COBAS TaqMan CT Test, v2.0

Transkript

1 COBAS TaqMan CT Test, v2.0 FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. COBAS TaqMan CT Test, v2.0 CTM CT v Tests P/N: AMPLICOR CT/NG Specimen Preparation Kit CT/NG PREP 100 Tests P/N: ART: US: TILTENKT BRUK COBAS TaqMan CT-testen v2.0 er en in vitro-nukleinsyreamplifikasjonstest til kvalitativ deteksjon av Chlamydia trachomatis-dna i endocervikale penselprøver fra kvinner eller i urin fra menn og kvinner. Prøvene prepareres med AMPLICOR CT/NG prøveprepareringskit for manuell prøvepreparering og COBAS TaqMan 48-analysatoren for automatisert amplifikasjon og deteksjon. SAMMENDRAG OG FORKLARING AV TESTEN Chlamydia er gram-negative, ikke-motile bakterier som eksisterer som obligat intracellulære parasitter i eukaryote celler på grunn av sin manglende evne til å syntetisere ATP. Chlamydia-genuset består av fire rapporterte arter: C. trachomatis, C. psittaci, C. pecorum og C. pneumoniae (TWAR). C. psittaci er primært et dyrepatogen, og den patogene rollen til C. pecorum er ikke avklart 1. Chlamydia trachomatis-infeksjoner er nå anerkjent som den nest viktigste årsaken til seksuelt overførbare sykdommer (STD) på verdensbasis med cirka 89,1 millioner nye tilfeller per år 2. I USA er det cirka 2,8 millioner tilfeller hvert år. 3 Chlamydia trachomatis forårsaker cervicitt, bekkeninfeksjon (PID), konjunktivitt hos spedbarn, lungebetennelse hos spedbarn, uretritt, epididymitt og proktitt 1,4. Chlamydia trachomatis er også den vanligste årsaken til ikke-gonoreisk uretritt (NGU) hos menn (cirka % av tilfellene). Konsekvensene av klamydiainfeksjon hos kvinner er alvorlige dersom den ikke behandles. Siden cirka halvparten av disse infeksjonene er asymptomatiske, er det mange tilfeller som ikke detekteres eller behandles, noe som fører til ytterligere problemer, spesielt hos gravide kvinner. Spedbarn som er født av mødre med klamydiainfeksjon, har høy risiko for å utvikle inklusjonskonjunktivitt og lungebetennelse. Dyrkningstester har vært den tradisjonelle referansestandarden for identifikasjon av C. trachomatis. Problemer med standardisering, høy teknisk kompleksitet og behovet for å opprettholde organismenes viabilitet under transport og oppbevaring før dyrkning har imidlertid ført til utviklingen av tester for C. trachomatis 5 som ikke krever dyrkning. Disse metodene, som ikke krever viable organismer, omfatter nukleinsyreamplifikasjonstester (NAAT), nukleinsyreprobetester, enzymimmunanalyser (EIA-tester), direkte fluorescerende antistofftest (DFA) og komplementbinding 1,5. I kliniske evalueringer har NAAT-metoder vist seg å være mer sensitive enn dyrking og andre metoder som ikke krever dyrking, og er blitt den foretrukne metode ved kliniske laboratorier for diagnostisering av C. trachomatis-infeksjoner 5. TESTPRINSIPPER COBAS TaqMan CT-test, v2.0 er basert på to hovedprosesser: (1) manuell prøvepreparering for å isolere CT-DNA; (2) samtidig PCR-amplifikasjon 6 av mål-dna ved hjelp av CT-spesifikke komplementære primere og deteksjon av splittede dobbel-fluoroformerkede oligonukleotidprober som muliggjør deteksjon av det amplifiserte produktet (amplicon) av mål-ct og CT-internkontroll-DNA, som amplifiseres og detekteres samtidig med prøven. Master Mix-reagenset inneholder primerpar og prober som er spesifikke for CT ryptisk plasmid-dna, CT kromosomalt ompa-gen-dna og CT-internkontroll-DNA. Master Mix er utviklet for å sikre deteksjon av alle 15 CT-serovarene. Deteksjonen av amplifisert DNA utføres ved å benytte målspesifikke og internkontrollspesifikke dobbelmerkede oligonukleotidprober som muliggjør uavhengig identifisering av CT-amplicon og CT-internkontrollamplicon. Prøvepreparering Urogenitale epitelceller innsamlet ved hjelp av penselprøver eller pelletert fra urin behandles med en detergentløsning for å frigjøre chlamydia-dna fra chlamydiabakteriens retikulærlegemer. En ytterligere detergentløsning tilsettes for å klargjøre den lyserte prøven for amplifikasjon. 1

