(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (51) Int Cl. C12N 15/82 ( ) A01H 5/00 ( ) C07K 14/415 ( ) C12N 15/113 ( ) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato (30) Prioritet , US, P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver Philip Morris Products S.A., Quai Jeanrenaud 3, 2000 Neuchâtel, CH-Sveits (72) Oppfinner HAYES, Alec, Brandy Oaks Boulevard, Chesterfield, VA 23832, US-USA KUDITHIPUDI, Chengalrayan, Tomahawk Meadows Lane, Midlothian, VA 23112, US-USA VAN DER HOEVEN, Rutger, Espace de l'europe 18, 2000 Neuchatel, CH-Sveits (74) Fullmektig Onsagers AS, Postboks 1813 Vika, 0123 OSLO, Norge (54) Benevnelse Transgene planter modifisert for redusert kadmium-transport, avledede produkter og relaterte fremgangsmåter (56) Anførte publikasjoner WO-A-02/ WO-A-2005/ COURBOT MIKAEL ET AL: "A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase" PLANT PHYSIOLOGY (ROCKVILLE), vol. 144, no. 2, June 2007 ( ), pages , XP ISSN: HUSSAIN DAWAR ET AL: "P-type ATPase heavy metal transporters with roles in essential zinc homeostasis in Arabidopsis" PLANT CELL, AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS, ROCKVILLE, MD, US, vol. 16, no. 5, 1 May 2004 ( ), pages , XP ISSN: DATABASE EMBL [Online] 21 June 2005 ( ), "Chloroplast transformation vector prvdb1, complete sequence." XP retrieved from EBI accession no. EMBL:DQ Database accession no. DQ BOVET LUCIEN ET AL: "Cadmium partitioning and gene expression studies in Nicotiana tabacum and Nicotiana rustica" PHYSIOLOGIA PLANTARUM, vol. 128, no. 3, November 2006 ( ), pages , XP ISSN: VERRET F ET AL: "Overexpression of AtHMA4 enhances root-to-shoot translocation of zinc and cadmium and plant metal tolerance" FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 576, no. 3, 22 October 2004 ( ), pages , XP ISSN: VICTOR KORENKOV ET AL: "Enhancing tonoplast Cd/H antiport activity increases Cd, Zn, and Mn tolerance, and impacts root/shoot Cd partitioning in Nicotiana tabacum L" PLANTA ; AN INTERNATIONAL JOURNAL OF PLANT BIOLOGY, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 226, no. 6, 18 July 2007 ( ), pages , XP ISSN:

2 MILLS R F ET AL: "The plant P1B-type ATPase AtHMA4 transports Zn and Cd and plays a role in detoxification of transition metals supplied at elevated levels" FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 579, no. 3, 31 January 2005 ( ), pages , XP ISSN: WILLIAMS ET AL: "P1B-ATPases - an ancient family of transition metal pumps with diverse functions in plants" TRENDS IN PLANT SCIENCE, ELSEVIER SCIENCE, OXFORD, GB, vol. 10, no. 10, 1 October 2005 ( ), pages , XP ISSN: LEE JOOHYUN ET AL: "Functional expression of a bacterial heavy metal transporter in Arabidopsis enhances resistance to and decreases uptake of heavy metals." PLANT PHYSIOLOGY (ROCKVILLE), vol. 133, no. 2, October 2003 ( ), pages , XP ISSN: SONG W-Y ET AL: "Engineering tolerance and accumulation of lead and cadmium in transgenic plants" NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING GROUP, NEW YORK, NY, US, vol. 21, no. 8, 1 August 2003 ( ), pages , XP ISSN: LUGON-MOULIN N ET AL: "Critical review of the science and options for reducing cadmium in tobacco (Nicotiana tabacum L.) and other plants", ADVANCES IN AGRONOMY ELSEVIER ACADEMIC PRESS INC, 525 B STREET, SUITE 1900, SAN DIEGO, CA USA SERIES : ADVANCES IN AGRONOMY (ISSN (PRINT)), 2004, pages , XP , ELMAYAN TALINE ET AL: "Synthesis of a bifunctional metallothionein/ beta-glucuronidase fusion protein in transgenic tobacco plants as a means of reducing leaf cadmium levels", PLANT JOURNAL, vol. 6, no. 3, 1994, pages , XP , ISSN:

3 1 Teknisk område 5 Sammensetninger, ekspresjonsvektorer, polynukleotider, polypeptider, transgene planter, transgene cellelinjer og transgene frø, og fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av disse utførelsesformene for å produsere ulike planter som kan redusere transporten av tungmetaller inn i deler av planten over bakken. Bakgrunn Planter får i hovedsak tak i tungmetaller slik som Zn, Ni og Cu ved å absorbere metallionsubstrater fra sitt miljø ved hjelp av ulike transportmekanismer mediert ved transmembrantransportere uttrykt på overflaten av rotceller og andre vaskulære vev. Transportere klassifisert som P-type ATPaser, slik som P1B-type ATPaser, er transportere som translokerer positivt ladde substrater over plasmamembraner ved å benytte energi som er frigjort fra eksergone ATP-hydrolysereaksjoner. P1B-type ATPaser blir også referert til som tungmetall-atpaser («HMA») eller CPx-type ATPaser. HMA er har i kraft av substratspesifisitet blitt gruppert i to underklasser, Cu/Ag- og Zn/Co/Cd/Pb-gruppene. Den første P1B-type ATPasen som ble karakterisert i planter er AtHMA4, klonet fra Arabidopsis. Substratselektivitet for HMA er er ikke strengt begrenset til transporten av essensielle metaller ved at flere ikke-essensielle metaller kan bli gjenkjent vilkårlig som substrater, noe som fører til akkumuleringen av mange ikke-essensielle metaller slik som Cd, Pb, As og Hg. Lugon-Moulin et al., (Advances in Agronomy 83: , 2004) gjennomgår tilnærminger for reduksjon av kadmiuminnholdet i tobakksplanter. Oppsummering av oppfinnelsen Ulike aspekter av oppfinnelsen er rettet på sammensetninger og fremgangsmåter for produksjon av transgene planter, inkludert transgene tobakksplanter, som er genetisk modifiserte for å forstyrre kadmium (Cd)-transport fra rotsystemet til bladene ved å redusere uttrykkingsnivåene av transportere av HMA-familien. En HMA-homolog («NtHMA») har blitt identifisert i tobakk, og denne kan benyttes til å konstruere ulike RNAi-konstruksjoner som koder for NtHMA-RNAipolynukleotider av interesse som kan fremme degraderingen av endogene NtHMA- RNA-transkripter. Transgene planter som kan uttrykke NtHMA-RNAipolynukleotider ifølge oppfinnelsen kan bli benyttet for å redusere steady-statenivåer av NtHMA-RNA-transkripter, og dermed for å redusere antallet funksjonelt aktive NtHMA-transportere som er tilgjengelige for transport av metaller over cellemembraner. Andre aspekter av oppfinnelsen er rettet på rekombinant uttrykking av vektorer som omfatter ulike NtHMA-RNAi-konstruksjoner og konsumerbare produkter som

4 2 inkorporerer blader som er utledet fra transgene planter produsert ifølge de tilkjennegitte fremgangsmåtene Ifølge foreliggende oppfinnelse blir det i ett aspekt tilveiebrakt en NtHMA-RNAikonstruksjon som er i stand til å inhibere uttrykkingen av et NtHMAmessengerRNA som det tilsvarer, der konstruksjonen omfatter eller består av: en første sekvens som har minst 70 % sekvensidentitet med en del av SEQ ID br. 3 eller 47, en andre sekvens, og en tredje sekvens som har en revers komplementær sekvens av den første sekvensen, posisjonert i den samme orienteringen som den første sekvensen, der den andre sekvensen er posisjonert mellom den første sekvensen og den tredje sekvensen, og den andre sekvensen er operativt koplet til den første sekvensen og til den tredje sekvensen. I NtHMA-RNAi-konstruksjonen: (a) den første sekvensen kan ha minst 95 % sekvensidentitet med en sekvens valgt fra