(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. C12N 1/82 (06.01) A01H /00 (06.01) C12N 9/02 (06.01) C12N 1/3 (06.01) C12P 7/64 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato () Prioritet , EP, , EP, (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK SM TR (73) Innehaver BASF Plant Science GmbH,, 6706 Ludwigshafen, Tyskland (72) Oppfinner NAPIER, Johnathan A., The WildernessButchers Lane, Preston Hertfordshire SG4 7TR, Storbritannia SENGER, Toralf, Emmendiger Weg 7,, Heidelberg, Tyskland BAUER, Jörg, Maxburgstrasse 6, Limburgerhof, Tyskland (74) Fullmektig Bryn Aarflot AS, Postboks 449 Sentrum, 04 OSLO, Norge (4) Benevnelse Desaturaser og fremgangsmåte for fremstilling av polyumettede fettsyrer i transgene organismer (6) Anførte publikasjoner US-A , WO-A-07/093776, WO-A1-08/49 ABBADI A ET AL: "Biosynthesis of very-long-chain polyunsaturated fatty acids in transgenic oilseeds: Constraints on their accumulation" PLANT CELL, AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS, ROCKVILLE, MD, US, vol. 16, no., 1 October 04 (04--01), pages , XP ISSN: DATABASE EMBL 8 July 08 ( ), Lucas, S. et al.: "CCBO422.b1 CCBO Cochliobolus heterostrophus, Chet minimal Cochliobolus heterostrophus cdna clone CCBO422 ', mrna sequence" XP retrieved from EBI Database accession no. FK NAPIER J A ET AL: "Progress towards the production of very long-chain polyunsaturated fatty acid in transgenic plants: Plant metabolic engineering comes of age" PHYSIOLOGIA PLANTARUM MARCH 06 BLACKWELL PUBLISHING LTD GB, vol. 126, no. 3, March 06 (06-03), pages , XP SINGH S P ET AL: "Metabolic engineering of new fatty acids in plants" CURRENT OPINION IN PLANT BIOLOGY, QUADRANT SUBSCRIPTION SERVICES, GB, vol. 8, no. 2, 1 April 0 ( ), pages 197-3, XP ISSN: UTTARO ANTONIO D: "Biosynthesis of polyunsaturated fatty acids in lower eukaryotes" IUBMB LIFE,, vol. 8, no., 1 October 06 (06--01), pages 63-71, XP

2 1 Beskrivelse Den foreliggende oppfinnelse vedrører polynukleotider fra Cochliobolus heterostrophus C, Cyanotehece Sp. CCY01, Mycocentrospora acerina og Hyaloperonospora parasitica, som koder for desaturase, og som kan anvendes for den rekombinante fremstilling av polyumettede fettsyrer. Oppfinnelsen vedrører videre vektorer, vertsceller og transgene ikke-humane organismer som omfatter polynukleotidene i henhold til oppfinnelsen, og vedrører polypeptidene som kodet for av polynukleotidene. Oppfinnelsen vedrører videre antistoffer mot polypeptidene ifølge oppfinnelsen. Endelig vedrører også oppfinnelsen fremstillingsprosesser for de polyumettede fettsyrer og for olje, lipid og fettsyresammensetninger og deres anvendelse som legemidler, kosmetika, næringsmidler, fôrstoff, foretrukket fiskefôr, eller kosttilskudd. 1 Fettsyrer og triacylglyserider har en rekke anvendelser innen næringsmiddelindustrien, i forbindelse med dyrefôr, kosmetika og innen den farmakologiske sektor. Avhengig av om de er frie mettede eller umettede fettsyrer, eller triacylglyserider med et økt innhold av mettede eller umettede fettsyrer, passer de for svært forskjellige anvendelser. Polyumettede fettsyrer slik som linolsyre og linolensyre er essensielle for pattedyr, da de ikke kan produseres som sådan av pattedyrene. Polyumettede 3- fettsyrer og 6-fettsyrer er derfor en viktig bestanddel i ernæring for mennesker og dyr. Polyumettede langkjede 3-fettsyrer så som eikosapentaensyre (= EPA, 2 C:,8,11,14,17 ) eller dokosaheksaensyre (= DHA, C22:6 4,7,,13,16,19 ) er viktige komponenter i human ernæring på grunn av deres ulike roller i helseaspekter som inkluderer utviklingen av barnehjernen, øynenes funksjonalitet, syntese av hormoner og andre signalsubstanser, og forebygging av kardiovaskulære lidelser, cancer og diabetes (Poulos, A Lipids :1-14, 199; Horrocks, LA og Yeo YK Pharmacol Res 40:211-22, 1999). Dette er grunnen til at der er en etterspørsel etter produksjon av polyumettede langkjede fettsyrer. 3 3-fettsyrer som man foretrukket finner i fiskeoljer, er særlig viktig i mat. Polyumettede fettsyrer slik som dokosaheksaensyre (= DHA, C22:6 4,7,,13,16,19 ) eller eikosapentaensyre (= EPA, C:,8,11,14,17 ) blir således f.eks. tilsatt til morsmelkerstatninger for å forbedre næringsverdien. Den umettede fettsyren DHA sies å ha en positiv effekt på utvikling og opprettholdelse av hjernefunksjoner.

3 2 Polyumettede fettsyrer omtales nedenfor som PUFA, PUFA er, LCPUFA eller LCPUFA er (polyumettede fettsyrer, PUFA, langkjedede polyumettede fettsyrer, LCPUFA). De forskjellige fettsyrer og triglyserider oppnås hovedsakelig fra mikroorganismer slik som Mortierella og og Schizochytrium eller fra oljeproduserende planter slik som soyabønne, rapsfrø, alger slik som Crypthecodinium eller Phaeodactylum og andre organismer, hvor de som regel oppnås i form av deres triacylglyserider (= triglyserider = triglyseroler). De kan imidlertid også oppnås fra dyr, slik som f.eks. fisk. De frie fettsyrene fremstilles fordelaktig ved hydrolyse. Svært langkjede polyumettede fettsyrer slik som DHA, EPA, arakidonsyre (= ARA, C:4,8,11,14 ), dihomo- - linolensyre (C:3 8,11,14 ) eller dokosapentaensyre (DPA, C22: 7,,13,16,19 ) syntetiseres ikke i oljeavlinger slik som rapsfrø, soyabønne, solsikke eller saflor. Konvensjonelle naturlige kilder for disse fettsyrer er fisk, slik som sild, laks, sardin, uer, ål, karpe, ørret, kveite, makrell, gjørs eller tunfisk, eller alger. 1 2 Avhengig av den tiltenkte anvendelsen er oljer med mettede eller umettede fettsyrer foretrukket. I ernæring for mennesker er f.eks. lipider med umettede fettsyrer, spesifikt polyumettede fettsyrer foretrukne. De polyumettede 3-fettsyrene sies å ha en positiv effekt på kolesterolnivået i blodet, og således på muligheten for å forebygge hjertesykdom. Risikoen for hjertesykdom, et slag eller hypertensjon kan markert nedsettes ved å tilsette disse 3-fettsyrene til mat. 3-fettsyrer har også en positiv effekt på inflammasjon, spesifikt på kroniske inflammatoriske prosesser forbundet med immunologiske sykdommer slik som reumatoid artritt. De tilsettes derfor til næringsmidler, spesifikt dietetiske ernæringsmidler, eller anvendes i medikamenter. 6-fettsyrer slik som arakidonsyre har en tendens til å ha en negativ effekt på disse lidelser i forbindelse med disse reumatiske sykdommer på grunn av vårt vanlige kostinntak og 6-fettsyrer er forløpere for vevshormoner, kjent som eikosanoider, slik som prostaglandinene, som er avledet fra dihomo- -linolensyre, arakidonsyre og eikosapentaensyre, og av tromboksanene og leukotrienene, som er avledet fra arakidonsyre og eikosapentaensyre. Eikosanoider som er dannet for 6-fettsyrer (kjent som PG 2 -seriene) fremmer generelt inflammatoriske reaksjoner, mens eikosanoider fra 3-fettsyrer (kjent som PG 3 -serier) har liten eller ingen proinflammatorisk effekt.