2 PCR-amplifikasjon Valg av mål I tillegg til kromosomalt DNA inneholder C. trachomatis et kryptisk plasmid på cirka 7500 basepar, som er felles for alle serovarer av C. trachomatis 7,8. COBAS TaqMan CT-testen v2.0 bruker primerne CP102 og CP103, som definerer en sekvens på cirka 206 nukleotider i det kryptiske plasmid-dna-et fra C. trachomatis. COBAS TaqMan CT-testen v2.0 bruker i tillegg primerne CTMP101 og CTMP102, som definerer en sekvens på cirka 182 nukleotider i det kromosomale DNA-et fra C. trachomatis. Målamplifikasjon Preparerte prøver tilsettes amplifikasjonsblandingen i K-rør eller K-plater der PCR-amplifikasjon skjer. Reaksjonsblandingen varmes opp for å denaturere det isolerte DNA og eksponere primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, hybridiserer oppstrøms- og nedstrømsprimerne spesifikt til en av DNA-trådene, Z05 forlenger primeren, og en ny DNA-tråd syntetiseres. Dette avslutter den første PCR-syklusen og gir en dobbelttrådet DNA-kopi av CT-DNAs og CT-internkontroll-DNAs målregioner. Reaksjonsblandingen varmes opp på nytt for å separere dette dobbelttrådete DNA-et og eksponere primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, hybridiseres primerne til mål-dna. I nærvær av Mn 2+ og ved dntp i overskudd forlenger Z05 DNA-polymerasen de hybridiserte primerne langs måltemplatene og produserer et dobbelttrådet DNAmolekyl som kalles et amplicon. COBAS TaqMan 48-analysatoren gjentar denne prosessen automatisk i et bestemt antall sykluser, der hver syklus skal doble mengden amplicon-dna. Ønsket antall sykluser er forhåndsprogrammert i COBAS TaqMan 48-analysatoren. Amplifikasjonen skjer kun i regionene mellom primerne for CT kryptisk plasmid og/eller ompa kromosomet. Hele det kryptiske CT-plasmidet eller kromosomet amplifiseres ikke. Internkontrollamplifikasjon I enzymbaserte amplifikasjonsprosesser som PCR kan hemmere som kan finnes i prøven, redusere effektiviteten. CT-internkontrollen gir mulighet til å identifisere preparerte prøver som inneholder substanser som kan interferere med PCR-amplifikasjon. CT-internkontrollen er et ikke-infeksiøst, rekombinant plasmid- DNA med primerbindende regioner identiske med dem i C. trachomatis-målsekvensen, en randomisert intern sekvens med tilsvarende lengde og basesammensetning som C. trachomatis-målsekvensen, og en unik probebindende region som gjør det mulig å skille CT-internkontrollen fra målamplicon. Disse egenskapene ble valgt for å sikre en likeverdig amplifikasjon av CT-internkontrollen og mål-dna fra C. trachomatis. CT-internkontrollreagensen er inkludert i COBAS TaqMan CT-testen v2.0 og introduseres i hver amplifikasjonsreaksjon slik at den koamplifiseres med mål-dna fra prøven. CT-internkontrollen er utviklet for å sikre at prøver ikke inneholder hemmere som kan interferere med amplifikasjon og deteksjon av 20 eller flere kopier av C. trachomatis-målnukleinsyre bestemt ved Poisson-analyse. Selektiv amplifikasjon Selektiv amplifikasjon av målnukleinsyre fra prøven oppnås i COBAS TaqMan CT-testen v2.0 ved hjelp av AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzym og deoksyuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin 9, men ikke DNA som inneholder deoksytymidin. Deoksyuridin finnes ikke i naturlig forekommende DNA, men finnes alltid i amplicon på grunn av bruken av deoksyuridintrifosfat som en av dntp-ene i Master Mix-reagenset. Det er derfor kun amplicon som inneholder deoksyuridin. Deoksyuridin gjør kontaminerende amplicon mottakelig for destruksjon av AmpErase-enzymet forut for amplifikasjon av mål-dna. Uspesifikke produkter som oppstår etter innledende aktivering av Master Mix med mangan, ødelegges av AmpErase-enzymet. AmpErase-enzymet, som inngår i Master Mix-reagenset, katalyserer nedbrytning av DNA som inneholder deoksyuridin, ved å bryte deoksyuridingruppens deoksyribosekjede ved C1-posisjonen. Ved temperaturøkning i det første varmetrinnet brytes amplicon-dna-kjeden der deoksyuridinet finnes, noe som igjen fører til at DNA ikke lenger er amplifiserbart. AmpErase-enzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 ºC, dvs. gjennom alle termosykliske trinn, og derfor blir ikke målamplicon som dannes under amplifikasjon ødelagt. Deteksjon av PCR-produkter i COBAS TaqMan -testen COBAS TaqMan CT-testen v2.0 anvender sanntids 10,11 PCR-teknologi. Bruken av dobbel-fluoroformerkede prober sørger for sanntidsdeteksjon av akkumulert PCR-produkt ved å måle emisjonsintensiteten av rapporteringsfluorescensen som frigjøres under amplifikasjonsprosessen. Probene består av CT kryptisk plasmid-, CT ompa- og CT-internkontrollspesifikke oligonukleotider merket med en rapporteringsfluorofor og en slukkerfluorofor. I COBAS TaqMan CT-testen v2.0 benytter probene for CT kryptisk plasmid og ompa samme rapporteringsfluorofor, og CT-internkontrollproben er merket med en annen rapporteringsfluorofor enn CT kryptisk plasmid- og ompa-probene. Når de dobbel-fluoroformerkede probene er intakte, undertrykkes rapporteringsfluorescensen på grunn av nærheten til slukkerfluoroforen gjennom energioverføringer av Förster-type. Under PCR hybridiserer probene til sin respektive målsekvens og splittes av 5' til 3' nukleaseaktivitet hos den termostabile Z05 DNA-polymerasen. Så snart rapporterings- og slukkerfluoroforene er frigjort og separert, forekommer det ikke lenger slukking, og rapporteringsfluoroforenes fluorescerensaktivitet øker. Amplifikasjonen av CT kryptisk plasmid- og/eller ompa-mål-dna måles uavhengig av, og ved en forskjellig bølgelengde enn CT-internkontroll-DNA. Denne prosessen gjentas et visst antall sykluser, der 2

3 hver syklus effektivt øker emisjonsintensiteten hos de individuelle rapporteringsfluoroforene og gir en uavhengig identifikasjon av CT-DNA og CT-internkontroll-DNA. REAGENSER AMPLICOR CT/NG Specimen Preparation Kit CT/NG PREP 100 tester AMPLICOR CT/NG prøveprepareringskit (P/N: ; ART: ; US: 83315) CT/NG URINE WASH 1 x 50 ml (CT/NG urinvaskebuffer) Tris-HCl-buffer 300 mm natriumklorid < 0,1 % detergent 0,09 % natriumazid CT/NG LYS 1 x 25 ml (CT/NG lyseringsreagens) Tris-HCl-buffer < 1 % solubiliserende middel 0,09 % natriumazid CT/NG DIL 2 x 50 ml (CT/NG fortynningsløsning) Tris-HCl-buffer 6 mm magnesiumklorid < 25 % detergent 0,05 % natriumazid COBAS TaqMan CT Test, v2.0 CTM CT v tester (P/N: ) Kontrollreagenser CT IC 3 x 0,1 ml (CT-internkontroll) Tris-HCl-buffer 8 kopier/µl av ikke-infeksiøst plasmid-dna (mikrobielt) som inneholder C. trachomatis primerbindende sekvenser og en unik probebindende region, svarende til cirka 20 IC-kopier/test < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA Amarantfarge 0,05 % natriumazid CT (+) C, v2.0 1 x 0,75 ml [C. trachomatis (+)-kontroll, v2.0] Tris-HCl-buffer 8,6 kopier/µl ikke-infeksiøst plasmid-dna (syntetisk) som inneholder C. trachomatis-sekvenser, svarende til cirka 20 kopier/test < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid CT ( ) C, v2.0 1 x 0,75 ml [C. trachomatis ( )-kontroll, v2.0] Tris-HCl-buffer < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid 3

