hpv-genotypene ofte assosieres med godartede intraepiteliale lesjoner eller kondylomer. Seksuelt overførbare infeksjoner med HPV er ekstremt vanlig; det er estimert at opptil 75 % av alle kvinner på et eller annet tidspunkt blir eksponert for HPV 6. De fleste HPV-infeksjoner forsvinner spontant, men persistens av en høyrisiko-hpv er en signifikant risikofaktor for utvikling av livmorhalskreft. I utviklede land med screeningprogrammer for livmorhalskreft, er PAP-utstryk (oppkalt etter dr. George Papanicolaou) blitt brukt siden midten av 1950-tallet som den viktigste metoden for å oppdage tidlige tegn på livmorhalskreft. Selv om den har senket dødstallene grunnet livmorhalskreft dramatisk i disse landene, krever PAP-metoden at resultatene tolkes av svært godt øvede cytopatologer, og det er en relativt unøyaktig test med høy andel av falske negative resultater. Cytologiske uregelmessigheter som blir funnet med PAP-metoden er som regel forårsaket av infeksjon med HPV, men diverse inflammatoriske variasjoner eller prøvetakingsvariasjoner kan forårsake falske positive PAP-resultater. Utredning av en uregelmessig PAP-test omfatter gjentatt testing, kolposkopi og biopsi. En histologisk bekreftet høygradig lesjon må fjernes kirurgisk for å hindre utviklingen av invasiv livmorhalskreft. Papillomavirus er svært vanskelig å dyrke in vitro, og ikke alle pasienter med HPV har en påvisbar antistoffrespons. Derfor er nukleinsyre (DNA)-testing av PCR en sensitiv og ikke-invasiv metode for å påvise tilstedeværelsen av en aktiv, cervikal HPV-infeksjon. Rapporterte bruksområder for HPVtypingstest omfatter evaluering av ervervelse og clearance av spesifikke HPV-typer 7 ; monitorering av typespesifikk persistens av genotyper assosiert med høyere risiko for cervikale lidelser og cervikal carcinogenese 8 ; virkning av kirurgisk behandling 9, strålebehandling 10 eller kjemoterapi 11 mot HPVassosierte lesjoner (test for helbredelse); genotyping i utvalgte screeningprogrammer pre- og postvaksineintroduksjon 12 samt tilrettelegging av epidemiologiske undersøkelser vedrørende det naturlige forløpet for HPV-infeksjoner. TESTPRINSIPPER LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen er basert på fire hovedprosesser: prøvepreparering; PCRamplifikasjon 13 av mål-dna ved hjelp av HPV-primere; hybridisering av amplifiserte produkter til oligonukleotidprober og deteksjon av probebundne amplifiserte produkter med kolorimetrisk bestemmelse. Avsnittet for informasjon om dokumentrevisjon er plassert ved slutten av dette dokumentet NO 1 Doc Rev. 11.0

2 Prøvepreparering med AmpliLute Liquid Media Extraction-kitet gir et utbytte av mål-hpv-dna og humant genomisk DNA som egner seg til PCR-amplifikasjon. Master Mix-reagenset inneholder primere til amplifikasjon av DNA fra 37 HPV-genotyper og humant ß-globin-gen. Deteksjonen og genotype - bestemmelsen utføres ved hjelp av det denaturerte amplifiserte DNA-et og en gruppe av oligonukleotide prober som muliggjør uavhengig identifikasjon av individuelle HPV-genotyper. Prøvepreparering HPV-DNA frigjøres ved å lysere cervikale celleprøver gjennom denaturering ved fohøyede temperaturer. Lysering utføres under tilstedeværelse av proteinase K, kaotropisk stoff og detergent og etterfølges av isolering og opprensing av DNA i en kolonne og eluering med elueringsreagens. ß-globin-genet isoleres samtidig, og fungerer som en kontroll på cellullær adekvans, ekstraksjon og amplifikasjon for hver prosesserte prøve. PCR-amplifikasjon Valg av mål LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen bruker biotinylerte primere som definerer en sekvens av nukleotider innen den polymorfe L1-regionen i HPV-genomet som er cirka 450 basepar lang. En blanding av HPV-primere som er til stede i Master Mix, er designet for å amplifisere HPV-DNA fra 37 HPVgenotyper 14 inkludert 13 høyrisiko-genotyper* (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 og 68) 3 5. Bindingsprobesekvenser er lokalisert i de polymorfe regionene av L1 som bindes av disse primerne. Et ekstra primerpar er rettet mot det humane ß-globin-genet for å sikre kontroll av celleadekvans, ekstraksjon og amplifikasjon. Målamplifikasjon AmpliTaq Gold DNA-polymerase benyttes til hot start -amplifikasjon av mål-hpv-dna og ß-globin-kontrollen. Først varmes PCR-reaksjonsblandingen opp for å aktivere AmpliTaq Gold DNApolymerase, for å denaturere virus-dna og genomisk DNA og for å eksponere primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, hybridiseres oppstrøms- og nedstrømsprimere til mål-dna-sekvensene. I nærvær av Mg 2+ og dntp i overskudd, forlenger AmpliTaq Gold DNA-polymerase de hybridiserte primerne langs måltemplatene og produserer et dobbelttrådet HPV-mål-DNA-molekyl med omtrent 450 basepar eller et ß-globin-DNA-molekyl med 268 basepar som kalles et amplicon. Denne prosessen gjentas i et bestemt antall sykluser, der hver syklus effektivt dobler mengden amplicon-dna. Amplifikasjon skjer kun i den delen av HPV-genomet eller ß-globin-genet som ligger mellom de tilsvarende primerparene. Hele genomet blir ikke amplifisert. Selektiv amplifikasjon Selektiv amplifikasjon av målnukleinsyre fra prøven oppnås i LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen ved hjelp av AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzym og deoksyuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin 15, men ikke DNA som inneholder deoksytymidin. Deoksyuridin finnes ikke i naturlig forekommende DNA, men finnes alltid i amplicon på grunn av bruken av deoksyuridintrifosfat i tillegg til deoksytymidintrifosfat i Master Mixreagenset. Det er derfor kun amplicon som inneholder deoksyuridin. Deoksyuridin gjør kontaminerende amplicon mottakelig for destruksjon ved hjelp av AmpErase-enzymet forut for amplifikasjon av mål-dna. AmpErase-enzymet, som inngår i Master Mix-reagenset, katalyserer nedbrytning av DNA som inneholder deoksyuridin, ved å bryte deoksyuridingruppens deoksyribosekjede i C1-posisjonen. Ved temperaturøkningen i det første varmetrinnet ved alkalisk ph i Master Mixen, brytes amplicon-dnakjeden der deoksyuridinet finnes, noe som fører til at DNA ikke lenger er amplifiserbart. AmpEraseenzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 C, dvs. gjennom alle termosykliske trinn, og derfor blir ikke målamplicon ødelagt. Etter amplifikasjon denatureres eventuelle rester av enzymet ved å tilsette denatureringsløsning og dermed hindres nedbryting av målamplicon. Hybridiseringsreaksjon Etter PCR-amplifikasjon blir HPV-ampliconet og ß-globin-ampliconet kjemisk denaturert for å danne enkelttrådet DNA ved å tilsette denatureringsløsning. Porsjoner av denaturert amplicon overføres deretter til en korresponderende brønn i typingsbrettet som inneholder hybridiseringsbuffer og en enkelt LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strimmel som inneholder coatede linjer med HPV- og ß-globin-prober. Det biotinmerkede ampliconet hybridiseres kun til oligonukleotidprobene hvis ampliconet inneholder en sekvens som matcher sekvensen til den komplementære proben. LINEAR ARRAY HPV Genotypingstrimmelen er også coatet med en kryssreaktiv oligonukleotid probe som hybridiseres til HPV-genotypene 33, 35, 52 og 58. Amplicon som inneholder nær matchende sekvenser (kun 1 3 mismatcher) komplemen - tære til proben, vil hybridiseres til denne probelinjen. * LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen påviser HPV 66. Risikoklassifiseringen av HPV 66 er ikke konklusiv. Fagfellevurderte tidsskrifter er ikke enige om hvordan denne typen skal klassifiseres, om den skal identifiseres som lav, middels eller høyrisiko, avhengig av publikasjonen. Analyser som bruker HPV DNAdeteksjon til screening av livmorhalskreft varierer også mht. deteksjonstype; Noen regner HPV 66 til høyrisikotypen, og andre gjør det ikke NO 2 Doc Rev. 11.0