4 3 1 2 På grunn av deres positive egenskaper har der ikke tidligere manglet forsøk på å gjøre gener tilgjengelige som er involvert i syntesen av fettsyrer eller triglyserider for produksjon av oljer i forskjellige organismer med et modifisert innhold av umettede fettsyrer. WO 91/13972 og dens US-ekvivalent beskriver således en 9-desaturase. WO 93/1124 krever en 1-desaturase og WO 94/1116 en 12-desaturase. Ytterligere desaturaser er f.eks. beskrevet i EP-A , WO 94/18337, WO 97/82, WO 97/21340, WO 9/18222, EP-A-0 794, Stukey et al., J. Biol. Chem., 26, 1990: , Wada et al., Nature 347, 1990: 0-3 eller Huang et al., Lipids 34, 1999: Den biokjemiske karakterisering av de forskjellige desaturaser har imidlertid inntil nå vært ufullstendig, da enzymene, som er membranbundne proteiner, viser store problemer med hensyn til deres isolering og karakterisering (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: , Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: ). Som regel er membranbundne desaturaser kjennetegnet ved at de innføres i en passende organisme som deretter analyseres for enzymaktivitet ved å analysere utgangsmaterialene og produktene. 6- desaturaser er beskrevet i WO 93/06712, US , WO 96/222, WO 00/217 og WO 99/ Deres anvendelse for fremstilling av transgene organismer er f.eks. beskrevet i WO 98/46763, WO 98/46764 og WO 98/4676. I denne forbindelse er ekspresjonen av forskjellige desaturaser og dannelsen av polyumettede fettsyrer også beskrevet og patentsøkt, se f.eks. WO 99/6616 eller WO 98/ Med hensyn til ekspresjonseffektivitet av desaturaser og deres effekt på dannelsen av polyumettede fettsyrer, skal det bemerkes at ekspresjonen av en enkelt desaturase som til nå som beskrevet kun har resultert i lave innhold av umettede fettsyrer/lipider som f.eks. - linolensyre og stearidonsyre. En blanding av 3- og 6-fettsyrer ble dessuten som regel oppnådd. 3 Særlig passende mikroorganismer for fremstilling av PUFA er er mikroalger slik som Phaeodactylum tricornutum, Porphiridium-arter, Thraustochytrium-arter, Schizochytrium-arter eller Crypthecodinium-arter, ciliater slik som Stylonychia eller Colpidium, sopp slik som Mortierella, Entomophthora eller Mucor og/eller moser slik som Physcomitrella, foretrukket Physcomitrella patens, Ceratodon og Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 3-8; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22: 60-62; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry and Biotechnology 73: ). Stammeseleksjon har resultert i utviklingen av en rekke mutante stammer av de aktuelle mikroorganismene som produserer en rekke ønskelige forbindelser som inkluderer PUFA er. Mutasjon og seleksjon av stammer med en forbedret produksjon av et spesielt molekyl slik som de polyumettede fettsyrene, er

5 4 imidlertid en tidkrevende og vanskelig prosess. Dette er hvorfor rekombinante metoder som beskrevet ovenfor er foretrukne når det er mulig. Kun begrensede mengder av de ønskede polyumettede fettsyrene slik som DPA, EPA eller ARA kan imidlertid fremstilles ved hjelp av de ovennevnte mikroorganismene. Avhengig av den anvendte mikroorganismen, dannes disse dessuten generelt som fettsyreblandinger av f.eks. EPA, DPA og ARA. En rekke syntesespor er diskutert for syntesen av arakidonsyre, eikosapentaensyre (EPA) og dokosaheksaensyre (DHA). EPA eller DHA fremstilles således i marine bakterier slik som Vibrio sp. Eller Shewanella sp. via polyketidsporet (Yu, R. et al. Lipids 3: 61-64, 00; Takeyama, H. et al. Microbiology 143: , 1997). 1 En alternativ strategi er den alternerende aktiviteten av desaturaser og elongaser (Zank, T.K. et al. Plant Journal 31: 2-268, 02; Sakuradani, E. et al. Gene 238: 44-43, 1999). En modifikasjon av sporet beskrevet i Zank et al. og i Sakuradani et al. via 6-desaturase, 6-elongase, -desaturase, -elongase og 4-desaturase er Sprecher syntesesporet (Sprecher 00, Biochim. Biophys. Acta 1486: ) i pattedyr. I stedet for 4-avmetningen, kan et ytterligere forlengelsestrinn gjennomføres her til å gi C 24, etterfulgt av en ytterligere 6-avmetning og til slutt β- oksidasjon for å gi C 22 -kjedelengden. Det som er kjent som Sprecher syntesesporet er imidlertid ikke egnet for produksjon i planter og mikroorganismer, da de regulerende mekanismene ennå ikke er kjent. 2 Avhengig av deres avmetningsspor, kan de polyumettede fettsyrene oppdeles i to store grupper, henholdsvis 6- eller 3-fettsyrer, som er forskjellige med hensyn til deres metabolske og funksjonelle aktiviteter. Utgangsmaterialet for det 6- metabolske sporet er fettsyren linolsyre (18:2 9,12 ), mens 3-sporet går via linolensyre (18:3 9,12,1 ). Linolensyre dannes ved aktiviteten av en 1-desaturase (Tocher et al. 1998, Prog. Lipid Res. 37, ; Domergue et al. 02, Eur. J. Biochem. 269, ). Pattedyr, og således også mennesker, har ingen tilsvarende desaturaseaktivitet ( 12-3 og 1-desaturase) og må ta opp disse fettsyrer (essensielle fettsyrer) via mat. Ved å starte med disse forløpere, blir de fysiologisk viktige polyumettede fettsyrene arakidonsyre (= ARA, :4,8,11,14 ), en 6-fettsyre, og de to 3-fettsyrene eikosapentaensyre (= EPA, :,8,11,14,17 ) og dokosaheksaensyre (DHA,