4 Amplifikasjons- og deteksjonsreagenser CT MMX, v2.0 (COBAS TaqMan CT Master Mix, v2.0) 3 x 0,75 ml Tricinbuffer Kaliumhydroksid Kaliumacetat Glyserol < 0,001 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001 % oppstrøms- og nedstrømsprimere for CT kryptisk plasmid og CT ompa < 0,001 % fluoroformerkede oligonukleotidprober spesifikke for CT kryptisk plasmid, CT ompa og CT-internkontroll < 0,001 % Aptamer < 0,05 % Z05 DNA-polymerase (mikrobiell) < 0,1 % AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzym (mikrobielt) 0,09 % natriumazid CT Mn 2+ (COBAS TaqMan CT manganløsning) 3 x 0,2 ml < 1,0 % manganacetat Isedikk 0,09 % natriumazid ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. B. Bruken av termen kopi i dette pakningsvedlegget viser til 1 kopi av C. trachomatismålnukleinsyre. Én (1) kopi tilsvarer den minste mengden C. trachomatis-målnukleinsyre som må til for å generere et positivt PCR-testresultat. C. Denne testen skal kun brukes til endocervikale prøver og urinprøver. Denne testen skal ikke brukes til halsprøver, rektalprøver eller andre prøver. D. Ikke pipetter med munnen. E. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. F. Unngå mikrobiell kontaminering av reagensene når du pipetterer ut porsjoner fra reagensflasker. G. Bruk av sterile engangspipetter og pipettespisser anbefales. H. Reagenser fra ulike lot eller ulike flasker innen samme lot må ikke slås sammen. I. Reagenser fra ulike kit må ikke blandes. J. Kast ubrukte reagenser, avfall og prøver i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. K. Kit som er utgått på dato, må ikke brukes. L. Dataark om materialsikkerhet (MSDS) kan på forespørsel sendes fra ditt lokale Roche-kontor. M. Arbeidsflyten på laboratoriet må være unidireksjonal og starte i preamplifikasjonsområdet og fortsette videre til postamplifikasjonsområdet (amplifikasjon/deteksjon). Forbruksmateriell og utstyr må være dedikert til hver preamplifikasjonsaktivitet og ikke brukes til andre aktiviteter eller flyttes mellom områdene. Hansker må brukes i alle områder og må byttes før området forlates. Utstyr og forbruksmateriell som brukes til reagenstillaging, må ikke brukes til prøvepreparering eller pipettering eller bearbeiding av amplifisert DNA eller andre kilder for mål-dna. Forbruksmateriell og -utstyr for postamplifikasjon skal forbli i postamplifikasjonsområdet. N. Prøver og kontroller må håndteres som infeksiøse, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 12 og CLSI-dokumentet M29-A3 13. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. MERK: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1 : 10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. O. For prøver som transporteres i transportmediet M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.), skal prøvepenselen bli værende i transportrøret som en visuell bekreftelse på at prøven er inokulert. COBAS TaqMan CT-testen v2.0 ble evaluert med prøver som ble transportert med 4

5 prøvepenselen i transportmedierøret M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.). Prøver som transporteres i M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.)-medier uten prøvepensel, er ikke evaluert, og slike prøver anbefales ikke for bruk i denne testen. P. Oppbevaring av urinprøver i romtemperatur (15 30 C) i mer enn 24 timer kan føre til forringelse av prøvene. Urinprøver som er oppbevart i mer enn 24 timer i romtemperatur (15 30 C), skal ikke brukes til testing. Q. CT/NG URINE WASH, CT/NG LYS, CT/NG DIL, CT MMX, v2.0, CT Mn 2+, CT IC, CT (+) C, v2.0 og CT ( ) C, v2.0 inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid, helles ned i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå azidoppbygging. R. Rør med skrukork må brukes til preparering av prøver og kontrolleres for å forhindre søl og mulig krysskontaminering av prøver. Ikke bruk rør med snapplokk. S. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker ved håndtering av reagenser. Unngå kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra reagensene. OPPBEVARING OG HÅNDTERING Ikke frys reagenser eller kontroller. A. Oppbevar CT/NG LYS ved 2 25 C. Oppbevar CT/NG URINE WASH og CT/NG DIL ved 2 8 C. Hvis det dannes bunnfall i ett av disse reagensene under oppbevaring, må reagenset varmes opp til romtemperatur (15-30 C) og blandes godt før bruk. Disse reagensene er stabile til angitt utløpsdato. B. Oppbevar CT MMX, v2.0, CT Mn 2+, CT (+) C, v2.0, CT ( ) C, v2.0 og CT IC ved 2 8 C. Disse reagensene er stabile til angitt utløpsdato. C. Oppbevar delvis brukte kontroller ved 2 8 C mellom kjøringene. Kontroller utløpsdatoen for åpnede kontroller før bruk. CT (+) C, v2.0 og CT ( ) C, v2.0 kan brukes opptil tre ganger til å klargjøre aktive kontroller CT (+), v2.0 og CT ( ), v2.0. D. CT MMX, v2.0, CT Mn 2+ og CT IC leveres i rør for engangsbruk, for serier à 16 reaksjoner. Eventuelt ubrukt materiale i disse rørene må kastes. E. Working Master Mix (tillages ved å tilsette CT Mn 2+ og CT IC til CT MMX,v2.0) må oppbevares mørkt i romtemperatur (15 30 C) i maks. 2 timer eller ved 2 8 ºC i maks. 16 timer. Preparerte prøver og kontroller må tilsettes innen 2 timer fra tidspunktet Working Master Mix ble klargjort, hvis den oppbevares ved romtemperatur (15 30 C), eller innen 16 timer fra tidspunktet Working Master Mix ble klargjort, hvis den oppbevares ved 2 8 ºC. F. Klargjorte prøver er stabile i opptil 2 timer ved C og 7 dager ved 2 8 C. G. Amplifikasjon må startes innen 90 minutter fra det tidspunktet de preparerte prøvene og kontrollene er tilsatt til Working Master Mix. MATERIELL SOM MEDFØLGER Prøveprepareringsreagenser A. AMPLICOR CT/NG Specimen Preparation Kit AMPLICOR CT/NG prøveprepareringskit (P/N: ; ART: ; US: 83315) CT/NG LYS (CT/NG lyseringsreagens) CT/NG URINE WASH (CT/NG urinvaskebuffer) CT/NG DIL (CT/NG fortynningsløsning) Amplifikasjons- og deteksjonsreagenser B. COBAS TaqMan CT Test, v2.0 (P/N: ) CT IC (CT-internkontroll) CT (+) C, v2.0 [C. trachomatis (+)-kontroll, v2.0] CT/NG PREP CTM CT v2.0 5

6 CT ( ) C, v2.0 [C. trachomatis ( )-kontroll, v2.0] CT MMX, v2.0 (COBAS TaqMan CT Master Mix, v2.0) CT Mn 2+ (COBAS TaqMan CT manganløsning) MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Instrumentering og programvare COBAS TaqMan 48-analysator AMPLILINK-programvare Datastasjon for AMPLILINK-programvaren Instrumentmanual for COBAS TaqMan 48-analysatoren for bruk sammen med applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software, Version 3.2 Series Applikasjonsmanual for AMPLILINK-programvaren versjon 3.2 for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren og COBAS AMPLICOR -analysatoren K-rør-åpner/lukker K-stativ for COBAS TaqMan 48-analysatoren K-platestativ for COBAS TaqMan 48-analysatoren Prøvetaking og transport M4RT Micro Test BL KIT Ref produsert og distribuert av Remel, Inc. Dette produktet er også tilgjengelig via bestillingssystemet hos Roche (P/N: ). Polypropylen prøvetakingsrør for urin, uten konserveringsmidler Engangsartikler K-rør K-stativer for COBAS TaqMan 48-analysatoren ANNET MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Eppendorf Repeater -pipette med 1,25 ml Eppendorf Combitip -reservoar (steril, enkeltpakket) Vortexmikser Pipettefyller: Drummond (P/N: ) eller tilsvarende 2,0 ml polypropylenrør med skrukork, sterile, ikke silikonbehandlede, koniske (for eksempel Sarstedt )** Rørstativ (f.eks. Sarstedt ) Pipetter (kapasitet 50 µl, 100 µl, 200 µl, 250 µl, 500 µl og 1000 µl)* med aerosolbarriere- eller positive displacement -spisser Mikrosentrifuge (maks. RCF x g, min. RCF x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M, eller tilsvarende Forlengede spisser med aerosolbarriere (Matrix 7055 eller tilsvarende) for bruk til prøver transportert i medium av typen M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) (M4RT MicroTest BL KIT) 37 C ± 2 C varmeblokk Absorberende papir Engangshansker, uten pudder * Pipettene må ha en nøyaktighet innenfor 3 % av angitt volum. Aerosolbarriere- eller positive displacement -DNasefrie (eller nukleasefrie) spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering av prøver og amplicon. ** Rør med skrukork må brukes til prøve- og kontrollpreparering for å forhindre søl og mulig krysskontaminering av prøver og kontroller. Ikke bruk rør med snapplokk. 6

