cobas HCV Kvantitativ nukleinsyretest for bruk på cobas 6800/8800 Systems For bruk til in vitro-diagnostikk cobas HCV P/N:

Transkript

1 Kvantitativ nukleinsyretest for bruk på cobas 6800/8800 Systems For bruk til in vitro-diagnostikk cobas HCV P/N: cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit P/N: cobas NHP Negative Control Kit P/N:

2 Innholdsfortegnelse Tiltenkt bruk... 4 Oppsummering og forklaring av testen... 4 Reagenser og materialer... 6 cobas HCV reagenser og kontroller... 6 cobas omni-reagenser for prøvepreparering... 9 Krav til oppbevaring og håndtering av reagenser Ytterligere materiell som kreves Instrumentering og programvare som kreves Krav til oppbevaring og håndtering Advarsler og forholdsregler Håndtering av reagenser God laboratoriepraksis Prøvetaking, -transport og -oppbevaring Prøver Bruksanvisning Merknader til prosedyren Kjøre cobas HCV Resultater Kvalitetskontroll og gyldighet av resultater Tolkning av resultater Testens begrensninger Vurdering av analytisk ytelse Viktige ytelsesegenskaper Deteksjonsgrense (LoD) Lineært område Presisjon innen laboratoriet Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 2

3 Verifisering av genotype Spesifisitet Analytisk spesifisitet Analytisk spesifisitet interfererende substanser Metodekorrelasjon Matriksekvivalens EDTA-plasma sammenlignet med serum Systemfeil Krysskontaminering Tilleggsinformasjon Viktigste analysefunksjoner Symboler Produsent og distributører Varemerker og patenter Copyright Referanser Dokumentrevisjon cobas HCV Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 3

4 Tiltenkt bruk cobas HCV er en in vitro-nukleinsyreamplifikasjonstest for både deteksjon og kvantitering av hepatitt C-RNA (HCV), genotype 1 til 6, i humant EDTA-plasma eller serum fra HCV-smittede personer. cobas HCV skal brukes som et hjelpemiddel ved diagnostisering av HCV-infeksjon hos følgende populasjoner: personer med påvist HCV-antistoff og tegn på leversykdom, personer med påvist HCV-antistoff som mistenkes å kunne være aktivt infisert, og personer med antistoffer mot HCV som står i fare for å utvikle HCV-infeksjon. Deteksjon av HCV-RNA tyder på at viruset reproduserer seg, noe som er tegn på aktiv infeksjon. Testen skal brukes ved oppfølging av pasienter med kronisk HCV sammen med kliniske markører og laboratoriemarkører for infeksjon. Testen kan brukes til å vurdere sannsynligheten for vedvarende virologisk respons (SVR) på et tidlig stadium i antiviral behandling, og til å vurdere virologisk respons på antiviral behandling (responsstyrt behandling) ved å måle endringer i HCV-RNA-nivåer i serum eller EDTA-plasma. Resultatene må tolkes i sammenheng med alle relevante kliniske funn og laboratoriefunn. Oppsummering og forklaring av testen Bakgrunn Hepatitt C-viruset (HCV) anses å være det viktigste etiologiske agens, ansvarlig for % av tilfellene av posttransfusjonshepatitt. 1-4 HCV er et enkelttrådet, "positive sense" RNA-virus med et genom som består av ca nukleotider som koder for 3000 aminosyrer. HCV er et blodbåret virus som kan overføres via blod og blodprodukter. Utstrakt bruk av metoder for HCV-blodscreening har i vesentlig grad redusert risikoen for transfusjonsassosiert hepatitt. Forekomsten av HCV-infeksjon er størst i forbindelse med intravenøst stoffmisbruk og litt mindre ved annen perkutan eksponering. 4 Kvantitering av HCV-RNA for å måle virusmengde ved baseline og for å overvåke under behandling er godt utprøvd for å vise effekt av antiviral respons på kombinasjonsbehandling med pegylert interferon pluss ribavirin (pegifn/rbv). 5-9 Retningslinjer for kontroll og behandling av HCV 10,11 anbefaler kvantitativ testing for HCV-RNA før start av antiviral behandling, til spesifikke tidspunkter under behandling (responsstyrt behandling, RGT) og 12 uker eller senere etter avsluttet behandling. Målet for behandlingen er fravær av detekterbart HCV-RNA med en sensitiv test, tatt 12 uker etter avsluttet behandling. Denne vil indikere at vedvarende virologisk respons (SVR) er oppnådd. 10 Bestemmelse av den virale kinetikken under behandling er blitt brukt for ytterligere å persontilpasse behandlingsvarigheten med nylig godkjente direktevirkende, antivirale agens (DAA-er), proteasehemmerne telaprevir og boceprevir Begrunnelse for HCV-testing I den svært dynamiske og omfattende prosessen med å finne legemidler for fremtidig HCV-behandling, er overvåking av virusmengde fortsatt den viktigste laboratorietesten for å bekrefte at vedvarende virologisk respons er oppnådd med DAA-er, som andregenerasjons proteasehemmere, nukleosidhemmere av HCV-polymerase og andre antivirale mekanismer cobas HCV for bruk på cobas 6800/8800 Systems er en kvantitativ test for HCV-RNA og viral kinetikk, for bruk i laboratorier som deltar i kliniske studier, samt for behandling av HCV-pasienter i klinisk praksis. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 4

5 Forklaring av testen cobas HCV er en kvantitativ test som utføres på cobas 6800 System og cobas 8800 System. Med cobas HCV er det mulig å detektere og kvantitere HCV-RNA i EDTA-plasma eller serum fra smittede pasienter. Doble prober brukes for å detektere og kvantitere, men ikke for å skille genotype 1-6. Virusmengden kvantiteres i forhold til en non-hcvpansret RNA-kvantiteringsstandard (RNA-QS) som tilsettes i hver prøve under prøveklargjøring. RNA-QS fungerer også som internkontroll og overvåker hele prøveklargjøringen og PCR-amplifikasjonsprosessen. I tillegg bruker testen tre eksterne kontroller: en høytiter positiv kontroll, en lavtiter positiv kontroll og en negativ kontroll. Testprinsipper cobas HCV er basert på helautomatisk prøveklargjøring (nukleinsyreekstraksjon og rensing) etterfulgt av PCRamplifikasjon og deteksjon. cobas 6800/8800 Systems består av prøveforsyningsmodulen, overføringsmodulen, prosesseringsmodulen og analysemodulen. Automatisk databehandling utføres av cobas 6800/8800-programvaren, som tilordner analyseresultater for alle analyser som enten "Target not detected", < LLoQ (nedre kvantiteringsgrense), > ULoQ (øvre kvantiteringsgrense) eller "HCV RNA detected", en verdi i linearitetsområdet LLoQ < x < ULoQ. Resultatene kan vises direkte på systemskjermen, eksporteres eller skrives ut som en rapport. Nukleinsyre fra pasientprøver, eksterne kontroller og tilsatte RNA-QS-molekyler blir ekstrahert samtidig. Virusnukleinsyrene blir frigjort ved å tilsette proteinase og lyseringsreagens i prøven. Den frigjorte nukleinsyren bindes til silikaoverflaten på de tilsatte magnetiske glasspartiklene. Ubundne substanser og urenheter, som denaturert protein, cellerester og potensielle PCR-hemmere, fjernes under de påfølgende vasketrinnene. Rensede nukleinsyrer elueres fra de magnetiske glasspartiklene med elueringsbuffer ved høy temperatur. Målnukleinsyren amplifiseres selektivt fra pasientprøven ved bruk av målvirusspesifikke oppstrøms- og nedstrømsprimere som er utvalgt fra høykonserverte regioner av HCV. RNA-QS amplifiseres selektivt ved bruk av sekvensspesifikke oppstrøms- og nedstrømsprimere som er utvalgt fordi de ikke har noen homologi med HCV-genomet. Et termostabilt DNA-polymeraseenzym brukes til både revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon. Mål- og RNA-QSsekvensene amplifiseres samtidig ved bruk av en universell PCR-amplifikasjonsprofil med forhåndsdefinerte temperaturtrinn og antall sykluser. Master Mix inneholder deoksyuridintrifosfat (dutp) - i stedet for deoksytymidintrifosfat (dttp) - som inngår i det nylig syntetiserte DNA-et (amplikon) Eventuelle kontaminerende amplikon fra tidligere PCR-kjøringer elimineres av AmpErase-enzymet, som er inkludert i PCR-blandingen, under det første varmetrinnet. Det nydannede amplikonet blir imidlertid ikke eliminert, siden AmpErase-enzymet blir deaktivert når det eksponeres for temperaturer over 55 C. cobas HCV Master Mix inneholder to deteksjonsprober som er spesifikke for HCV-målsekvensen, samt én for RNA-QS. Probene er merket med målspesifikke rapporteringsfluoroforer, som muliggjør samtidig deteksjon av HCV-mål og RNA-QS i to ulike målkanaler. 23,24 Når det ikke er bundet til målsekvensen, undertrykkes fluorescenssignalet for den intakte proben av slukkerfluoroforen. Under PCR-amplifikasjonstrinnet hybridiseres probene til det spesifikke enkelttrådete DNA-templatet, slik at proben splittes av 5'-til-3'-nukleaseaktiviteten til DNA-polymerasen. Dette fører til at rapporterings- og slukkerfluoroforene separeres og at det genereres et fluorescenssignal. Med hver PCR-syklus blir det generert stadig flere splittede prober, og det samlede signalet for rapporteringsfluoroforen økes samtidig. Sanntidsdeteksjon og differensiering av PCR-produkter oppnås ved å måle fluorescensen fra de frigjorte rapporteringsfluoroforene for virusmålene og RNA-QS. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 5

