SAMMENRAG OG FORKLARING

Transkript

1 B ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplifisert DNA Assay U 44 Norsk *Amerikanske patentnr. 5,27,184; 5,547,861; 5,648,211; 5,712,124; 5,744,11; 5,846,726; 5,851,767; 5,866,6; 5,919,6; 5,928,869; 5,958,7; 6,54,279; 6,9,552; 6,117,65; 6,16,2; 6,656,68; 6,682,889; 6,74,582. BRUKSOMRÅDE BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplifisert DNA Assay, til bruk med BD ProbeTec ET System, bruker SDA-teknologi (trådforskyvningsamplifisering) for direkte, kvalitativ påvisning av DNA for organismer som tilhører familien Chlamydiaceae (inkludert, men ikke begrenset til Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci). Analysen er indisert for testing av halspensler (med eller uten transportmedium), fra pasienter med kliniske tegn og symptomer og andre diagnostiske tegn på pneumoni. Analysen kan brukes som en hjelp til presumptiv diagnose av pneumoni assosiert med familien Chlamydiaceae. SAMMENRAG OG FORKLARING Chlamydophila pneumoniae forårsaker omtrent 5 15 % av tilfellene av pneumoni i befolkningen (CAP). 1 Mennesker er eneste kjente smittekilde. Overføring fra en person til en annen via respiratoriske sekresjoner og nær kontakt er generelt nødvendig, 2 med en inkubasjonstid på flere uker. De fleste tilfeller av pneumoni som skyldes C. pneumoniae er relativt milde og dødeligheten er lav. Imidlertid er reinfeksjon hyppig og forekommer ofte blant eldre pasienter som trenger hospitalisering. Dyrkningsmetoder for C. penumoniae er langsomme og svært vanskelige å utføre, og brukes derfor ikke rutinemessig for diagnostikk. Dyrkningsmetoder er likevel viktige for å dokumentere levedyktighet for organismen og for å gi prøver til resistenstesting. MIF-testen (mikroimmunofluorescens) for IgM- og IgG-antistoff er den vanligste serologiske analysen som brukes til diagnose og tillater differensiering mellom primærinfeksjon og reinfeksjon. Akutt infeksjon defineres av en firedobling av IgG-titret mellom akutte og rekonvalesens-sera eller et IgM-titer 16. Tidligere eksponering indikeres av et IgG-titer 16. Bruk av en enkelt IgG-titer for diagnose anbefales ikke. Derfor er serologisk diagnose nyttig bare som et retrospektivt, epidemiologisk verktøy, og ikke til hjelp i pasientbehandlingen. Det er viktig å stille diagnosen pneumoni og avklare etiologien, ikke minst på grunn av økende bekymring for overforbruk av antibiotika. Raske diagnostiske teknikker som bruker amplifisering av nukleinsyre kan være nyttige for å stille diagnosen og på denne måten sørge for adekvat behandling i rett tid. PRINSIPPER FOR PROSEDYREN BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay er basert på samtidig amplifisering og påvisning av mål-dna ved hjelp av amplifiseringsprimere og en fluorescensmerket detektorprobe. SDA reagensene blir tørket i to separate, engangsmikrobrønner. Den behandlede prøven tilføres i primingbrønnen som inneholder amplifiseringsprimerne, fluorescensmerket detektorprobe og andre reagenser som er nødvendige for amplifiseringen. Primerne er designet for å amplifisere et 6 baseparkonservert område av RNAse-P-genet som tilhører medlemmer av familien Chlamydiaceae, inkludert Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis og Chlamydophila psittaci. Etter inkubasjon blir reaksjonsblandingen overført til amplifiseringsbrønnen, som inneholder to enzymer (en DNA-polymerase og en restriksjonsendonuklease) som er nødvendige for SDA. Amplifiseringsbrønnene blir forseglet for å hindre kontaminering og deretter inkubert i en temperaturregulert, fluorescensavleser som overvåker hver reaksjon med hensyn til produksjon av amplifiserte produkter. Hver reaksjon koamplifiserer og påviser en intern amplifiseringskontroll (IAC). Hensikten med denne er å bekrefte at adekvate forhold for amplifisering er til stede og for å redusere muligheten for å rapportere et falsk negativt resultat på grunn av tilstedeværelse av analysehemmere. Om DNA fra familien Chlamydiaceae er til stede eller ikke blir bestemt ved å beregne PAT-verdier (Passes After Threshold) for prøver basert på forutbestemte terskelverdier. Instrumentet rapporterer automatisk resultater som positive, negative eller ubestemte. REAGENSER OG MATERIALER Hver BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplifiied DNA Assay-reagenspakke inneholder: Chlamydiaceae Family (CF) priming-brønner, (1 x 24) 6 Oligonukleotider 7,5 pmol, dntp 15,2 nmol, 2 detektorprober 22,5 pmol Syntetisk oligonukleotid 75 kopier Chlamydiaceae Family (CF) Amplifiseringsbrønner, (1 x 24) Restriksjonsenzym: enheter, DNA-polymerase 14 enheter 1 priming-deksler, 16 selvklebende forseglere (1/2), 8 avfallsposer BD ProbeTec ET Respiratory and media Diluent and Control Kit (CF/LP*/MP**): Innhold: Respiratorisk diluent og mediadiluent: Bicin, natriumfosfat, natriumhydroksid, DMSO og Proclin; 1 (CF/LP/MP) positive kontroller: 1 5 ng laksesperm-dna, 47, µg Tris, 9, µg EDTA, 6 kopier CF-plasmid, 4 8 kopier LP-plasmid, 5 4 kopier MP-plasmid; 1 (CF/LP/MP) negative kontroller: 1 5 ng laksesperm-dna, 47, µg Tris, 9, µg EDTA; 1 2-mL rør med propp * Refererer til BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay ** Refererer til BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) Amplified DNA Assay /1