3 Deteksjonsreaksjon Etter hybridiseringsreaksjonen vaskes LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strimmelen godt for å fjerne ubundet materiale. Streptavidin-HRP-konjugat blir tilsatt til strimmelen. Streptavidin-HRP-konjugatet binder seg til det biotinmerkede ampliconet som er hybridisert til oligonukleotidprobene på strimmelen. Strimmelen vaskes igjen for å fjerne ubundet streptavidin-hrp-konjugat, og en substratløsning som inneholder hydrogenperoksid og 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) tilsettes til hver strimmel. I nærvær av hydrogenperoksid vil det bundne streptavidin-hrp katalysere oksidering av TMB, som danner et blåfarget kompleks som felles ut på de probeposisjonene der hybridisering har funnet sted. LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strimmelen leses deretter av visuelt ved å sammenligne mønsteret av blå linjer med en referanseguide for LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen. REAGENSER AmpliLute Liquid Media Extraction Kit EXTRN 50 tester AmpliLute ekstraksjonskit for flytende medier P/N: CAR 1 x 310 µg (Carrier RNA) Syntetisk RNA, lyofilisert (tilsett AVE) PK 1 x 1,25 ml (Proteinase K) Proteinase K, serinproteinase, tritirachiumalbum Xn Proteinase K + Helseskadelig R: 36/37/38-42/43 Irriterer øynene, luftveiene og huden. Kan gi allergi ved innånding og hudkontakt. S: /37 Unngå innånding av sprøytetåke. Unngå hudkontakt. Får man stoffet i øynene, skyll straks grundig med store mengder vann og kontakt lege. Bruk egnede verneklær og vernehansker. AVE (Elueringsbuffer) RNase-fritt vann < 0,09 % natriumazid AW2 (Vaskebuffer 2) Tris-HCl-buffer < 0,09 % natriumazid (tilsett absolutt etanol) ATL (Vevlyseringsbuffer) EDTA 10 % natriumdodesylsulfat AL (Lyseringsbuffer) 50 % guanidin-hcl Xn % guanidin-hcl + 4 x 2 ml 1 x 13 ml 1 x 10 ml 1 x 33 ml Helseskadelig NO 3 Doc Rev. 11.0

4 R: 22-36/38 Farlig ved svelging. Irriterer øynene og huden. S: Må ikke oppbevares sammen med næringsmidler, drikkevarer eller dyrefôr. Får man stoffet i øynene, skyll straks grundig med store mengder vann og kontakt lege. Bruk egnede verneklær. Ved svelging, kontakt lege omgående og vis denne beholderen eller etiketten. EXT (Kolonneforlengere, 3 ml) VC (VacConnectors) ELT (Elueringsrør 1,5 ml) CLM (QIAamp MinElute -kolonner) Silicamembran LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test LA HPV GT (P/N: ) HPV MMX (LINEAR ARRAY HPV Master Mix) Tris buffer Kaliumklorid < 0,02 % AmpliTaq Gold DNA-polymerase (mikrobiell) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzym (mikrobielt) < 0,001 % datp, dctp, dutp, dgtp, dttp < 0,001 % Hver av oppstrøms- og nedstrømsprimerne (biotinylerte) 0,06 % natriumazid HPV Mg 2+ (LINEAR ARRAY HPV-magnesiumløsning) < 1 % magnesiumklorid Amarantfarge 0,05 % natriumazid HPV (+) C (LINEAR ARRAY HPV positiv kontroll) Tris-HCl-buffer EDTA < 0,002 % Poly ra RNA (syntetisk) < 0,001 % ikke-infeksiøst plasmid-dna (mikrobielt) som inneholder HPV-sekvenser < 0,001 % ikke-infeksiøst plasmid-dna (mikrobielt) som inneholder humane ß-globin-sekvenser 0,05 % natriumazid HPV ( ) C (LINEAR ARRAY HPV negativ kontroll) Tris-HCl-buffer EDTA < 0,002 % Poly ra RNA (syntetisk) 0,05 % natriumazid HPV Strip (LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strimmel) Nylonstrimmel coatet med HPV-DNA-prober og 1 human ß-globin DNA-probe (ved høye og lave probekonsentrasjoner) 50 stk. 50 stk. 50 stk. 50 stk. 48 tester 4 x 0,58 ml 4 x 0,125 ml 4 x 0,5 ml 4 x 0,5 ml 4 x 12 tester NO 4 Doc Rev. 11.0

5 LINEAR ARRAY Detection Kit LINEAR ARRAY deteksjonskit (P/N: ) DN (Denatureringsløsning) 1,6 % natriumhydroksid EDTA Tymolblått Xi 1,6 % (v/v) natriumhydroksid + LA DK 96 tester 2 x 12 ml Irriterende SDS (SDS-konsentrat) 20 % natriumlaurylsulfat (SDS) 1 % ProClin 150 konserveringsvæske SSPE (SSPE-konsentrat) Natriumfosfatløsning Natriumklorid EDTA 1 % ProClin 150 konserveringsvæske SA-HRP (Streptavidin-HRP-konjugat) Streptavidin-HRP-konjugat ACES-buffer Natriumklorid 1 % ProClin 150 konserveringsvæske CIT (Sitratkonsentrat) Sitratløsning SUB A (Substrat A) Sitratløsning 0,01 % hydrogenperoksid 0,1 % ProClin 150 konserveringsvæske SUB B (Substrat B) 0,1 % 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) 40 % dimetylformamid (DMF) T 40 % (v/v) dimetylformamid (DMF) 4 x 27 ml 2 x 160 ml 2 x 2 ml 2 x 36 ml 3 x 160 ml 3 x 40 ml Giftig R: 61-20/21-36 Kan gi fosterskader. Farlig ved innånding og hudkontakt. Irriterer øynene. S: Unngå direkte kontakt innhent spesielle opplysninger før bruk. Ved uhell eller illebefinnende er omgående legebehandling nødvendig; vis etiketten om mulig NO 5 Doc Rev. 11.0