6 Reagenser og materialer cobas HCV reagenser og kontroller Alle uåpnede reagenser og kontroller skal oppbevares som anbefalt i Tabell 1 til Tabell 4. Tabell 1 cobas HCV cobas HCV Oppbevares ved 2-8 C Kassett med 96 tester (P/N ) Komponenter i kitet Reagensingredienser Antall per kit 96 tester Proteinaseløsning (PASE) (RNA kvantiteringsstandard) (RNA-QS) Elueringsbuffer (EB) Master Mix-reagens 1 (MMX-R1) HCV Master Mix-reagens 2 (HCV MMX-R2) Tris-buffer, < 0,05 % EDTA, kalsiumklorid, kalsiumacetat, 8 % (vekt/volum) proteinase EUH210: Sikkerhetsdatablader er tilgjengelige på forespørsel. EUH208: Kan utløse en allergisk reaksjon. Inneholder: Subtilisin, Tris-buffer, < 0,05 % EDTA, < 0,001 % non-hcv-relatert pansret RNA-konstruksjon som inneholder primer- og probespesifikke primersekvensregioner (ikke-infeksiøst RNA i MS2-bakteriofag), < 0,1 % natriumazid Tris-buffer, 0,2 % metyl-4-hydroksybenzoat Manganacetat, kaliumhydroksid, < 0,1 % natriumazid Trisinbuffer, kaliumacetat, 18 % dimetylsulfoksid, glyserol, < 0,1 % Tween 20, EDTA, < 0,12 % datp, dctp, dgtp og dutp, < 0,01 % oppstrøms og nedstrøms HCV-primere, < 0,01 % kvantiteringsstandard oppstrøms- og nedstrømsprimere, < 0,01 % fluoroformerkede oligonukleotidprober spesifikke for HCV og HCV-kvantiteringsstandard, < 0,01 % oligonukleotidaptamer, < 0,01 % Z05D DNApolymerase, < 0,1 % AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylase) (mikrobiell), < 0,1 % natriumazid 13 ml 13 ml 13 ml 5,5 ml 6 ml Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 6

7 Tabell 2 cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit Oppbevares ved 2 til 8 C (P/N ) Komponenter i kitet Reagensingredienser Antall per kit Sikkerhetssymbol og advarsel* HBV/HCV/HIV-1 Lav positiv kontroll (HBV/HCV/HIV-1 L(+)C) HBV/HCV/HIV-1 Høy positiv kontroll (HBV/HCV/HIV-1 H(+)C) < 0,001 % HIV-1 gruppe M pansret RNA innkapslet i MS2-bakteriofagbelagt protein, < 0,001 % syntetisk (plasmid) HBV-DNA innkapslet i Lambda-bakteriofagbelagt protein, < 0,001 % syntetisk (pansret) HCV- RNA innkapslet i MS2-bakteriofagbelagt protein, normalt humant plasma, ikkereaktivt med lisensierte tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HBsAg, antistoff mot HBc; HIV-1-RNA, HIV-2-RNA, HCV-RNA, HBV-DNA, HEV-RNA, WNV-RNA og CMV-DNA ikke detekterbart med PCRmetoder. 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske < 0,001 % høytitret syntetisk (pansret) HIV-1 gruppe M-RNA innkapslet i MS2- bakteriofagbelagt protein, < 0,001 % syntetisk (plasmid) HBV-DNA innkapslet i Lambda-bakteriofagbelagt protein, < 0,001 % syntetisk (pansret) HCV-RNA innkapslet i MS2-bakteriofagbelagt protein, normalt humant plasma, ikke-reaktivt med lisensierte tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HBsAg, antistoff mot HBc; HIV-1-RNA, HIV-2-RNA, HCV-RNA, HBV-DNA, HEV-RNA, WNV-RNA og CMV- DNA ikke detekterbart med PCR-metoder. 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske 5,2 ml (8 x 0,65 ml) 5,2 ml (8 x 0,65 ml) Advarsel H317: Kan utløse en allergisk hudreaksjon. P261: Unngå innånding av støv/røyk/gass/ tåke/damp/aerosoler. P272: Tilsølte arbeidsklær må ikke fjernes fra arbeidsplassen. P280: Bruk vernehansker. P302 + P352: VED HUDKONTAKT: Vask med mye såpe og vann. P333 + P313: Ved hudirritasjon eller utslett: Søk legehjelp. P363: Tilsølte klær må vaskes før de brukes på nytt. Advarsel H317: Kan utløse en allergisk hudreaksjon. P261: Unngå innånding av støv/røyk/gass/ tåke/damp/aerosoler. P272: Tilsølte arbeidsklær må ikke fjernes fra arbeidsplassen. P280: Bruk vernehansker. P302 + P352: VED HUDKONTAKT: Vask med mye såpe og vann. P333 + P313: Ved hudirritasjon eller utslett: Søk legehjelp. P363: Tilsølte klær må vaskes før de brukes på nytt. * Merking av produktsikkerhet følger primært EUs GHS-retningslinjer. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 7

8 Tabell 3 cobas NHP Negative Control Kit cobas NHP Negative Control Kit Oppbevares ved 2-8 C (P/N ) Komponenter i kitet Reagensingredienser Antall per kit Sikkerhetssymbol og advarsel* Negativ kontroll med normalt humant plasma (NHP-NC) Normalt humant plasma, ikke-reaktivt med lisensierte tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HBsAg, antistoff mot HBc; HIV-1-RNA, HIV-2-RNA, HCV-RNA, HBV-DNA, HEV-RNA, WNV-RNA og CMV- DNA ikke detekterbart med PCR-metoder. < 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske 16 ml (16 x 1 ml) Advarsel H317: Kan utløse en allergisk hudreaksjon. P261: Unngå innånding av støv/røyk/gass/ tåke/damp/aerosoler. P272: Tilsølte arbeidsklær må ikke fjernes fra arbeidsplassen. P280: Bruk vernehansker. P302 + P352: VED HUDKONTAKT: Vask med mye såpe og vann. P333 + P313: Ved hudirritasjon eller utslett: Søk legehjelp. P363: Tilsølte klær må vaskes før de brukes på nytt. * Merking av produktsikkerhet følger primært EUs GHS-retningslinjer. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 8

