AdnaTest ProstateCancerSelect

Transkript

1 AdnaTest ProstateCancerSelect Anriking av tumorceller fra blodet fra pasienter med prostatakreft til genekspresjonsanalyser Til bruk i in vitro-diagnostikk Brukerhåndbok T-1-520

2 Innhold Bestillingsinformasjon... 3 Bruksområde... 3 Forkortelser og symboler... 4 Patenter og registrerte varemerker... 4 Produktbeskrivelse... 5 Settkomponenter... 6 Nødvendige tilleggsmaterialer... 7 Oppbevaring... 8 Informasjon om bruk... 8 Advarsler og forsiktighetsregler knyttet til in vitro-diagnostisk bruk Protokoll A. Klargjøring av ProstateSelect-kuler B. Seleksjon av tumorceller Ytelseskarakteristikker Hurtigveiledning

3 Bestillingsinformasjon Du finner bestillingsinformasjon på og I tillegg vil supportteamet fra QIAGEN Hannover svare på spørsmål angående AdnaTest (support@adnagen.com). Bruksområde ble utviklet for anriking av sirkulerende tumorceller fra perifert blod fra pasienter med prostatakreft og er ment for in vitro-diagnostisk bruk. AdnaTest ProstateCancerDetect anbefales til den påfølgende analysen av prostatakreftassosiert genekspresjon. 3

4 Forkortelser og symboler AdnaMag-L AdnaMag-S bp cdna DNA mrna PCR RNase o/min RT Konsentrator for magnetiske partikler (Large) Konsentrator for magnetiske partikler (Small) Basepar Komplementær deoksyribonukleinsyre Deoksyribonukleinsyre Budbringer-ribonukleinsyre Polymerasekjedereaksjon Ribonuklease Omdreininger per minutt Revers transkriptase Skal brukes innen Temperaturbegrensning Katalognummer Se informasjonen i håndboken Produsent Medisinsk utstyr for in vitro-diagnostikk Patenter og registrerte varemerker Dynabeads er et registrert varemerke som tilhører Invitrogen og Life Technologies Corporation. 4

5 Produktbeskrivelse muliggjør immunmagnetisk anriking av tumorceller via epiteliale og tumorassosierte antigener. Antistoffer mot epiteliale og tumorassosierte antigener konjugert til magnetiske kuler (Dynabeads ) for merking av tumorceller i perifert blod. Merkede celler blir ekstrahert ved en magnetisk partikkelkonsentrator (AdnaMag-L og AdnaMag-S) og blir deretter lysert (figur 1). Cellelysatet blir brukt for videre analyse (det anbefales å fortsette med AdnaTest ProstateCancerDetect). ProstateSelectkuler Inkubering Separasjon Cellelysering RNA Rensing av mrna med Oligo(dT) 25-belagte magnetiske kuler Revers transkriptase Blodceller Tumorceller RNA RNA cdna Antistoff- eller Oligo(dT) 25-belagte magnetiske kuler AdnaTest ProstateCancerDetect Figur 1. Skjematisk oversikt over prøveklargjøring 5

6 Settkomponenter inneholder følgende komponenter: Tabell 1. Settkomponenter Komponent ProstateSelect Beads (ProstateSelect-kuler) Lysis/Binding Buffer (lyserings-/bindingsbuffer) Symbol T (12 tester)

7 Nødvendige tilleggsmaterialer Utstyr: Vorteksmikser for 15 ml og 1,5 ml rør Konsentratorer for magnetiske partikler AdnaMag-L (QIAGEN Hannover GmbH, kat.nr. T-1-700) AdnaMag-S (QIAGEN Hannover GmbH, kat.nr. T-1-800) Materiale: Sterile, RNase-frie 10 ml glass- eller plastpipetter og pipetteringsenhet Sterile, RNase-frie 1,5 ml reagensrør (f.eks. Sarstedt, katalognr ) 15 ml rør (bruk sterile, RNase-frie polypropylenrør, f.eks. Sarstedt, katalognr ) Pipetter og RNase-frie pipettespisser med aerosolbarriere, egnet for pipetteringsvolumer fra 100 µl til 1000 µl Vernehansker, vernebriller Reagenser: Fosfatbufret saltvann (PBS), ph 7,0 7,3 (f.eks. Fisher, katalognr. VX , D-PBS) 7