én eller flere i gruppen bestående av: ekson 1 som definert ifølge SEQ ID nr. 5, et fragment av ekson 1 som definert ifølge SEQ ID nr. 5, ekson 2 som definert ifølge SEQ ID nr. 7, et fragment av ekson 2 som definert ifølge SEQ ID nr. 7, ekson 3 som definert ifølge SEQ ID nr. 9, et fragment av ekson 3 som definert ifølge SEQ ID nr. 9, ekson 4 som definert ifølge SEQ ID nr. 11, et fragment av ekson 4 som definert ifølge SEQ ID nr. 11, ekson 5 som definert ifølge SEQ ID nr. 13, et fragment av ekson 5 som definert ifølge SEQ ID nr. 13, ekson 6 som definert ifølge SEQ ID nr. 15, et fragment av ekson 6 som definert ifølge SEQ ID nr. 15, ekson 7 som definert ifølge SEQ ID nr. 17, et fragment av ekson 7 som definert ifølge SEQ ID nr. 17, ekson 8 som definert ifølge SEQ ID nr. 19, et fragment av ekson 8 som definert ifølge SEQ ID nr. 19, ekson 9 som definert ifølge SEQ ID nr. 21, et fragment av ekson 9 som definert ifølge SEQ ID nr. 21, ekson 10 som definert ifølge SEQ ID nr. 23, et fragment av ekson 10 som definert ifølge SEQ ID nr. 23, ekson 11 som definert ifølge SEQ ID nr. 25 og et fragment av ekson 11 som definert ifølge SEQ ID nr. 25, (b) den andre sekvensen kan ha minst 95 % sekvensidentitet med en sekvens valgt fra én eller flere i gruppen bestående av: intron 1 som definert ifølge SEQ ID nr. 4, et fragment av intron 1 som definert ifølge SEQ ID nr. 4, intron 2 som definert ifølge SEQ ID nr. 6, et fragment av intron 2 som definert ifølge SEQ ID nr. 6, intron 3 som definert ifølge SEQ ID nr. 8, et fragment av intron 3 som definert ifølge SEQ ID nr. 8, intron 4 som definert ifølge SEQ ID nr. 10, et fragment av intron 4 som definert ifølge SEQ ID nr. 10, intron 5 som definert ifølge SEQ ID nr. 12, et fragment av intron 5 som definert ifølge SEQ ID nr. 12, intron 6 som definert ifølge SEQ ID nr. 14, et fragment av intron 6 som definert ifølge SEQ ID nr. 14,

5 intron 7 som definert ifølge SEQ ID nr. 16, et fragment av intron 7 som definert ifølge SEQ ID nr. 16, intron 8 som definert ifølge SEQ ID nr. 18, et fragment av intron 8 som definert ifølge SEQ ID nr. 18, intron 9 som definert ifølge SEQ ID nr. 20, et fragment av intron 9 som definert ifølge SEQ ID nr. 20, intron 10 som definert ifølge SEQ ID nr. 22, et fragment av intron 10 som definert ifølge SEQ ID nr. 22, intron 11 som definert ifølge SEQ ID nr. 24, et fragment av intron 11 som definert ifølge SEQ ID nr. 24, intron 12 som definert ifølge SEQ ID nr. 26 og et fragment av intron 12 som definert ifølge SEQ ID nr. 26, (c) den tredje sekvensen kan ha minst 95 % sekvensidentitet med en sekvens valgt fra én eller flere i gruppen bestående av: SEQ ID nr. 27, et fragment av SEQ ID nr. 27, SEQ ID nr. 28, et fragment av SEQ ID nr. 28, SEQ ID nr. 29, et fragment av SEQ ID nr. 29, SEQ ID nr. 30, et fragment av SEQ ID nr. 30, SEQ ID nr. 31, et fragment av SEQ ID nr. 31, SEQ ID nr. 32, et fragment av SEQ ID nr. 32, SEQ ID nr. 33, et fragment av SEQ ID nr. 33, SEQ ID nr. 34, et fragment av SEQ ID nr. 34, SEQ ID nr. 35, et fragment av SEQ ID nr. 35, SEQ ID nr. 36, et fragment av SEQ ID nr. 36, SEQ ID nr. 37, et fragment av SEQ ID nr. 37, (d) den første sekvensen kan omfatte SEQ ID nr. 38, den andre sekvensen kan omfatte SEQ ID nr. 39 og den tredje sekvensen kan omfatte SEQ ID nr. 40, (e) den første sekvensen kan omfatte SEQ ID nr. 42, den andre sekvensen kan omfatte SEQ ID nr. 43 og den tredje sekvensen kan omfatte SEQ ID nr. 44, eller (f) én eller to eller tre av (a), (b), (c) og (e). I NtHMA-RNAi-konstruksjonen kan videre den første og andre