9 cobas omni-reagenser for prøvepreparering Tabell 4 cobas omni-reagenser for prøvepreparering* Reagenser Reagensingredienser Antall per kit Sikkerhetssymbol og advarsel** cobas omni MGP Reagent (MGP) Oppbevares ved 2 til 8 C (P/N ) cobas omni Specimen Diluent (SPEC DIL) Oppbevares ved 2 til 8 C (P/N ) cobas omni Lysis Reagent (LYS) Oppbevares ved 2 til 8 C (P/N ) cobas omni Wash Reagent (WASH) Oppbevares ved 15 til 30 C (P/N ) Magnetiske glasspartikler, Tris-buffer, 0,1 % metyl-4-hydroksybenzoat, < 0,1 % natriumazid Tris-buffer, 0,1 % metyl-4-hydroksybenzoat, < 0,1 % natriumazid 43 % (vekt per vekt) guanidintiocyanat, 5 % (vekt/volum) polydocanol, 2 % (vekt/volum) ditiotreitol, dihydronatriumsitrat Natriumsitratdihydrat, 0,1 % metyl-4 hydroksybenzoat 480 tester Ikke relevant 4 x 875 ml Ikke relevant 4 x 875 ml Fare H302 + H332: Farlig ved svelging eller innånding. H318: Gir alvorlig øyeskade. H412: Skadelig, med langtidsvirkning for liv i vann. EUH032: Ved kontakt med syre utvikles meget giftig gass. P301 + P312: VED SVELGING: Kontakt GIFT- INFORMASJONSSENTRALEN eller lege ved ubehag. P264: Vask huden grundig etter håndtering. P270: Ikke spis, drikk eller røyk ved bruk av produktet. P273: Unngå utslipp til miljøet. P280: Bruk vernehansker/vernebriller/ansiktsskjerm. P305 + P351 + P338: VED KONTAKT MED ØYNENE: Skyll forsiktig med vann i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser dersom dette enkelt lar seg gjøre. Fortsett skyllingen. P310: Kontakt umiddelbart Giftinformasjonssentralen eller lege ved ubehag. P330: Skyll munnen. 4,2 l Ikke relevant * Disse reagensene er ikke inkludert i cobas HCV-testkitet. Se listen over ytterligere materiell som kreves (Tabell 7). ** Merking av produktsikkerhet følger primært EUs GHS-retningslinjer. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 9

10 Krav til oppbevaring og håndtering av reagenser Reagenser skal oppbevares og håndteres som beskrevet i Tabell 5 og Tabell 6. Når reagenser ikke er plassert i cobas 6800/8800 Systems, skal de oppbevares ved temperaturene som er angitt i Tabell 5. Tabell 5 Oppbevaring av reagenser (som ikke er plassert i systemet) Reagens cobas HCV cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit cobas NHP Negative Control Kit cobas omni Lysis Reagent cobas omni MGP Reagent cobas omni Specimen Diluent cobas omni Wash Reagent Oppbevaringstemperatur 2-8 C 2-8 C 2-8 C 2-8 C 2-8 C 2-8 C C Reagenser som er plassert på cobas 6800/8800 Systems, oppbevares ved riktige temperaturer, og utløpsdatoen overvåkes av systemet. cobas 6800/8800 Systems tillater kun at reagenser brukes hvis alle betingelsene som vises i Tabell 6, er oppfylt. Systemet hindrer automatisk bruk av utløpte reagenser. Tabell 6 informerer brukeren om betingelsene for reagensoppbevaring som håndheves av cobas 6800/8800 Systems. Tabell 6 Betingelser for reagensholdbarhet som håndheves av cobas 6800/8800 Systems Reagens Kitets utløpsdato Holdbarhet for åpnet kit Antall kjøringer som dette kitet kan brukes for Holdbarhet på systemet (samlet tid på systemet ute av kjøleskap) cobas HCV Dato ikke passert 30 dager fra første gangs bruk Maks. 10 kjøringer Maks. 8 timer cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit Dato ikke passert Ikke relevant Ikke relevant Maks. 8 timer cobas NHP Negative Control Kit Dato ikke passert Ikke relevant Ikke relevant Maks. 10 timer cobas omni Lysis Reagent Dato ikke passert 30 dager etter innmating* cobas omni MGP Reagent Dato ikke passert 30 dager etter innmating* cobas omni Specimen Diluent Dato ikke passert 30 dager etter innmating* cobas omni Wash Reagent Dato ikke passert 30 dager etter innmating* * Tiden måles fra første gang reagenset settes inn i cobas 6800/8800 Systems. Ikke relevant Ikke relevant Ikke relevant Ikke relevant Ikke relevant Ikke relevant Ikke relevant Ikke relevant Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 10

11 Ytterligere materiell som kreves Tabell 7 Materialer og forbruksartikler som brukes på cobas 6800/8800 Systems Materiale P/N cobas omni Processing Plate cobas omni Amplification Plate cobas omni Pipette Tips cobas omni Liquid Waste Container cobas omni Lysis Reagent cobas omni MGP Reagent cobas omni Specimen Diluent cobas omni Wash Reagent Pose for fast avfall Beholder for fast avfall Instrumentering og programvare som kreves cobas 6800/8800-programvare og cobas HCV-analysepakke må være installert på instrumentet/instrumentene. IG-serveren (Instrument Gateway-server) følger med systemet. Tabell 8 Instrumentering Utstyr P/N cobas 6800 System (flyttbart alternativ) og cobas 6800 System (fast) og cobas 8800 System Prøveforsyningsmodul Se brukermanualen for cobas 6800/8800 Systems for ytterligere informasjon om primære og sekundære prøverør som kan brukes på instrumentene. Merk: Kontakt din lokale Roche-representant for en detaljert liste over hvilke prøverack, rack for tilstoppede spisser og rackbrett som kan brukes på instrumentene. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 11

12 Krav til oppbevaring og håndtering Advarsler og forholdsregler Som med alle laboratorieprosedyrer er god laboratoriepraksis essensielt for å sikre optimal ytelse for denne analysen. På grunn av testens høye sensitivitet, må det utvises aktsomhet for å sikre at reagenser og amplifikasjonsblandinger ikke kontamineres. Kun for bruk til in vitro-diagnostikk. cobas HCV er ikke evaluert for bruk som screeningtest for tilstedeværelse av HCV i blod eller blodprodukter. Alle pasientprøver må håndteres som potensielt infeksiøse, og gode laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories og i CLSI-dokumentet M29-A4. 25,26 Kun personell som har opplæring i håndtering av infeksiøst materiale og i bruk av cobas HCV og cobas 6800/8800 Systems, skal utføre denne prosedyren. Alt materiale med human opprinnelse skal betraktes som potensielt infeksiøst og skal håndteres i samsvar med universelle forholdsregler. Hvis det oppstår søl, desinfiser umiddelbart med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i destillert eller deionisert vann (fortynn klor til husholdningsbruk i forholdet 1:10) eller følg gjeldende laboratorieprosedyrer. cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit og cobas NHP Negative Control Kit inneholder plasma med opprinnelse i humant blod. Kildematerialet er testet med godkjente antistofftester og har vist seg å være ikkereaktivt for antistoffer mot HCV, antistoffer mot HIV-1/2, HBsAg og antistoffer mot HBc. Testing av normalt humant plasma med PCR-metoden viste heller ikke noe detekterbart HIV-1-RNA (gruppe M og O), HIV-2- RNA, HCV-RNA, HBV-DNA, HEV-RNA, WNV-RNA eller CMV-DNA. Ingen kjente testmetoder kan garantere helt at produkter fra humant blod ikke vil kunne overføre infeksiøse agens. Ikke frys fullblod eller prøver som har vært oppbevart i primærrør. Bruk kun medfølgende eller spesifiserte forbruksartikler for å sikre optimal testytelse. Sikkerhetsdatablader (SDS) er tilgjengelige på forespørsel fra din lokale Roche-representant. Følg angitte prosedyrer og retningslinjer nøye for å sikre at testen utføres korrekt. Eventuelle avvik fra prosedyrene og retningslinjene kan påvirke testytelsen, slik at den ikke blir optimal. Falske positive resultater kan oppstå hvis krysskontaminering av prøver ikke forhindres under prøvehåndtering og prøveprosessering. Ikke bruk et prøveinnmatingsvolum på 200 µl hvis virusmengden forventes å være < 100 IU/ml. Håndtering av reagenser Håndter alle reagenser, kontroller og prøver i henhold til god laboratoriepraksis for å unngå krysskontaminering av prøver eller kontroller. Inspiser visuelt alle reagenskassetter, fortynningsvæsker, lyseringsreagenser og vaskereagenser før bruk for å sikre at det ikke er tegn på lekkasje. Ikke bruk materialet til testing hvis det er tegn på lekkasje. cobas omni Lysis Reagent inneholder guanidintiocyanat, et potensielt farlig kjemikalium. Unngå at reagensene kommer i kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår, ellers kan det oppstå brannskade. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 12