6 ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. B. Denne testen skal kun brukes for humane celleprøver tatt på cobas PCR-celleinnsamlings - medium eller PreservCyt-løsning. C. Ikke pipetter med munnen. D. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. E. Unngå mikrobiell kontaminering og DNA-kontaminering av reagensene når du pipetterer ut porsjoner fra reagensflasker. Bruk av sterile engangspipetter og DNA-frie og DNase-frie pipettespisser anbefales. F. Reagenser fra ulike loter eller ulike flasker fra samme lot må ikke blandes sammen. G. Kast ubrukte reagenser og avfall i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. H. Kit som er utgått på dato må ikke brukes. I. Dataark om sikkerhet (SDS) kan på forespørsel sendes fra ditt lokale Roche-kontor. J. Arbeidsflyten på laboratoriet må være unidireksjonal, og starte i preamplifikasjonsområdet og fortsette videre til postamplifikasjonsområdet (amplifikasjon/deteksjon). Preamplifikasjonsaktiviteter må starte med reagenstillaging og fortsette med prøvepreparering. Forbruksmateriell og utstyr må være dedikert til hver preamplifikasjonsaktivitet og ikke brukes til andre aktiviteter eller flyttes mellom områdene. Hansker må brukes i alle områder og må byttes før området forlates. Utstyr og forbruksmateriell som brukes til reagenstillaging må ikke brukes til prøvepreparering eller pipettering eller bearbeiding av amplifisert DNA eller andre kilder for mål-dna. Forbruksmateriell og utstyr for postamplifikasjon skal forbli i postamplifikasjonsområdet til enhver tid. K. Prøver må håndteres som infeksiøse, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 16 og CLSI-dokumentet M29-A3 17. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en fersk løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. MERK: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. L. AW2, AVE, HPV MMX, HPV Mg 2+, HPV ( ) C og HPV (+) C inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid helles i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå azidoppbygging. M. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker når du håndterer AL, PK, HPV MMX, HPV Mg 2+, DN, SA-HRP, SUB A, SUB B og aktivt substrat (blandet SUB A- og SUB B-reagens). Unngå kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra disse reagensene. N. SUB B og det aktive substratet inneholder dimetylformamid som er rapportert å være giftige i høye orale doser, og kan gi fosterskader. Unngå hudkontakt, innånding av damp og svelging. Ved hudkontakt må du vaske grundig med såpe og vann og oppsøke lege umiddelbart. O. AL inneholder guanidinhydroklorid, som sammen med blekemiddel kan danne svært reaktive stoffer. Hvis væske som inneholder denne bufferen søles, må du rengjøre med passende laboratorierengjøringsmiddel og vann. Hvis den utsølte væsken inneholder potensielt infeksiøse agens, må det affiserte området rengjøres først med laboratorierengjøringsmiddel og vann, og deretter med 0,5 % natriumhypokloritt. Ikke tilsett blekemiddel eller syreløsninger direkte i avfall som inneholder AL. P. Glass- eller plastbeholdere som er under vakuum, kan implodere under bruk. Dette kan medføre personskade. Bruk av øyebeskyttelse anbefales på det sterkeste ved bruk av glass- eller plastbeholdere under delvis vakuum. Dette er for å unngå personskader. Det må kun brukes beholdere som er spesielt utviklet for denne bruken. Ikke bruk beholdere for vakuumapplikasjoner hvis de ikke er utviklet for å motstå vakuumtrykk, hvis beholderen er skrapet opp, har sprekker eller revner eller hvis beholderen er klemt på en slik måte at det medfører svekkelse, eller hvis beholderen holdes i hånden. Q. Kun LINEAR ARRAY HPV Master Mix må brukes sammen med LINEAR ARRAY HPV Genotypingtesten. AMPLICOR HPV Master Mix kan ikke brukes med LINEAR ARRAY HPV Genotypingtesten NO 6 Doc Rev. 11.0

7 OPPBEVARING OG HÅNDTERING A. Ikke frys ned reagensene med mindre noe annet er angitt. B. Oppbevar CLM og PK fra AmpliLute Liquid Media Extraction-kitet ved 2 8 C. Oppbevar andre reagenser fra AmpliLute Liquid Media Extraction-kitet ved 2 25 C. Etter åpning kan ubrukte deler av PK oppbevares i opptil 2 måneder ved 2 8 C. ATL og AL kan oppbevares i opptil 2 måneder ved 2 25 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. Når det er rekonstituert med AVE, kan CAR oppbevares i opptil 24 timer ved 2 8 C eller fordeles og fryses ved 20 C i opptil 2 måneder. Etter tilsetning absolutt alkohol til AW2, kan ubrukt buffer lagres ved 2 25 C i 2 måneder eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. Når rekonstituert CAR er tilsatt til AL, kan ubrukte deler av aktiv AL oppbevares ved 2 8 C i opptil 48 timer. C. Oppbevar HPV MMX og HPV Mg 2+ ved 2 8 C. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til utløpsdato. Etter åpning må alle ubrukte rester av reagensene kastes. Working Master Mix (klargjort ved tilsetning av HPV Mg 2+ til HPV MMX) må oppbevares ved 2 8 C og brukes innen 6 timer etter tillaging. D. Oppbevar HPV ( ) C og HPV (+) C ved 2 8 C. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til utløpsdato. Etter åpning må alle ubrukte rester av reagensene kastes. E. Oppbevar HPV-strimler (HPV Strip) ved 2 8 C. Når dette reagenset er uåpnet, er det stabilt til utløpsdato. Etter åpning må alle ubrukte strimler kastes. F. Oppbevar DN ved 2 25 C. Når DN er uåpnet, er den stabil til utløpsdato. Så snart DN er åpnet, er den holdbar i 3 måneder ved 2 25 C (eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først). G. Oppbevar CIT, SA-HRP, SUB A og SUB B ved 2 8 C. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til utløpsdato. Så snart disse reagensene er åpnet, er de holdbare i 1 måned ved 2 8 C (eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først). H. Oppbevar SDS og SSPE ved 2 8 C. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til utløpsdato. Så snart de er åpnet, er disse reagensene holdbare i 1 måned ved 2 8 C (eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først). Det dannes et bunnfall i SDS og SSPE under oppbevaring ved 2 8 C. Varm opp ved 53 C ± 2 C i maks. 30 minutter før bruk, og bland godt for å løse opp bunnfallet. Aktive hybridiserings- og vaskebuffere, tillaget ved fortynning av SDS og SSPE med destillert eller deionisert vann, må oppbevares ved romtemperatur i en ren, lukket beholder, og er holdbare i 30 dager etter tillaging. I. Aktivt konjugat må nylages hver dag ved å blande SA-HRP med aktiv ambient (romtemperert) vaskebuffer. Konjugatet er stabilt i 3 timer i romtemperatur. J. Det aktive substratet må nylages hver dag ved å blande SUB A med SUB B. Substratet er stabilt i romtemperatur i 3 timer når det beskyttes mot lys. SUB A, SUB B eller det aktive substratet må ikke utsettes for metaller, oksideringsmidler eller direkte lys. K. Aktiv sitratbuffer, tillaget ved fortynning av CIT med destillert eller deionisert vann, må oppbevares ved romtemperatur i en ren, lukket beholder. Bufferen kan oppbevares i 30 dager etter tillaging. MATERIELL SOM MEDFØLGER A. AmpliLute Liquid Media Extraction Kit AmpliLute ekstraksjonssett for flytende medier (P/N: ) CAR (Carrier RNA) PK (Proteinase K) AVE (Elueringsbuffer) AW2 (Vaskebuffer 2) ATL (Vevlyseringsbuffer) AL (Lyseringsbuffer) EXT (Kolonneforlengere, 3 ml) EXTRN NO 7 Doc Rev. 11.0