sekvensen hver ha en lengde valgt fra gruppen bestående av nukleotider, nukleotider, nukleotider, nukleotider, nukleotider, nukleotider, nukleotider, nukleotider, nukleotider, og nukleotider. I et annet aspekt av oppfinnelsen blir det tilveiebrakt en ekspresjonsvektor omfattende en promoter posisjonert oppstrøms og operativt koblet til NtHMA- RNAi-konstruksjonen ifølge oppfinnelsen. I ekspresjonsvektoren kan promoteren være valgt fra gruppen bestående av: en vevsspesifikk promoter, en induserbar promoter og en konstitutiv promoter. Videre ifølge foreliggende oppfinnelse blir det tilveiebrakt en transgen plante omfattende RNAi-molekylet ifølge oppfinnelsen og som har reduserte Cd-nivåer i minst en del av planten sammenlignet med delen i et ikke-transgent motstykke. Den transgene planten kan være en tobakksplante. I et annet aspekt blir det tilveiebrakt et konsumerbart tobakksprodukt som inkorporerer blader som omfatter RNAi-molekylet ifølge oppfinnelsen og som er

6 høstet fra en transgen plante ifølge foreliggende oppfinnelse slik at bladene har redusert innhold av Cd sammenlignet med blader høstet fra en ikke-transgen motpart dyrket ved identiske betingelser, der produktet har reduserte Cd-nivåer sammenlignet med et produkt som inkorporerer blader høstet fra den ikke-transgene motparten, og der produktet er en sigar, en sigarett eller et røykfritt tobakksprodukt. I produktet ifølge oppfinnelsen kan en % Cd-reduksjon være en verdi på minst omtrent 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 %. Cd-innholdet kan være en verdi som strekker seg fra omtrent 0,01 til omtrent 0,05 ppm, fra omtrent 0,01 til omtrent 0,1 ppm, fra omtrent 0,01 til omtrent 0,5 ppm, fra omtrent 0,01 til omtrent 1,0 ppm eller fra omtrent 0,01 til omtrent 5 ppm. I et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse blir det tilveiebrakt en fremgangsmåte for å redusere Cd-nivåer i minst en del av en plante, omfattende å: redusere nivåene av et NtHMA-mRNA i planten ved å forårsake uttrykking av en RNAi-konstruksjon, der NtHMA er valgt fra gruppen bestående av: et polynukleotid som omfatter eller består av en sekvens som har minst 70 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 1, og som koder for en NtHMA-transporter som har P1B-type ATPase-aktivitet, et polynukleotid som omfatter eller består av en sekvens som har minst 50 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 3, et polynukleotid som omfatter eller består av en sekvens som har minst 50 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 47, et polynukleotid som omfatter eller består av en sekvens som koder for et polypeptid som har minst 70 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 2, der polypeptidet er en NtHMA-transporter som har P1B-type ATPase-aktivitet, og et polynukleotid som omfatter eller består av en sekvens som koder for et polypeptid som har minst 70 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 49, der polypeptidet er en NtHMA-transporter som har P1B-type ATPase-aktivitet. I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan RNAi-konstruksjonen omfatte: en første sekvens som har minst 90 % sekvensidentitet med en del av SEQ ID nr. 3 eller 47, en andre sekvens, og en tredje sekvens som har en revers komplementær sekvens av den første sekvensen, posisjonert i den samme orienteringen som den første sekvensen, der den andre sekvensen er posisjonert mellom den første sekvensen og den tredje sekvensen, og den andre sekvensen er operativt koplet til den første sekvensen og den tredje sekvensen.