13 cobas HCV-kit, cobas omni MGP Reagent og cobas omni Specimen Diluent inneholder natriumazid som konserveringsmiddel. Unngå at reagensene kommer i kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår, ellers kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl av reagensene. Sørg for at cobas omni Lysis Reagent, som inneholder guanidintiocyanat, ikke kommer i kontakt med natriumhypoklorittløsning (klorløsning). Denne blandingen kan produsere en svært giftig gass. Kast alle materialer som har vært i kontakt med prøver og reagenser, i henhold til nasjonalt, regionalt, og lokalt regelverk. God laboratoriepraksis Ikke pipetter med munnen. Ikke spis, drikk eller røyk i angitte arbeidsområder. Bruk laboratoriehansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Hansker må byttes mellom håndtering av prøver og cobas HCV-kit og cobas omni-reagenser for å hindre kontaminering. Unngå kontaminering av hanskene når prøver og kontroller håndteres. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser og etter at hanskene er tatt av. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i destillert eller de-ionisert vann (fortynn klor til husholdningsbruk i forholdet 1:10). Tørk deretter av overflaten med 70 % etanol. Hvis det søles på cobas 6800/8800-instrumentet, følg instruksjonene i brukermanualen for cobas 6800/8800 Systems for å sørge for tilstrekkelig rengjøring og dekontaminering av instrumentoverflatene. Prøvetaking, -transport og -oppbevaring Prøver Merk: Alle prøver og kontroller må behandles som om de er potensielt infeksiøse. Oppbevar alle prøver ved angitte temperaturer. Prøvens holdbarhet blir redusert ved høye temperaturer. Hvis det brukes prøver som har vært frosset i sekundærrør, plasser prøvene i romtemperatur (15-30 C) til de er helt tint, og bland (f.eks. vortex i 3-5 sekunder) og sentrifuger deretter prøvene for å samle alt prøvemateriale i bunnen av røret. Blodprøver må tas i SST serumsepareringsrør, BD Vacutainer PPT plasmaprepareringsrør for molekylære diagnostiske testmetoder eller i sterile rør med EDTA som antikoagulant. Følg instruksjonene fra produsenten av prøvetakingsrøret. Fullblod som er tatt i SST serumsepareringsrør, BD Vacutainer PPT plasmaprepareringsrør for molekylære diagnostiske testmetoder eller i sterile rør med EDTA som antikoagulant, kan oppbevares og/eller transporteres i opptil 24 timer ved 2-25 C før plasma-/serumpreparering. Sentrifugering skal utføres i samsvar med produsentens instruksjoner. Etter separering kan EDTA-plasma eller serumprøver oppbevares i sekundærrør i opptil 6 dager ved 2 C til 8 C eller opptil 12 uker ved -18 C. Ved langvarig oppbevaring anbefales temperaturer på -60 C. Plasma-/serumprøver er stabile i opptil fire fryse-/tinesykluser når de fryses ved -18 C. Sørg om mulig for at det tas nok fullblod til at det blir mulig å bruke det anbefalte prosesseringsvolumet for EDTA-plasma eller serum på 500 µl (for en total minimums prøvemengde på 650 µl). Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 13

14 Hvis prøver skal sendes, må de pakkes og merkes i henhold til gjeldende nasjonalt og internasjonalt regelverk for transport av prøver og biologisk materiale. Bruksanvisning Merknader til prosedyren Ikke bruk cobas HCV-testreagenser, cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit, cobas NHP Negative Control Kit eller cobas omni-reagenser etter utløpsdatoen. Forbruksartikler skal ikke gjenbrukes. De er kun for engangsbruk. Se brukermanualen for cobas 6800/8800 Systems for informasjon om riktig vedlikehold av instrumenter. Kjøre cobas HCV cobas HCV kan kjøres med to påkrevde prøvevolumer på 350 µl (for arbeidsflyten med 200 µl prøve) og 650 µl (for arbeidsflyten med 500 µl prøve). Testprosedyren beskrives i detalj i brukermanualen for cobas 6800/8800 Systems. Figur 1 nedenfor viser et sammendrag av prosedyren. Merk: Ikke bruk arbeidsflyten for 200 µl prøve hvis virusmengden forventes å være 100 IU/ml. Det bør tas tilstrekkelig med blod til at det blir mulig å bruke det anbefalte prosesseringsvolumet for EDTAplasma eller serum på 500 µl (for en total minimums prøvemengde på 650 µl). Figur 1 cobas HCV-testprosedyre Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 14

15 Resultater cobas 6800/8800 Systems beregner automatisk HCV-RNA-konsentrasjonen for prøver og kontroller. HCV-RNAkonsentrasjonen uttrykkes i internasjonale enheter per milliliter (IU/ml). Kvalitetskontroll og gyldighet av resultater En negativ kontroll [( ) C] og to positive kontroller, en lav positiv kontroll [HCV L(+)C] og en høy positiv kontroll [HCV H(+)C] behandles med hver analyseserie. Sjekk analyseseriens gyldighet i cobas 6800/8800-programvaren og/eller rapporten. Analyseserien er gyldig hvis det ikke vises noen flagg for noen av de tre kontrollene, som omfatter en negativ kontroll og to positive kontroller: HCV L(+)C, HCV H(+)C. Resultatet for den negative kontrollen vises som ( ) C, og resultatene for den lave og høye positive kontrollen vises som HxV L(+)C og HxV H(+)C. Resultatene gjøres automatisk ugyldige av cobas 6800/8800-programvaren hvis den negative og positive kontrollen ikke blir godkjent. Kontrollflagg Tabell 9 Kontrollflagg for negative og positive kontroller Negativ kontroll Flagg Resultat Tolkning ( ) C Q02 (Kontrollserie ikke godkjent) Invalid Positiv kontroll Flagg Resultat Tolkning HxV L(+)C HxV H(+)C Q02 (Kontrollserie ikke godkjent) Q02 (Kontrollserie ikke godkjent) Invalid Invalid Hvis analyseserien er ugyldig, må hele analyseserien, inkludert prøver og kontroller, testes på nytt. Et ugyldig resultat, eller det beregnede titerresultatet for den negative kontrollen er ikke negativt. Et ugyldig resultat eller beregnet titerresultat for den lave positive kontrollen er ikke innenfor akseptområdet. Et ugyldig resultat eller beregnet titerresultat for den høye positive kontrollen er ikke innenfor akseptområdet. HxV L(+)C står for cobas HBV/HCV/HIV-1 lav positiv kontroll, og HxV H(+)C står for cobas HBV/HCV/HIV-1 høy positiv kontroll i cobas 6800/8800-programvaren. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 15