8 VC (VacConnectors) ELT (Elueringsrør 1,5 ml) CLM (QIAamp MinElute -kolonner) B. LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test (P/N: ) HPV MMX (LINEAR ARRAY HPV Master Mix) HPV Mg 2+ (LINEAR ARRAY HPV-magnesiumløsning) HPV (+) C (LINEAR ARRAY HPV positiv kontroll) HPV ( ) C (LINEAR ARRAY HPV negativ kontroll) HPV Strip (LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strimmel) Reference Guide LA HPV GT (LINEAR ARRAY HPV Genotyping-test referanseguide) C. LINEAR ARRAY Detection Kit LINEAR ARRAY deteksjonskit LA DK (P/N: ) DN (Denatureringsløsning) SDS (SDS-konsentrat) SSPE (SSPE-konsentrat) SA-HRP (Streptavidin-HRP-konjugat) CIT (Sitratkonsentrat) SUB A (Substrat A) SUB B (Substrat B) D. 24-Well Tray with Lid 24-brønnersbrett med lokk (P/N: ) MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Preamplifikasjon reagensklargjøringsområdet Bruk MicroAmp reaksjonsrør (AB# N ), korker (AB# N eller AB# N ), plate/låsemekanisme-enhet (AB# ) eller Ready-Pak MicroAmp Assembly (AB# ) og platebase (AB# N ) til Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System Forseglbar plastpose Eppendorf Multipette -pipette* 1,0 ml eller 1,25 ml Eppendorf Combitip plus (steril, individuelt pakket)* Pipetter (kapasitet 50 µl til 125 µl)* med aerosolbarriere- eller positive displacement DNAog DNase-frie spisser Engangshansker, uten pudder NO 8 Doc Rev. 11.0

9 Preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområdet Eppendorf Multipette-pipette * 1,0 ml og 5,0 ml Eppendorf Combitip plus (steril, individuelt pakket)* Pipetter (kapasitet 20 µl, 200 µl og 1000 µl)* med aerosolbarriere- eller positive displacement DNA- og DNase-frie spisser Sterile 2,0 ml rør med skrukork (f.eks. Sarstedt ) Rørstativ (f.eks. Sarstedt ) Absolutt etanol som oppfyller ACS-spesifikasjoner Sterile konisk formede rør av polypropylen; 15 ml og 50 ml: (Corning og eller tilsvarende) Sterile serologiske engangspipetter (5 ml, 10 ml og 25 ml) Pipet-Aid (Drummond eller tilsvarende) Mikrosentrifuge (min. RCF x g), Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M, eller tilsvarende Vortexmikser 56 C ± 2 C og 70 C ± 2 C varmeblokker Vakuummanifold (f.eks., QIAvac 24, kat. nr ; QIAvac 24 Plus, kat. nr med QIAvac Connecting System, kat. nr ) Vakuumkilde [f.eks. en pumpe som kan yte et vakuum på 800 til 900 mbar, KNF Neuberger LABOPORT modell UN840.3FTP (115 V, 60 Hz) eller modell N840.3FT.18 (230 V, 50 Hz) eller QIAGEN-vakuumpumpe, P/N: (110 V, 60 Hz), (115 V, 60 Hz) eller (230 V, 50 Hz)] med slanger til manifolden Vakuumregulator (QIAGEN kat. nr ), valgfritt Prøvetakingsrør (2 ml, QIAGEN kat. nr ), valgfritt Engangshansker, uten pudder Postamplifikasjon amplifikasjons-/deteksjonsområdet Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, P/N: ) Sterile serologiske engangspipetter av polystyren (5 ml, 10 ml og 25 ml) Multikanalpipette (kapasitet 100 µl)* Pipetter (kapasitet 20 µl, 200 µl og 1000 µl)* med aerosolbarriere- eller positive displacement DNA- og DNase-frie spisser Vortexmikser Destillert eller deionisert vann 53 C ± 2 C ristevannbad som kan yte cirka 60 RPM (Bellco Hotshaker Plus, P/N: (115 V, 60 Hz), eller P/N: (230 V, 50 Hz) eller tilsvarende) 53 C ± 2 C vannbad Orbitalrister som kan yte cirka 60 RPM Pinsett i rustfritt stål (VWR-nr eller tilsvarende) Vann- / kjemikalie- / varmebestandig tusj (Sharpie Industrial Super Permanent Marker, P/N: eller tilsvarende) Vakuumaspirasjonsapparat med en passende væskeoppsamlingsbeholder (PYREX, filterflaske med tykke vegger, Corning P/N: L eller tilsvarende) 12-kanals væskestrømsplitter/aspirator (Art Robbins Instruments, P/N: ) Blyringlodd, 0,45 kg (1 lb.) (VWR-nr eller tilsvarende) Oppbevaringsflasker eller -kolber, 1 l, 2 l, 3 l 100 ml, 250 ml, 500 ml begerglass 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1 l graderte målesylindre Eppendorf Multipette-pipette* 50 ml Eppendorf Combitip plus (steril, individuelt pakket) NO 9 Doc Rev. 11.0