2 BD ProbeTec ET Swab Diluent and Control Kit (tcf/tmp)*: Innhold: Penseldiluent: Bicin, natriumfosfat, natriumhydroksid, DMSO og Proclin 1 (tcf/tmp) positive kontroller: 1 75 ng laksesperm-dna, 78,8 µg Tris, 15, µg EDTA, 6 kopier CF-plasmid, 8 kopier LP-plasmid, 9 kopier MP-plasmid; 1 (tcf/tmp) negative kontroller: 1 75 ng laksesperm- DNA, 78,8 µg Tris, 15, µg EDTA * Anmerkningen t refererer til reagenser som skal brukes med halspensel (uten transportmedium). Instrument, utstyr og forbruksvarer: BD ProbeTec ET Instrument og Instrument Plate (instrument og metallplate), BD ProbeTec ET Lysing Heater (lysator), BD ProbeTec ET Priming & Warming Heater, BD ProbeTec ET Lysing Rack (lyseringsstativ), BD ProbeTec ET Pipettor (pipette), stativ og Power Supply (strømtilførsel), BD ProbeTec ET Accessories Kit (tilbehørskit), BD ProbeTec ET 2 ml og 4 ml prøverør og propper, BD ProbeTec ET Pipette Tips (pipettespisser) Nødvendige materialer som ikke følger med: Klasse II biologisk sikkerhetskabinett (BSC), vortexmixer, -2 C og/eller -7 C (eller kaldere) stabil ikke-temperaturs-syklusfryser, mikrosentrifuge som klarer 16 x g, vannbad, digitalt termometer, vannbadstativ med påskrudd lokk, 2 ml prøverørstativ og annet passende prøverørstativ, BBL CultureSwab EZ-pensler, engangshansker, mikropipetter som kan levere volum på 2 1 µl, aerosol resistente aerosolresistente pipettespisser, destillert vann, vann til molekylærbiologi, 1 % (v/v) natriumhypokloritt med Alconox* Løs opp 7,5 g Alconox i 1 L 1 % (v/v) natriumhypoklorittoppløsning og bland. Lages nytt daglig. Oppbevarings- og håndteringsanvisninger: BD ProbeTec ET CF-reagenspakken kan oppbevares ved 2 C. Uåpnede reagenspakker skal ikke brukes etter utløpsdato. Når en pose er åpnet, er mikrobrønnene stabile i 12 uker hvis de er ordentlig forseglet eller til utløpsdatoen, ettersom hva som kommer først. Skal ikke fryses. BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF/LP/MP) kan lagres ved 2 C. Reagensene skal ikke brukes etter utløpsdato. Skal ikke fryses. BD ProbeTec ET Penseldiluent og kontrollsett (tcf/tmp) kan lagres ved 2 C. Reagensene skal ikke brukes etter utløpsdato. Skal ikke fryses. Advarsler og forsiktighetsregler Til in vitro-diagnostisk bruk. 1. Patogene mikroorganismer, blant annet hepatittvirus og humant immunsviktvirus, kan være til stede i kliniske prøver. Standard forsiktighetsregler 4-7 og institusjonelle retningslinjer skal følges ved håndtering av alt materiale som er kontaminert med blod og andre kroppsvæsker. 2. BD ProbeTec ET Swab Diluent and Respiratory and Media Diluent inneholder dimetylsvoveloksid (DMSO). DMSO er skadelig ved innånding, hudkontakt eller svelging. Unngå kontakt med øynene, og bruk alltid hansker ved håndtering. Dersom det kommer i kontakt med øynene, skyll umiddelbart med rikelige mengder vann, og søk medisinsk hjelp. Dersom det kommer i kontakt med huden, vask umiddelbart med rikelige mengder såpe og vann.. Selv om egne arbeidsområder ikke er nødvendig fordi BD ProbeTec ETs design reduserer muligheten for ampliconkontaminering i testomgivelsene, er det nødvendig med andre forholdsregler for å kontrollere kontamineringen, særlig for å hindre kontaminering under prosessen. 4. Reagensposer som inneholder ubrukte priming-brønner og amplifiseringsbrønner MÅ forsegles godt igjen etter åpning. Kontroller at en tørkepose er til stede før reagensposen forsegles på nytt. 5. Platen som inneholder amplifiseringsbrønner MÅ forsegles ordentlig med den selvklebende forseglingen før platen flyttes fra BD ProbeTec ET Priming og Warming Heater til BD ProbeTec ET Instrument. Forseglingen sørger for en lukket reaksjon for amplifiseringen og påvisning, og er nødvendig for å unngå kontaminering av instrumentet og arbeidsområdet med amplifiseringsprodukter. Forseglingen skal ikke på noe tidspunkt fjernes fra mikrobrønnene. 6. Priming-brønner med gjenværende væske (etter overføring av væske fra priming-brønnene til amplifiseringsbrønnene) utgjør en kilde til målkontaminering. Forsegl priming-brønnene godt med den selvklebende platen før de kastes. 7. For å forhindre kontaminering av arbeidsområdet med amplifiseringsprodukter, bruk avfallsposene som leveres i reagenspakken ved kasting av testede amplifiseringsbrønner. Pass på at posene er godt lukket før de kastes. 8. SKIFT HANSKER ved spesifiserte trinn under behandling av prøvene og analyseprosedyren for å unngå krysskontaminering av prøver. Hvis hansker kommer i kontakt med prøven, skal hanskene straks skiftes for å hindre kontaminering av andre prøver. 9. I tilfelle kontaminering av arbeidsområdet eller utstyret med prøver eller kontroller, rengjør det kontaminerte området grundig med 1 % (v/v) natriumhypokloritt med Alconox og skyll grundig med vann. La overflaten tørke fullstendig før videre testing. 1. Bruk bare BD ProbeTec ET Pipettor og BD ProbeTec ET Pipette-spisser til overføring av behandlede prøver til priming-brønnene og overføring av prøvene fra priming-brønnene til amplifiseringsbrønnene. 11. Følg etablert laboratoriepraksis når brukte pipettespisser, prøverør, priming-brønner og annet engangsutstyr skal kastes. Kast engangsutstyr forsvarlig. Forsegl og kast avfallsbeholdere når de er ¾ fulle eller daglig (det som skjer først). 12. Ikke bland eller bytt mikrobrønner, kontroller eller behandlingsreagenser fra kit med forskjellige partinumre (lot). 1. Kontakt den lokale BD-representanten i tilfelle en uvanlig situasjon, slik som søl i BD ProbeTec ETinstrumentet eller DNA-kontaminering som ikke kan fjernes ved rengjøring. 2

3 PRØVEINNSAMLING OG TRANSPORT 1. Prøveinnsamling Prøver skal samles inn som anbefalt av Clinical Microbiology Procedures Handbook 8 eller ditt laboratoriums prosedyrehåndbok. BBL CultureSwab EZ (BD kat.nr ) skal brukes til innsamling av halspensler oppbevart uten transportmedium. 2. Oppbevaring og transport av prøver Halspensler (uten transportmedium): Prøvene kan oppbevares/transporteres ved 18 C i maksimalt 2 dager. Prøver kan kjøles ned ved 2 8 C i maksimalt dager. Prøver kan oppbevares ved -2 C eller lavere i maksimalt 14 uker. Halspensler i 2SP-medium: 8 Prøvene skal straks kjøles ned til 2 8 C. Transport på våt is eller kuldepakninger hvis transporttiden er på mer enn noen få minutter. Prøver kan kjøles ned ved 2 8 C i maksimalt 2 dager. Prøver som krever lengre oppbevaringsperioder, må oppbevares ved -7 C. TESTPROSEDYRE Se brukerhåndboken for BD ProbeTec ET System for spesifikke anvisninger om bruk og vedlikehold av systemkomponentene. A. Forberedelse av instrumentene: 1. Strømmen må være slått på, og instrumentene må få tid til å varmes opp før analysen starter. a. Lysatoren og Priming & Warming Heater trenger omtrent 9 min til oppvarming og stabilisering. Settpunktet for lysator er 114 C. Settpunktet for priming-komponenten i Priming & Warming Heater er 72,5 C. Settpunktet for varmekomponenten i Priming & Warming Heater er 54 C. b. BD ProbeTec ET-instrumentet er under programvarekontroll og trenger omlag min. til oppvarming. 2. Temperaturen på varmeren må kontrolleres før målingen starter. Noter temperaturene i BD ProbeTec ET System Maintenance Log (systemvedlikeholdslogg). a. Lysator Fjern plastlokket og la temperaturen stabilisere seg i 15 min. Termometeret skal vise mellom 112 og 116 C. b. Priming & Warming Heater Priming heater-termometeret skal vise mellom 72 og 7 C. Warming heater-termometeret skal vise mellom 5,5 og 54,5 C.. Kontroller temperaturen som vises på skjermen på BD ProbeTec ET. Temperaturen må vise mellom 47,5 og 55, C. Noter temperaturen i BD ProbeTec ET System Maintenance Log. B. Pipettor: Se brukerhåndboken for BD ProbeTec ET System for å få detaljert forklaring av tastaturfunksjonene på BD ProbeTec ET Pipettor I tillegg må BD ProbeTec ET Pipettor rengjøres etter hver bruk. Kontakt den lokale BD-representanten for veiledning om hvordan BD ProbeTec ET Pipettor skal rengjøres og vedlikeholdes. Følgende programmer er nødvendige for å utføre BD ProbeTec ET CF Assay. Program 1 overfører væske fra de behandlede prøvene til CF-priming-brønnene. Program 5 overfører væske fra CF-priming-brønner til CF-amplifiseringsbrønner. Programmer pipetten som følger: Program 1: 1. Slå PÅ pipetten. Pipetten piper en gang, blinker ZERO, blinker Software Version n (programvareversjonsnr.) og piper en gang til. 2. Trykk på den blå Prog -knappen (program). Trykk på Vol -knappen (volum) til 1 vises på skjermen for å velge program 1. Trykk på Enter.. Gå inn i programmeringsmodus ved å trykke på og holde Prog -knappen inne. Mens du trykker på Prog -knappen, trykk samtidig på spesialfunksjonsknappen med en pipettespiss eller enden på en binders. 4. Trykk på Fill (fyll). Trykk på pil opp inntil 2 vises på skjermen. Trykk på Enter. 5. Trykk på Disp (dispenser). Trykk på pil opp inntil 15 vises på skjermen. Trykk på Enter. 6. Trykk en gang til på Enter for å lagre programmet og avslutte. Da skal du høre et pip som indikerer at programmeringen er fullført. 7. Kontroller programmet ved å trykke på utløserknappen for å gå gjennom hvert trinn. Mens du går gjennom hvert trinn, sett farten på aspirasjon/dispensering med Vol -knappen. På hvert trinn vises fartsindikatoren. Bruk Vol -knappen til å justere fartsindikatoren til å vise 2 firkanter for Fill - og Disp -trinnene. Program 5: 1. Trykk på Prog -knappen. Trykk på Vol -knappen til 5 vises på skjermen for å velge program 5. Trykk på Enter.