16 Tolkning av resultater For en gyldig analyseserie, sjekk hver enkelt prøve for flagg i cobas 6800/8800-programvaren eller rapporten. Resultatene skal tolkes på følgende måte: En gyldig analyseserie kan omfatte både gyldige og ugyldige prøveresultater. Tabell 10 Målresultater for tolkning av individuelle målresultater Resultater Tolkning Target Not Detected HCV-RNA ikke detektert. Rapporter resultatene som "HCV ikke detektert". < Titer Min Beregnet titer er under analysens nedre kvantiteringsgrense (LLoQ). Rapporter resultatene som "HCV detektert, mindre enn (Titer Min)" Titer min = 15 IU/ml (500 µl) Titer min = 40 IU/ml (200 µl) Titer Beregnet titer er innenfor analysens linearitetsområde større enn eller lik Titer Min og mindre enn eller lik Titer Max. Rapporter resultatene som "(Titer) HCV detektert". > Titer Max a Beregnet titer er over analysens øvre kvantiteringsgrense (ULoQ). Rapporter resultatene som "HCV detektert, større enn (Titer Max)" Titer Max = 1,00E+08 IU/ml (500 µl og 200 µl) a Prøveresultat "> Titer Max" henviser til HCV-positive prøver som er detektert med titre over den øvre kvantiteringsgrensen (ULoQ). Hvis et kvantitativt resultat er ønskelig, må originalprøven fortynnes med HCV-negativt EDTA-plasma eller serum, avhengig av typen originalprøve, og analysen må gjentas. Multipliser det rapporterte resultatet med fortynningsfaktoren. Testens begrensninger cobas HCV er kun evaluert for bruk i kombinasjon med cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit, cobas NHP Negative Control Kit, cobas omni MGP Reagent, cobas omni Lysis Reagent, cobas omni Specimen Diluent og cobas omni Wash Reagent for bruk på cobas 6800/8800 Systems. Pålitelige resultater avhenger av riktige prosedyrer for prøvetaking, oppbevaring og håndtering av prøver. Denne testen er kun validert for bruk med EDTA-plasma og serum. Testing av andre prøvematerialer kan føre til feil resultat. Kvantitering av HCV-RNA er avhengig av antall viruspartikler som er til stede i prøven, og kan påvirkes av prøvetakingsmetode, pasientfaktorer (dvs. alder, tilstedeværelse av symptomer) og/eller infeksjonsstadium. Selv om det er sjelden, kan mutasjoner innenfor høyt konserverte regioner av et virusgenom som cobas HCV er rettet mot, påvirke primer- og/eller probebinding, noe som kan føre til underkvantitering av viruset eller manglende evne til å detektere viruset. På grunn av iboende forskjeller mellom teknologier anbefales det at brukerne utfører metodekorrelasjonsstudier i laboratoriet for å bestemme de teknologiske forskjellene før en ny teknologi tas i bruk. Brukere skal følge arbeidsstedets egne retningslinjer/prosedyrer. cobas HCV er ikke beregnet for bruk som screeningtest for tilstedeværelse av HCV i blod eller blodprodukter. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 16

17 Vurdering av analytisk ytelse Viktige ytelsesegenskaper Deteksjonsgrense (LoD) WHO International Standard Deteksjonsgrensen for cobas HCV ble bestemt ved analyse av serielle fortynninger av WHO International Standard for Hepatitis C Virus RNA for Nucleic Acid Amplification Technology Assays (4. WHO International Standard) genotype 1a, anskaffet fra NIBSC, i HCV-negativt humant EDTA-plasma og serum ved bruk av prøveprosesseringsvolumer på 500 µl og 200 µl. Minimum prøvemengde var henholdsvis 650 µl og 350 µl L for prosessering på cobas 6800/8800 Systems. Paneler med seks konsentrasjonsnivåer pluss et negativt ble testet for et prøveprosesseringsvolum på 500 µl og sju konsentrasjonsnivåer for et prøveprosesseringsvolum på 200 µl over tre loter med cobas HCVtestreagenser, flere kjøringer, dager, brukere og instrumenter. Resultatene for EDTA-plasma og serum fra begge prøveprosesseringsvolumene vises i henholdsvis Tabell 11 og Tabell 14. Studien viste at cobas HCV detekterte HCV-RNA i en konsentrasjon på 8,46 IU/ml med et 95 % konfidensintervall på 7,50-9,79 IU/ml for prøveprosesseringsvolumet på 500 µl i EDTA-plasma, og i en konsentrasjon på 9,61 IU/ml med et 95 % konfidensintervall på 8,70-10,95 IU/ml for prøveprosesseringsvolumet på 500 µl i serum. Studien viste at cobas HCV detekterte HCV-RNA i en konsentrasjon på 24,93 IU/ml med et 95 % konfidensintervall på 22,51-28,35 IU/ml for prøveprosesseringsvolumet på 200 µl i EDTA-plasma, og i en konsentrasjon på 33,25 IU/ml med et 95 % konfidensintervall på 29,94-37,94 IU/ml for prøveprosesseringsvolumet på 200 µl i serum. Differansen mellom EDTA-plasma og serum ved bruk av prøveprosesseringsvolumer på 500 µl og 200 µl var ikke statistisk signifikant. Tabell 11 Deteksjonsgrense i EDTA-plasma (500 µl) Innmatet titerkonsentrasjon (HCV-RNA IU/ml) Antall gyldige replikater Antall positive Treffrate i % , , , , , , * 0,53 LoD med PROBIT ved 95 % treffrate *Prøver som ble bekreftet negative med alternative analysemetoder. 8,46 IU/ml 95 % konfidensintervall: 7,50 9,79 IU/ml Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 17

18 Tabell 12 Deteksjonsgrense i serum (500 µl) Innmatet titerkonsentrasjon (HCV-RNA IU/ml) Antall gyldige replikater Antall positive Treffrate i % , , , , , , ,00 LoD med PROBIT ved 95 % treffrate 9,61 IU/ml 95 % konfidensintervall: 8,70 10,95 IU/ml Tabell 13 Deteksjonsgrense i EDTA-plasma (200 µl) Innmatet titerkonsentrasjon (HCV-RNA IU/ml) Antall gyldige replikater Antall positive Treffrate i % , , , , , , , * 0,53 LoD med PROBIT ved 95 % treffrate *Prøver som ble bekreftet negative med alternative analysemetoder. 24,93 IU/ml 95 % konfidensområde: 22,51-28,35 IU/ml Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 18

19 Tabell 14 Deteksjonsgrense i serum (200 µl) Innmatet titerkonsentrasjon Antall gyldige replikater Antall positive Treffrate i % (HCV-RNA IU/ml) , , , , , , , ,00 LoD med PROBIT ved 95 % treffrate Lineært område 33,25 IU/ml 95 % konfidensintervall: 29,94 37,94 IU/ml Linearitetsstudien for cobas HCV ble utført med en fortynningsserie som besto av 16 panelprøver som dekket det tiltenkte linearitetsområdet for den dominerende genotypen (GT 1). Høytitrede panelprøver ble klargjort fra høytitret pansret RNA-materiale (arrna), mens de lavtitrede panelprøvene ble klargjort fra en klinisk prøve (CS, clinical sample). Linearitetspanelet var utformet for å ha en omtrentlig overlapping på 2 log 10 titer mellom de to materialekildene. Det forventede linearitetsområdet for cobas HCV er fra LLoQ (15 IU/ml prosesseringsvolumer på 500 µl og 40 IU/ml i prosesseringsvolumer på 200 µl) til ULoQ (1,00E+08 IU/ml i begge prosesseringsvolumene). Linearitetspanelet var utformet for å dekke et konsentrasjonsnivå under LLoQ (f.eks. 7,5 IU/ml) til et konsentrasjonsnivå over ULoQ (f.eks. 2,0E+08 IU/ml) og inkludere medisinske beslutningspunkter. I tillegg var linearitetspanelet utformet til delvis å støtte trinn på 1,0 log 10 gjennom hele linearitetsområdet. For hver panelprøve var den nominelle konsentrasjonen i IU/ml og kilden for HCV-RNA angitt. Med et prosesseringsvolum på 500 µl er cobas HCV lineær for EDTA-plasma og serum fra 15 IU/ml til 1,00E+08 IU/ml og viser et absolutt avvik fra den bedre tilpassede lineære regresjonen på mindre enn ± 0,24 log 10. Over linearitetsområdet er testens nøyaktighet innenfor ± 0,24 log 10. Med et prosesseringsvolum på 200 µl er cobas HCV lineær for EDTA-plasma og serum fra 40 IU/ml til 1,00E+08 IU/ml og viser et absolutt avvik fra den bedre tilpassede lineære regresjonen på mindre enn ± 0,24 log 10. Over linearitetsområdet er testens nøyaktighet innenfor ± 0,24 log 10 i plasma og ± 0,27 log 10 i serum. Se Figur 2 til Figur 5 for representative resultater. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 19

20 Figur 2 Linearitet i EDTA-plasma (500 µl) Observert Log-titer [konsentrasjonsenheter] Observasjoner I det spesifiserte området Regresjonslinje Kubemodell Øvre avviksgrense Nedre avviksgrense Tilordnet Log-titer [konsentrasjonsenheter] Figur 3 Linearitet i serum (500 µl) Observert Log-titer [konsentrasjonsenheter] Observasjoner I det spesifiserte området Regresjonslinje Kubemodell Øvre avviksgrense Nedre avviksgrense Tilordnet Log-titer [konsentrasjonsenheter] Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 20