7 PRØVETAKING, TRANSPORT OG OPPBEVARING MERK: Alle prøver og kontroller må behandles som om de er potensielt infeksiøse. De eneste godkjente prøvematerialene er: 1. Urinprøver (menn og kvinner) transportert i rene polypropylenbeholdere. Ikke bruk urinprøver tatt i beholdere som inneholder konserveringsmidler. 2. Endocervikale penselprøver som er tatt og transportert i transportmedium av typen M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.). Følg instruksjonene for riktig prøvetaking nedenfor for å oppnå pålitelige testresultater. Denne testen skal ikke brukes til halsprøver, rektalprøver eller andre prøvematerialer enn de som er angitt. For å sikre at prøvene holder god kvalitet når de leveres til laboratoriet for testing, må urinprøver og endocervikale penselprøver transporteres til laboratoriet så raskt som mulig. Prøvene skal ikke transporteres uten kontrollerte temperaturforhold. A. Prøvetaking Urinprøver (menn og kvinner) MERK: Pasienten må ikke ha urinert de siste 2 timer. 1. Samle 10 til 50 ml førstestrømsurin (første del av strømmen) i en ren polypropylenbeholder uten konserveringsmidler. 2. Forsegl prøvebeholderen og merk den med relevante opplysninger. Følg laboratoriets prøvetakingsog transportprosedyre. Prøven kan transporteres til teststedet ved romtemperatur (15 30 C). Penselprøver (kvinner) som er tatt i transportmedium av typen M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) 1. Endocervikale penselprøver kan tas og transporteres i 3 ml transportmedium av typen M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.). Bruk anbefalte metoder til å ta prøver av sylinderceller og skvamøse sylinderceller etter fjerning av cervicalt slimsekret Bruk kun pensel med dacron-, rayon- eller kalsiumalginatspiss med skaft av plast eller ikkealuminium. Ikke bruk pensler med skaft av tre eller aluminium. 3. La penslene være igjen i transportmediet. Forsegl prøvebeholderen og merk den med relevante opplysninger. Følg laboratoriets prøvetakings- og transportprosedyre. Prøven kan transporteres til teststedet ved romtemperatur (15 30 C). B. Transport av prøver Urinprøver (menn og kvinner) 1. Urinprøver kan transporteres til teststedet ved C. Urinprøvene er stabile i 24 timer ved C. 2. Urinprøver som krever transport til eksterne testsentre, må sendes via en levering-over-natten - tjeneste som garanterer levering innen 24 timer. Transporten må skje ved C. Hvis urinprøvene transporteres ved C, må de oppbevares ved 2 8 C frem til transporttidspunktet for å sikre at oppbevaringen ved C ikke overskrider 24 timer. Transport av prøver må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale 15. Penselprøver (kvinner) som er tatt i transportmedium av typen M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) 1. Penselprøver kan transporteres til teststedet ved C så lenge den samlede oppbevaringsog transportperioden ved C er mindre enn 14 dager. Oppbevar penselprøvene kjølig hvis transporten til laboratoriet skjer senere enn 14 dager etter prøvetaking. Hvis prøvene skal brukes til dyrking, må de håndteres i overensstemmelse med anbefalingene for dyrkning ( 60 C hvis de ikke dyrkes i løpet av 24 timer). 2. Penselprøver som krever transport til eksterne laboratorier, kan transporteres ved C etter prøvetaking foretatt i overensstemmelse med laboratoriets prosedyrer for transport av penselprøver. Transport av prøver må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale 15. C. Oppbevaring av prøver MERK: Rutinemessing nedfrysing eller forlenget oppbevaring av prøver kan påvirke ytelsen. Urinprøver (menn og kvinner) Urinprøver som ikke behandles i løpet av 24 timer etter prøvetaking, må lagres ved 2 8 C. Disse prøvene må behandles innen 7 dager etter prøvetaking. Urinprøver som ikke kan behandles i løpet av 7 dager etter prøvetaking, kan oppbevares ved 20 C eller lavere i opptil 30 dager. 7