10 50 ml adapter Eppendorf Biopur (P/N: ) RBS35 vaskeløsning for brett (VWR-nr. PI27952 / Pierce-nr ) Engangshansker, uten pudder * Pipettene må ha en nøyaktighet innenfor 3 % av angitt volum. Aerosolbarriere- eller positive displacement DNAog DNase-frie spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering av prøver og amplicon. TAKING, TRANSPORT OG OPPBEVARING AV PRØVER MERK: Alle prøver må behandles som om de er potensielt smittebærende. A. Taking av prøver Kun cervikale celleprøver som er tatt i cobas PCR-celleinnsamlingsmedium eller PreservCyt-løsning, er validert for bruk med LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test. Følg produsentens anvisninger for å ta prøver av cervikale celler i cobas PCR-celleinnsamlingsmedier eller PreservCyt-løsning. B. Transport av prøver Cervikale celleprøver tatt på cobas PCR-celleinnsamlingsmedium eller PreservCyt-løsning, kan transporteres ved 2 30 C. Transport av cervikale celleprøver må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale 18. C. Oppbevaring av prøver Livmorhalsprøver som er tatt i cobas PCR celleinnsamlingsmedium eller PreservCyt-løsning, kan oppbevares ved 2 30 C i inntil 6 måneder. BRUKSANVISNING MERK: La alle reagenser bli temperert til romtemperatur (15 30 C) før bruk med mindre noe annet er angitt. Kontroller visuelt at alle reagensene inneholder tilstrekkelig reagensvolum før testprosedyren startes. MERK: Cervikale celleprøver må ha romtemperatur (15 30 C) før bruk. MERK: Bruk pipetter med aerosolbarriere- eller positive displacement -spiss der dette er angitt. Vær svært forsiktig for å sikre selektiv amplifikasjon. Størrelse på analyseserier: Hvert AmpliLute Liquid Media Extraction-kit inneholder reagenser til 50 tester. Hvert LINEAR ARRAY Detection-kit inneholder reagenser til 96 tester. Hver LINEAR ARRAY HPV Genotyping-test inneholder reagenser som rekker til fire analyseserier á 12 tester. Disse kan utføres separat eller simultant. Minst ett replikat hver av LINEAR ARRAY HPV negativ kontroll og LINEAR ARRAY HPV positiv kontroll må tas med i hver analyseserie med opptil 22 prøver (se under Kvalitetskontroll ). Amplifikasjonsreagenser er pakket i flasker á 12 tester for engangsbruk. LINEAR ARRAY HPV negativ kontroll og LINEAR ARRAY HPV positiv kontroll er pakket i flasker for engangsbruk. LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strimler er pakket i poser á 12 tester til engangsbruk. For å få en mest mulig effektiv bruk av reagenser, bør prøver og kontroller kjøres i analyseserier bestående av et antall som er multipler av 12. Arbeidsflyt: LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen kan fullføres i løpet av én dag, eller over to dager. Hvis analyseringen skal fullføres i løpet av en arbeidsdag, følger du anvisningene fra A til D i rekkefølge. Hvis analyseringen skal fullføres over 2 dager, kan prosedyren stanses etter prøve- og kontrollpreparering (del B) eller etter amplifikasjon (del C). For å utføre prøve- og kontrollpreparering på dag 1 og amplifikasjon og deteksjon på dag 2, går du gjennom trinnene B.1 til B.29 og oppbevarer de preparerte prøvene og kontrollene slik det er angitt i trinn B.29. På dag 2 begynner du med del A (tillaging av reagenser). Deretter tiner du preparerte prøver og kontroller ved romtemperatur, før du fortsetter med trinn B.30. MERK: Ikke utsett preparerte prøver og kontroller for mer enn 1 fryse/tine-syklus. For å fullføre prøve- og kontrollpreparering og amplifikasjon på dag 1 og deteksjon på dag 2, må du gjennomføre del A (reagenstillaging), del B (prøve- og kontrollpreparering) og del C (amplifikasjon) på dag 1 og lagre det denaturerte ampliconet ved 2 8 C slik som angitt i trinn C.6. Fortsett med del D (Genotypedeteksjon med LINEAR ARRAY HPV-strimmel) på dag NO 10 Doc Rev. 11.0

11 A. Reagenstillaging Utføres i: Preamplifikasjon reagenstillagingsområdet 1. Bestem antall reaksjonsrør som er nødvendig for analysering av prøver og kontroller. Plasser rørene i MicroAmp-platen og lås dem på plass med låsemekanismen. 2. Klargjør Working Master Mix ved å tilsette 125 µl HPV Mg 2+ til en flaske HPV MMX. Det er ikke nødvendig å måle Master Mix-volumet. Tilsett 125 µl HPV Mg 2+ til hele flasken HPV MMX. Sett på korken og bland godt ved å vende røret opp-ned ganger. Ikke vortex Working Master Mix. Den rosa fargen i HPV Mg 2+ brukes som en visuell bekreftelse på at HPV Mg 2+ er blitt tilsatt til HPV MMX. Kast gjenværende HPV Mg Tilsett 50 µl Working Master Mix i hvert reaksjonsrør ved hjelp av en Multipette-pipette eller en pipette med aerosolbarriere- eller positive displacement spiss. Ikke sett korkene på reaksjonsrørene på dette tidspunktet. 4. Plasser platen med Working Master Mix og et passende antall korker til reaksjonsrørene i en forseglbar plastpose, og forsegl plastposen. Gå til Preamplifikasjon prøve- og kontroll - prepareringsområdet. Oppbevar plater som inneholder Working Master Mix, ved 2 8 C i Preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområdet til prøve- og kontrollprepareringen er fullført. Working Master Mix er stabil i 6 timer ved 2 8 C i reaksjonsrør som er forseglet i en plastpose. B. Prøve- og kontrollpreparering Utføres i: Preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområdet 1. Sett temperaturen i en varmeblokk til 56 C ± 2 C. 2. Sett temperaturen i en annen varmeblokk til 70 C ± 2 C. 3. Temperer reagenser, prøver og kontroller til romtemperatur (minst 15 minutter). Hvis det er dannet bunnfall i ATL eller AL, må det oppløses ved å varme opp til 70 C og blande forsiktig. MERK: Trinn B.4 B.6 kan utføres under inkuberingen av prøver/kontroller med PK og ATL (trinn B.10). 4. Løs opp lyofilisert CAR ved å tilsette 310 µl AVE. Vortex i 10 sekunder. Sett initialer og dato på røret. MERK: Rekonstituert CAR er stabilt ved 2 8 C i opptil 24 timer, eller det kan fordeles og fryses ved 20 C i opptil 2 måneder eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. Ikke frys og tin oppløst CAR mer enn 3 ganger. 5. Tilsett 30 ml absolutt etanol til AW2. Sett initialer og dato på flasken. Bland fortynnet AW2 ved å riste det. MERK: Fortynnet AW2 kan oppbevares i romtemperatur i opptil 2 måneder eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. 6. Klargjør aktiv AL ved å tilsette korrekt volum rekonstituert CAR til AL slik som vist i tabell 1. Bland forsiktig ved å vende røret opp-ned 10 ganger. Ikke bland det i vortex-mikseren. Dette er for å unngå skumdannelse. Tabell 1 Klargjøring av aktiv AL Antall prøver/kontroller som skal prepareres Reagenser CAR (ml) 0,04 0,07 0,10 0,13 0,16 0,20 0,25 AL (ml) 4,0 7,0 10,0 13,0 16,0 20,0 25,0 MERK: Aktiv AL er stabil ved 2 8 C i opptil 48 timer. 7. Merk et 2 ml rør med skrukork for hver prøve og kontroll som skal prepareres. MERK: IKKE bruk 1,5 ml rør med skrukork eller andre konisk formede rør, siden de vil forstyrre varmeoverføringen under inkuberingen og kan resultere i ufullstendig lysering. 8. Tilsett 80 µl ATL til hvert rør. 9. Vortex hver prøve og kontroll i 10 sekunder. Tilsett 250 µl av hver prøve og kontroll til det korresponderende merkede røret. 10. Tilsett 20 µl PK til hvert rør. Sett kork på rørene og vortex i 10 sekunder. Inkuber rørene i en varmeblokk ved 56 C ± 2 C i 30 minutter NO 11 Doc Rev. 11.0