21 Figur 4 Linearitet i EDTA-plasma (200 µl) Observert Log-titer [konsentrasjonsenheter] Observasjoner I det spesifiserte området Regresjonslinje Kubemodell Øvre avviksgrense Nedre avviksgrense Tilordnet Log-titer [konsentrasjonsenheter] Figur 5 Linearitet i serum (200 µl) Observert Log-titer [konsentrasjonsenheter] Observasjoner I det spesifiserte området Regresjonslinje Kubemodell Øvre avviksgrense Nedre avviksgrense Tilordnet Log-titer [konsentrasjonsenheter] Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 21

22 Presisjon innen laboratoriet Presisjonen for cobas HCV ble bestemt ved å analysere serielle fortynninger av kliniske HCV-prøver (genotype 1) (CS) eller av pansret HCV-RNA (arrna) i HCV-negativt EDTA-plasma eller i serum. 13 fortynningsnivåer ble testet i plasma, og 12 nivåer ble testet i serum i to replikater for hvert nivå i to kjøringer i løpet av 12 dager, noe som gav til sammen 48 replikater per konsentrasjon. Hver prøve ble kjørt gjennom hele cobas HCV-testprosedyren på et helautomatisk cobas 6800/8800 System. Derfor representerer presisjonen som er vist her, alle aspekter av testprosedyren. Studien ble utført med tre lot av cobas HCV-testreagenser. Resultatene vises i Tabell 15 til Tabell 18. cobas HCV viste høy presisjon for tre lot med reagenser som ble testet over et konsentrasjonsområde på 1,00E+01 IU/ml til 1,0E+07 IU/ml med et prøveprosesseringsvolum på 500 µl og 2,50E+01 IU/ml til 1,0E+07 IU/ml med et prøveprosesseringsvolum på 200 µl. Tabell 15 Presisjon innen laboratoriet for cobas HCV (EDTA-plasmaprøver prosesseringsvolum på 500 µl)* Nominell konsentrasjon (IU/ml) Tilordnet konsentrasjon (IU/ml) Kildemateriale EDTA-plasma Lot 1 Lot 2 Lot 3 Alle lot SD SD SD Sammenslåtte SD 1,00E+07 1,67E+07 arrna 0,04 0,05 0,03 0,04 1,00E+06 1,67E+06 arrna 0,05 0,05 0,06 0,05 4,00E+05 6,69E+05 arrna 0,03 0,04 0,05 0,04 5,00E+04 6,69E+04 CS 0,08 0,06 0,06 0,06 1,00E+04 1,67E+04 arrna 0,05 0,05 0,04 0,05 1,00E+04 1,34E+04 CS 0,03 0,06 0,05 0,05 4,00E+03 6,69E+03 arrna 0,05 0,06 0,06 0,06 1,00E+03 1,34E+03 CS 0,05 0,06 0,05 0,05 1,00E+03 1,67E+03 arrna 0,05 0,07 0,05 0,06 1,00E+02 1,34E+02 CS 0,06 0,09 0,05 0,07 1,00E+02 1,67E+02 arrna 0,10 0,06 0,06 0,08 5,00E+01 6,69E+01 CS 0,09 0,17 0,10 0,13 1,00E+01 1,34E+01 CS 0,26 0,21 0,13 0,21 * Titerresultater anses å være log-normalfordelt og er analysert etter log 10 -transformering. Kolonnene SD (standardavvik) viser totalt log-transformert titer for hver av de tre reagenslotene. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 22

23 Tabell 16 Presisjon innen laboratoriet for cobas HCV (serumprøver prosesseringsvolum på 500 µl)* Nominell konsentrasjon (IU/ml) Tilordnet konsentrasjon (IU/ml) Kildemateriale Serum Lot 1 Lot 2 Lot 3 Alle lot SD SD SD Sammenslåtte SD 1,00E+07 1,92E+07 arrna 0,03 0,07 0,04 0,05 1,00E+06 1,92E+06 arrna 0,05 0,06 0,04 0,05 4,00E+05 7,69E+05 arrna 0,03 0,07 0,03 0,05 5,00E+04 4,05E+04 CS 0,07 0,06 0,04 0,06 1,00E+04 1,92E+04 arrna 0,06 0,06 0,04 0,05 1,00E+04 8,11E+03 CS 0,05 0,06 0,04 0,05 4,00E+03 7,69E+03 arrna 0,04 0,08 0,04 0,06 1,00E+03 8,11E+02 CS 0,05 0,06 0,06 0,05 1,00E+03 1,92E+03 arrna 0,06 0,05 0,05 0,05 1,00E+02 8,11E+01 CS 0,10 0,18 0,10 0,13 1,00E+02 1,92E+02 arrna 0,07 0,08 0,09 0,08 5,00E+01 4,05E+01 CS 0,09 0,14 0,18 0,14 * Titerresultater anses å være log-normalfordelt og er analysert etter log 10 -transformering. Kolonnene SD (standardavvik) viser totalt log-transformert titer for hver av de tre reagenslotene. Tabell 17 Presisjon innen laboratoriet for cobas HCV (EDTA-plasma prosesseringsvolum på 200 µl)* EDTA-plasma Nominell konsentrasjon (IU/ml) Tilordnet konsentrasjon (IU/ml) Kildemateriale Lot 1 Lot 2 Lot 3 Alle lot SD SD SD Sammenslåtte SD 1,00E+07 1,67E+07 arrna 0,04 0,06 0,05 0,05 1,00E+06 1,67E+06 arrna 0,04 0,03 0,05 0,04 4,00E+05 6,69E+05 arrna 0,04 0,06 0,03 0,04 5,00E+04 6,69E+04 CS 0,05 0,06 0,05 0,06 1,00E+04 1,67E+04 arrna 0,05 0,05 0,05 0,05 1,00E+04 1,34E+04 CS 0,07 0,06 0,05 0,06 4,00E+03 6,69E+03 arrna 0,05 0,06 0,05 0,05 1,00E+03 1,34E+03 CS 0,08 0,08 0,06 0,07 1,00E+03 1,67E+03 arrna 0,04 0,07 0,05 0,05 1,00E+02 1,34E+02 CS 0,11 0,15 0,13 0,13 1,00E+02 1,67E+02 arrna 0,10 0,10 0,13 0,11 7,50E+01 1,00E+02 CS 0,15 0,12 0,11 0,13 2,50E+01 3,34E+01 CS 0,19 0,20 0,22 0,21 * Titerresultater anses å være log-normalfordelt og er analysert etter log 10 -transformering. Kolonnene SD (standardavvik) viser totalt log-transformert titer for hver av de tre reagenslotene. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 23

24 Tabell 18 Presisjon innen laboratoriet for cobas HCV (serum prosesseringsvolum på 200 µl)* Nominell konsentrasjon (IU/ml) Tilordnet konsentrasjon (IU/ml) Kildemateriale Serum Lot 1 Lot 2 Lot 3 Alle lot SD SD SD Sammenslåtte SD 1,00E+07 1,92E+07 arrna 0,02 0,06 0,03 0,04 1,00E+06 1,92E+06 arrna 0,03 0,06 0,04 0,04 4,00E+05 7,69E+05 arrna 0,04 0,09 0,04 0,06 5,00E+04 4,05E+04 CS 0,05 0,06 0,06 0,06 1,00E+04 1,92E+04 arrna 0,05 0,07 0,04 0,06 1,00E+04 8,11E+03 CS 0,04 0,05 0,05 0,05 4,00E+03 7,69E+03 arrna 0,04 0,07 0,04 0,05 1,00E+03 8,11E+02 CS 0,10 0,09 0,08 0,09 1,00E+03 1,92E+03 arrna 0,05 0,07 0,04 0,05 1,00E+02 8,11E+01 CS 0,17 0,30 0,17 0,22 1,00E+02 1,92E+02 arrna 0,13 0,13 0,09 0,12 7,50E+01 6,08E+01 CS 0,11 0,16 0,12 0,13 * Titerresultater anses å være log-normalfordelt og er analysert etter log 10 -transformering. Kolonnene SD (standardavvik) viser totalt log-transformert titer for hver av de tre reagenslotene. Verifisering av genotype Ytelsen til cobas HCV for HCV-genotyper ble evaluert ved: Bestemmelse av deteksjonsgrensen for genotyper 1b til 6 testet i prøveprosesseringsvolum på 500 µl Verifisering av deteksjonsgrensen for genotyper 1b til 6 testet i prøveprosesseringsvolum på 200 µl Verifisering av lineariteten for genotype 2 til 6 Deteksjonsgrense for genotype 1b til 6 Deteksjonsgrensen for cobas HCV for genotype 1b til 6 ble bestemt ved å analysere serielle fortynninger fra hver genotype i HCV-negativt humant EDTA-plasma og serum ved bruk av prøveprosesseringsvolumer på 500 µl. Paneler med seks konsentrasjonsnivåer pluss en negativ ble testet ved å bruke tre lot med cobas HCV-testreagenser, over flere kjøringer, dager, brukere og instrumenter. Resultatene for EDTA-plasma og serum for prøveprosesseringsvolum på 500 µl vises i henholdsvis Tabell 19 og Tabell 20. Studien viste at cobas HCV detekterte alle HCV-genotyper som ble testet med en lignende LoD, som HCV-genotype 1a. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 24