8 Penselprøver (kvinner) som er tatt i transportmedium av typen M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) Oppbevar penselprøver som ikke skal analyseres umiddelbart etter mottak i laboratoriet, ved C, og analyser dem innen 14 dager. Penselprøver som ikke analyseres innen 14 dager etter prøvetaking, må oppbevares ved 20 C eller kaldere og analyseres innen 30 dager etter prøvetaking. BRUKSANVISNING MERK: Mer detaljert informasjon om bruk av instrumentet, utskrift av resultater og tolking av flagg, kommentarer og feilmeldinger finnes i instrumentmanualen for COBAS TaqMan 48- analysatoren for bruk sammen med applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software Version 3.2 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan - analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren og COBAS AMPLICOR -analysatoren. MERK: Alle amplifikasjons- og deteksjonsreagenser må ha romtemperatur (15 30 C) før bruk. Ta dem ut av kjølelagringen på 2 8 C minst 30 minutter før bruk. MERK: Pensel- og urinprøver må stå minutter i romtemperatur (15 30 C) før bruk. MERK: Bruk pipetter med aerosolbarriere- eller positive displacement -spiss der dette er angitt. Vær svært forsiktig og varsom for å unngå kontaminering. Størrelse på analyseserier: Hvert COBAS TaqMan CT-testkit v2.0 inneholder tilstrekkelig reagens til tre analyseserier à 16 tester. Disse kan utføres separat eller samtidig. Et replikat hver av CT ( ) C, v2.0 og CT (+) C, v2.0 må inkluderes i hver analyseserie på opptil 48 prøver og kontroller (se avsnittet Kvalitetskontroll ). Amplifikasjons- og deteksjonsreagensene er pakket i flasker à 16 tester for engangsbruk. For å få en mest mulig effektiv bruk av reagenser bør prøver og kontroller kjøres i analyseserier bestående av et antall som er multipler av 16. Prøveprepareringsreagensene er pakket i engangsflasker for 100 tester. Prøve- og kontrollpreparering A. Prøvepreparering utført i: Preamplifikasjon prøveprepareringsområdet Urinprøver (menn og kvinner) 1. Merk ett 2,0 ml rør med skrukork for hver pasientprøve. 2. Tilsett 500 µl CT/NG URINE WASH i hvert av de merkede rørene. 3. Vortex urinen godt (3 10 sekunder). Hvis du bruker frosne prøver, skal prøvene tines i romtemperatur (15 30 C) før vortexing (volumer på mer enn 2 ml må tines over natten ved 2 8 C). Fortsett med prøvebehandlingen selv om det måtte forekomme bunnfall. Fjern korkene forsiktig fra urinprøvebeholderne. Unngå å kontaminere hanskene med urin fra korken. Hvis kontaminering skulle skje, må hanskene byttes ut med et rent par før neste prøve behandles. 4. Tilsett 500 µl godt blandet pasienturinprøve til det merkede røret som inneholder CT/NG URINE WASH. Bruk en ny spiss med aerosolbarriere for hver prøve. Kork rørene og bland godt ved hjelp av vortexing. 5. Inkuber rørene i 15 minutter ved 37 C. 6. Sentrifuger ved x g i 5 minutter. 7. Tøm ut supernatanten og trykk hvert rør mot et separat ark av absorberende papir. 8. Bruk en ny pipettespiss med aerosolbarriere for hver prøve, og tilsett 250 µl CT/NG LYS til hvert rør. Kork rørene og bland godt ved hjelp av vortexing. 9. Inkuber alle rørene i 15 minutter ved romtemperatur (15 30 C). 10. Bruk en ny pipettespiss med aerosolbarriere for hver prøve, og tilsett 250 µl CT/NG DIL til hvert rør. Kork rørene og bland godt ved hjelp av vortexing. 11. Sentrifuger rørene i 10 minutter ved x g. 12. Preparerte prøver kan oppbevares ved romtemperatur (15 30 C) i opptil 2 timer før overføring av en avpipettert mengde til K-rørene eller K-platene som inneholder Working Master Mix. Oppbevar preparerte prøver ved 2 8 C hvis avpipettering til K-rør eller K-plater ikke vil finne sted innen 2 timer. Preparerte prøver som oppbevares ved 2 8 C må testes innen 7 dager. Penselprøver MERK: COBAS TaqMan CT-testen v2.0 er evaluert med transportmedium av typen M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.). Bruk av alternative transportmedier må evalueres av laboratoriet. 1. Kontroller at medierøret M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) inneholder en pensel. Pensler skal etterlates i medierøret M4RT MicroTest Culture Transport System 8

9 (Remel, Inc.) for å unngå feil behandling. Tilstedeværelsen av en pensel i medierøret M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) er ikke en garanti for korrekt prøvetaking. 2. Merk ett 2,0 ml rør med skrukork for hver pasientprøve. Ikke bruk rør med snapplokk. 3. Tilsett 100 µl CT/NG LYS i de merkede 2 ml polypropylenrørene. 4. Bland prøvene ved hjelp av vortexing. Hvis prøvene ble oppbevart nedfrosset, skal de tines i romtemperatur (15 30 C) før vortexing. Fjern korkene forsiktig fra prøverørene. Unngå å kontaminere hanskene. Hvis kontaminering skulle skje, må hanskene byttes ut med et rent par før neste prøve behandles. 5. Bruk en pipette med en ny spiss med aerosolbarriere og tilsett 100 µl av en godt blandet prøve til det korresponderende røret som inneholder CT/NG LYS. Bruk en ny spiss med aerosolbarriere for hver prøve. Kork røret og bland godt ved hjelp av vortexing. 6. Inkuber rørene i 10 minutter ved romtemperatur (15 30 C). 7. Bruk en ny pipettespiss med aerosolbarriere for hver prøve, og tilsett 200 µl CT/NG DIL til hvert rør. Kork røret og bland godt ved hjelp av vortexing. 8. Inkuber rørene i 10 minutter ved romtemperatur (15 30 C). 9. Preparerte prøver kan oppbevares ved romtemperatur (15 30 C) i opptil 2 timer før overføring av en avpipettert mengde til K-rør eller K-plater som inneholder Working Master Mix. Oppbevar preparerte prøver ved 2 8 C hvis avpipettering til K-rørene ikke vil finne sted innen 2 timer. Preparerte prøver som oppbevares ved 2 8 C, må testes innen 7 dager. B. Kontrollpreparering utført i: Preamplifikasjon prøveprepareringsområdet MERK: Arbeidskontroller må tilberedes ferskt samme dag som testen utføres. Arbeidskontroller kan brukes til å klargjøre flere preparerte kontroller i løpet av dagen, men må kastes ved arbeidsdagens slutt. MERK: CT (+) C, v2.0- og CT ( ) C, v2.0-reagensene i COBAS TaqMan CT-testkit v2.0 er utviklet for å kunne brukes opptil tre ganger til preparering av CT (+), v2.0- og CT ( ), v2.0- arbeidskontroller. MERK: Ved testing av både penselprøver og urinprøver er det nødvendig å preparere ett sett med kontroller for hver prøvetype. Arbeidskontroller: Klargjør følgende CT (+), v2.0- og CT ( ), v2.0-arbeidskontroller. 1. Bruk en pipette med steril pipettespiss til å tilsette 1 ml CT/NG DIL til hvert av to 2 ml polypropylenrør med skrukork. Merk ett rør med CT (+), v2.0-arbeidskontroll, og merk det andre røret med CT ( ), v2.0-arbeidskontroll. 2. Vortex CT (+) C, v2.0 og CT ( ) C, v2.0 ved maksimal hastighet i 5 sekunder. Fjern korkene forsiktig fra rørene. Unngå å kontaminere hanskene. Hvis kontaminering skulle skje, må hanskene byttes ut med et rent par før du fortsetter. 3. Bruk en pipette med en ny spiss med aerosolbarriere og tilsett 100 µl CT (+) C, v2.0 til røret som er merket CT (+), v2.0-arbeidskontroll. Sett på korken og oppbevar CT (+) C, v2.0-røret ved 2 8 C. 4. Bruk en pipette med en ny spiss med aerosolbarriere og tilsett 100 µl CT ( ) C, v2.0 til røret som er merket CT ( ), v2.0-arbeidskontroll. Sett på korken og oppbevar CT ( ) C, v2.0-røret ved 2 8 C. 5. Kork arbeidskontrollene og bland godt ved hjelp av vortexing. Oppbevar ved romtemperatur (15 30 C) og kast dem når arbeidsdagen er over. Urinprøver: Klargjør følgende CT (+), v2.0 og CT ( ), v2.0 preparerte kontroller. 1. Bruk en pipette med steril pipettespiss til å tilsette 250 µl CT/NG LYS til hvert av to 2 ml polypropylenrør med skrukork. Merk et rør med CT (+), v2.0 preparert kontroll, og merk det andre røret med CT ( ), v2.0 preparert kontroll. 2. Bruk en pipette med en ny spiss med aerosolbarriere og tilsett 250 µl av CT (+), v2.0- arbeidskontrollen til røret som er merket CT (+), v2.0 preparert kontroll. 3. Bruk en pipette med en ny spiss med aerosolbarriere og tilsett 250 µl av CT ( ), v2.0- arbeidskontrollen til røret som er merket CT ( ), v2.0 preparert kontroll. 4. Kork rørene og bland godt ved hjelp av vortexing. Inkuber alle rørene i 10 minutter ved romtemperatur (15 30 C). Oppbevar ved romtemperatur (15 30 C) og kast dem når arbeidsdagen er over. 9