12 11. Mens prøvene og kontrollene inkuberes, setter du sammen QIAvac 24- (eller QIAvac 24 Plus-) vakuummanifolden i henhold til håndboken for QIAGEN-vakuummanifold. Ta ut en CLM for hver prøve og kontroll fra de forseglede forpakningene og merk dem. Spar på avfallsrørene til bruk i trinn B.23. Åpne lokket på CLM, og sett den inn i VC. Sett inn EXT i CLM. 12. Etter at inkubasjonen ved 56 C ± 2 C er fullført, tilsettes 250 µl aktiv AL til hvert rør. Sett kork på rørene og vortex i 10 sekunder på maks fart. MERK: Et hvitt bunnfall kan bli dannet når aktiv AL tilsettes. Bunnfallet påvirker ikke prøve- og kontrollprepareringsprosedyren og vil løse seg opp under den påfølgende inkubasjonen. 13. Inkuber rørene i en varmeblokk ved 70 C ± 2 C i 15 minutter. Vortex prøvene og kontrollene en gang i mellom under inkubasjonsperioden. 14. Etter at inkuberingen av prøver og kontroller er fullført ved 70 C ± 2 C, tilsettes 300 µl absolutt etanol til hvert rør. Sett kork på rørene og vortex i 15 sekunder på maks fart. 15. Inkuber rørene i 5 minutter ved romtemperatur. Spinn rørene pulsvis ved hjelp av en bordsentrifuge på maksimal hastighet. 16. Overfør lysatet fra hvert rør til den tilhørende CLM. La det inkubere i minst 1 minutt. 17. Skru på vakuumpumpen. Koble vakuumet på manifolden for å fjerne alt lysat, og fortsett å la vakuumet virke i minst 1 minutt til. Fjerne vakuumet fra manifolden slik det beskrives i håndboken for QIAGEN-vakuummanifolden. MERK: Hvis lysatet fra en individuell prøve eller kontroll ikke har passert fullstendig gjennom membranen, plasserer du CLM i et rent 2 ml prøverør, stenger lokket og sentrifugerer på maksimal hastighet i 1 minutt eller til lysatet har passert helt gjennom. Ekstra 2 ml prøverør kan kjøpes separat (se Materiell som kreves, men som ikke medfølger ). 18. Tilsett 750 µl AW2 til hvert CLM. La det inkubere i minst 1 minutt. 19. Skru på vakuumpumpen. Koble vakuumet på manifolden for å fjerne all væske, og fortsett å la vakuumet virke i minst 1 minutt til. Fjerne vakuumet fra manifolden slik det beskrives i håndboken for QIAGEN-vakuummanifolden. 20. Tilsett 750 µl absolutt etanol til hvert CLM. La det inkubere i minst 1 minutt. 21. Skru på vakuumpumpen. Koble vakuumet på manifolden for å fjerne all væske, og fortsett å la vakuumet virke i minst 1 minutt til. Fjerne vakuumet fra manifolden slik det beskrives i håndboken for QIAGEN-vakuummanifolden. 22. Fjern EXT forsiktig fra hver CLM. Kast EXT. MERK: For å unngå krysskontaminering må du være påpasselig med å ikke berøre CLM mens EXT fjernes. 23. Plasser hver CLM i et avfallsrør (fra trinn B.11) og lukk lokkene. Sentrifuger enhetene på maksimum RPM i 3 minutter. 24. Merk ett ELT for hver prøve og kontroll. 25. Kast avfallsrørene og plasser hver CLM i de korresponderende merkede ELT-rørene. 26. Åpne lokkene på hver CLM, og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter. 27. Tilsett 120 µl AVE til hvert CLM. Steng alle lokkene. MERK: Forsikre deg om at AVE er temperert til romtemperatur før det tilsettes til CLM. 28. Inkuber enhetene ved romtemperatur i 5 minutter, og sentrifuger ved maksimal hastighet (RPM) i 1 minutt. 29. Fjern og kast CLM fra enhetene og kork rørene. Amplifiser de preparerte prøvene og kontrollene umiddelbart, eller oppbevar dem ved 2 8 C eller nedfrosset ved 20 C. Preparerte prøver og kontroller kan oppbevares ved romtemperatur i opptil 6 timer, ved 2 8 C i opptil 7 dager, eller ved 20 C eller kaldere i opptil 8 uker, med maks én fryse/tine-syklus. Mer enn én fryse/tine-syklus kan føre til tap av signal. 30. Tilsett 50 µl av hver preparerte prøve og kontroll til det korresponderende amplifikasjonsrøret som inneholder Working Master Mix. Bruk en ny aerosolbarriere- eller en positive displacement -spiss for hver prøve og kontroll. Kork amplifikasjonsrørene. MERK: Hvis preparerte prøver og kontroller har vært oppbevart frosset, må de tines ved romtemperatur. Når de er tint, må hver preparerte prøve og kontroll vortexes kraftig i 10 sekunder. Hvis preparerte prøver og kontroller har vært oppbevart ved 2 8 C, må hver prøve og kontroll vortexes kraftig i 10 sekunder før de tilsettes til Working Master Mix NO 12 Doc Rev. 11.0

13 MERK: Amplifikasjon på Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 må starte innen 45 minutter etter at de preparerte prøvene og kontrollene er tilsatt til Working Master Mix. 31. Overfør amplifikasjonsplaten med de preparerte prøvene og kontrollene til amplifikasjons-/ deteksjonsområdet. Gjenværende materiale fra de preparerte prøvene og kontrollene kan oppbevares i henhold til instruksjonene i trinn B.29. C. Amplifikasjon Utføres i: Postamplifikasjon amplifikasjons-/deteksjonsområdet 1. Plasser platen/låsemekanisme-enheten i termoblokken. 2. Programmer Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 for LINEAR ARRAY HPV Genotyping-test på følgende måte: HOLD-program: 2 min, 50 C HOLD-program: 9 min, 95 C CYCLE-program (40 sykluser): 30 sek, 95 C, 1 min, 55 C, 1 min, 72 C (Ramp rate = 50 %) HOLD-program: 5 min, 72 C HOLD-program: 72 C ubegrenset Angi Ramp rate til 50 % i CYCLE-programmene. Angi metodenavn og brukernavn etter behov. Se i brukerhåndboken for Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 for ytterligere informasjon om programmering og betjening av termocycleren. 3. Start METHOD-programmet. Still inn Ramp Speed til Max og Reaction Volume til 100 µl i skjermbildet Method Options. Trykk på START igjen. Programmet kjører i omtrent 3 timer og 15 minutter. 4. Fjern platen fra termoblokken innen 4 timer etter at det siste HOLD-programmet startet. Plasser den i MicroAmp-platebasen og fortsett umiddelbart med trinn 5. Ikke la reaksjonsrørene stå i termoblokken utover 4 timer. IKKE TA MED AMPLIFISERTE PRØVER INN I PREAMPLI - FIKASJONSOMRÅDET. AMPLIFISERTE KONTROLLER OG PRØVER SKAL BETRAKTES SOM EN HOVEDKILDE TIL POTENSIELL KONTAMINERING. 5. Ta korkene forsiktig av reaksjonsrørene for å unngå å danne aerosoler av amplifikasjons - produktene. Tilsett straks 100 µl DN til første kolonne (eller rad) med reaksjonsrør ved hjelp av en multikanalpipette med aerosolbarrierespisser, og bland ved å pipettere opp og ned fem ganger. Gjenta denne prosedyren for hver kolonne (eller rad) med et nytt sett spisser. 6. Denaturert amplicon kan oppbevares i romtemperatur i maksimum 5 timer før du fortsetter med deteksjonen (del D). Hvis deteksjonsreaksjonen ikke kan utføres innen 5 timer, må du korke rørene med nye korker og lagre det denaturerte ampliconet ved 2 8 C i opptil 7 dager. D. Genotypedeteksjon med LINEAR ARRAY HPV-strimmel Utføres i: Postamplifikasjon amplifikasjons-/deteksjonsområdet MERK: Unngå søl av prøvemateriale fra en brønn til en annen under deteksjonsprosedyren. Vann fra vannbadet må ikke sprutes over i brønnene i platen. 24-brønnersbrettene må ikke stables. 1. Varm opp alle deteksjonsreagenser til romtemperatur. 2. Forvarm et vannbad til 53 C ± 2 C. 3. Forvarm ristevannbadet til 53 C ± 2 C med en ristehastighet på cirka 60 RPM. Kontroller at det er nok vann i vannbadet til å varme opp 24-brønnersbrettet, men ikke så mye at det spruter over i 24-brønnersbrettet. Vannet må være i kontakt med cirka 1/4 av den ytre brønndybden eller 0,5 cm av 24-brønnersbrettet. MERK: Det kan forekomme falske positive resultater hvis vannet i vannbadet ikke er i ordentlig kontakt med 24-brønnersbrettet. 4. Klargjør aktiv hybridiseringsbuffer på følgende måte: Inspiser SSPE og SDS, hvis nødvendig, varm opp til 53 C ± 2 C for å løse opp ev. bunnfall. Tilsett 100 ml SSPE til 388 ml destillert eller deionisert vann. Bland godt. Tilsett 12,5 ml SDS og bland godt. Den aktive hybridiseringsbufferen holder til 100 LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strimler. Den aktive hybridiseringsbufferen skal oppbevares ved romtemperatur i en ren beholder, og den er stabil i 30 dager NO 13 Doc Rev. 11.0