4 2. Gå inn i programmeringsmodus ved å trykke på og holde Prog -knappen inne. Mens du trykker på Prog -knappen, trykk samtidig på spesialfunksjonsknappen med en pipettespiss eller enden på en binders.. Trykk på Fill (fyll). Trykk på pil opp inntil 1 vises på skjermen. Trykk på Enter. 4. Trykk på Disp. Trykk på pil opp inntil 1 vises på skjermen. Trykk på Enter. 5. Trykk på Mix (bland). Trykk på pil opp inntil 5 vises på skjermen. Trykk på Enter. 6. Trykk en gang til på Enter for å lagre programmet og avslutte. Da skal du høre et pip som indikerer at programmeringen er fullført. 7. Kontroller programmet ved å trykke på utløserknappen for å gå gjennom hvert trinn. Mens du går gjennom hvert trinn, sett farten på aspirasjon/dispensering/blanding med Vol -knappen. På hvert trinn vises fartsindikatoren. Bruk Vol -knappen til å justere fartsindikatoren til å vise 2 firkanter for aspirasjons- og dispenseringsfunksjonene. Bruk Vol -knappen til å justere farten på blandingen så den viser firkanter. Programgjennomgang Programmene skal gjennomgås før prosedyren startes. Gå gjennom programmet ved å skru PÅ pipetten. Trykk på den blå Prog -knappen (program). Trykk på Vol -knappen (volum) til det riktige programnummeret (1 eller 5) vises. Trykk på Enter -knappen. Bruk pipetteutløseren til å gå gjennom programmet skritt for skritt. Program 1: Dette programmet aspirerer 2 µl, og dispenserer 15 µl i CF-mikrobrønnen. Pipettorskjermen skal vise følgende: Fill 2 µl - SII Dispense 15 µl - SII Program 5: Dette programmet aspirerer 1 µl; dispenserer 1 µl; og mikser 5 µl tre ganger. Pipettorskjermen skal vise følgende: Fill 1 µl - SII Dispense 1 µl - SII Miks 5 µl - SIII Zero (blinker av og på) C. Platelayout: Rapport om layout på platen blir generert fra BD ProbeTec ET-instrumentet etter at analysetype, identifikasjon av prøver, kontrollpartinumre (lot) og kitpartinumre (lot) er logget inn i systemet. Platelayoutrapporten viser den fysiske layouten til prøver og kontroller for hver plate som skal testes. Denne organiseringen brukes både på priming-platen og amplifiseringsplaten. For CF-analysen er Priming-brønnene helt blå stripsene med brønner. Amplifiserings-brønnene er lyseblå stripete stripser med brønner. D. Behandling av halspenselprøver (uten transportmedium): MERK: La BD ProbeTec ET Swab Diluent (tcf/tmp) komme til romtemperatur og bland med å snu den forsiktig før bruk. Mål opp nødvendig BD ProbeTec ET Swab Diluent (tcf/tmp) i en ren beholder. For å vurdere mengden som trengs, bruk 1 ml til hver prøve og legg til 1 2 ml ekstra for lettere pipettering. Forhindre kontaminering av oppløsningsvæsken ved å la være å helle tiloversbliven væske tilbake på flasken. 1. Merk et 4 ml prøverør for hver halspensel som skal behandles. 2. La prøvene nå romtemperatur.. Pipetter 1 ml penseldiluent (tcf/tmp) til hvert prøverør. 4. Sett inn penselen. Bland med å snurre penselen i oppløsningsvæsken i 5 1 s. 5. Klem penselen mot siden av røret slik at væsken renner tilbake til bunnen av røret. 6. Fjern penselen forsiktig for å unngå sprut. MERK: Dråper kan gi kontaminering av arbeidsområdet. 7. Plasser penselen tilbake i transportrøret og kast det. 8. Sett korken tett på. 9. Vortex røret i 5 s. 1. Gjenta trinn 9 for ytterligere prøvepensler. 11. Gjør i stand kontrollene. Se Klargjøring av kontroll for halspensler (avsnitt F). 12. Bruk platelayoutrapporten og plasser prøvene og kontrollene i riktig rekkefølge på lyseringsstativet. 1. Lås prøvene på plass i BD ProbeTec ET Lysing Rack. 14. Sett inn lyseringsstativet i BD ProbeTec ET Lysing Heater. 15. Varm prøvene i 1 min. 16. Etter 1 min, fjern BD ProbeTec ET Lysing Rack fra BD ProbeTec ET Lysing Heater og la det kjøles ned i minst 15 min. Bank stativet forsiktig mot benken for å samle så mye kondensat som mulig i bunnen av glasset. MERK: Etter at prøvene er lysert: a. De kan lagres ved 18 C i opptil 6 t og kan testes uten re-lysering. b. De kan lagres i opptil dager ved 2 8 C. Prøvene må vortexes og lyseres på nytt før testing. 4

5 c. De kan lagres i opptil 14 dager ved -2 C. Prøvene må tines ved romtemperatur, vortexes og lyseres på nytt før testing. 17. Prøvene er nå klare for Testprosedyre for BD ProbeTec ET CF Assay (avsnitt G). E. Behandling av halspenselprøver (2SP-medium) Notater om prosedyren: Skift pipettespiss mellom alle væskeoverføringer. Det anbefales å bruke aerosol-barrierespisser. La BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent (CF/LP/MP) komme til romtemperatur og bland ved å snu den forsiktig før bruk. Fyll nødvendig mengde BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent (CF/LP/MP) i en ren beholder. For å vurdere mengden som trengs, bruk,4 ml til hver prøve og legg til 1 2 ml ekstra for lettere pipettering. Forhindre kontaminering av oppløsningsvæsken ved å la være å helle tiloversbliven væske tilbake på flasken. 1. La prøvene nå romtemperatur. 2. Merk et 2 ml rør med skrukork for hver prøve som skal testes.. Overfør 4 µl Respiratory and Media Diluent (CF/LP/MP) til hvert prøverør med skrukork. Følgende trinn 4 6 skal gjøres i et biologisk sikkerhetskabinett (BSC): 4. Pulsvortex prøvene i 5 15 s for å blande godt. 5. Pipetter 2 µl av prøven i det merkede glasset. MERK: Hvis prøvevolumet er mindre enn 2 µl (prøven må være minst 1 µl), bring volumet til 2 µl ved hjelp av vann til molekylærbiologi. 6. Skift hansker etter tilsetting av prøver. MERK: Fyll et vannbad med destillert vann, og bring det til kokepunktet før du fortsetter til trinn Pulsvortex i 5 sekunder. 8. Gjør i stand kontrollene. Se Klargjøring av kontroll for 2SP-medium (Avsnitt F). 9. Overfør prøvene og kontrollene til et vannbadstativ. 1. Plasser vannbadstativet i kokende vann i 1 min. 11. Etter 1 min, fjern vannbadstativet og la glassene avkjøles ved romtemperatur i 15 min. ADVARSEL: Pass på å unngå brannskader fra det kokende vannet, vannbadstativet eller overflatene på vannbadet som kan være varme. 12. Etter avkjøling sentrifuger (16 x g) i om lag 5 s. MERK: Etter at prøvene er kokt: De kan oppbevares ved 18 C i opptil 6 t og kan testes uten ny koking. De kan lagres i opptil dager ved 2 8 C. Prøvene må vortexes og lyseres på nytt før testing. De kan oppbevares i opptil 14 dager ved -2 C. Prøvene må tines ved romtemperatur, vortexes og kokes på nytt forut for testing. 1. Prøvene er nå klare for Testprosedyre for BD ProbeTec ET CF Assay (avsnitt G). F. Kontrollklargjørig: Klargjøring av kontroller for halspensler 1. For hver runde (plate) som skal testes, gjør i stand et negativt kontrollrør (tcf/tmp) og et positivt kontrollrør (tcf/tmp). Hvis en plate inneholder mer enn et partinummer (lot) for reagenspakken, må kontroller testes for hvert parti (lot). 2. Fjern korken fra det negative kontrollrøret (tcf/tmp).. Bruk en ny pipettespiss, og tilsett 1 ml penseldiluent. 4. Sett korken tett på. 5. Fjern korken fra det positive kontrollrøret (tcf/tmp). 6. Bruk en ny pipette, og tilsett 1 ml penseldiluent. 7. Sett korken tett på. 8. Vortex kontrollrørene i 5 s. 9. Kontrollrørene er nå klare til lysering. Se Behandling av halspenselprøver (Avsnitt D). Klargjøring av 2SP-mediumkontroll: 1. For hver runde (plate) som skal testes, gjør i stand et negativt kontrollrør (CF/LP/MP) og et positivt kontrollrør (CF/LP/MP). Hvis en plate inneholder mer enn et partinummer (lot) for reagenspakke, må kontroller testes for hvert parti (lot). 2. Vend Respiratory and Media Diluent forsiktig før bruk.. Fjern korken fra det negative kontrollrøret (CF/LP/MP). 4. Bruk en ny pipettespiss for hvert kontrollrør og tilsett 2 µl vann til molekylærbiologi. 5. Bruk en ny pipettespiss for hvert kontrollrør og tilsett 4 µl Respiratory and Media Diluent. 6. Sett korken tett på. 7. Fjern korken fra det positive kontrollrøret (CF/LP/MP). 8. Bruk en ny pipettespiss for hvert kontrollrør og tilsett 2 µl vann til molekylærbiologi. 5