10 Penselprøver: Klargjør følgende CT (+), v2.0 og CT ( ), v2.0 preparerte kontroller. 1. Bruk en pipette med en steril pipettespiss til å tilsette 100 µl CT/NG LYS til hvert av to 2 ml polypropylenrør med skrukork. Merk et rør med CT (+), v2.0 preparert kontroll og merk det andre røret CT ( ), v2.0 preparert kontroll. 2. Bruk en pipette med en steril pipettespiss, og tilsett 100 µl M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.)-medium til hvert av rørene som inneholder CT/NG LYS. 3. Kork rørene og bland godt ved hjelp av vortexing. 4. Bruk en pipette med en ny spiss med aerosolbarriere og tilsett 200 µl av CT (+), v2.0- arbeidskontrollen til røret som er merket CT (+), v2.0 preparert kontroll. 5. Bruk en pipette med en ny spiss med aerosolbarriere og tilsett 200 µl av CT ( ), v2.0- arbeidskontrollen til røret som er merket CT ( ), v2.0 preparert kontroll. 6. Kork rørene og bland godt ved hjelp av vortexing. Inkuber i 10 minutter i romtemperatur (15 30 C). Oppbevar ved romtemperatur (15 30 C) og kast dem når arbeidsdagen er over. Amplifikasjon og deteksjon MERK: K-carrier og K-carrier-holderen må tørkes av med en lofri klut fuktet med 70 % isopropanolløsning. A. Tillaging av reagenser MERK: COBAS TaqMan CT Master Mix, v2.0 (CT MMX, v2.0), Working Master Mix (Working MMX) og Working MMX tilsatt preparerte prøver og kontroller er lyssensitive. Beskytt disse reagensene fra lys. MERK: COBAS TaqMan CT Master Mix, v2.0 (CT MMX, v2.0), COBAS TaqMan CT manganløsning (CT Mn 2+ ) og COBAS TaqMan CT-internkontroll (CT IC) må stå ved romtemperatur (15 30 C) i minst 30 minutter før tillaging av Working Master Mix. MERK: Gjør klar Working MMX etter at preparering av prøver og kontroller er fullført. MERK: Working MMX må brukes innen 2 timer etter tillaging dersom den oppbevares ved romtemperatur (15 30 C), eller innen 16 timer dersom den oppbevares ved 2 8 ºC. MERK: Når preparerte prøver og kontroller er tilsatt til Working MMX, må amplifikasjonen startes innen 90 minutter. 1. La et rør CT MMX, v2.0, et rør CT IC og et rør CT Mn 2+ stå i romtemperatur (15 30 C) i minst 30 minutter. 2. Plasser et K-rørstativ i holderen for K-rørstativ. Plasser K-rør eller en ny K-plate i K-rørstativ uten å berøre sidene på K-rørene eller K-platebrønnene. MERK: Hvis det er færre enn 24 rør som skal analyseres, må posisjonene 1, 2, 5, 20, 23 og 24 benyttes for å balansere K-rørstativet i termocycleren. 3. Ta av lokkene ved hjelp av verktøyet for K-rør-åpner/lukker om nødvendig. Plasser lokkene i oppbevaringsbeholderen for lokk til K-rør. 4. Klargjør Working MMX på følgende måte: For 16 tester tilsettes 150 µl CT Mn 2+ og 50 µl CT IC til et rør CT MMX, v2.0. Sett korken på røret og bland ved å vende opp-ned 10 ganger. Ikke vortex Working MMX. Working MMX må beskyttes mot lys og brukes innen 2 timer ved oppbevaring i romtemperatur (15 30 C) eller innen 16 timer ved oppbevaring i 2 8 C. 5. Pipetter 50 µl Working MMX til hvert K-rør eller hver K-platebrønn. MERK: Hvis preparerte prøver har vært oppbevart i frossen tilstand før amplifikasjonen, må de tines ved romtemperatur (15 30 C) og blandes godt ved hjelp av vortexing. Sentrifuger preparerte urinprøver i 10 minutter ved x g. MERK: Pipettespissen må ikke komme i kontakt med andre overflater enn gjeldende K-rør eller K-plate når Working MMX pipetteres. Hvis spissen kommer i kontakt med K-platestativet, må den kastes for å unngå at det introduseres PCR-hemmere. 6. Tilsett 50 µl av hver preparerte prøve og kontroll til det aktuelle K-røret eller den aktuelle K-platebrønnen som inneholder Working MMX, ved hjelp av en mikropipette med aerosolbarriereeller positive displacement -spiss. Bland hver prøve eller kontroll med mikropipetten ved å trekke prøve-/reagensblandingen tre ganger opp og ned uten å generere bobler. MERK: Pipettespissen må ikke komme i kontakt med andre overflater enn gjeldende K-rør eller K-plate når preparerte prøver og kontroller pipetteres. Hvis spissen kommer i kontakt med K-platestativet, må den kastes for å unngå at det introduseres PCR-hemmere. 10