14 5. Klargjør aktiv ambient (romtemperert) vaskebuffer på følgende måte: Inspiser SSPE og SDS, hvis nødvendig, varm opp til 53 C ± 2 C for å løse opp ev. bunnfall. Tilsett 133 ml SSPE til 2520 ml destillert eller deionisert vann. Bland godt. Tilsett 13,3 ml SDS og bland godt. Aktiv ambient (romtemperert) vaskebuffer holder til 100 LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strimler. Aktiv ambient (romtemperert) vaskebuffer skal oppbevares ved romtemperatur i en ren beholder, og den er stabil i 30 dager. 6. Klargjør aktiv stringent vaskebuffer på følgende måte: For hver strimmel som testes, ta ut 5 ml aktiv ambient (romtemperert) vaskebuffer (klargjort i forrige trinn) og tilsett i en medieflaske av passende størrelse (f.eks.: til en analyseserie bestående av 24 strimler, tas 120 ml aktiv ambient (romtemperert) vaskebuffer ut og tilsettes til medieflasken). Aktiv stringent vaskebuffer må nylages for hver analyseserie. 7. Varm opp aktiv hybridiseringsbuffer og aktiv stringent vaskebuffer i et vannbad som holder 53 C ± 2 C i minst 15 minutter. La aktiv hybridiseringsbuffer og aktiv stringent vaskebuffer stå i vannbadet til de skal brukes. 8. Klargjør aktiv sitratbuffer på følgende måte: Inspiser CIT og hvis nødvendig, varm opp til 53 C ± 2 C for å løse opp ev. bunnfall. Tilsett 25 ml CIT til 475 ml destillert eller deionisert vann. Bland godt. Den aktive sitratbufferen holder til 100 LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strimler. Aktiv sitratbuffer skal oppbevares ved romtemperatur i en ren beholder, og den er stabil i 30 dager. 9. Ta ut det nødvendige antallet LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strimler fra HPV Strip-posen ved hjelp av en ren pinsett. 10. Merk hver HPV-strimmel (HPV Strip) med tilsvarende prøve- eller kontroll-id med en vann-, kjemikalie- og varmebestandig tusj. 11. Plasser hver strimmel med probelinjene vendt oppover i de aktuelle brønnene i 24-brønnersbrettet. 12. Tilsett 4 ml forvarmet aktiv hybridiseringsbuffer i hver brønn som inneholder en merket strimmel. 13. Bruk en pipette med aerosolbarriere- eller positive displacement -spiss, og pipetter 75 µl denaturert amplicon forsiktig til den korresponderende brønnen med merket strimmel. Vipp brettet forsiktig etter hver tilsetning. Bruk en ny spiss for hver amplicontilsetning. 14. Sett lokket på 24-brønnersbrettet, og plasser brettet i ristevannbadet som holder 53 C ± 2 C. Plasser et blyringlodd på 0,45 kg (1 lb.) på lokket for å holde 24-brønnersbrettet på plass i ristevannbadet. Hybridiser i 30 minutter med en ristehastighet på cirka 60 RPM. 15. Under hybridiseringen (trinn 14) klargjøres aktivt konjugat på følgende måte: Tilsett 15 µl SA-HRP til 5 ml aktiv ambient (romtemperert) vaskebuffer for hver strimmel som testes. Bland godt. Det aktive konjugatet skal oppbevares ved romtemperatur i en ren beholder. Konjugatet er stabilt i 3 timer. 16. Ta ut 24-brønnersbrettet fra ristevannbadet, og fjern den aktive hybridiseringsbufferen fra brønnene ved hjelp av vakuumaspirasjon. 17. Tilsett 4 ml aktiv ambient (romtemperert) vaskebuffer til hver brønn som inneholder en strimmel. Vipp forsiktig 24-brønnersbrettet frem og tilbake 3 4 ganger for å vaske strimlene, og vakuumaspirer aktiv ambient (romtemperert) vaskebuffer umiddelbart fra brønnene. 18. Tilsett 4 ml forvarmet aktiv stringent vaskebuffer til hver brønn som inneholder en strimmel. Fjern eventuell kondens fra brettlokket med en ren papirserviett, og sett på lokket på 24-brønnersbrettet. Sett 24-brønnersbrettet i ristevannbadet som holder 53 C ± 2 C. Plasser et blyringlodd på 0,45 kg (1 lb.) på lokket for å holde 24-brønnersbrettet på plass i ristevannbadet. Inkuber i 15 minutter med en ristehastighet på cirka 60 RPM. 19. Ta ut 24-brønnersbrettet fra ristevannbadet, og fjern aktiv stringent vaskebuffer fra brønnene ved hjelp av vakuumaspirasjon. 20. Tilsett 4 ml aktivt konjugat til hver brønn som inneholder en strimmel. Fjern eventuell kondens fra brettlokket med en ren papirserviett, og sett på lokket på 24-brønnersbrettet. Plasser 24-brønnersbrettet på orbitalristeren ved romtemperatur. Inkuber i 30 minutter i rom - temperatur (15 30 C) med en ristehastighet på cirka 60 RPM. 21. Ta ut 24-brønnersbrettet fra orbitalristeren, og fjern det aktive konjugatet fra brønnene ved hjelp av vakuumaspirasjon. 22. Tilsett 4 ml aktiv ambient (romtempererert) vaskebuffer til hver brønn som inneholder en strimmel. Vipp forsiktig 24-brønnersbrettet frem og tilbake 3 4 ganger for å vaske strimlene, og vakuumaspirer aktiv ambient (romtemperert) vaskebuffer umiddelbart fra brønnene. 23. Tilsett 4 ml aktiv ambient (romtempererert) vaskebuffer til hver brønn som inneholder en strimmel. Fjern eventuell kondens fra brettlokket med en ren papirserviett, og sett lokket på 24-brønnersbrettet. Plasser 24-brønnersbrettet på orbitalristeren i 10 minutter med en ristehastighet på cirka 60 RPM NO 14 Doc Rev. 11.0