25 Tabell 19 Deteksjonsgrense i EDTA-plasma (500 µl) for HCV-RNA-genotype Genotype 95 % LoD med Probit 95 % konfidensintervall GT 1b 11,32 IU/ml 9,72 14,52 IU/ml GT 2 9,10 IU/ml 7,83 11,80 IU/ml GT 3 8,68 IU/ml 7,30 11,51 IU/ml GT 4 12,78 IU/ml 10,69 17,20 IU/ml GT 5 11,63 IU/ml 9,66 15,98 IU/ml GT 6 12,58 IU/ml 9,78 20,10 IU/ml Tabell 20 Deteksjonsgrense i serum (500 µl) for HCV-RNA-genotype Genotype 95 % LoD med Probit 95 % konfidensintervall GT 1b 15,24 IU/ml 12,40 21,58 IU/ml GT 2 12,51 IU/ml 10,25 17,63 IU/ml GT 3 7,21 IU/ml 6,10 9,50 IU/ml GT 4 11,62 IU/ml 9,92 15,02 IU/ml GT 5 13,06 IU/ml 10,64 18,68 IU/ml GT 6 11,15 IU/ml 9,54 14,40 IU/ml Verifisering av deteksjonsgrense for genotype 1b til 6 Kliniske HCV-RNA-prøver for seks ulike genotyper (1b, 2, 3, 4, 5, 6) ble fortynnet til tre ulike konsentrasjonsnivåer i EDTA-plasma og serum. Treffraten ble bestemt med 63 replikater for hvert nivå. Testingen ble utført med tre lot av cobas HCV-reagenser. Resultatene fra EDTA-plasma og serum ved bruk av 200 µl vises i Tabell 21 og Tabell 22. Disse resultatene bekrefter at cobas HCV detekterte HCV-RNA for de seks ulike genotypene i konsentrasjoner på 33 IU/ml med en treffrate på 90,5 % med et ensidig øvre 95 % konfidensintervall på 95,8 %. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 25

26 Tabell 21 Verifisering av deteksjonsgrense i EDTA-plasma (200 µl) for HCV-RNA-genotype 17,5 IU/ml 33 IU/ml 50 IU/ml Antall Treffrate Antall Treffrate Antall Treffrate gyldige Antall i % gyldige Antall i % gyldige Antall i % Genotype replikater positive (95 % KI*) replikater positive (95 % KI*) replikater positive (95 % KI*) 1b , , , , , , , , , , , , , , , , , ,4 * Ensidig øvre 95 % konfidensintervall Tabell 22 Verifisering av deteksjonsgrense i serum (200 µl) for HCV-RNA-genotype 17,5 IU/ml 33 IU/ml 50 IU/ml Antall Treffrate Antall Treffrate Antall Treffrate gyldige Antall i % gyldige Antall i % gyldige Antall i % Genotype replikater positive (95 % KI*) replikater positive (95 % KI*) replikater positive (95 % KI*) 1b , , , , , , , , , , , , , , , , , ,8 * Ensidig øvre 95 % konfidensintervall Linearitet for genotype 2 til 6 Fortynningsserien som ble brukt ved verifisering av genotypelinearitetsstudien for cobas HCV, besto av ni panelprøver over hele det tiltenkte linearitetsområdet. Høytitrede panelprøver ble klargjort fra høytitret arrna-materiale, mens de lavtitrede panelprøvene ble fremstilt fra en høytitret klinisk prøve (CS). Linearitetspanelet var utformet for å ha en omtrentlig overlapping på 2 log 10 titer mellom de to materialekildene. Linearitetsområdet for cobas HCV dekket området fra LLoQ (15 IU/ml for et prøveprosesseringsvolum på 500 µl, 40 IU/ml for et prosesseringsvolum på 200 µl) til ULoQ (1,00E+08 IU/ml for begge prosesseringsvolumene) og inkluderte minst ett medisinsk beslutningspunkt. Testingen ble utført med tre lot av cobas HCV-reagenser. 15 replikater per nivå ble testet i EDTA-plasma. Lineariteten innenfor linearitetsområdet for cobas HCV ble verifisert for alle de fem genotypene (2, 3, 4, 5 og 6). Det maksimale avviket mellom den lineære regresjonen og den bedre tilpassede ikke-lineære regresjonen var lik eller mindre enn 0,24 log 10. Spesifisitet Spesifisiteten for cobas HCV ble bestemt ved å analysere HCV-negative EDTA-plasma- og serumprøver fra individuelle donorer. 300 individuelle EDTA-plasmaprøver og 300 individuelle serumprøver (600 resultater totalt) ble testet med to lot av cobas HCV-reagenser. Alle prøvene testet negativt for HCV-RNA. I testpanelet var spesifisiteten for cobas HCV 100 % (95 % konfidensgrense: 99,5 %). Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 26

27 Analytisk spesifisitet Den analytiske spesifisiteten for cobas HCV ble evaluert ved å fortynne et panel med mikroorganismer med HCV- RNA-positivt og HCV-RNA-negativt EDTA-plasma. Mikroorganismene ble tilsatt i normalt, virusnegativt humant EDTA-plasma og testet med og uten HCV-RNA. Det ble oppnådd negative resultater med cobas HCV for alle mikroorganismeprøver uten HCV-målet, og det ble oppnådd positive resultater for alle mikroorganismeprøver med HCV-målet. I tillegg var gjennomsnittlig log 10 titer for hver av de positive HCV-prøvene som inneholdt potensielt kryssreagerende organismer, innenfor ± 0,3 log 10 av gjennomsnittlig log 10 titer for den respektive spikede positive kontrollen. Tabell 23 Mikroorganismer som ble testet for kryssreaktivitet Virus Bakterier Gjærsopp Adenovirus type 5 West Nile-virus Propionibacterium acnes Candida albicans Cytomegalovirus St. Louis-encefalittvirus Staphylococcus aureus Epstein-Barr-virus Murray Valley-encefalittvirus Hepatitt A-virus Dengue-virus type 1, 2, 3 og 4 Hepatitt B-virus Hepatitt D-virus FSME-virus (stamme HYPR) Gulfeber-virus Humant immunsviktvirus 1 Humant herpesvirus, type 6 Humant T-celle lymfotropt virus type 1 og 2 Herpes simplex-virus type 1 og 2 Humant papillomavirus Varicella-Zoster-virus Influensa A-virus Zika-virus Analytisk spesifisitet interfererende substanser Forhøyede nivåer av triglycerider (34,5 g/l), konjugert bilirubin (0,25 g/l), ukonjugert bilirubin (0,25 g/l), albumin (58,7 g/l), hemoglobin (2,9 g/l) og humant DNA (2 mg/l) i prøver ble testet ved nærvær og fravær av HCV-RNA. De testede endogene interfererende substansene viste seg ikke å interferere med testens ytelse for cobas HCV. I tillegg ble det testet for tilstedeværelse av autoimmune sykdommer som systemisk lupus erythematosus (SLE), revmatoid faktor (RF) og antinukleært antistoff (ANA). Med hensyn til sensitivitet, viste individuelle prøver for to SLE-donorer, én RF-donor og fire ANA-donorer interferens med cobas HCV. En undersøkelse av den underliggende årsaken viste at testen overvant interferensen fra de aktuelle SLE- og RF-donorprøvene da de ble testet ved tilstedeværelse av 75 IU/ml HCV-RNA. De fire ANA-donorprøvene som viste interferens med cobas HCV da de ble testet med 50 IU/ml HCV-RNA, viste også interferens da de ble testet med 75 IU/ml HCV-RNA. For å vurdere om den observerte interferensen var ANAspesifikk eller donorspesifikk, ble ytterligere 15 ANA-donorer testet ved tilstedeværelse av 50 IU/ml og 75 IU/ml HCV-RNA. Ingen av de testede konsentrasjonene av de ekstra donorprøvene viste noen interferens med cobas HCV med hensyn til sensitivitet/kvantitering. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 27