8 Oppbevaring skal oppbevares ved 4 8 C. Ingen komponenter skal brukes etter utløpt holdbarhetsdato. Informasjon om bruk Hvis det er ytre skader på settets eske eller enkeltkomponenter, kan du kontakte QIAGEN Technical Services (se for kontaktinformasjon). Testen må utføres av personell med kompetanse innen molekylærbiologiske teknikker. Prøveklargjøring: Blodprøver må tas før bruk av terapeutiske stoffer. Ikke bruk AdnaTest tidligere enn 7 dager etter siste terapeutiske intervensjon! Blodprøvetaking: Bruk kun AdnaCollect-blodprøverør (katalognr. T-1-600, QIAGEN Hannover GmbH) eller rør som inneholder EDTA som antikoagulant for blodprøvetaking (f.eks. S Monovette kalium-edta, Sarstedt; BD Vacutainer K3EDTA, Becton Dickinson), for å ta minst 5 ml fullblod. Heparin og sitrat må ikke brukes. Blodet skal oppbevares ved 4 8 C umiddelbart. 8

9 Prøvene skal behandles så snart som mulig, men ikke senere enn 4 timer etter blodprøvetaking ved bruk av standard EDTA-rør eller innen 24 timer ved bruk av AdnaCollect. Blodprøven må ikke hemolyseres. Håndtering: ProstateSelect-kuler 1 inneholder natriumazid som konserveringsmiddel. Natriumazid er cytotoksisk og må derfor fjernes før du bruker kulene. Alle komponenter og ekstra reagenser som leveres fra andre leverandører, må oppbevares i henhold til instruksjonene. Følg sikkerhetsrådene fra de aktuelle produsentene. Bruk vernehansker for å unngå kontaminering med DNA, RNA og RNaser. Alikvoter ProstateSelect-kuler for å unngå kontaminering. Testen må utføres i angitt rekkefølge og må overholde alle spesifikasjoner angitt i forbindelse med inkubasjonstider og -temperaturer. Kast prøvene hvis seleksjonskulene agglutinerer under celleanriking. Utfør prøvebehandling inkl. revers transkripsjon og påfølgende analyse av amplifiserte PCR-produkter i ulike rom om det er mulig, for å unngå krysskontaminering. Bruk av produkter fra andre leverandører enn de som er foreslått, kan føre til resultater av dårligere kvalitet. 9

10 Advarsler og forsiktighetsregler knyttet til in vitrodiagnostisk bruk Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangshansker og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. Se gjeldende sikkerhetsdatablader (SDS) hvis du ønsker mer informasjon. Disse er tilgjengelige i praktisk og kompakt PDF-format på der du kan søke etter, vise og skrive ut sikkerhetsdatabladet for hvert QIAGEN-sett og hver settkomponent. Kast prøve- og analyseavfall i henhold til lokale sikkerhetsprosedyrer. 10

11 Protokoll A. Klargjøring av ProstateSelect-kuler Natriumazid må fjernes ved å vaske ProstateSelect-kulene før bruk: 1. Resuspender ProstateSelect-kuler 1 grundig ved pipettering. Skal ikke blandes i vorteksmikser! 2. Beregn volumet av ProstateSelect-kuler 1 som trengs for alle prøver som skal behandles (100 µl per prøve), og overfør det beregnede volumet til et 1,5 ml reagensrør. Dersom mer enn 10 prøver behandles, skal flere 1,5 ml reagensrør brukes. 3. Sett røret inn i AdnaMag-S. 4. Fjern supernatanten med en pipette etter 1 min. Viktig for hver prosedyre: Ikke ta på kulene når du fjerner supernatantene! 5. Vasking a. Fjern magnetskyveenheten fra AdnaMag-S. b. Tilsett 1 ml PBS, og resuspender kulene ved gjentatt pipettering. c. Plasser magnetskyveenheten inn i AdnaMag-S. d. Fjern supernatanten helt med en pipette etter 1 min. Gjenta to ganger (tre vaskinger totalt). 6. Fjern røret fra AdnaMag-S, og resuspender kulene i PBS til originalvolumet (100 µl per prøve). 11