6 22:6 4,7,,13,17,19 ) syntetisert via sekvensen av desaturase- og elongase-reaksjoner. Anvendelsen av 3-fettsyrer viser den terapeutiske aktiviteten beskrevet ovenfor i behandling av kardiovaskulære sykdommer (Shimikawa 01, World Rev. Nutr. Diet. 88, 0-8), inflammasjoner (Calder 02, Proc. Nutr. Soc. 61, 34-38) og artritt (Cleland og James 00, J. Rheumatol. 27, 2-27). 1 Høyere planter omfatter polyumettede fettsyrer slik som linolsyre (C18:2) og linolensyre (C18:3). ARA, EPA og DHA finnes overhodet ikke i frøoljer av høyere planter, eller kun i svært små mengder (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Végétales [New Dictionary of Vegetable Oils]. Technique & Documentation Lavoisier, 199. ISBN: ). Produksjonen av LCPUFA er i høyere planter (foretrukket i oljeavlinger slik som rapsfrø, linfrø, solsikke og soyabønne) ville være økonomisk fordelaktig, da store mengder av høykvalitets LCPUFA er for næringsmiddelindustrien, for dyrefôr og for farmasøytiske formål vil kunne oppnås. En mulig rute er via rekombinante metoder, hvor gener som koder for enzymer av biosyntesen av LCPUFA er innføres og uttrykkes i oljeavlinger. Disse gener koder f.eks. for 6-desaturaser, 6-elongaser, -desaturaser eller 4-desaturaser. Disse gener kan fordelaktig isoleres fra mikroorganismer og lavere planter som produserer LCPUFA er og innlemmer dem i membranene eller triacylglyseridene. Det har således allerede vært mulig å isolere 6-desaturasegener fra mosen Physcomitrella patens og 6-elongasegener fra P. patens og fra nematoden C. elegans. (Zank, T.K. et al. Plant Journal 31:2-268, 02, Beudoin et al. Biochem Soc Trans 28: , 00). 2 De første transgene plantene som omfatter og uttrykker gener som koder for LCPUFAbiosynteseenzymer som produserer LCPUFA er ble f.eks. beskrevet i DE-A (fremgangsmåte for fremstilling av polyumettede fettsyrer i planter). Disse planter produserer imidlertid LCPUFA er i mengder som krever ytterligere optimalisering for prosessering av oljene som er tilstede i plantene. For å sikre anrikning av mat og av fôr med disse polyumettede fettsyrene, er der derfor et stort behov for midler og metoder for en enkel, rimelig prosess for fremstilling av disse polyumettede fettsyrer, særlig i eukaryote systemer. 3 Formålet som den foreliggende oppfinnelse er basert på, er tilveiebringelsen av slike midler og metoder. Dette formål oppnås ved utførelsesformene som er beskrevet i patentkravene og i det etterfølgende.

7 6 Den foreliggende oppfinnelse vedrører således et polynukleotid som omfatter en nukleinsyresekvens valgt fra gruppen som omfatter: (a) Nukleinsyresekvens som vist i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 1, 2, 8, 9, 1, 16, 0 eller 1; (b) Nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid som presenterer en aminosyresekvens som vist i hvilken som helst av SEKV. ID nr. 3,, 17 eller 2; (c) Nukleinsyresekvens som har minst 70 % identitet med én av nukleinsyresekvensene i (a) eller (b), og som koder for et polypeptid med en desaturaseaktivitet; og (d) Nukleinsyresekvens for et fragment av en nukleinsyre i (a), (b) eller (c), hvor fragmentet koder for et polypeptid med en desaturaseaktivitet. 1 Klassen av 6-fettsyrene er basert på 6-fettsyren linolsyre (18:2 9,12), mens klassen av 3-fettsyrene er basert på (3-fettsyren linolensyre (18:3(9,12,1), se figur 1. Disse to fettsyrer er substratene for syntesen av henholdsvis langkjede (6- og (3- PUFA er. Økningen av innholdet i disse fettsyrer i henhold til gener som innføres fører til en økning av innholdet i langkjede-pufa er. 2 Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer polynukleotidsekvenser som fører til en økning av henholdsvis substratene 18:2(9,12 og 18:3(9,12,1. Der er blitt identifisert polynukleotidsekvenser som koder for enzymer med (12-desaturaseaktivitet, med (12- og (1-desaturaseaktivitet, med (1-desaturaseaktivitet eller med (3- desaturaseaktivitet. 3 I henhold til oppfinnelsen refererer betegnelsen polynukleotid til polynukleotider som omfatter nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med desaturaseaktivitet. Desaturaseaktivitetene kreves foretrukket for biosyntesen av lipider eller fettsyrer. Særlig foretrukket antar de formen av de etterfølgende desaturaseaktiviteter: 12- desaturase-, 1-desaturase-, 12- og 1-desaturase- eller omega-3-desaturaseaktivitet. Desaturasene er foretrukket involvert i syntesene av polyumettede fettsyrer (PUFA er) og særlig foretrukket i syntesene av langkjede-pufa er (LCPUFA er). Passende deteksjonssystemer for disse desaturaseaktiviteter er beskrevet i eksemplene eller i WO 0/083. Desaturaseaktivitetetene ifølge oppfinnelsen har særlig foretrukket substratspesifisiteter og/eller omdannelsesrater som er sammenlignbare med dem til de respektive homologe desaturaseenzymer fra Pythium

8 7 irregulare, Ostreococcus tauri, Phytophtora sojae eller Phytophtora infestans. Disse spesifikke polynukleotider i henhold til oppfinnelsen, dvs. polynukleotidene med en nukleinsyresekvens som vist i SEKV. ID nr. 1, 2, 8, 9, 1, 16, 0 eller 1 er blitt oppnådd fra Cochliobolus heterostrophus C, Cyanothece sp. CCY01, Polaromonas sp. JS666, Prochlorococcus marinus str. MIT 9313, Synechococcus sp. PCC 733, Mycocentrospora acerina eller Hyaloperonospora parasitica. 1 Særlig nukleinsyresekvensen i henhold til SEKV. ID nr. 1 og 2 stammer fra Cochliobolus heterostrophus C, nukleinsyresekvensene i henhold til SEKV. ID nr. 8 og 9 fra Cyanothece sp. CCY01, nukleinsyresekvensene i henhold til SEKV. ID nr. 1 og 16 fra Mycocentrospora acerina og nukleinsyresekvensene i henhold til SEKV. ID nr. 0 og 1 fra Hyaloperonospora parasitica. SEKV. ID nr. 1, 8 og 0 er genome sekvenser, SEKV. ID nr. 1 er et mrna-transkript, mens SEKV. ID nr. 2, 9, 16 og 1 er kodesekvenser (cds). SEKV. ID nr. 3,, 17 og 2 viser de tilsvarende aminosyresekvensene. Polynukleotider ifølge oppfinnelsen som er særlig foretrukne er således: Polynukleotider som koder for et polypeptid med 1-desaturaseaktivitet, og som omfatter (i) en nukleinsyresekvens som vist i SEKV. ID nr. 1 eller 2, (ii) en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid som vist i SEKV. ID nr. 3, (iii) en nukleinsyresekvens som har minst 70 % identitet med én av nukleinsyresekvensene i (i) eller (ii), eller (iv) en nukleinsyresekvens for et fragment av en nukleinsyre i (i), (ii) eller (iii), hvor fragmentet koder for et polypeptid med en 1-desaturaseaktivitet. 2 Polynukleotider som koder for et polypeptid med 1-desaturaseaktivitet, og som omfatter (i) en nukleinsyresekvens som vist i SEKV. ID nr. 8 eller 9, (ii) en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid som vist i SEKV. ID nr., (iii) en nukleinsyresekvens som har minst 70 % identitet med én av nukleinsyresekvensene (i) eller (ii), eller en nukleinsyresekvens for et fragment av en nukleinsyre i (i), (ii) eller (iii), hvor fragmentet koder for et polypeptid med en 1-desaturaseaktivitet. 3 Polynukleotider som koder for et polypeptid med 12-desaturaseaktivitet, og som omfatter (i) en nukleinsyresekvens som vist i SEKV. ID nr. 1 eller 16, (ii) en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid som vist i SEKV. ID nr. 17, (iii) en nukleinsyresekvens som har minst 70 % identitet med én av nukleinsyresekvensene i