11 7. Gjenta trinn 6 for hver preparerte prøve og kontroll til alle er overført til K-rør eller K-plater. Bruk en ny spiss for hver prøve og kontroll. Inspiser visuelt at det ikke finnes bobler. Fjern dem ved behov. Dekk til K-platen eller lukk K-rørene med en K-rør-åpner/lukker. Verifiser visuelt at korrekt volum er tilsatt i alle K-rør. 8. Amplifikasjonen må startes innen 90 minutter fra det tidspunktet da de preparerte prøvene og kontrollene ble tilsatt til K-rørene eller K-platebrønnene med Working MMX. 9. Gjenværende materiale av de preparerte prøvene skal oppbevares ved 2 8 ºC i tilfelle retesting blir nødvendig. Eventuell retesting må utføres innen 7 dager etter prøvepreparering. B. Innlasting og betjening av COBAS TaqMan 48-analysatoren 1. Slå på arbeidsstasjonens datamaskin, og logg deg på Windows XP med aktuell bruker-id og passord. 2. Slå på COBAS TaqMan 48-analysatoren. Kontroller at instrumentet initialiseres og er klart til bruk. Hvis K-rørstativ fra tidligere analyseserier fortsatt befinner seg i noen av termoblokkene, må de fjernes ved hjelp av løfteverktøyet for K-rørstativ. 3. Åpne AMPLILINK-programvaren på datamaskinen. Logg deg på med aktuell bruker-id og passord. 4. Klikk på ikonet Orders for å opprette K-rørstativtestbestillinger for prøvene som skal analyseres. Velg fliken Sample, og klikk deretter på knappen New. Legg inn bestillingsnummeret for hver prøve ved hjelp av tastaturet eller strekkodeleseren. Velg testdefinisjonen for COBAS TaqMan CTtesten v2.0. Gjenta for hver prøve. Klikk på knappen Save. MERK: Hvis det er færre enn 24 rør som skal analyseres, må posisjonene 1, 2, 5, 20, 23 og 24 benyttes for å balansere K-rørstativet i termocycleren. 5. Angi informasjon for kvalitetskontroller ved å velge fliken Quality Control i vinduet Orders. Klikk på knappen New, og legg inn informasjonen for COBAS TaqMan CT-testen v2.0 som følger med kitet, ved hjelp av tastaturet eller strekkodeleseren. Angi lotnummer, utløpsdato, akseptgrenser for lav (+) kontroll for COBAS TaqMan CT-test v2.0, i tillegg til kalibreringskoeffisienter i de angitte feltene. Klikk på OK. 6. Legg inn oppsettets K-rørstativnummer ved å klikke på fliken K-Carrier i vinduet Orders. Klikk på New i vinduet K-Carrier. Angi K-rørstativnummeret fra strekkoden på K-rørstativet i feltet til høyre for K-Carrier ID ved hjelp av tastaturet eller strekkodeleseren. Merk at resultatene fra et tidligere oppsett med samme K-rørstativ-ID må godkjennes først. Etter at samme strekkoden for K-rørstativ er brukt to ganger på samme analysator, må resultatene fra disse batchene godkjennes, arkiveres og slettes før samme strekkode kan brukes på nytt. Velg testdefinisjon for COBAS TaqMan CT-testen v2.0 fra testpanelet nederst i vinduet. 7. Velg den første raden i kolonnen Type (T) i Worklist. Marker dette feltet for å åpne rullegardinmenyen. Velg deretter ønsket kontrolltype. Dobbeltklikk i feltet Sample ID på samme rad. Vinduet LookUp Control vises med alle tilgjengelige kontroller. Når kontrollen er valgt, vises de tilhørende kalibrerings- og kontrollverdiene i informasjonspanelet nede til høyre. Gjenta denne prosedyren for alle kontroller det er behov for. 8. For å legge til prøver i Worklist dobbeltklikker du på den første posisjonen (raden) for innlegging av prøver. Da vises vinduet Lookup Sample som inneholder tildelte prøvebestillinger. Bruk Shift + Pil-taster for å markere mer enn ett bestillingsnummer. Kontroller at alle bestillinger er tildelt testdefinisjonen for COBAS TaqMan CT-test, v Klikk på Save for å lagre bestillingen for K-rørstativet. C. Amplifikasjon og deteksjon 1. Velg ikonet Systems på fliken System. Klikk på Open for å åpne termocycleren. Når dekselet på termocycleren har åpnet seg helt og Ready to Load vises i vinduet Systems, løfter du opp og holder lokket til termocycleren åpent. Bruk løfteverktøyet for K-rørstativet til å flytte K-rørstativet med de lukkede K-rørene eller K-platen med Working Master Mix, prøver og kontroller, inn i termocycleren. Lukk lokket på termocycleren. 2. Klikk på Start i vinduet Systems under TC-ikonet for å lukke dekselet på termocycleren og starte analysen. 3. Amplifikasjon og deteksjon utføres automatisk av COBAS TaqMan 48-analysatoren. 11

12 RESULTATER Kalkulering av resultater COBAS TaqMan 48-analysatoren bestemmer automatisk om CT-DNA er detektert for prøven eller kontrollen. COBAS TaqMan 48-analysator: Bestemmer syklusterskelverdi (Cycle Threshold, Ct) for CT-DNA og CT-internkontroll-DNA. Bestemmer om CT-DNA er detektert basert på Ct-verdiene for CT-DNA og CT-internkontroll- DNA. Validering av analyseserien For å sikre at analyseserien er gyldig, sjekker du i resultatvinduet i AMPLILINK-programvaren v3.2 eller på utskriften om det finnes flagg og kommentarer. Analyseserien er gyldig hvis det ikke vises noen flagg for COBAS TaqMan CT-kontrollene, v2.0. Følgende resultater oppnås ved gyldig analyseserie: Kontroll Resultat Tolkning Negativ kontroll Target Not Detected Kontrollen er innenfor akseptområdet Positiv kontroll 1 Positive Kontrollen er innenfor akseptområdet Analyseserien er ikke gyldig hvis noen av de følgende flaggene vises for COBAS TaqMan CT-kontroller, v2.0: CT-negativ kontroll, v2.0: Flagg Resultat Tolkning _N_NC_INVALID Invalid Kontaminasjon eller intet IC-signal CT-positiv kontroll, v2.0: Flagg Resultat Tolkning _L_LPC_INVALID Invalid Kontrollen er ikke innenfor akseptområdet, intet målsignal eller intet IC-signal Hvis analyseserien er ugyldig, må hele analyseserien gjentas, inkludert preparering av prøver og kontroller, amplifikasjon og deteksjon. 12

13 Tolking av resultater: For å validere analyseserien må hvert prøvesvar kontrolleres for å se om det finnes noen flagg eller kommentarer på resultatutskriften. Tolk resultatene på følgende måte: En gyldig analyseserie kan inkludere både gyldige og ugyldige prøveresultater, avhengig av om flagg og/eller kommentarer er kommet opp for de ulike prøvene. Prøveresultater tolkes på følgende måte: Flagg Resultat Tolkning Ingen flagg Target Not Detected C. trachomatis-dna ikke detektert. Prøven er antatt negativ for C. trachomatis. Et negativt resultat utelukker ikke C. trachomatis-infeksjon fordi resultatene er avhengig av korrekt prøvetaking, fravær av hemmere og tilstrekkelig DNA til å bli detektert. Ingen flagg 1 Positive C. trachomatis-dna detektert. Prøven er positiv for eller C. trachomatis. > 1 Positive _Q_RFITOOLOW > 1 Positive C. trachomatis-dna detektert. Prøven er positiv for C. trachomatis. _Q_QS_INVALID Invalid Inhibert prøve. C. trachomatis-dna kan, om det er til stede, ikke detekteres. Preparer en ny utpipettering av originalprøven og gjenta testen. Hemmere er ofte labile, og en prøve som i første omgang er inhibert, er kanskje ikke inhibert når den analyseres på nytt. Hvis originalprøven ikke er tilgjengelig, må en ny prøve tas. KVALITETSKONTROLL Ett replikat hver av COBAS TaqMan CT ( )-kontroll v2.0 og COBAS TaqMan CT (+)-kontroll v2.0 må inkluderes for hver analyseserie. Som for alle nye laboratorieprosedyrer bør nye operatører vurdere bruk av ytterligere interne kontroller hver gang testen utføres, inntil man har oppnådd ønsket grad av trygghet for at testen utføres på riktig måte. Det finnes ingen krav til kontrollenes posisjoner i K-rørstativet. Sjekk om det finnes flagg og kommentarer i analyseutskriften for å sikre at analyseserien er gyldig. Negativ kontroll CT ( ) C, v2.0 må gi resultatet Target Not Detected, det vil si at Ct-verdien for CT-DNA-et oversteg analysegrensen, eller at man ikke fant noen Ct-verdi for CT-DNA-et, men en gyldig Ct-verdi for CT-internkontroll-DNA-et. Hvis CT ( ) C, v2.0 ikke oppfyller dette kriteriet, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøve- og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Rochekontoret for teknisk assistanse hvis CT ( ) C, v2.0 er ugyldig ved flere gjentatte tilfeller. Positiv kontroll Akseptområdet for CT (+) C, v2.0 er angitt på verdikortet for COBAS TaqMan CT-testen. v2.0. Resultatet for CT (+) C, v2.0 må ligge innenfor området som er angitt på verdikortet for COBAS TaqMan CT-testen v2.0. Hvis den positive kontrollen ikke oppfyller dette kriteriet, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøve- og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Roche-kontoret for teknisk hjelp hvis resultatet for den positive kontrollen gjentatte ganger er utenfor angitt område. CT (+)-kontrollen v2.0 inneholder cirka 20 kopier/test av en C. trachomatis-plasmid-dna-sekvens. Dette er cirka fire ganger nedre deteksjonsgrense for analysen, bestemt med Poisson-analyse. Amplifikasjon og deteksjon av CT (+)-kontrollen v2.0 beviser at amplifikasjon har funnet sted. CT (+)-kontrollen v2.0 vil ikke gjenspeile amplifikasjonseffektiviteten eller deteksjonsnivået for testen. Internkontroll Internkontrollen er beregnet for identifikasjon av prøver som inneholder polymerasehemmere. Bruk av internkontroll vil ikke eliminere alle falske negative testresultater. 13