6 9. Bruk en ny pipettespiss for hvert kontrollrør og tilsett 4 µl respiratorisk- og mediediluent. 1. Sett korken tett på. 11. Vortex kontrollrørene i 5 s. 12. Kontrollene er nå klare til koking. Se Behandling av 2SP-mediumprøver (Avsnitt E). G. Testprosedyre for BD ProbeTec ET CF Assay: MERK: Før prøveprosedyren utføres, arranger de behandlede prøvene og kontrollene i et stativ som kan håndtere 2 ml og 4 ml prøverør, slik som BD ProbeTec ET 2 ml Sample Tube Rack eller BD ProbeTec ET Lysing Rack som begge er kompatible med BD ProbeTec ET Pipettor. 1. Fjern og kast lokkene fra de avkjølte prøvene og kontrollene. 2. SKIFT HANSKER før du fortsetter, for å hindre kontaminering.. Gjør i stand Priming-brønnplaten ved hjelp av platelayoutrapporten se Platelayout (Avsnitt C). 4. Gjenforsegle mikrobrønnposene som følger. a. Plasser posen på et plant underlag. Hold den åpne enden flatt med en hånd. b. Mens du trykker, la fingeren gli langs det ytre seglet fra en ende av posen til den andre. c. Inspiser for å være sikker på at posen er forseglet. 5. Velg Program 1 på BD ProbeTec ET Pipettor. 6. Ta opp pipettespissene. Åpne BD ProbeTec ET Pipettoren ved å trekke avstandsknappen helt ut. MERK: Pass på at spissene er sikkert satt på pipetten for å forhindre lekkasje. 7. Aspirer 2 µl fra den første kolonnen av prøver. 8. Utløs pipetten forsiktig, la spissen berøre sidene av brønnene og dispenser 15 µl i den korresponderende kolonnen med priming-brønner (1 A H). MERK: Utløs ikke pipetten over prøver eller mikrobrønner, da dette kan forårsake kontaminering. Brå bevegelser kan forårsake dråpe- eller aerosoldannelse. 9. Kast spissene. Trykk på pipettens utløser for å tilbakestille pipetten. MERK: Kast spissene forsiktig for å unngå dråper eller aerosoler som kan kontaminere arbeidsflaten. 1. Ta opp nye spisser, utvid pipetten og aspirer 2 µl fra andre kolonne med prøver. 11. Utløs pipetten forsiktig, la spissen berøre sidene av brønnene og dispenser 15 µl i den korresponderende kolonnen med priming-brønner (2 A H). 12. Kast spissene. 1. Fortsett å overføre resten av prøvene for kjøringen. 14. Dekk til priming-platen med engangsplastlokk og inkuber platen ved romtemperatur i minst 2 min (kan inkuberes i opptil 6 t). MERK: Sett nye lokk på de behandlede prøvene. SKIFT HANSKER. 15. På slutten av priming-inkubasjonstiden gjøres amplifiseringsplaten i stand. Konfigurer amplifiseringsbrønnene på en plate som samsvarer med platelayoutrapporten (på samme måte som priming-platen) Forsegle mikrobrønnposen på nytt som beskrevet i trinn Fjern plastlokket fra priming-platen og plasser platen på Priming Heater. Plasser STRAKS amplifiseringsplaten i fremste posisjon i Warming Heater for å forvarme denne. 17. Sett tidsuret på 1 min. (MERK: Dette trinnet er kritisk med hensyn til tid.) 18. Etter 1 min (+/- 1 min) lang inkubering velg Program 5 på pipetten. 19. Ta opp pipettespisser og overfør 1 µl fra kolonne 1 på priming-platen til kolonne 1 på amplifiseringsplaten. La pipettespissen berøre sidene av brønnene når væsken has i. Etter dispensering la pipetten automatisk blande væsken i brønnene. Løft pipetten forsiktig fra platen. Unngå berøring av andre brønner. 2. Kast spissene. Ta opp nye spisser og fortsett å overføre reagensblanding fra priming-brønnene til amplifiseringsbrønnene, kolonne etter kolonne, med nye spisser for hver kolonne. 21. Når siste kolonne er overført, fjern baksiden fra en selvklebende forsegler (en amplifiseringsforsegler [1/2] vil dekke opp til 6 kolonner. Hvis platen inneholder mer enn 6 kolonner MÅ det brukes et fullt forseglingsark). Hold forseglingen i kantene og legg den over mikrobrønnene. Bruk rammen på Warming Heater til å hjelpe deg med å legge på forseglingen. Trykk ned på forseglingen for å sikre at alle mikrobrønnene er fullstendig forseglet. 22. Ved BD ProbeTec ET-brukerpanelet skal du flytte transportvognen ut og åpne døren. Flytt STRAKS (innen s), den forseglede amplifiseringsplaten til BD ProbeTec ET-instrumentet og start kjøringen. (Se bruksanvisningen for BD ProbeTec ET System for detaljerte anvisninger.) 2. Etter at kjøringen er startet fortsett med følgende del av rengjøringsprosedyren: a. Forsegle priming-brønnene med en selvklebende forsegling og fjern platen fra Priming & Warming Heater. ADVARSEL: Temperaturen er over 7 C. Bruk en varmebeskyttende hanske for å fjerne platen. b. La platen kjøles ned på benken i 5 min. c. Fjern de forseglede priming-brønnene fra platen ved å holde i forseglingen på begge sider, og løft brønnene rett opp som en enhet. Plasser de forseglede mikrobrønnene i en avfallspose og forsegle. d. Rengjøring av metallplaten: Skyll platen med 1 % (v/v) natriumhypokloritt Alconox-oppløsning. 6

7 Skyll platen med vann. Pakk platen i et rent papirhåndkle og la den tørke fullstendig før den brukes på nytt. 24. Når kjøringen er ferdig, genereres det en utskrift av testresultatene. 25. Kjør transportvognen frem, åpne døren og fjern platen. Lukk døren og kjør transportvognen tilbake i instrumentet. 26. Fjern de forseglede amplifiseringsbrønnene fra platen. ADVARSEL: Ikke fjern forseglingsmaterialet fra mikrobrønnene. De forseglede mikrobrønnene kan lett fjernes som en enhet ved å holde forseglingen i topp og bunn og løfte rett opp og ut fra platen. Plasser de forseglede mikrobrønnene i avfallsposen. Forsegle posen. 27. Rengjøring av metallplaten: Skyll platen med 1 % (v/v) natriumhypokloritt Alconox-oppløsning. Skyll platen med vann. Pakk platen i et rent papirhåndkle og la den tørke fullstendig før den brukes på nytt. 28. Etter dagens siste kjøring utføres følgende rengjøringsprosedyre: a. Fukt papirhåndklær eller gaskompresser med 1 % (v/v) natriumhypokloritt med Alconoxoppløsning og påfør benkeplater og de ytre overflatene til lysator, Priming & Warming Heater, stativ for prøverør, vannbad, sentrifuge og BD ProbeTec ET-instrumentet. La oppløsningen forbli på overflatene i 2 min. Fukt papirhåndklær eller gaskompresser med vann og fjern rengjøringsmidlet. Skift håndklær eller gaskompress ofte når rengjøringsmiddelet påføres og når det skylles med vann. Fukt papirhåndklær eller gaskompresser med 1 % (v/v) natriumhypokloritt med Alconox, og tørk av pipettehåndtaket (BARE HÅNDTAKET). Etter 2 min tørkes håndtaket av med papirhåndklær eller gaskompresser fuktet med vann. b. Dypp lyseringsstativet, lyseringsstativsokkelen, lyseringsstativdekselet og platene i 1 % natriumhypokloritt med Alconox i 1 2 min. Skyll grundig med vann og la det lufttørke. c. Gjenopplad pipetten. d. Kast den forseglede avfallsposen og posen med biologisk avfall i henhold til etablerte prosedyrer for avfallsbehandling av smittefarlig, biologisk avfall. 29. Minst en gang i uken utføres følgende prosedyre: a. Kast vannet i vannbadene. b. Skyll vannbadene med 1 % (v/v) natriumhypokloritt Alconox-oppløsning. Skyll med vann og la dem tørke. c. Fyll på destillert vann. Kvalitetskontroll Kvalitetskontroll må utføres i henhold til lokale og/eller nasjonale retningslinjer eller akkrediteringskrav og ditt laboratoriums standard kvalitetskontrollprosedyrer. Det anbefales at brukeren refererer til aktuelle CLSI-retningslinjer (tidligere NCCLS) og CLIA-bestemmelser for egnede kvalitetskontrollprosedyrer. Penseldiluent og kontroller leveres sammen i Swab Diluent and Control Kit (tcf/tmp). Respiratory and Media Diluent and Controls leveres sammen i Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF/LP/MP). En positiv og en negativ kontroll må inkluderes i hver kjøring for hver prøvetype og analysekjøring på en plate og for hvert nytt reagenspartinummer (lot). Kontrollene kan plasseres tilfeldig. Den positive kontrollen overvåker for betydelig reagenssvikt. Den negative kontroll overvåker for kontaminering av reagensene og/eller miljøet. De positive og negative kontrollene må teste respektivt positivt og negativt, for å kunne rapportere prøveresultatene. Hvis kontrollene ikke oppfører seg som ventet, må analysene anses for ugyldige, og pasientresultatene blir ikke rapportert av instrumentet. Hvis kontrollene ikke oppnår forventede resultater, skal du gjenta hele prosedyren med et nytt sett kontroller, nye mikrobrønner og de behandlede prøvene. Hvis inadekvate, behandlede prøver er igjen for en gjentatt prøve, behandle på nytt en ny fortynning av primærprøven. Hvis gjentatte kontroller ikke gir forventede resultater, kontakt den lokale BD-representanten (se Tolkning av resultater ). En intern amplifiseringskontroll (IAC) er tørket inn i priming-brønnen. IAC inneholder nukleinsyremål som er amplifisert i nærvær av prøveblandingen. IAC er designet for å bekrefte verdien av amplifiseringsreaksjonen og identifisere potensiell hemming av den behandlede prøven. Prøveprosesskontroller Kontroller av prøveprosessene kan testes i samsvar med kravene fra de relevante godkjenningsmyndighetene. En positiv og negativ kontroll skal teste hele analysesystemet. Av denne grunn kan kjente, positive prøver tjene som kontroller ved å behandles sammen med og testes i tilknytning til ukjente prøver. Prøver som brukes som behandlingskontroller må lagres, behandles og testes i henhold til pakningsvedlegget. De positive og negative kontrollene er designet for å kontrollere effektiviteten av prøvebehandlingsprosedyrene når man tester halspensler (enten med eller uten transportmedium, Swab Control og Respiratory and Media Controls) fordi kontrollene behandles på samme måte som prøvene i seg selv. Overvåkning av forekomst av DNA-kontaminering Minst en gang i måneden skal følgende testprosedyre gjennomføres for å overvåke arbeidsplassen og utstyret med henblikk på forekomst av DNA-kontaminering. Miljøovervåkning er avgjørende for å påvise kontaminering før det utvikler seg til et problem. 1. For hvert område* som skal testes, bruk BBL CultureSwab EZ-pensel. 2. Merk et prøverør for hvert område som skal testes og pipetter 1 ml penseldiluent (tcf/tmp) i hvert rør. 7