9 8 (i) eller (ii), eller (iv) en nukleinsyresekvens for et fragment av en nukleinsyre i (i), (ii) eller (iii), hvor fragmentet koder for et polypeptid med en 12-desaturaseaktivitet. Polynukleotider som koder for et polypeptid med 3-desaturaseaktivitet, og som omfatter (i) en nukleinsyre som vist i SEKV. ID nr. 0 eller 1, (ii) en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid som vist i SEKV. ID nr. 2, (iii) en nukleinsyresekvens som har minst 70 % identitet med én av nukleinsyresekvensene i (i) eller (ii), eller (iv) en nukleinsyresekvens for et fragment av en nukleinsyre i (i), (ii) eller (iii), hvor fragmentet koder for et polypeptid med en 3-desaturaseaktivitet. 1 Betegnelsen delta-12-desaturase (eller -12-desaturase eller d-12-desaturase eller d12-des eller d12des) eller delta-12-desaturase (eller -12-desaturase eller d-12- desaturase eller d12-des eller d12des)-aktivitet som anvendt i den foreliggende sammenheng refererer til et enzym med den enzymatiske funksjonen for dehydrogenering av C18-fettsyrer som allerede er dehydrogenert på C-atomet 9-. Her dehydrogeneres i hvert tilfelle ett hydrogenatom på C-atomene C12 og C13, som fører til en dobbeltbinding mellom disse to C-atomer. 2 Betegnelsen delta-1-desaturase (eller -1-desaturase eller d-1-desaturase eller d1-des eller d1des) eller delta-1-desaturase (eller -1-desaturase eller d-1- desaturase eller d1-des eller d1des)-aktivitet som anvendt i den foreliggende sammenheng refererer til et enzym med den enzymatiske funksjon for dehydrogenering av C18- og/eller C-fettsyrer som er dehydrogenert på C-atomene 6-7, 8-9, 9-, og/eller Her er ett hydrogenatom i hvert tilfelle dehydrognert på C-atomene C1-16 og/eller C17-18 som fører til en dobbeltbinding mellom de to C-atomene. 3 Betegnelsen delta-12- og delta-1-desaturase (eller -12- og -1-desaturase eller som beskrevet over) eller delta-12- og delta-1-desaturase (eller -12- og 1- desaturase eller som beskrevet ovenfor) aktivitet som anvendt i den foreliggende sammenheng refererer til et enzym med en enzymatisk funksjon for dehydrogenering av C18- og/eller C-fettsyrer som er dehydrogenert på C-atomer 6-7, 8-9, 9- og/eller Her er et hydrogenatom i hvert tilfelle av C-atomene C12-13 og C1-16 og/eller C17-18 dehydrogenert, som fører til en dobbeltbinding mellom de to C- atomene.

10 9 Betegnelsen omega-3-desaturase (eller (13-desaturase eller (3-Des eller (3Des eller omega3 Des eller o3des) eller omega-3-desaturase (eller (3-desaturase eller (3-Des eller (3Des eller omega3 Des eller o3des) aktivitet som anvendt i den foreliggende sammenheng refererer til et enzym med enzymatisk funksjon for dehydrogenering av C18-, C- og/eller C22-fettsyrer som er dehydrogenert på C-atomene 4-, -6, 6-7, 8-9, 9-, og/eller Her er ett hydrogenatom dehydrogenert i hvert tilfelle av C-atomene C1-16 og/eller C17-18 og/eller C19-, som fører til en dobbeltbinding mellom de to C-atomene. 1 Desaturaser ifølge oppfinnelsen viser særlig foretrukket, i rekkefølge, desaturasemotivet 1 GXHX3HX13GX9PX3WX3H (SEKV. ID nr. 46), desaturasemotivet 2 PX14(H/Q)H (SEKV. ID nr. 47) og enten desaturasemotivet 3 HX2HHXPXY (SEKV. ID nr. 48) eller desaturasemotivet 4 HX2HHX6PXY (SEKV. ID nr. 49), hvor X står for en hvilken som helst aminosyre. Om den er en 12-, 1- eller omega3-desaturase kan utledes fra aminosyren i den variable stillingen 16 i desaturasemotivet 2 (H eller Q): Q = glutamin er indikasjon på putative 12- desaturaser, H = histidin er indikasjon på 1- eller omega3-desaturaser. I denne sammenheng stammer polynukleotidsekvensene eller peptidsekvensene ifølge oppfinnelse foretrukket fra de ovennevnte organismer. 2 Sett i lys av degenereringen av den genetiske koden, er det klart at når de ovennevnte spesifikke sekvenser også kan modifiseres, hvor de modifiserte polynukleotider fremdeles koder for polypeptider med en aminosyresekvens som vist i hvilke som helst av SEKV: ID nr. 3,, 17 eller 2, og som har de ovennevnte desaturaseaktiviteter. 3 Betegnelsen polynukleotid omfatter også varianter av de ovennevnte spesifikke polynukleotider. Disse kan være i form av homologe, ortologe eller paraloge sekvenser. Slike varianter omfatter nukleinsyresekvenser som viser minst én basesubstitusjon, én baseaddisjon eller én basedelesjon, idet det er ment at varianten fremdeles koder for et polypeptid med den ovennevnte biologiske aktivitet av den respektive utgangssekvensen. Varianter omfatter polynukleotider som er i stand til hybridisering med de ovennevnte polynukleotider, foretrukket under stringente betingelser. Særlig foretrukne stringente betingelser er kjent for den fagkyndige på området, og kan bli funnet i Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), Et foretrukket eksempel på stringente