12 B. Seleksjon av tumorceller 1. Pipetter 5 ml av en blodprøve over i et 15 ml rør. (Bruk kun godkjente blodprøverør, se side 8.) 2. Resuspender ProstateSelect-kuler grundig (klargjort i trinn A6) ved pipettering, og tilsett 100 µl av disse kulene i hver blodprøve. 3. Roter rørene langsomt (ca. 5 o/min) i 30 minutter ved romtemperatur på en enhet med både vippe- og dreiefunksjon. 4. Sett rørene inn i AdnaMag-L uten magnetskyveenhet. Snu AdnaMag-L nedover for å frigjøre kuler som er fanget i overdelen. 5. Sett inn magnetskyveenheten, og inkuber rørene i AdnaMag-L i 3 minutter ved romtemperatur. 6. Stabiliser lyserings-/bindingsbuffer 2 til romtemperatur i mellomtiden. Merk: Sjekk at lyserings-/bindingsbuffer ikke inneholder bunnfall. Hvis det blir observert bunnfall, må bufferen stabiliseres til romtemperatur og blandes til den er fullstendig oppløst. 7. Fjern blodsupernatanten helt med en 10 ml pipette uten å berøre kulene. 8. Vasking a. Fjern magnetskyveenheten fra AdnaMag-L. b. Tilsett 5 ml PBS, sett lokk på rørene, og rist AdnaMag-L forsiktig frem og tilbake 5 ganger for å resuspendere de magnetiske kulene / cellekomplekser. c. Snu AdnaMag-L med rørene vendt nedover to ganger for å frigjøre dråper som fanget i overdelen. 12

13 d. Sett magnetskyveenheten inn i AdnaMag-L, og inkuber i 1 min ved romtemperatur. e. Fjern supernatanten helt med en pipette. Gjenta to ganger (tre vaskinger totalt). 9. Fjern magnetskyveenheten fra AdnaMag-L. 10. Resuspender magnetiske kuler / cellekomplekser i 1 ml PBS, og overfør hver prøve til et 1,5 ml reagensrør. 11. Sett reagensrørene inn i AdnaMag-S med en innsatt magnetskyveenhet. Merk: Magnetskyveenheten til AdnaMag-S kan settes inn i to posisjoner. Skyveenheten må alltid settes inn med den hvite plastfilmen vendt fremover, slik at magnetene kommer nær reagensrørene. 12. Etter 1 minutt skal supernatanten fjernes helt med en pipette for å optimalisere følgende cellelysering! 13. Fjern magnetskyveenheten fra AdnaMag-S. 14. Tilsett 200 µl lyserings-/bindingsbuffer 2 (stabilisert til romtemperatur) til hvert reagensrør. Resuspender ved pipettering minst fem ganger. 15. Sett magnetskyveenheten inn i AdnaMag-S, og inkuber i 1 min. 16. Overfør supernatanter (cellelysater) inn i nye 1,5 ml reagensrør. 17. Kast rørene med kulene. 18. Fortsett med mrna-isolasjon (AdnaTest ProstateCancer- Detect) umiddelbart, eller lagre cellelysatene ved maks. 20 C i maks. 2 uker. 13

14 Ytelseskarakteristikker Se for ytelseskarakteristikker for. Hurtigveiledning Komponenter ProstateSelect Beads (ProstateSelect-kuler) Lysis/Binding Buffer (lyserings-/bindingsbuffer) 1 2 Du trenger følgende til hver prøve 5 ml fullblod (se side 8 for mer informasjon) 1 15 ml rør 2 1,5 ml reagensrør 10 ml glass- eller plastpipetter (RNase-frie) og pipetteringsenhet µl pipetter og spisser (RNase-frie) Protokoll Resuspender ProstateSelect-kuler 1 grundig, og overfør 100 µl for hver blodprøve til et 1,5 ml reagensrør. Vask ProstateSelect-kuler med 3 1 ml PBS. Resuspender ProstateSelect-kuler i 100 µl PBS per blodprøve. Overfør 5 ml fullblod til et 15 ml rør. Tilsett 100 µl vaskede ProstateSelect-kuler i hver blodprøve. 14

15 Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur med vipping og rotasjon ved ca. 5 o/min. Plasser røret i 3 minutter i AdnaMag-L for å separere kulene. Frigjør eventuelle bloddråper fanget i overdelen ved å snu AdnaMag-L nedover. Fjern blodsupernatanten. Vask kuler med 3 5 ml PBS. Resuspender kuler i 1 ml PBS, og overfør til et nytt 1,5 ml reagensrør. Separer kuler i AdnaMag-S, og fjern supernatanten. Resuspender kuler i 200 µl lyserings-/bindingsbuffer 2 ved pipettering minst fem ganger. Sett reagensrørene inn i AdnaMag-S, og overfør supernatanten til et nytt reagensrør. Fortsett med AdnaTest ProstateCancerDetect umiddelbart, eller oppbevar dem ved maks. 20 C i maks. 2 uker. 15

16 HB-2099-NO-001# QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse 1 D Hilden TYSKLAND Hvis du trenger hjelp, ring Telefonnr.: +49 (0) Faksnr.: +49 (0) E-post: support@adnagen.com Internet: og