8 . Dypp den første penselen i diluent og stryk over det første området med en bred, penslende bevegelse. 4. Bland penselen i diluent, klem ut penselen, sett korken på røret igjen og vortex i 5 s. Kast penslene. 5. Gjenta for hvert område som testes. 6. Plasser rørene i lyseringsstativet og varm i lysatoren i 1 min. Fjern stativet fra varmerne og la prøvene avkjøles i 15 min før du fortsetter. 7. Mens rørene varmes opp, bruk rene håndklær fuktet i vann for å fjerne gjenværende bufferblanding fra de avtørkede overflatene. 8. Så snart prøvene er avkjølt, fortsett med Testprosedyre for BD ProbeTec ET CF Assay (avsnitt G). * Anbefalte områder å teste omfatter: Overflater på lyseringsstativet, lysatoren, vannbadstativ, mikrosentrifuge, Priming & Warming Heater, svarte metallplater, pipettehåndtak, instrumentknapper, instrumenttastatur, tørre overflater på vannbad, overflater på prøvestativ og arbeidsbenker inkludert prøvebehandlingsområder. Hvis et område viser positivt resultat, skal du rengjøre området med nylaget 1 % (v/v) natriumhypokloritt med Alconox. Sørg for at hele området vætes med rengjøringsoppløsningen, og la den forbli på overflaten i minst 2 min, eller til den er tørr. Om nødvendig, skal du fjerne overflødig rengjøringsoppløsning med et rent håndkle. Tørk av området med et rent håndkle dyppet i vann, og la overflaten tørke. Test området på nytt. Gjenta inntil et negativt resultat oppnås. Hvis kontamineringen ikke forsvinner, skal du kontakte den lokale BD-representanten for ytterligere informasjon. Tolkning av prøveresultater Tilstedeværelse eller fravær av Chlamydiaceae-familie-DNA bestemmes ved å beregne PAT-verdi (Passes After Threshold) for prøver basert på forutbestemte terskelverdier. PAT-verdien er et mål som brukes til å vurdere størrelsen på signalet som genereres som resultat av reaksjonen. For denne målingen, indikerer større tall at terskelvedien ble nådd i tidlig fase av amplifiseringen, mens mindre tall betyr at terskelverden ble nådd seinere under reaksjonen. Størrelsen på PAT-verdien er ikke indikativ på nivået av Chlamydiaceae-familie-DNA i prøven. Hvis prøvekontrollresultatene ikke er som ventet, skal pasientresultatene ikke rapporteres. Se kvalitetskontrollavsnittet for forventede kontrollverdier. Rapporterte resultater bestemmes som følger. PAT-verdi CF-mål IAC-mål Resultat Tolkning Rapport > > eller = Positiv Chlamydiaceaefamilie-DNA påvist ved SDA. = > Negativ Chlamydiaceaefamilie-DNA ikke påvist ved SDA. Positiv for organismer som tilhører familien Chlamydiaceae, noe som peker i retning av aktuell infeksjon. Tilleggstesting er nødvendig for å identifisere arter som er påvist. Antatt negativ for organismer som tilhører familien Chlamydiaceae. Infeksjon med Chlamydiaceae kan ikke utelukkes fordi nivået på tilstedeværende DNA kan være under grensen for påvisning. = = Ubestemt Amplifiseringskontroll hemmet. Tilleggstesting er nødvendig for å tolke resultatet. a a Gjenta BD ProbeTec ET CF Assay fra det behandlede prøverøret. Hvis det er for lite volum igjen fra den behandlede prøven, gjenta fra originalprøven eller ta en ny prøve om nødvendig. Hvis det gjentatte resultatet er enten positivt eller negativt, skal du tolke det som beskrevet ovenfor. Hvis resultatet gjentas som ubestemt, skal det rekvireres en ny prøve. Bestemmelse av CF- og IAC-terskel: Terskelverdiene for Chlamydiaceae-familie-mål-DNA og IAC ble opprinnelig fastslått med mottakeroperatorkarakteristiske kurveanalyser av data som er samlet inn fra positive og negative kontroller. Disse terskelverdiene ble verifisert og validert i kliniske studier. PROSEDYRENS BEGRENSNINGER 1. BD ProbeTec ET CF Assay er spesifikk for, men differensierer ikke medlemmer av familien Chlamydiaceae (dvs. C. trachomatis, C. muridarum, C. suis, C. abortus, C. percorum, C. caviae, C. pneumoniae, C. felis og C. psittaci). 2. BD ProbeTec ET CF Assay er bare evaluert for halspensler (med og uten 2SP-transportmedium). Resultater med andre prøvetyper er ikke vurdert.. BD ProbeTec ET CF Assay er bare evaluert for pasienter som er minst ett år gamle. 4. Som med mange diagnostiske tester skal resultatene av BD ProbeTec ET CF Assay tolkes i sammenheng med andre laboratoriemessige og kliniske data som er tilgjengelige for legen. Et positivt resultat ved denne analysen kombinert med andre kliniske tegn og symptomer og diagnostisk bevis for pneumoni er indikativ for Chlamydiaceae-familie-assosiert pneumoni. 5. Et negativt resultat skal ikke brukes til å utelukke diagnosen Chlamydiaceae-familie-assosiert pneumoni fordi testresultatene kan påvirkes av feilaktig prøvetakingsteknikk, teknisk svikt, forbytting av prøver, samtidig antibiotikabehandling eller tilstedeværelse av et nivå av Chlamydiaceae-familie-DNA i prøven som er under den analytiske sensitiviteten til prøven. Derfor kan det være nødvendig med ytterligere, diagnostiske tester, som kultur, serologi og /eller validert nukelinsyreamplifiseringstester som anbefalt i publiserte retningslinjer. 9 8

9 6. BD ProbeTec ET CF Assay kan ikke brukes til å vurdere om behandlingen er vellykket eller mislykket siden nukleinsyrer fra familien Chlamydiaceae kan vedvare etter antimikrobiell behandling. 7. Optimale testresultater forutsetter adekvat prøveinnsamling og -håndtering. 8. Bruk av BD ProbeTec ET CF Assay skal begrenses til personale som har opplæring i analyseprosedyrene og BD ProbeTec ET System. 9. BD ProbeTec ET CF Assay gir kvalitative resultater. Det kan ikke trekkes noen sammenheng mellom størrelsen på PAT-verdien og mengden Chlamydiaceae-familie-DNA i prøven. forventede resultater A: Prevalens Positivitetsraten som observeres ved Chlamydiaceae-testing vil variere, avhengig av testmetoden som brukes, alderen på pasienten, underliggende risikofaktorer, geografisk område, og viktigst lokal sykdomsprevalens inkludert mulig yrkesmessig eksponering. B: Frekvensdistribusjon for PAT-verdi Prospektiv studie Merk: Alle BD ProbeTec ET CF Assay-resultater ble sammenlignet med dyrkningsresultatet ved en halspensel presset ut i 2SP-transportmedium. Se Egenskaper ved prøveutførelsen for detaljert beskrivelse av studiedesignet. Totalt 54 halspensler (lagret uten transportmedium) samlet inn prospektivt fra 54 pasienter ved sju kliniske steder innen USA og Canada ble analysert med BD ProbeTec ET CF Assay. En frekvensdistribusjon av initiale CF PAT-verdi sammenlignet med dyrkningsresultatene er vist i figur 1. Syttifem av halspenslene som ble samlet inn prospektivt og presset ut i 2SP-transportmedium for dyrkningstesting ble også testet med BD ProbeTec ET CF Assay. En frekvensdistribusjon av initiale CF PATverdier sammenlignet med dyrkningsresultatene er vist i figur 2. Retrospektiv studie Tjuefem retrospektive halspensler ble presset ut i 2SP-transportmedium og oppbevart frosne og testet med BD ProbeTec ET CF Assay ved en klinikk i Europa. En frekvensdistribusjon av den initiale CF PATverdien sammenlignet med det originale dyrkningsresultatet er vist i figur. En frekvensdistribusjon av den initiale CF PAT-verdien sammenlignet med det originale PCR-resultatet fra den samme prøven er vist i figur 4. Figur 1: Frekvensdistribusjon for CF PAT-verdi Prospektiv halspenselresultater (uten transportmedium) sammenlignet med dyrkning Frekvens (-) (+) CF PAT-verdi Dyrkning ( ) Dyrkning (+) Dyrkningsresultat Total Negativt Positivt Total