7 5 Etter uttrykking av RNAi-konstruksjonen kan delen av planten ha et Cd-innhold som er redusert med minst omtrent 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % I tillegg eller alternativt, etter uttrykking av RNAi-konstruksjonen, så kan delen av planten ha et Cd-innhold som strekker seg fra omtrent 0,01 til omtrent 0,05 ppm, fra omtrent 0,01 til omtrent 0,1 ppm, fra omtrent 0,01 til omtrent 0,5 ppm, fra omtrent 0,01 til omtrent 1,0 ppm eller fra omtrent 0,01 til omtrent 5 ppm. Ytterligere og ulike aspekter (her også referert til som «utførelsesformer») av foreliggende oppfinnelse er beskrevet nedenfor. Kort beskrivelse av tegningene Figur 1 er en skjematisk fremstilling av en NtHMA-genomisk klon som omfatter 11 eksoner Figur 2A illustrerer et eksempel på en subklonestrategi for konstruering av en NtHMA-RNAi-ekspresjonsvektor som muliggjør den konstitutive uttrykkingen av NtHMA-RNAi-polynukleotider av interesse, som beskrevet i eksempel 2. Figur 2B illustrerer en hypotetisk dobbelttrådet RNA-dupleks utformet (som «stamme-løkke-stamme»-struktur) fra intra-molekylære basepar-interaksjoner inne i NtHMA-RNAi-polynukleotidet produsert som et produkt transkribert fra et eksempel på en NtHMA-RNAi-konstruksjon. Figur 3A viser et eksempel på en RNAi-sekvens, NtHMA ( ), for fremstilling av NtHMA-RNAi-polynukleotider av interesse, som beskrevet i eksempel 2. Figurene 3B-3D viser Cd-reduksjon i blader hos flere førstegenerasjons (T0) transgene linjer, som representerer tre varianter som har blitt genetisk modifisert til å uttrykke NtHMA-RNAi-polynukleotider ( ), som beskrevet i eksempel 5. Figur 4A viser et eksempel på en RNAi-sekvens, NtHMA ( ), for fremstilling av NtHMA-RNAi-polynukleotider av interesse, som beskrevet i eksempel 3. Figurene 4B-4D viser Cd-reduksjon i blader for flere førstegenerasjons (T0) transgene linjer, som representerer tre varianter som har blitt genetisk modifisert til å uttrykke NtHMA-RNAi-polynukleotider ( ), som beskrevet i eksempel 5. Figurene 5A-C viser normaliserte NtHMA-RNAi-transkriptnivåer i ulike førstegenerasjons (T0) transgene linjer som har blitt genetisk modifiserte til å

8 6 uttrykke NtHMA-RNAi-polynukleotider av interesse, som bestemt ved kvalitativ sanntid-pcr-analyse av bladekstrakter, som beskrevet i eksempel Figur 6 viser fordelingen av Cd og Zn i blader og roten i ulike førstegenerasjons (T0) transgene linjer som har blitt genetisk modifisert for å uttrykke NtHMA-RNAipolynukleotider av interesse, som vist i tabell 2 og beskrevet i eksempel 7. Figur 7 viser Cd-fordeling i bark- («B»), blad- («L»), marg- («P») og rotvev ((«R») i ulike førstegenerasjons (T0) transgene linjer som har blitt genetisk modifisert for å uttrykke NtHMA-RNAi-polynukleotider av interesse, som presentert i tabell 3 og beskrevet i eksempel 8. Figur 8 viser Cd-fordeling mellom bladet («L») og roten («R») i ulike andregenerasjons (T1) transgene linjer som har blitt genetisk modifisert for å uttrykke NtHMA-RNAi-polynukleotider av interesse, som beskrevet i eksempel 9. Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen I. Isolering av tobakk-nthma-gener og genprodukter Figur 1 er en skjematisk fremstilling av en NtHMA-genomisk klon som omfatter 11 eksoner som koder for en tungmetalltransporter som er beslektet med HMAfamilien av transportere. Eksempel 1 beskriver videre identifiseringen av den NtHMA-genomiske klonen (_HO-18-2) og 4 NtHMA-cDNA-kloner. Tabell 1 nedenfor viser nukleotidposisjonene som tilsvarer ekson- og intron-underregioner kartlagt med den NtHMA-genomiske klonen (_HO-18-2). A. NtHMA-polynukleotider Uttrykket «polynukleotid» refererer til en polymer av nukleotider som omfatter minst 10 baser i lengde. Polynukleotidene kan være DNA, RNA eller en DNA/RNA-hybrid