11 1 2 3 hybridiseringsbetingelser er hybridisering i 6 x natriumklorid/natriumsitrat (= SSC) ved omtrent 4 o C, foretrukket 0 o C, o C, 60 o C, og mest foretrukket ved 62 o C, etterfulgt av ett eller flere vasketrinn i 0,1 x SSC, 0,1 % SDS ved 0-6 o C, foretrukke -6 o C, enda mer foretrukket ved 60-6 o C. Den fagkyndige vet at disse hybridiseringsbetingelser varierer som en funksujon av type nukleinsyre og, f.eks. når organiske løsningsmidler er tilstede, med hensyn til temperaturen og bufferkonsentrasjonen. Under standard hybridiseringsbetingelser, varierer temperaturen som en funksjon av typen av nukleinsyre mellom 42 o C og 8 o C i vandig buffer med en konsentrasjon fra 0,1 til x SSC (ph 7,2). Dersom organisk løsningsmiddel er tilstede i den ovennevnte buffer, f.eks. 0 % formamid, er temperaturen under standardbetingelser omtrent 42 o C. Hybridiseringsbetingelsene for DNA:DNA-hybrider er foretrukket f.eks. 0,1 x SSC og o C til 4 o C, foretrukket mellom o C og 4 o C. Hybridiseringsbetingelser for DNA:RNA-hybrider er foretrukket f.eks. 0,1 x SSC og o C til o C, foretrukket mellom 4 o C og o C. De ovennevnte hybridiseringstemperaturer bestemmes f.eks. for en nukleinsyre med omtrent 0 bp (= basepar) i lengde, og et G + C innhold på 0 % i fravær av formamid. Den fagkyndige vet hvordan man bestemmer hybridiseringsbetingelser som er nødvendige ved hjelp av lærebøker, slik som den som er nevnt i det foregående, eller fra de etterfølgende lærebøker: Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989: Hames og Higgins (red.) 198, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press ved Oxford University Press, Oxford; Brown (red.) 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press ved Oxford University Press, Oxford. Som et alternativ kan varianter av de spesifikke polynukleotidene ifølge oppfinnelsen også tilveiebringes ved polymerasekjedereaksjon (PCR)-baserte metoder. Med dette som formål, er det mulig først å utlede primere fra konserverte sekvenser (for eksempel sekvenser som koder for funksjonelle domener i polypeptidet). Konserverte sekvenser kan bestemmes ved sekvenssammenlikninger med polynukleotider som koder for polypeptider med en tilsvarende aktivitet. Templatet som anvendes kan være DNA eller cdna fra bakterier, sopp, planter eller dyr. DNA-fragmenter oppnådd ved PCR kan anvendes for å screene passende genome biblioteker eller cdna-biblioteker for å, om nødvendig, isolere den fullstendige åpne leserammen til polynukleotidet, og bestemme den ved sekvensering. Foretrukne varianter omfatter polynukleotider som omfatter en nukleinsyresekvens med minst 0 %, minst %, minst 60 %, minst 6 %, minst 70 %, minst 7 %, minst 80 %, minst 81 %, minst 82 %, minst 83 %, minst 84 %, minst 8 %, minst 86 %, minst 87 %, minst 88 %, minst 89 %, minst 90 %, minst 91 %, minst 92 %, minst 93 %, minst 94 %, minst 9 %, minst 96 %, minst 97 %, minst 98 % eller minst 99 % (eller

12 11 med en annen prosent enn nevnt her) identitet med én av de ovennevnte spesifikke nukleinsyresekvenser og koder for et polypeptid med den respektive biologiske aktivitet. Like foretrukket er polynukleotider innbefattet som omfatter nukleinsyresekvenser som koder for et polypeptid med en aminosyresekvens med minst 0 %, minst %, minst 60 %, minst 6 %, minst 70 %, minst 7 %, minst 80 %, minst 81 %, minst 82 %, minst 83 %, minst 84 %, minst 8 %, minst 86 %, minst 87 %, minst 88 %, minst 89 %, minst 90 %, minst 91 %, minst 92 %, minst 93 %, minst 94 %, minst 9 %, minst 96 %, minst 97 %, minst 98 % eller minst 99 % (eller en annen prosent enn nevnt her) identitet med én av de ovennevnte spesifikke aminosyresekvenser, og hvor polypeptidet har den respektive biologiske aktiviteten til utgangssekvensen. 1 2 Prosentandelen av identiske nukleotider eller aminosyrer relaterer foretrukket til et sekvenssegment av minst 0 % av sekvensene som skal sammenliknes, særlig foretrukket over hele lengden av sekvensene som skal sammenliknes. En rekke programmer som gjennomfører algoritmer for slike sammenlikninger er beskrevet i den kjente teknikk, og er kommersielt tilgjengelig. Det skal særlig vises til algoritmene av Needleman og Wunsch eller Smith og Waterman, som gir særlig pålitelige resultater. Disse algoritmer kan foretrukket gjennomføres ved de etterfølgende programmer: PileUp (J. Mol. Evolution., 2, , 1987, Higgins 1989, CABIOS, : 11-13), Gap and BestFit (Needleman og Wunsch (J. Mol. Biol. 48; (1970) og Smith og Waterman (Adv. Appl. Math. 2; (1981))), som del av GCGprogramvaren (Genetics Computer Group, 7 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 3711, 1991). For formålene i den foreliggende oppfinnelse, er det særlig foretrukket å bestemme prosentandelen (%) av sekvensidentiteten med GAPprogrammet over hele sekvensen, med de etterfølgende innstilte parametere: Gapvekt: 0, Lengdevekt: 3, Gjennomsnittlig match: 000 og gjennomsnittlig mismatch: 0, Et polynukleotid som kun omfatter et fragment av de ovennevnte nukleinsyresekvenser er også et polynukleotid ifølge oppfinnelsen. Det skal her forstås at fragmentet koder for et polypeptid som fremviser den biologiske aktiviteten til utgangssekvensen, eller til polypeptidet som sistnevnte koder for. Polypeptider som kodes for av slike polynukleotider omfatter derfor, eller består av, domener av de ovennevnte spesifikke polypeptider (utgangspolypeptider) som gir den biologiske aktiviteten. Et fragment for formålene i henhold til oppfinnelsen omfatter foretrukket minst 0, minst 0, minst eller minst 00 etterfølgende nukleotider av de

13 12 ovennevnte spesifikke sekvenser eller koder for en aminosyresekvens som omfatter minst, minst, minst 0, minst 80, minst 0 eller minst etterfølgende aminosyrer av én av de ovennevnte spesifikke aminosyresekvenser, og gir biologisk aktivitet, foretrukket desaturaseaktivitet, som beskrevet ovenfor. 1 Polynukleotidvariantene ifølge oppfinnelsen viser foretrukket minst %, minst %, minst %, minst 40 %, minst 0 %, minst 60 %, minst 70 %, minst 80 % eller minst 90 % av den respektive biologiske aktiviteten til polypeptidet som er kodet for av utgangssekvensen. Det vil si at polypeptidene som kodes for av polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan delta i metabolismen av forbindelser som er nødvendig for syntesen av fettsyrer, fettsyreestere slik som diacylglyserider og/eller triacylglyserider i en organisme, foretrukket i en plante eller plantecelle, eller kan delta i transporten av molekyler over membraner, som betyr C 18 -, C - eller C 22 -karbonkjeder i fettsyremolekylet med dobbeltbindinger i minst to, fordelaktig tre, fire, fem eller seks stillinger. 2 Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen omfatter enten de ovennevnte spesifikke nukleinsyresekvensene, eller består av dem. Det vil si at polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan i prinsippet også omfatte ytterligere nukleotider. Disse kan foretrukket være 3 - eller -umettede regioner av den genomiske nukleinsyresekvensen. De består foretrukket av minst 0, 0 eller 00 nukleotider ved -terminusen, og av minst, 0 eller 0 nukleotider ved 3 -terminusen for koderegionen. Ytterligere polynukleotider som omfatter ytterligere nukleinsyresekvenser er dem som koder for fusjonsproteiner. Slike fusjonsproteiner kan kode for ytterligere polypeptider eller polypeptiddeler, i tillegg til de ovennevnte polypeptider. Det ytterligere polypeptid eller polypeptiddelen kan forme seg til ytterligere enzymer i lipid- eller fettsyrebiosynteser. Andre som er mulige er polypeptider som kan virke som ekspresjonsmarkører (grønn, gul, rød, blå fluorescerende proteiner, alkalisk fosfatase og andre) eller såkalte tags som merkinger eller som et hjelpemiddel for rensing (f.eks. FLAG-tags, 6-histidin tags, MYC-tags og andre). 3 Polynukleotidvarianter kan isoleres fra forskjellige naturlige eller kunstige kilder. De kan f.eks. dannes kunstig ved in vitro eller in vivo mutagenese. Homologer eller ortologer av de spesifikke sekvensene kan oppnås fra en rekke dyr, planter eller andre mikroorganismer. De oppnås foretrukke fra alger. Alger slik som Isochrysis, Euglena eller Crypthecodinium, alger/diatomer slik som Thalassiosira, Phaeodactylum eller