10 Figur 2: Frekvensdistribusjon for CF PAT-verdi Prospektive halspenselresultater (2SP-medium) sammenlignet med dyrkning Frekvens (-) (+) 1 CF PAT-verdi Dyrkning ( ) Dyrkning (+) Dyrkningsresultat Total Negativt Positivt Total Figur : Frekvensdistribusjon for CF PAT-verdi Retrospektive halspenselresultater (2SP-medium) sammenlignet med dyrkning (2SP-medium),5 2,5 Frekvens 2 1,5 1 (-) (+) 1 Dyrkning( ) Dyrkning(+), CF PAT-verdi Dyrkningsresultat Total Negativt Positivt 1 4 Total 1 4 1

11 Figur 4: Frekvensdistribusjon for CF PAT-verdi Retrospektive halspenselresultat (2SP-medium) sammenlignet med PCR (2SP-medium) Frekvens (-) (+) CF PAT-verdi Dyrkning ( ) Dyrkning (+) C. Kontroller PCR Resultat Total Negativt Positivt 4 Total Under den kliniske evalueringen ble det utført totalt 45 kjøringer med respiratoriske kontroller og mediakontroller (CF/LP/MP). Alle kjøringene hadde akseptable kontrollresultater. Totalt 78 kjøringer ble utført med penselkontroller (tcf/tmp). To av kjøringene hadde kontrollsvikt. En svikt skyldtes prosedyrefeil, den andre kunne ikke tilskrives noen bestemt årsak. PAT-verdi for CF/LP/MP-kontroller og tcf/tmp-kontroller er oppsummert i henholdsvis tabell 1 og 2 Tabell 1: CF PAT-verdisammendrag for respiratoriske kontroller og mediakontroller (CF/LP/MP) Kontroll N Variasjonsområde 5. persentil Gjennomsnittlig Median 95. persentil CF-negativ 45 CF-positiv 45 9,5 52, 41,4 49, , Tabell 2: CF PAT-verdisammendrag for penselkontroller (tcf/tmp) Kontroll N Variasjonsområde 5. persentil Gjennomsnittlig Median 95. persentil CF-negativ 77 CF-positiv 76 28, 52,7 48,5 51,1 51,8 52,5 FUNKSJONSEGENSKAPER Prospektiv studie BD ProbeTec ET CF Assay ble evaluert prospektivt ved sju kliniske steder i USA og Canada i løpet av En halspensel (CultureSwab EZ oppbevart uten transportmedium) ble samlet inn for testing med BD ProbeTec ET CF Assay. En polyesterpensel ble samlet inn og suspendert i 2SP-transportmedium (sukrosefosfat) for dyrkning og testing og en annen polyesterpensel ble suspendert i Tris-EDTA-buffer (TE) for polymerasekjedereaksjonstesting (PCR). Derfor ble alle BD ProbeTec ET CF Assay-resultater fra prospektivt innsamlede prøver sammenlignet med halspenseldyrkningsresultat fra 2SP-medium. Et av de sju kliniske sentrene utførte alle referansetestene for Chlamydiaceae-dyrkning. Tilstedeværelse av minst en inklusjon etter farging med genus-spesifikk monoklonalt antistoff ble ansett for å indikere at prøven var positiv for en art av Chlamydiaceae. Tilstedeværelse av minst en inklusjon etter farging med FITC-konjugert C. pneumoniae-spesifikt monoklonalt antistoff ble ansett for å indikere at prøven var positiv for en art av C. pneumoniae. Ett av de sju kliniske sentrene utførte alle PCR-testene for de prospektive prøvene. PCR ble utført på halspensler presset ut i TE-buffer fra alle BD ProbeTec ET CF Assay-positive pasienter, og i tillegg på en del av de konkordante, negative prøvene og alle prøver med avvikende resultater (dvs. prøver med forskjell i BD ProbeTec ET CF og referansemetoden). PCR-analysen var spesifikk for C. pneumoniae og er en av fire publiserte protokollene som tilfredsstiller optimale kriterier for en godkjent PCR-analyse.,9 Totalt 54 halspensler (lagret uten transportmedium) som ble samlet inn fra 54 pasienter, tilfredsstilte inklusjonskriterine i studien (dvs. radiografiske tegn på pneumoni, pasienter 1 år gamle, på antibiotika 14 dager, godkjente prøvetyper samlet inn, adekvate referansemetoder anvendt osv.). For å vurdere ytelsesegenskapene til BD ProbeTec ET CF Assay, ble resultater fra halspensler (uten transportmedium) sammenlignet med dyrkningsresultat fra en parallell halspensel presset ut i 2SP- 11

12 medium. En prøve ble ansett som positiv hvis dyrkningsresultatet var positivt. En prøve ble ansett som negativ hvis dyrkningsresultatet var negativt. Resultater av halspenslene (uten transportmedium) er oppsummert i tabell. Ingen ubestemte resultater ble observert. Tabell : Prospektive halspenselresultater for BD ProbeTec ET CF Assay (uten transportmedium) sammenlignet med dyrkning Dyrkning Sted CF-resultat Positiv Negativ Total 1 Positiv Negativ 2 a Total Positiv Negativ Sensitivitet (95 % Kl) % (/2) ( % 84,2 %) Total NA Positiv 1 b 1 Negativ Total NA 4 Positiv Negativ Total NA 6 Positiv Negativ 4 4 Total 4 4 NA 7 Positiv Negativ 1 c 8 81 Total Til sammen Positiv 1 1 Negativ 5 5 Total % (/1) ( % 97,5 %) % (/) ( % 7,8 %) Spesifisitet (95 % Kl) 1 % (89/89) (95,9 % 1 %) 1 % (26/26) (86,8 % 1 %) 99 % (97/98) (94,4 % 1 %) 1 % (24/24) (85,8 % 1 %) 1 % (4/4) (89,7 % 1 %) 1 % (8/8) (95,5 % 1%) 99,7 % (5/51) (98,4 % 1 %) a Dyrkningsresultatene for begge prøver hadde en gradert 1+-vekst (1 inklusjon pr brønn eller 5 inklusjoner pr ml 2SP-medium). PCR-resultatene for begge prøver var negative. b PCR-resultatet var positivt. c Dyrkningen hadde en gradert 2+-vekst (72 inklusjoner pr brønn eller 6 inklusjoner pr ml 2SP-medium). PCR-resultatet var negativt. NA= Passer ikke MERK: PCR-analysen er spesifikk for C. pneumoniae og er en av fire publiserte protokollene som tilfredsstiller optimale kriterier for en godkjent PCR-analyse.,9 Syttifem av halspenslene (presset ut i 2SP-medium) som ble samlet inn prospektivt og presset ut i 2SPtransportmedium for dyrkningstesting ble også testet med BD ProbeTec ET CF Assay. Resultater fra halspensler presset ut i 2SP-medium ble sammenlignet med dyrkningsresultater fra den samme prøven. En prøve ble ansett som positiv hvis dyrkningsresultatet var positivt. En prøve ble ansett som negativ hvis dyrkningsresultatet var negativt. Resultater av halspenslene lagret i 2SP-transportmedium er oppsummert i tabell 4. Ingen ubestemte resultater ble observert. 12