28 I tillegg ble legemiddelkomponentene som er oppført i Tabell 24, testet ved tre ganger C max. Det ble vist at alle de testede legemiddelkomponentene ikke interfererer med spesifisitet og kvantitering av HCV-RNA med cobas HCV. Alle potensielt interfererende substanser har vist seg ikke å interferere med testens ytelse. Det ble oppnådd negative resultater med cobas HCV for alle prøver uten HCV-målet, og det ble oppnådd positive resultater for alle prøver med HCV-målet. I tillegg var gjennomsnittlig log 10 titer for hver av de positive HCV-prøvene som inneholdt potensielt interfererende substanser, innenfor ± 0,3 log 10 av gjennomsnittlig log 10 titer for den respektive spikede positive kontrollen. Tabell 24 Legemiddelkomponenter som ble testet for interferens med kvantitering av HCV-RNA med cobas HCV Legemiddelklasse Immunmodulator HIV-oppstartshemmere Peginterferon -2a Peginterferon -2b Ribavirin Maraviroc Generisk legemiddelnavn HIV-integrasehemmer Elvitegravir/kobicistat Raltegravir Ikke-nukleosid HIV revers transkriptasehemmer Efavirenz Etravirin Nevirapin Rilpivirin HIV proteasehemmere Atazanavir Lopinavir Tipranavir Darunavir Fosamprenavir Nelfinavir Ritonavir Saquinavir HCV proteasehemmere Bokeprevir Telaprevir Revers transkriptase- eller DNApolymerasehemmer Preparater for behandling av opportunistiske infeksjoner Simeprevir Abacavir Emtricitabin Entecavir Foscarnet Cidofovir Lamivudin Telbivudin Azithromycin Clarithromycin Etambutol Flukonazol Isoniazid Tenofovir Adefovir dipivoxil Zidovudin Aciclovir Valganciklovir Ganciklovir Sofosbuvir Pyrazinamid Rifabutin Rifampicin Sulfametoksazol Trimetoprim Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 28

29 Metodekorrelasjon Vurdering av ytelsen til cobas HCV sammenlignet med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV kvantitativ test, v2.0 Ytelsen til cobas HCV og COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV kvantitativ test, v2.0 (TaqMan HCV Test, v2.0) ble sammenlignet ved å analysere serum- og EDTA-plasmaprøver fra HCV-smittede pasienter. Totalt 149 EDTA-plasmaprøver og 122 serumprøver over alle HCV-genotyper, som ble analysert i duplikat, var gyldige og innenfor kvantiteringsområdet for begge testene. Deming-regresjonsanalyse ble utført. Gjennomsnittlig titeravvik fra prøvene som ble analysert med de to testene, var 0,02 log 10 (95 % konfidensintervall: 0,00; 0,04). Resultatene av Deming-regresjonsanalysen vises i Figur 6. Symbolet i Figur 6 indikerer enkeltbestemmelse. Figur 6 Regresjonsanalyse av cobas HCV sammenlignet med TaqMan HCV-testen, v2.0, EDTA-plasmaprøver og serumprøver Gjennomsnittlig Log10 Titer cobas HCV y=1,07x - 0,24 R 2 = 0,99 Genotype Linjer n/a Deming-regresjonslinje Gjennomsnittlig Log10 Titer COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 29

30 Matriksekvivalens EDTA-plasma sammenlignet med serum 190 parede EDTA-plasmaprøver og serumprøver ble analysert for matriksekvivalens. Av disse var 73 parede prøver HCV-positive prøver. De HCV-positive prøvene dekket genotype 1-4 over hele linearitetsområdet. Gjennomsnittlig titeravvik som ble målt for de matchende EDTA-plasmaprøvene og serumprøvene, var -0,13 log 10 (95 % konfidensintervall: -0,19; -0,07) (Figur 7). Figur 7 Matriksekvivalensytelse mellom EDTA-plasma og serum Log10 Titer cobas HCV-serum y=0,99x - 0,08 R 2 = 0,96 Genotype Linjer n/a Deming-regresjonslinje Log10 Titer cobas HCV-matchet plasma Systemfeil Systemfeilfrekvensen ble bestemt for cobas HCV ved å teste 100 replikater av EDTA-plasma og 100 replikater av serum tilsatt HCV-målet. Disse prøvene ble testet i en målkonsentrasjon på ca. 3 x LoD. Resultatene av denne studien fastslo at alle replikater var gyldige og positive for HCV, noe som gav en systemfeilfrekvens på 0 %. Det tosidige, eksakte 95 % konfidensintervallet var 0 % for nedre grense og 3,62 % for øvre grense for hver matriks [0 %: 3,62 %]. Krysskontaminering Krysskontamineringsfrekvensen for cobas HCV ble bestemt ved å teste 240 replikater av en normal, virusnegativ (HIV, HCV og HBV) human EDTA-plasmaprøve og 225 replikater av en høytitret HCV-prøve på 4,0E+07 IU/ml. Det ble til sammen utført fem analyseserier med positive og negative prøver i en sjakkbrettkonfigurasjon. 239 av 240 replikater av de negative prøvene var gyldige og detekterte negativt, noe som gav en krysskontamineringsfrekvens på 0,42 %. Det tosidige, eksakte 95 % konfidensintervallet var 0,01 % for nedre grense og 2,3 % for øvre grense [0 %: 2,3 %]. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 30

31 Tilleggsinformasjon Viktigste analysefunksjoner Prøvetype EDTA-plasma, serum Minimum prøvemengde som kreves 650 µl eller 350 µl Prøveprosesseringsvolum 500 µl eller 200 µl Analytisk sensitivitet Lineært område 15 IU/ml (500 µl) 40 IU/ml (200 µl) 500 µl: 15 IU/ml 1,0E+08 IU/ml 200 µl: 40 IU/ml 1,0E+08 IU/ml Spesifisitet 100 % (ensidig 95 % konfidensintervall: 99,5 %) Genotyper detektert HCV-genotyper 1-6 Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 31

32 Symboler Følgende symboler brukes ved merking for Roche PCR-diagnostiske produkter. Tabell 25 Symboler brukt ved merking av Roche PCR-diagnostiske produkter Tilleggsprogramvare In-Vitro-diagnostisk medisinsk utstyr Autorisert representant i EF Nedre grense for akseptområdet Strekkodedataark Produsent Lotnummer Oppbevares på et mørkt sted Biologisk risiko Inneholder tilstrekkelig til <n> tester Katalognummer Temperaturbegrensning Vennligst se brukerveiledningen Testdefinisjonsfil Innhold i kitet Øvre grense for akseptområdet Distribuert av Utløpsdato Kun for evaluering av IVD-ytelse Globalt handelsnummer Dette produktet innfrir kravene til Europaparlamentets Rådsdirektiv 98/79/ EF om in vitro-diagnostisk medisinsk utstyr. Teknisk support for kunder i USA Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 32

33 Produsent og distributører Tabell 26 Produsent og distributører Produsert i USA Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse Mannheim, Germany Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 201, boulevard Armand-Frappier 6343 Rotkreuz, Switzerland H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Roche Diagnostics GmbH Pour toute assistance technique, Sandhofer Strasse 116 appeler le: ) Mannheim, Germany Roche Diagnostics Roche Diagnostics, SL 2, Avenue du Vercors Avda. Generalitat, Meylan, France E Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Roche Diagnostica Brasil Ltda. Viale G. B. Stucchi 110 Av. Engenheiro Billings, Monza, Milano, Italy Jaguaré, Building São Paulo, SP Brazil Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, Amadora, Portugal Varemerker og patenter Se Copyright 2016 Roche Molecular Systems, Inc. Doc Rev. 2.0 (Mfg-US) 33