14 Thraustochytrium, Pythium, moser slik som Physcomitrella, foretrukket Physcomitrella patens eller Ceratodon er foretrukket, og særlig foretrukket er alger av slekten Euglena eller diatomene av klassen Oomycota slik som slektene Pythium eller Phytophtora eller sopp slik som Postia placenta eller Microdochium nivale, eller fra divisjonen Zygomycota fra slektene Rhizopus, Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora, Entomophtora, Mucor eller Mortierella. Polynukleotidene kan også oppnås fra planter, foretrukket fra familien Selaginellaceae, slik som Selaginella moellendorffi, eller fra høyere planter slik som Primulaceae slik som Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens eller Osteospermum hypseroides, bakterier som Shewanella, cyanobakterier slik som Synecoccus, gjær eller dyr slik som nematoder, f.eks. Caenorhabditis, bløtdyr, insekter eller fisk. Polynukleotidvariantene er også foretrukket avledet fra et dyr fra ordenen virveldyr. Særlig foretrukket er polynukleotidene avledet fra klassen Vertebrater; Euteleostomi, Actinopterygii, Neopterygii, Teleostei, Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes, Salmonidae eller Oncorhynchus og spesielt særlig foretrukket fra ordenen Salmoniformes slik som familien Salmonidae, slik som slekten Salmo, f.eks. fra slektene og artene Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta eller Salmo trutta fario. Her kan polynukleotidene ifølge oppfinnelsen isoleres ved hjelp av standard teknikker innen nukleærbiologi, og ved hjelp av sekvensinformasjonen tilveiebrakt her. Det er også mulig, ved hjelp av sammenlikningsaltoritmer, å identifisere f.eks. en homolog sekvens, eller homologe, konserverte sekvensregioner på DNA eller aminosyrenivået. Disse kan anvendes som hybridiseringsprobe og standard hybridiseringsteknikker (slik som f.eks. dem beskrevet i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) for isolering av ytterligere nukleinsyresekvenser som er anvendbare i prosessen. Dessuten er det mulig å isolere polynukleotider eller fragmenter derav ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR), hvor oligonukleotidprimere som er basert på denne sekvens eller deler derav anvendes (f.eks. et nukleinsyremolekyl som omfatter den fullstendige sekvensen eller del derav, kan isoleres ved polymerasekjedereaksjon ved å anvende oligonukleotidprimere som er blitt dannet på grunnlag av den same sekvens). Det er f.eks. mulig å isolere mrna fra celler (f.eks. ved guanidinium tiocyanatekstraksjonsmetoden av Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: ), og cdna kan dannes ved hjelp av revers transkriptase (f.eks. Moloney MLV revers transkriptase, som kan oppnås fra Gibco/BRL, Bethesda, MD, eller AMV revers transkriptase, som kan oppnås fra Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL). Syntetiske oligonukleotidprimere for amplifikasjon ved hjelp av polymerasekjedereaksjonen kan dannes på grunnlag av polynukleotidet og

15 14 aminosyresekvensen som vist i SEKV. ID nummer (SEKV. ID nr.). En nukleinsyre ifølge oppfinnelsen kan amplifiseres ved å anvende cdna eller alternativt genomisk DNA som templatet, og passende oligonukleotidprimere, i henhold til standard PCRamplifikasjonsteknikker. Nukleinsyren som således er amplifisert kan klones inn i en passende vektor, og karakteriseres ved hjelp av DNA-sekvensanalyse. Oligonukleotider som tilsvarer en desaturasenukleotidsekvens kan dannes ved standard syntesemetoder, f.eks. ved å anvende en automatisk DNA-syntetisator. 1 Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan enten tilveiebringes i form av isolerte polynukleotider (dvs. isolert fra deres naturlige opprinnelse, f.eks. genomlokuset) eller i genetisk modifisert form (dvs. polynukleotidene kan også være tilstede i deres naturlige genlokus, men i et slikt tilfelle må de være genetisk modifisert). Et isolert polynukleotid omfatter foretrukket mindre enn kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0, kb eller 0,1 kb av nukleinsyreveksens som naturlig forekommer i dets miljø. Polynukleotidet ifølge oppfinnelsen kan være tilstede som et enkelttrådet eller dobbelttrådet nukleinsyremolekyl, og kan være i form av genomisk DNA, cdna eller RNA. Polynukleotidet ifølge oppfinnelsen består foretrukket av RNA eller DNA. Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen omfatter alle orienteringer av sekvensen vist i SEKV. ID numrene, dvs. også komplementærtråder og reverse, eller reversekomplementære orienteringer. Betegnelsen omfatter videre også kjemisk modifiserte nukleinsyrer slik som de naturlig forekommende metylerte DNA-molekyler, eller artifisielle nukleinsyrer, f.eks. biotinylerte nukleinsyrer. 2 3 Oppfinnelsen omfatter også oligonukleotider med minst 1 bp, foretrukket minst bp, minst 2 bp, minst bp, minst 3 bp, eller minst 0 bp, som spesifikt kan hybridisere under stringente betingelser med ett av de ovennevnte polynukleotider. Oligonukleotidene kan bestå av DNA eller RNA eller begge. Slike oligonukleotider kan anvendes som primere for PCR, som ekspresjonsinhiberende antisense oligonukleotider, for RNA-interferens (RNAi)-metoder, eller for kimeroplastiske eller genoplastiske metoder. RNAi-metoder er beskrevet f.eks. i Fire et al., Nature (1998) 391: ; Fire, Trends Genet. 1, (1999); Sharp, RNA interference 01. Genes Dev. 1, (01); Hammond et al. Nature Rev. Genet. 2, (01); Tuschi, Chem. Biochem. 2, (01); Hamilton et al., Science 286, (1999); Hammond et al., Nature 404, (00); Zamore et al., Cell 1, 2-33 (00); Bernstein et al., nature 409, (01); Elbashir et al., Genes Dev. 1, (01); WO 01/2908; WO 99/32619, eller Elbashir et al., 01 Nature 411: og tjener til å inhibere genekspresjon ved å nedbryte