13 Tabell 4: Prospektive halspenselresultater (2SP-medium) for BD ProbeTec ET CF Assay sammenlignet med dyrkning Dyrkning Sted CF resultat Positiv Negativ Total 2 Positiv Negativ 1 a 6 7 Total Positiv 1 c 1 Negativ 2 b 5 7 Total Til sammen Positiv 1 1 Negativ Total Sensitivitet (95 % Kl) % (/1) ( % 97,5 %) % (/2) ( % 84,2 %) % (/) ( % 7,8 %) Spesifisitet (95 % Kl) 1 % (6/6) (9, % 1 %) 97,2 % (5/6) (85,5 % 99,9 %) 98,6 % (71/72) (92,5 % 1 %) a Dyrkningen hadde en gradert 2+-vekst (72 inklusjoner pr brønn eller 6 inklusjoner pr ml 2SP-medium). PCR-resultatet var negativt. b Dyrkningsresultatene for begge prøver hadde en gradert 1+-vekst (1 inklusjon pr brønn eller 5 inklusjoner pr ml 2SP-medium). PCR-resultatene for begge prøver var negative. c PCR-resultatet var positivt. MERK: PCR-metodeanalysen er spesifikk for C. pneumoniae og er en av fire publiserte protokollene som tilfredsstiller optimale kriterier for en godkjent PCR-analyse.,9 En av halspenslene som ble samlet inn fra hver pasient som ble innrullert i den prospektive studien av BD ProbeTec ET CF Assay ble suspendert i Tris-EDTA-buffer for PCR-testing. Alle positive, avvikende (BD ProbeTec ET CF Assay-positive, dyrkningsnegative eller vice versa) og omtrent 1 % av de sammenfallende negative prøvene ble testet med en etablert C. pneumoniae-spesifikk PCR-metode. All PCR-testing ble utført ved en klinikk. Totalt 27 pasienter hadde prøver som ble testet med PCRanalyse for C. pneumoniae (dvs. 21 pasienter med sammenfallende negative resultater og seks pasienter med avvikende resultater). Tabell 5 oppsummerer de samlede resultatkombinasjonene fra dyrkning, BD ProbeTec ET CF Assay og PCR-analyse. Tabell 5: Oppsummering av prospektive pasienttestmetoder og BD ProbeTec ET CF Assay-resultater Dyrkningsresultat BD ProbeTec ET CF Assay-resultater Halspensel 2SP-medium PCR-resultat c Pasientantall + a Oppfylte ikke kriteriene b + N/A N/A 65 N/A 17 N/A N/A 26 N/A N/A 1 Tekst: N/A = Ikke tilgjengelig + viser et positivt resultat - viser et negativt resultat a To dyrkninger hadde en gradert 1+-vekst (1 inklusjoner pr brønn eller 5 inklusjoner pr ml 2SP-medium). En dyrkning hadde en gradert 2+-vekst (72 inklusjoner pr brønn eller 6 inklusjoner pr ml 2SP-medium). b Prøven ankom opptint til teststedet. Dyrkningen ble likevel utført og var negativ. Fordi prøven var skadet ble dyrkningsresultatet ikke brukt til å vurdere ytelsesegenskapene ved BD ProbeTec ET CF Assay. c PCR-metodeanalysen er spesifikk for C. pneumoniae og er en av fire publiserte PCR-protokoller som tilfredsstiller optimale kriterier for en godkjent PCR-analyse.,9 Retrospektiv studie På grunn av det lave antall positive prøver som ble påvist i den prospektive studien, identifiserte BD et sted i Europa som hadde 25 halspenselprøver utpresset og oppbevart frosne i 2SP-transportmedium. Disse retrospektive prøvene hadde vært oppbevart frosne i opptil åtte år, men de fleste av prøvene (84 %, 21/25) var oppbevart i mindre enn seks år. De 25 retrospektive prøvene ble karakterisert ved en kombinasjon av dyrkning og PCR eller bare PCR. Av de 25 prøvene hadde alle PCR-resultater (22 positive, tre negative). Av de 22 PCR-positive prøvene hadde bare fire positive C. pneumoniae-dyrkningsresultater. For de gjenværende 18 PCR-positive prøvene og tre PCR-negative prøvene, ble det ikke gjort noen dyrkningstesting. En prøve ble ansett som positiv hvis enten dyrkningsresultatet eller PCR-resultatet var positivt. En prøve ble ansett som negativ hvis tilgjengelig PCR-resultatet var negativt. Prosentvis enighet mellom anslag for 1

14 BD ProbeTec ET CF Assay fra halspensel oppbevart i 2SP-transportmedium sammenlignet med tilgjengelig kultur og/eller PCR-resultater er oppsummert i tabell 6. Sammenlignet med dyrkning er positiv prosentenighet 1 % (4/4). Positiv, negativ og total prosentenighet sammenlignet med PCR var henholdsvis 81,8 % (18/22), 1 % (/) og 84 % (21/25). Tabell 6: Retrospektive halspenselresultater for BD ProbeTec ET CF Assay (2SP-medium) sammenlignet med dyrkning (2SP-medium) og/eller PCR (2SP-medium) Dyrkning og/eller PCR Prosent anslått enighet (95 % Kl) Sted CF-resultat Positiv Negativ Total Positiv Negativ Til sammen DAN 8 Positiv 18 a,b 18 Negativ 4 c d 7 81,8 % (18/22) 1 % (/) 84 % (21/25) Total (59,7 % 94,8 %) (29,2 % 1 %) (6,9 % 95,5 %) a Fire av de 18 prøvene ble identifisert som positive for C. pneumoniae ved dyrkning. b Av de 18 prøvene som var positive ved PCR, var det to prøver som ble identifisert som positive for C. psittaci, og 16 ble identifisert som positive for C. pneumoniae. c Fire prøver ble identifisert som PCR-positive for C. pneumoniae. d Tre prøver var PCR-negative både ved Chlamydiaceae-genus og en artsspesifikk C. penumoniae-pcranalyse. Dyrkningsstudier ble ikke utført. Analytiske studier BD ProbeTec ET CT Assay-amplifiseringsreaksjonsvolumet er 1 µl av behandlet prøve. Analytisk sensitivitet Analytisk sensitivitet ved BD ProbeTec ET CF Assay ble bestemt ved testing av et representativt panel av organismer som tilhører Chlamydiaceae-familien, inkludert Chlamydophila pneumoniae (16 stammer), Chlamydia trachomatis (15 serovarer), Chlamydia psittaci (6 stammer) og C. muridarum (1 stamme). For hver organisme, med unntak av C. trachomatis-serovarer E og F, ble bakterielle suspensjoner fortynnet til, 6, 9 og 12 elementærpartikler (EB) pr reaksjon. C. trachomatis-serovarer E og F ble testet ved, 6, 1 2 og 1 8 EB/reaksjon. For studier som er gjort av kliniske prøver eller transportmedium, ble C. pneumoniae-atcc-stamme AR9 valgt som representativ for familien Chlamydiaceae. Analytisk sensitivitet ved BD ProbeTec ET CF Assay i nærvær av en halspenselprøve ble bestemt ved å så ut pensler med 2 µl fortynnet C. pneumoniae-ar9-standardkultur for å gi nivåer på,, 6 og 9 EB pr reaksjon. Analytisk sensitivitet ved BD ProbeTec ET CF Assay i nærvær av en 2SP-transportmedium ble bestemt ved å så ut 2SP-medium med fortynnet C. pneumoniae-ar9-standardkultur for å gi nivåer på, 9, 12, 2, 4 og 6 EB pr reaksjon. Alle prøver ble behandlet og målt i tre eksemplarer. Basert på 1 % positivitet er analytisk sensitivitet for forskjellige organismer og prøvematriser oppsummert i tabell 7. Grense for påvisning (LOD), kan imidlertid være lavere enn det laveste nivået som er testet. Tabell 7: BD ProbeTec ET CF Assay analytisk sensitivitet i forskjellige isolater* Organisme Analytisk sensitivitet (EB/reaksjon) C. pneumoniae (16 stammer) 6 C. trachomatis-serovarer B, Ba, C, D, I, LGV-1, LGV-2, LGV- 6 C. trachomatis-serovar A 9 C. trachomatis-serovar G 12 C. trachomatis-serovars H, J, K 15 C. trachomatis-serovar E og F Henholdsvis 1 2 og 2 5 C. psittaci (6 stammer) 6 (5 stammer) og 12 (1 stamme) C. muridarum (1 stamme) 6 Behandlede halspensler 2SP-transportmedium 9 * Om ikke annet er notert, representerer LOD median for alle stammer og serovarer som er testet. 14