som omfatter ribonukleotider, deoksyribonukleotider, kombinasjoner av deoksyribo- og ribonukleotider, og kombinasjoner av baser og/eller modifiseringer, inkludert uracil, adenin, tymin, cytosin, guanin, inosin, xantin, hypoxantin, isocytosin og isoguanin. Uttrykket inkluderer enkelt- og dobbelttrådede former av DNA eller RNA. Uttrykket «DNA» inkluderer genomiske DNA er, cdna er, kjemisk syntetiserte DNA er, PCR-amplifiserte DNA er og kombinasjoner/ekvivalenter derav. Uttrykket «isolert polynukleotid» refererer til et polynukleotid som ikke henger sammen med noe opphavsgenom, eller separert fra en nativ kontekst. Uttrykket inkluderer ethvert rekombinant polynukleotidmolekyl slik som NtHMA-RNAi-konstruksjoner, NtHMA-RNAi-ekspresjonsvektorer, NtHMA-genomiske kloner og fragmenter og varianter derav. Som vist på figur 1 omfatter den NtHMA-genomiske klonen som er betegnet SEQ ID nr. 1: intron 1 (SEQ ID nr. 4), ekson 1 (SEQ ID nr. 5), intron 2 (SEQ ID nr. 6),

9 ekson 2 (SEQ ID nr. 7), intron 3 (SEQ ID nr. 8), ekson 3 (SEQ ID nr. 9), intron 4 (SEQ ID nr. 10), ekson 4 (SEQ ID nr. 11), intron 5 (SEQ ID nr. 12), ekson 5 (SEQ ID nr. 13), intron 6 (SEQ ID nr. 14), ekson 6 (SEQ ID nr. 15), intron 7 (SEQ ID nr. 16), ekson 7 (SEQ ID nr. 17), intron 8 (SEQ ID nr. 18), ekson 8 (SEQ ID nr. 19), intron 9 (SEQ ID nr. 20), ekson 9 (SEQ ID nr. 21), intron 10 (SEQ ID nr. 22), ekson 10 (SEQ ID nr. 23), intron 11 (SEQ ID nr. 24), ekson 11 (SEQ ID nr. 25) og intron 12 (SEQ ID nr. 26). For sekvenser, se sekvenslisten nedenfor. Referanse-eksempler er rettet på isolerte polynukleotider som representerer genomiske fragmenter isolert på NtHMA-lokuset, som omfatter SEQ ID nr. 1, fragmenter av SEQ ID nr. 1, eller varianter derav. Referanse-eksempler er rettet på isolerte NtHMApolynukleotidvarianter som omfatter minst 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 1, eller fragmenter av SEQ ID nr. 1. Referanse-eksempler er rettet på isolerte polynukleotider som har sekvenser som komplementerer den for NtHMA-polynukleotidvarianter som omfatter minst 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 1, eller fragmenter av SEQ ID nr. 1. Referanse-eksempler er rettet på isolerte polynukleotider som ved moderate til høyt stringente betingelser spesifikt kan hybridisere med polynukleotider som omfatter SEQ ID nr. 1, eller fragmenter av SEQ ID nr. 1. Referanse-eksempler er rettet på isolerte polynukleotider av NtHMA-cDNA (klon P6663), omfattende SEQ ID nr. 3, fragmenter av SEQ ID nr. 3, eller varianter derav. Referanse-eksempler er rettet på isolerte NtHMA-polynukleotidvarianter som omfatter minst 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 3, eller fragmenter av SEQ ID nr. 3. Referanseeksempler er rettet på isolerte NtHMA-polyribonukleotidvarianter som omfatter minst 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 3, eller fragmenter av SEQ ID nr. 3, og der T er har blitt substituert med U er (f.eks. RNA er). Referanse-eksempler er rettet på isolerte polynukleotider som under moderate til høyt stringente betingelser spesifikt kan hybridisere med polynukleotider som omfatter SEQ ID nr. 3, eller fragmenter av SEQ ID nr. 3. Referanse-eksempler er rettet på isolerte polynukleotider som har en sekvens som komplementerer den for NtHMA-polynukleotidvarianter som omfatter minst 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 3, eller fragmenter av SEQ ID nr. 3. Referanse-eksempler er rettet på isolerte polynukleotider av NtHMA-cDNA (klon P6643), som omfatter SEQ ID nr. 47, fragmenter av SEQ ID nr. 47, eller varianter derav. Referanse-eksempler er rettet på isolerte NtHMA-polynukleotidvarianter som omfatter 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 47, eller fragmenter av SEQ ID nr. 47.