14 FORSIKTIGHETSREGLER Som for andre laboratorieprosedyrer er god laboratorieteknikk essensielt for å sikre optimal ytelse for denne analysen. På grunn av testens høye analytiske sensitivitet må det utvises stor grad av varsomhet for å bevare reagensenes og amplifikasjonsblandingens renhet. Alle reagenser må inspiseres nøye for å være sikker på at de er rene. Kast eventuelle tvilsomme reagenser. TESTENS BEGRENSNINGER 1. Test kun de angitte prøvematerialene. COBAS TaqMan CT-testen v2.0 er evaluert ved hjelp av endocervikale penselprøver fra kvinner tatt i transportmedium av typen M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) samt urinprøver fra kvinner og menn tatt uten konserveringsmidler. Testing av andre prøvematerialer er ikke evaluert for bruk og kan føre til falske negative eller falske positive resultater. 2. Deteksjon av C. trachomatis er avhengig av antall organismer som finnes i prøven, og kan påvirkes av metoden for prøvetaking, pasientfaktorer (dvs. alder, sykdomshistorikk, tilstedeværelse av symptomer), infeksjonsstadium og/eller infiserende C. trachomatis-stamme. 3. Falske negative resultater kan forekomme som følge av hemming av polymerase. CT-internkontrollen er blitt tilsatt til COBAS TaqMan CT-testen v2.0 for å muliggjøre identifikasjon av preparerte prøver som inneholder substanser som kan interferere i PCR-amplifikasjon av mer enn 20 kopier/test. 4. Prevalensen av klamydiainfeksjon i en populasjon kan påvirke ytelsen. Positive, prediktive verdier synker ved testing av populasjoner med lav prevalens eller individer uten risiko for smitte. Fordi prevalensen av C. trachomatis kan være lav i noen populasjoner eller pasientgrupper, kan en falsk positiv rate på 4 % til 5 % overstige den sanne positive raten, slik at den prediktive verdien av en positiv test er svært lav. Siden noen sanne infiserte pasienter ikke kan identifiseres via testing av én enkelt prøve, kan den sanne raten av falske positive verdier ikke bestemmes eller antas ut fra de kliniske dataene. Frekvensen av falske positive testresultater kan være knyttet til opplæring, operatørens dyktighet, behandling av reagenser og prøver eller andre lignende faktorer i hvert enkelt laboratorium. 5. Pålitelige resultater avhenger av prosedyrene for prøvetaking, transport, oppbevaring og håndtering. Variabler som skyldes oppbevaring, er ikke blitt fullstendig definert. 6. Tilsetning av AmpErase-enzym til Master Mix muliggjør selektiv amplifikasjon av mål-dna. Kontaminering av reagensene kan imidlertid bare unngås gjennom gode laboratorierutiner og ved å følge prosedyrene spesifisert i dette pakningsvedlegget nøye. 7. Denne testen kan ikke gi svar på om behandlingen lykkes eller ikke. 8. Som for alle diagnostiske tester må resultatene fra COBAS TaqMan CT-testen v2.0 tolkes i sammenheng med alle kliniske og laboratoriemessige funn. 9. Dette produktet må kun brukes av personell som er opplært i PCR-teknikk. 10. Vurdering av hvorvidt prøvematerialet er adekvat (for penselprøver), kan kun gjøres ved mikroskopisk visualisering av sylinderepitelcellene i prøvene. 11. COBAS TaqMan CT-testen v2.0 anbefales ikke for evaluering av mistanke om seksuelt misbruk eller andre rettsmedisinske indikasjoner. 12. Ytterligere testing anbefales i tilfeller hvor falske positive eller falske negative resultater kan føre til alvorlige medisinske, sosiale eller psykologiske konsekvenser. 13. COBAS TaqMan CT-testen v2.0 gir kvalitative resultater. Det kan ikke utledes noen korrelasjon mellom størrelsesorden av en positiv COBAS TaqMan CT-test v2.0 terskelverdi og antallet av C. trachomatis-celler i en infisert prøve. Testen detekterer kun C. trachomatis, ikke C. psittaci, C. pneumoniae eller C. pecorum. 14. Det anbefales at testing av urinprøver fra kvinner og menn med COBAS TaqMan CT-testen v2.0 utføres basert på førstestrømsurin (definert som de første 10 til 50 ml av urinstrømmen). Effekten av andre variabler, som f.eks. førstestrøms- versus midtstrømsprøve, etter utskylling osv., er ikke evaluert. 15. Effekten av andre mulige variabler, som f.eks. utflod, tampongbruk, utskylling osv., samt prøvetakingsvariabler, er ikke evaluert. 16. COBAS TaqMan CT-testen v2.0 er ikke ment å skulle erstatte livmorhalsundersøkelser eller endocervikale prøver for diagnostisering av urogenital infeksjon. Pasienter kan ha cervicitt, uretritt, urinveisinfeksjoner eller vaginale infeksjoner av andre årsaker eller samtidige infeksjoner fra andre agens. 17. Dette produktet kan kun brukes sammen med COBAS TaqMan 48-analysatoren. 18. Tilstedeværelsen av PCR-hemmere kan føre til falske negative eller ugyldige resultater. 14