15 Analytisk spesifisitet Totalt 18 mikroorganismer (86 bakterier, sju fungi, 14 virus og en parasitt) ble vurdert med BD ProbeTec ET CF Assay. Bakterielle isolater ble testet ved konsentrasjoner som varierte fra 1,17 x 1 7 til,7 x 1 9 CFU/mL eller celler/ml, unntatt Coccidioides immitis og Haemophilus ducrei som ble testet med bakterielle suspensjoner som var ekvivalente til McFarland-standarter på henholdsvis 5 og 2. Virus ble testet ved en konsentrasjon på 1 x 1 6 virale partikler/ml, mens Trichomonas vaginalis ble testet ved 4,6 x 1 6 celler/ml. Genomisk DNA eller RNA ble testet for fire viruser ved konsentrasjoner på 1 x 1 6 genomer/ml. Ingen av mikroorganismene som ble testet, ga et positivt resultat eller hemmet IAC (tabell 8). Tabell 8: BD ProbeTec ET CF Assay-resultater analytisk spesifisitet Acinetobacter calcoaceticus Haemophilus parainfluenzae Peptostreptococcus Acinetobacter lwoffii Herpes simplex virus-1 asaccharolyticus Actinomyces israelii Herpes simplex virus-2 Peptostreptococcus productus Adenovirus-5 Histoplasma capsulatum Plesiomonas shigelloides Aeromonas hydrophila HIV-I, Clade B Porphyromonas asaccharolytica Alcaligenes faecalis HPV, type 16 Prevotella melaninogenicus Bacillus subtilis HPV, type 18 Prevotella oralis Bacteroides fragilis Influenza virus A Propionibacterium acnes Blastomyces dermatitidis Influenza virus B Proteus mirabilis Bordetella bronchiseptica Kingella kingae Providencia stuartii Bordetella parapertussis Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Bordetella pertussis ssp. ozaenae type 4 Respiratorisk syncytialt virus, lang Branhamella catarrhalis Klebsiella pneumoniae stamme Candida albicans ssp. pneumoniae Rhinovirus Candida glabrata Lactobacillus acidophilus Salmonella choleraesuis serotype Candida tropicalis Lactobacillus brevis Enteritidis Citrobacter freundii Legionella pneumophila Salmonella choleraesuis serotype Clostridium perfringens Listeria monocytogenes Typhi Coccidioides immitis Mobiluncus mulierieris Salmonella Minnesota Corynebacterium diphtheriae Moraxella lacunata Salmonella typhimurium Corynebacterium jeikeium Moraxella osloensis Serratia marcescens Corynebacterium renale Morganella morganii Staphylococcus aureus, protein Cryptococcus neoformans Mycobacterium avium A-produserende Cytomegalovirus Mycobacterium gordonae Staphylococcus aureus, non-protein Edwardsiella tarda Mycobacterium kansasii A-produserende Eikenella corrodens Mycobacterium intracellulare Staphylococcus epidermidis Enterobacter aerogenes Mycobacterium smegmatis Stenotrophomonas maltophilia Enterobacter cloacae Mycobacterium tuberculosis Streptococcus, gruppe B Enterococcus faecalis Mycoplasma genitalium Streptococcus mitis Enterococcus faecium Mycoplasma hominis, type 1 Streptococcus mutans Enterovirus (Echovirus) Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pneumoniae Epstein-Barr virus Neisseria cinerea Streptococcus pyogenes Escherichia coli Neisseria gonorrhoeae Streptomyces griseus Flavobacterium meningosepticum Neisseria meningitidis Tatlockia (Legionella) micdadei Fusobacterium nucleatum Neisseria mucosa Trichomonas vaginalis Gardnerella vaginalis Neisseria polysaccharea Ureaplasma urealyticum Gemella haemolysans Parainfluenza I virus Veillonella parvula Haemophilus ducreyi Peptostreptococcus anaerobius Vibrio parahaemolyticus Haemophilus influenzae Yersinia enterocolitica Forstyrrende stoffer Potensielt forstyrrende stoffer, som kan finnes i halsprøvepensler, ble testet med BD ProbeTec ET CF Assay under fravær av målet med 15 EB/reaksjon av C. pneumoniae-atcc-stamme AR9. I fravær av målet var det ingen av stoffene som ble testet som ga et positivt resultat eller hemmet IAC ved konsentrasjonene listet opp i tabell 9. Alle prøvene som ble testet, ga et positivt resultat. 15

16 Tabell 9: BD ProbeTec ET CF Assay stoffer testet for forstyrrelse Halspenselprøver Stoffer testet Konsentrasjon i prøven Hostesaft Robitussin DM 25 % Triaminic (drue) 25 % Nesespray (alle) Vicks Sinex 1 % Neo-Synephrine (vanlig styrke) 1 % Halsspray Cepacol (kjølig mentol) 25 % Vicks Chloraseptic (kirsebær) 25 % Munnskyllevæske Scope (original mint) 25 % Listerine (original) 25 % Hostedrops Halls Sugar Free Citrus Blend 25 % Cold-Eeze Zinc 25 % Organismer Mycoplasma pneumoniae 1 7 celler/ml Legionella pneumophila 1 7 CFU/mL Mycoplasma pneumoniae og Legionella pneumophila Henholdsvis 1 7 celler/ml og 1 7 CFU/mL Prøver med tilsetninger For å supplere antallet positive prøver påtruffet i den kliniske studien, ble 25 halspensler tilsatt 5 x 1 4 EB/mL av C. pneumoniae (positive prøver). På samme måte, for å simulere Chlamydiaceaenegative halspensler, ble 5 pensler tilsatt en bakteriell suspensjon som bare inneholdt L. pneumophila og M. pneumoniae. Alle prøvene ble testet med BD ProbeTec ET CF Assay. Resultatene er oppsummert i tabell 1. Total nøyaktighet var 98,7 % (74/75). Tabell 1: BD ProbeTec ET CF Assay resultater for halspenselprøver med tilsetninger Tilsetningsnivå Positiv Negativ Total Positiv 25 1* 26 BD ProbeTec ET CF Assay-resultater Negativ Total *Initialt falsk positive, gjentatt negative med BD ProbeTec ET CF Assay Reproduserbarhet Reproduserbarhet ved BD ProbeTec ET CF Assay ble vurdert for halspensler ved tre laboratorier med testpaneler som inneholdt 24 prøver som ble preparert i PBS/BSA. Panelet inneholdt 12 prøver som var negative for C. pneumoniae i tillegg til tre lave og tre høye C. pneumoniae-positive prøver (henholdsvis 45 og 75 EB/reaksjon). I tillegg var det tre lave positive prøver som inneholdt henholdsvis 45 EB, 4 CFU og 6 celler/reaksjon av C. pneumoniae (CP), L. pneumophila (LP) og M. pneumoniae (MP) og tre høye, positive prøver som hver inneholdt henholdsvis 75 EB, 65 CFU og 1 celler/reaksjon av disse organismene. En operatør på hvert av de tre stedene testet panelene en gang om dagen over tre dager. Resultatene er oppsummert i tabell 11. Tabell 11: BD ProbeTec ET CF Assay: Halspenselreproduserbarhet Estimater etter prøvenivå Mellom dager innenfor sted Mellom steder Panelmedlem N % riktig Gjennomsnittlig PAT SD % CV SD % CV CP-HØY 27 1 % 51,2,1,61,11,21 CP-LAV 27 1 % 5,7,,,29,58 CP/LP/MP-HØY 27 1 % 51,8,26,51,, CP/LP/MP-LAV 27 1 % 5,6,,,, Negativ 18 1 %, IAC med CP-negative prøver 18 1 % 52,,17,2,6,12 16

17 TILGJENGELIGHET Følgende BD ProbeTec ET-produkter er tilgjengelige: Kat. nr. Beskrivelse BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay 447 BD ProbeTec ET Swab Diluent and Control Kit 4471 BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit BD ProbeTec ET Accessories Kit 4471 BD ProbeTec ET Accessories Kit ll BD ProbeTec ET Pipette Tips, 6 x BD ProbeTec ET Sample Tubes (4, ml) and Caps, 4 hver BD ProbeTec ET 2 ml Sample Tubes, Caps and Labels, BD ProbeTec ET 2 ml Caps, BD ProbeTec ET Instrument, utenfor USA BD ProbeTec ET Instrument, USA og Canada BD ProbeTec ET Priming & Warming Heater, 22 V 4448 BD ProbeTec ET Priming & Warming Heater, 12 V BD ProbeTec ET Lysing Heater, 22 V 4448 BD ProbeTec ET Lysing Heater, 12 V BD ProbeTec ET Pipettor 4452 BD ProbeTec ET Lysing Rack REFERANSER 1. Bartlett, J.G., Dowell, S. F., Mandell, L.A., File, T.M., Musher, D.M., Fine, M.J. 2. Guidelines from the Infectious Diseases Society of America - Practice guidelines for the management of communityacquired pneumonia in adults. Clin Infect Dis 1: Murray et al Manual of clinical microbiology, 7th edition, ASM Press.. Dowell, S.F., Peeling, R.W., et.al. 21. Standardizing Chlamydia pneumoniae Assays: Recommendations from the Centers for Disease Control and Prevention (USA) and the Laboratory Centre for Disease Control (Canada). Clin Infect Dis : National Committee for Clinical Laboratory Standards. 21. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd. ed. NCCLS, Wayne, Pa. 5. Garner. J.S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 7. Directive 2/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/91/EEC). Official Journal L262, 17/1/2, p Isolation of Chlamydia ssp. in cell culture. In: Clinical microbiology procedures handbook, Isenberg HD (Ed.), 1992, American Society for Microbiology, Washington DC, pp Mandell, L.A., Bartlett, J.G., et. al. 2. Update of practice guidelines for the management of community-acquired pneumonia in immunocompetent adults. Clin Infect Dis 7:

18 18

19 m Becton, Dickinson and Company A BENEX Limited 7 Loveton Circle Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Sparks, Maryland USA Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. Alconox is a trademark of Alconox, Inc. BD, BD Logo, BBL, BD ProbeTec and CultureSwab are trademarks of Becton, Dickinson and Company. 28 BD