16 1 mrna. Kimeroplastiske eller genoplastiske tilnærminger tjener in vivo modifikasjon (f.eks. introduksjon av punktmutasjoner) i gener i deres endogene loci. Tilsvarende metoder er omtalt i US 6, US 76 32, US , US , US , US , US , US , US og US Det har fordelaktig fremkommet at polynukleotider ifølge oppfinnelsen kan særlig anvendes effektivt for rekombinant produksjon av polyumettede fettsyrer i vertsceller og i transgene organismer. Spesielt er polypeptidene som kodes for av polynukleotidene ifølge oppfinnelsen og som har 12-desaturase, 1-desaturase, 12- og 1-desaturase eller omega-3-desaturase aktivitet i stand til å omdanne C 18 -, C - og C 22 -fettsyrer med én, to, tre, fire eller fem dobbeltbindinger, og foretrukket polyumettede C 18 -fettsyrer med én, to eller tre dobbeltbindinger, slik som C18:1 (9, C18:2 (9,12 eller C18:3 (6,9,12, polyumettede C-fettsyrer med tre eller fire dobbeltbindinger slik som C:3 (8,11,14, C:4 (,8,11,14 eller C:4 (8,11,14,17 eller polyumettede C22-fettsyrer med fire eller fem dobbeltbindinger slik som C22:4 (7,,13,16 eller C22: (7,,13,16,19. Særlig foretrukket fører polynukleotidet og aminosyresekvensene ifølge oppfinnelsen til en økning i C18:2 (9,12- eller 18:3 (9,12,1-fettsyrer. Figur 1 viser hvor disse desaturaser ifølge oppfinnelsen tar del i biosyntesen av langkjedepolyumettede fettsyrer og/eller hvordan de kan anvendes for å fremstille disse fettsyrer. 2 3 I denne sammenheng er det særlig foretrukket å anvende 6-desaturase kodet for av polynukleotidsekvensen med SEKV. ID nr. 22 (d6des(pir)), 6-elongasen kodet for polynukleotidsekvensen med SEKV. ID nr. 31 (d6elo(pp)), -desaturasen kodet for av polynukleotidsekvensen med SEKV. ID nr. 2 (ddes(tc)), 1-elongasen kodet for av polynukleotidsekvensen med SEKV. ID nr. 34 (ddes(ot)), 14-desaturasen kodet for av polynukleotidsekvensen med SEKV. ID nr. 37 (d4des(tc)), 6-elongasen kodet for av polynukleotidsekvensen med SEKV. ID nr. 40 (d6elo(tp)), 6-desaturasen kodet for av polynukleotidsekvenbsen med SEKV. ID nr. 41 (d6des(tc)) med én eller flere av desaturasene i henhold til oppfinnelsen for å syntetisere langkjede polyumettede fettsyrer; det vises i denne forbindelse til WO 06/0241. Alternativt er det også mulig å anvende en 9-elongase og en 8-desaturase istedenfor den ovennevnte 6-desaturasen og 6-elongasen som beskrevet i WO 04/ Avhengig av fettsyren som skal fremstilles, er det mulig å ko-uttrykke, i vertscellen eller transgene organismer beskrevet i det etterfølgende, eller å anvende i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, en rekke kombinasjoner av polynukleotidene

17 16 ifølge oppfinnelsen med de ovennevnte desaturaser eller elongaser. Særlig foretrukne kombinasjoner for fremstilling av eikosapentaensyre er vist i tabeller og 8, og for dokosaheksaensyre i tabell 6 nedenfor. Det er f.eks. mulig å anvende en 12- desaturase, 1-desaturase, 12- og 1-desaturase, eller omega-3-desaturase ifølge oppfinnelsen, alene eller i en passende kombinasjon (f.eks. en 12-desaturase og en 1-desaturase), sammen med d6des(pir) og/eller d6des(ot), d6elo(pp), ddes(tc) og 3Des(Pi) for fremstilling av EPA. Likeledes kan en 12-desaturase, 1- desaturase, 12- og 1-desaturase, eller omega-3-desaturase ifølge oppfinnelsen, alene eller i en passende kombinasjon, anvendes sammen med d6des(pir) og/eller d6des(ot), d6elo(pp), ddes(tc), 3Des(Pi), delo(ot), d4des(tc) for fremstilling av dokosaheksaensyre. 1 Det er fettsyrene i fosfolipider eller CoA-fettsyreestere som foretrukket avmettes, fordelaktig i CoA-fettsyreestere. En enkel, ikke-kostbar produksjon av disse polyumettede fettsyrene er således mulig, særlig i eukaryote systemer. De umettede fettsyrene fremstilt ved hjelp av polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan deretter utformes som oljesammensetninger, lipidsammensetninger og fettsyresammensetninger, og kan anvendes på en passende måte. Den foreliggende oppfinnelse angår videre en vektor som omfatter polynukleotidet ifølge oppfinnelsen. 2 3 Betegnelsen vektor refererer til et nukleinsyremolekyl som er i stand til å transportere et annet nukleinsyremolekyl, slik som polynukleotidene ifølge oppfinnelsen, hvortil det er bundet. En type vektor er et plasmid, en sirkulær dobbelttrådet DNA-sløyfe inn i hvilken ytterligere DNA-segmenter kan ligeres. En ytterligere type vektor er en viral vektor, idet det er mulig at ytterligere DNAsegmenter ligeres inn i det virale genomet. Visse vektorer er i stand til autonom replikasjon i en vertscelle som de er blitt innført i (f.eks. bakterievektorer med bakteriereplikasjons-origo). Andre vektorer integreres fordelaktig i genomet til vertscellen når de innføres i vertscellen, og replikerer således sammen med vertsgenomet. Visse vektorer kan dessuten styre ekspresjonen av gener som de er i operabel kobling med. Disse vektorene er i den foreliggende sammenheng omtalt som ekspresjonsvektorer. Ekspresjonsvektorer som vanligvis er egnet for DNArekombinasjonsteknikker har formen av plasmider. I den foreliggende beskrivelse kan plasmid og vektor anvendes om hverandre, da plasmidet er den vektorformen som oftest anvendes. Oppfinnelsen skal også imidlertid omfatte andre former av