10 Referanse-eksempler er rettet på isolerte NtHMA-polyribonukleotidvarianter som omfatter minst 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 47, fragmenter av SEQ ID nr. 47, og der T er har blitt substituert med U er (f.eks. RNA er). Referanse-eksempler er rettet på isolerte polynukleotider som under moderate til høyt stringente betingelser spesifikt kan hybridisere med polynukleotider som omfatter SEQ ID nr. 47, fragmeter av SEQ ID nr. 47. Referanse-eksempler er rettet på isolerte polynukleotider som har en sekvens som komplementerer den for NtHMA-polynukleotidvarianter som omfatter minst 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 47, fragmenter av SEQ ID nr. 47. Referanse-eksempler er rettet på biopolymerer som er homologe med NtHMApolynukleotider og NtHMA-polypeptider («NtHMA-homologer»), som kan bli identifisert fra ulike plantearter. F.eks. kan NtHMA-homologer bli eksperimentelt isolert ved å screene passende nukleinsyrebiblioteker som er utledet fra ulike plantearter av interesse. Alternativt kan NtHMA-homologer bli identifisert ved screening av genomdatabaser inneholdende sekvenser fra én eller flere arter som benytter en sekvens utledet fra NtHMA-polynukleotider og/eller NtHMApolypeptider. Slike genomdatabaser er enkelt tilgjengelige for et antall arter (f.eks. på internett (www) på tigr.org/tdb, genetics.wisc.edu, stanford.edu/.about.ball, hivweb.lan1.gov, ncbi.nlm.nig.gov, ebi.ac.uk og pasteur.fr/other/biology). Degenererte oligonukleotidsekvenser kan f.eks. bli oppnådd ved «tilbake-translasjon» fra NtHMA-polypeptidfragmenter. NtHMA-polynukleotider kan bli benyttet som prober eller primere for å identifisere/amplifisere beslektede sekvenser, eller for å oppnå fullengde-sekvenser for beslektede NtHMA er ved f.eks. PCR, eller ved hjelp av andre velkjente teknikker (se f.eks. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, Inc. (1990)). B. NtHMA-polypeptider Uttrykket «NtHMA-polypeptid» refererer til et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens betegnet som SEQ ID nr. 2, polypeptider som har vesentlig homologi (dvs., sekvenslikhet) eller vesentlig identitet med SEQ ID nr. 2, fragmenter av SEQ ID nr. 2, og varianter derav. NtHMA-polypeptidene inkluderer sekvenser som har tilstrekkelig eller vesentlig identitetsgrad eller likhet med SEQ ID nr. 2 og som kan virke ved å transportere tungmetaller over cellemembraner. NtHMA-polypeptider inkluderer varianter fremstilt ved introdusering av enhver type endring (f.eks. innskudd, delesjoner eller substitusjoner av aminosyrer, endringer i glykosyleringstilstander, endringer som påvirker refolding eller isomeriseringer, tredimensjonale strukturer eller selv-assosieringstilstander) som med hensikt kan bli fremstilt eller isolert naturlig. NtHMA-polypeptider kan være lineære eller syklisert ved å benytte kjente fremgangsmåter (f.eks. H.U. Saragovi, et

11 9 al., Bio/Technology 10, 773 (1992), og R.S. McDowell et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9245 (1992) der begge herved er tatt inn ved referanse). NtHMA-polypeptider omfatter minst 8 til 10, minst 20, minst 30 eller minst 40 sammenhengende aminosyrer Referanse-eksempler er rettet på isolerte NtHMA-polypeptider som det er kodet for av polynukleotidsekvens SEQ ID nr. 1, omfattende SEQ ID nr. 2, fragmenter av SEQ ID nr. 2, eller varianter derav. Referanse-eksempler er rettet på isolerte NtHMA-polypeptidvarianter som omfatter minst 70 %, 75 5, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 2, eller fragmenter av SEQ ID nr. 2. Referanse-eksempler er rettet på isolerte NtHMA-polypeptider (klon P6663) omfattende SEQ ID nr. 2, fragmenter av SEQ ID nr. 2 eller varianter derav. Referanse-eksempler er rettet på isolerte NtHMA-polypeptidvarianter som