15 24. Ta ut 24-brønnersbrettet fra orbitalristeren, og fjern aktiv ambient (romtemperert) vaskebuffer fra brønnene ved hjelp av vakuumaspirasjon. 25. Tilsett 4 ml aktiv ambient (romtempererert) vaskebuffer til hver brønn som inneholder en strimmel. Sett lokket på 24-brønnersbrettet, og plasser 24-brønnersbrettet på orbitalristeren ved romtemperatur i 10 minutter med en ristehastighet på cirka 60 RPM. 26. Ta ut 24-brønnersbrettet fra orbitalristeren, og fjern aktiv ambient (romtemperert) vaskebuffer fra brønnene ved hjelp av vakuumaspirasjon. 27. Tilsett 4 ml aktiv sitratbuffer til hver brønn som inneholder en strimmel. Sett lokket på 24-brønnersbrettet, og plasser 24-brønnersbrettet på orbitalristeren ved romtemperatur i 5 minutter med en ristehastighet på cirka 60 RPM. 28. Klargjør aktivt substrat på følgende måte: Tilsett 4 ml SUB A til 1 ml SUB B per strimmel som testes. Bland godt. Det aktive substratet skal oppbevares ved romtemperatur, beskyttet fra direkte lys i en ren beholder. Substratet er stabilt i 3 timer. 29. Ta ut 24-brønnersbrettet fra orbitalristeren, og fjern den aktive sitratbufferen fra brønnene ved hjelp av vakuumaspirasjon. 30. Tilsett 4 ml aktivt substrat til hver brønn som inneholder en strimmel. Sett lokket på 24-brønnersbrettet, og plasser 24-brønnersbrettet på orbitalristeren ved romtemperatur i 5 minutter med en ristehastighet på cirka 60 RPM. 31. Ta ut 24-brønnersbrettet fra orbitalristeren, og fjern det aktive substratet fra brønnene ved hjelp av vakuumaspirasjon. 32. Tilsett 4 ml destillert eller deionisert vann til hver brønn som inneholder en strimmel. 33. Ta ut strimlene fra 24-brønnersbrettet ved hjelp av en ren pinsett. Plasser strimlene på en ren og tørr overflate og la dem lufttørke i minst en time eller opptil 72 timer ved romtemperatur før tolking. Rengjøring av 24-brønnersbrettet Utføres i: Postamplifikasjon amplifikasjons-/deteksjonsområdet MERK: 24-brønnersbrettene kan kastes eller brukes på nytt. Hvis brettene skal brukes på nytt, må følgende rengjøringsprosedyre følges etter hver bruk: 1. Lag en 10 % RBS35-løsning ved å tilsette 1 del RBS35 til 9 deler destillert eller deionisert vann. 2. Fyll hvert brett med 10 %-løsningen, og la det stå ved romtemperatur over natten. 3. Rengjør brettet grundig med destillert eller deionisert vann. 4. La brettet tørke helt før bruk NO 15 Doc Rev. 11.0

16 RESULTATER Forsikre deg om at kontrollresultatene for analyseserien er gyldige (se Kvalitetskontroll). Hvis analyse - serien er ugyldig, må hele serien gjentas (preparering av prøver, amplifikasjon og genotypedeteksjon med LINEAR ARRAY HPV-strimmel). Hvis analyseserien er gyldig, tolkes LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strimmelen ved å plassere LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test-referanseguiden over strimmelen, slik at strimmelen kommer frem i det utstansede feltet og HPV-genotypereferanselinjene vises på hver side av strimmelen. Kontroller at den svarte referanselinjen (REF) på guiden er på linje med den svarte linjen på HPV-strimmelen. Noter ned de positive synlige båndene, og tolk HPV- og ß-globin (BG)-resultatene for hver strimmel på følgende måte: HPV resultat BG lav resultat BG høy resultat Tolkning Ugyldig resultat. HPV-DNA, om det er til stede, kunne ikke påvises. Fraværet av BG høy- og BG lav-resultater indikerer utilstrekkelig prøvetaking, preparering eller tilstedeværelse av hemmere. Preparer en ny utpipettering av originalprøven og gjenta testen. Hvis originalprøven ikke er tilgjengelig, må en ny prøve tas. Ugyldig resultat. HPV-DNA, om det er til stede, kunne ikke påvises. Fraværet av BG lav indikerer utilstrekkelig prøvetaking, preparering eller tilstedeværelse av hemmere. Preparer en ny utpipettering av originalprøven og gjenta testen. Hvis originalprøven ikke er tilgjengelig, må en ny prøve tas. HPV-DNA ikke påvist. Et negativt resultat utelukker ikke tilstedeværelse av HPV-infeksjon fordi resultatene er avhengig av korrekt prøvetaking, preparering, fravær av hemmere og tilstrekkelig HPV-DNA til at det kan påvises. HPV-DNA påvist (rapporter genotyper). Prøven er positiv for tilstedeværelse av HPV. Fraværet av BG lav og BG høy indikerer utilstrekkelig prøvetaking, preparering, tilstedeværelse av hemmere eller konkurranse med høyt titer av mål-hpv. Prøven kan inneholde flere HPV-genotyper som ikke kunne påvises. HPV-DNA påvist (rapporter genotyper). Prøven er positiv for tilstedeværelse av HPV. Fraværet av BG lav indikerer utilstrekkelig prøvetaking, preparering, tilstedeværelse av hemmere eller konkurranse med høyt titer av mål-hpv. Prøven kan inneholde flere HPV-genotyper som ikke kunne påvises. HPV-DNA påvist (rapporter genotyper). Prøven er positiv for tilstedeværelse av HPV. Tilstedeværelse av andre HPV-genotyper i prøven kan ikke utelukkes fullstendig. Tolking av kryssreaktiv probe LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strimmelen inneholder en kryssreaktiv probe som hybridiserer til HPVgenotype 33, 35, 52 og 58. Positive båndresultater for proben skal tolkes på følgende måte: Båndresultat Tolkning 33, 52/33/35/58 HPV 33* 35, 52/33/35/58 HPV 35* 58, 52/33/35/58 HPV 58* 52/33/35/58 HPV 52 * koinfeksjon med HPV-genotype 52 kan ikke utelukkes med disse testresultatene NO 16 Doc Rev. 11.0