18 17 ekspresjonsvektorer slik som virale vektorer, som utviser tilsvarende funksjoner. Videre skal betegnelsen vektor også omfatte andre vektorer som den fagkyndige på området kjenner til, slik som fager, viruser så som SV40, CMV, TMV, transposoner, IS-elementer, fasmider, fagemider, kosmider, lineær eller sirkulær DNA, artifisielle kromosomer. Endelig omfatter betegnelsen også konstrukter for målrettet, dvs. homolog, rekombinasjon, eller den heterologe insersjon av polynukleotider. 1 Vektorer kan innføres i prokaryote og eukaryote celler via konvensjonelle transformasjons- eller transfeksjonsteknikker. Betegnelsene transformasjon og transfeksjon, konjugering og transduksjon, som anvendt i den foreliggende sammenheng, skal omfatte en rekke metoder som er kjent innen teknikken for innføring av fremmed nukleinsyre (f.eks. DNA) i en vertscelle, som inkluderer kalsiumfosfat eller kalsiumkloridkopresipitering, DEAE-dekstranmediert transfeksjon, lipofeksjon, naturlig kompetanse, kjemisk mediert overføring, elektroporering eller partikkelbombardering. Passende metoder for transformasjon eller transfeksjon av vertsceller som inkluderer planteceller finner man i Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) og andre laboratorielæerbøker slik som Methods in Molecular Biology, 199, bind 44, Agrobacterium protocols, red.: Gartland og Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. 2 3 Passende kloningsvektorer er generelt kjent for den fagkyndige. De inkluderer særlig vektorer som kan replikere i mikrogelsystemer, som er hovedsakelig vektorer som sikrer effektiv kloning i gjær eller sopp, og som muliggjør stabil transformasjon av planter. De som skal nevnes er særlig forskjellige binære og kointegrerte vektorsystemer som er egnet for den T-DNA-medierte transformasjon. Slike vektorsystemer er som regel kjennetegnet ved at de omfatter i det minste vir-genene, som er nødvendige for den agrobakterie medierte transformasjonen, og T-DNAgrensesekvenser (T-DNA-grense). Disse vektorsystemer omfatter foretrukket videre cis-regulerende regioner, slik som promotere og terminatorer, og/eller seleksjonsmarkører, og ved hjelp av disse kan passende transformerte organismer identifiseres. Mens vir-gener og T-DNA-sekvenser i forbindelse med kointegrerte vektorsystemer er oppstilt på den samme vektoren, er binære systemer basert på minst to vektorer, hvorav én bærer vir-gener, men ikke T-DNA, og den andre bærer T-DNA, men ikke vir-gen. Som et resultat er de sistnevnte vektorer relativt små, lette å manipulere, og replikerer både i E. coli og i Agrobacterium. Disse binære vektorer

19 18 1 inkluderer vektorer fra pbib-hyg-serien, ppzp-serien, pbecks-serien og pgreenserien. I forbindelse med oppfinnelsen anvendes foretrukket Bin19, pbi1, pbinar, pgptv og pcambia. En oversikt over binære vektorer og deres anvendelse er funnet i Hellens et al., Trends in Plant Science (00), Vektorene med de inserterte vektorene ifølge oppfinnelsen kan stabilt propageres under selektive betingelser i mikroorganismer, særlig Escherichia coli og Agrobacterium tumefaciens, og muliggjør en overføring av heterologt DNA til planter eller mikroorganismer. Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan innføres i organismer slik som mikroorganismer eller planter ved hjelp av kloningsvektorene, og kan således anvendes for å transformere planter. Vektorer som er egnet for dette formål er publisert i: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), kapittel 6/7, s (1993); F.F: White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; i: Transgenic Plants, bind 1, Engineering and Utilization, red.: Kung og R. Wu, Academic Press, 1993, 1-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, i: Transgenic Plants, bind 1, Engineering and Utilization, red.: Kung og R. Wu, Academic Press (1993), ; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), Vektoren er foretrukket en ekspresjonsvektor. Polynukleotidet er tilstede i ekspresjonsvektoren ifølge oppfinnelsen i operativ (dvs. funksjonell) kobling med en ekspresjonskontrollsekvens. Ekspresjonskontrollsekvensen sammen med polynukleotidet og eventuelt ytterligere sekvenselementer i vektoren omtales også som ekspresjonskassetten. Ekspresjonskontrollsekvensen sikrer, at etter transformasjon eller transfeksjon inn i en vertscelle, kan polynukleotidet uttrykkes. Ekspresjonskontrollsekvensen for anvendelse omfatter foretrukket cis-regulerende elementer slik som promoter og/eller enhancer nukleinsyresekvenser, som gjenkjennes ved vertscellenes transkripsjonsmaskineri. Betegnelsen omfatter videre andre ekspresjonskontrollelementer, f.eks. polyadenyleringssignaler og RNAstabiliseringssekvenser. Disse regulerende sekvenser er f.eks. beskrevet i Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 18, Academic Press, San Diego, CA (1990) eller se: Gruber og Crosby, i: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, red.: Glick og Thompson, kapittel 7, 89-8, inkluderende litteraturen angitt her. Ekspresjonskontrollsekvenser omfatter dem som styrer den konstitutive ekspresjon av en nukleotidsekvens i en rekke typer av vertsceller, og dem som styrer den direkte ekspresjonen av nukleotidsekvensen kun inn i bestemte vertsceller under bestemte betingelser. Den fagkyndige vet at designen av ekspresjonsvektoren kan avhenge av en rekke faktorer, slik som valg av vertscellen som skal transformeres, grad av ekspresjon av ønsket protein og liknende.

20 19 Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan være tilstede i én eller flere kopier i ekspresjonskassetten eller i ekspresjonsvektoren ifølge oppfinnelsen (f.eks. i form av flere ekspresjonskassetter). Her kan de regulerende sekvenser eller faktorer foretrukket ha en positiv effekt på genekspresjonen av de introduserte genene, som beskrevet ovenfor, og derved øke denne. Det er således mulig å forsterke de regulerende elementer fordelaktig på transkripsjonsnivået ved å anvende sterke transfeksjonssignaler, slik som promotere og/eller enhancere. Dessuten er det også mulig å forsterke translasjonen, f.eks. ved å forbedre mrna-stabiliteten. Ytterligere ekspresjonskontrollsekvenser som ligger innenfor det som er ment med den foreliggende oppfinnelse er translasjonsterminatorer i 3 -enden av polynukleotidene som skal translateres. Et eksempel som kan anvendes her er OCS1-terminatoren. Som i tilfellet av promoterne, bør en forskjellig terminatorsekvens anvendes for hvert polynukleotid som skal uttrykkes Foretrukne ekspresjonskontrollsekvenser eller regulerende sekvenser er tilstede i promotere slik som cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T, T3, gal, trc, ara, SP6, -PR og -PL promotere og benyttes fordelaktig i gram-negative bakterier. Ytterligere fordelaktige reguleringssekvener er tilstede i de gram-positive promoterne amy og SPO2, i gjær- eller soppromoterne ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GADPH, TEF, rp28, ADH eller i plantepromoterne CaMV/3S [Franck et al., Cell 21 (1980) ], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos eller i ubiquitin eller faseolinpromoteren. Fordelaktig i denne sammenheng er også induserbare promotere slik som promoteren som beskrevet i EP- A (benzensulfonamid induserbar), Plant J. 2, 1992: (Gatz et al., tetrasyklin induserbar), EP-A (abscisinsyre induserbar) eller WO 93/21334 (etanol- eller sykloheksanol induserbar). Ytterligere egnede plantepromotere er den systoliske FBPase-promoteren eller ST-LSI-promoteren av potet (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 244), glysin-maks-fosforibosylpyrofosfatamidotransferasepromoteren (Genbank aksesjonsnummer U87999) eller den nodespesifikke promoteren beskrevet i EP-A Særlig fordelaktige promotere er promotere som muliggjør ekspresjon i vev som er involvert i biosyntesen av fettsyrer. Svært fordelaktig er frøspesifikke promotere, slik som USP-promoteren, men også andre promotere slik som LeB4-, DC3-, faseolin- eller napin-promoteren. Ytterligere særlig fordelaktige promotere er frøspesifikke promotere som kan anvendes for monokotyledon- eller dikotyledon-planter som er beskrevet i US (rapsfrø napin promoter), WO 98/4461 (Arobidopsis oleosin promoter), US 04 0 (Phaseolus vulgaris faseolin promoter), WO 91/13980 (Brassica Bce4-promoter), av