omfatter minst70 %, 75 5, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 2, eller fragmenter av SEQ ID nr. 2. Referanse-eksempler er rettet på isolerte NtHMA-polypeptider (klon P6643), omfattende SEQ ID nr. 49, fragmenter av SEQ ID nr. 49, eller varianter derav. Referanse-eksempler er rettet på isolerte NtHMA-polypeptidvarianter omfattende minst 70 %, 75 5, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 49, eller fragmenter av SEQ ID nr. 49. II. Sammensetninger og relaterte fremgangsmåter for reduksjon av NtHMAgenuttrykking og/eller NtHMA-mediert transporteraktivitet Passende antagonistiske sammensetninger som kan nedregulere uttrykkingen og/eller aktiviteten av NtHMA og NtHMA-varianter inkluderer sekvens-spesifikke polynukleotider som kan interferere med transkripsjonen av ett eller flere endogene NtHMA-gener, sekvensspesifikke polynukleotider som kan interferere med translasjonen av NtHMA-RNA-transkripter (f.eks. dsrna, sirna, ribozymer), sekvensspesifikke polypeptider som kan interferere med proteinstabiliteten til NtHMA, den enzymatiske aktiviteten til NtHMA og/eller bindingsaktiviteten til NtHMA med hensyn på substrater og/eller regulatoriske proteiner, antistoffer som oppviser spesifisitet for NtHMA, og små molekylforbindelser som kan interferere med proteinstabiliteten til NtHMA, den enzymatiske aktiviteten til NtHMA og/eller bindingsaktiviteten til NtHMA. En effektiv antagonist kan redusere tungmetall (f.eks. Cd)-transport inn i bladoverflatestrukturer med minst 5 %, 10 %, 15 %. 220 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % eller 95 %.

12 10 A. Definisjoner Gjennom hele denne beskrivelsen og i de tilhørende kravene virker uttrykkene «en» og «et» som singulære referanser og flertallsreferanser dersom ikke konteksten klart sier noe annet. En referanse til «et RNAi-polynukleotid» inkluderer slik et flertall av slike RNAi-polynukleotider, og en referanse til «planten» inkluderer referanser til én eller flere slike planter. Uttrykket «orientering» refererer til en spesifikk rekkefølge i plasseringen av et polynukleotid relativt posisjonen til et referansepolynukleotid. Et lineært DNA har to mulige orienteringer: 5 -til-3 retning og den 3 -til-5 retningen. Dersom en referansesekvens er posisjonert i den 5 -til-3 retningen, og dersom en annen sekvens er posisjonert i den 5 -til-3 retningen i det samme polynukleotidmolekylet/-tråden da er for eksempel referansesekvensen og den andre sekvensen orientert i den samme retningen, eller har den samme orienteringen. Typisk er en promotersekvens og et gen av interesse under reguleringen av den gitte promoteren posisjonert i den samme orienteringen. Med hensyn på referansesekvensen som er posisjonert i den 5 -til-3 retningen, dersom en annen sekvens er posisjonert i den 3 -til-5 retningen i det samme polynukleotidmolekylet/-tråden, så er imidlertid referansesekvensen og den andre sekvensen orientert i anti-sensretning, eller har anti-sensorientering. To sekvenser som har anti-sensorienteringer med hensyn på hverandre kan alternativt bli beskrevet som å ha den samme orienteringen, dersom referansesekvensen (5 -til-3 retning) og den reverse komplementære sekvensen til referansesekvensen (referansesekvens posisjonert i 5 -til3 retningen) er posisjonert i det samme polynukleotidmolekylet/-tråden. Uttrykket «NtHMA-RNAi-ekspresjonsvektor» refererer til en nukleinsyrevehikkel som omfatter en kombinasjon av DNA-komponenter for å muliggjøre transporten og uttrykkingen av NtHMA-RNAi-konstruksjoner. Passende ekspresjonsvektorer inkluderer episomer som er i stand til ekstra-kromosomal replikasjon slik som sirkulære, dobbelttrådede DNA-plasmider, lineariserte dobbelttrådede DNAplasmider og andre funskjonelt ekvivalente ekspresjonsvektorer av ethvert opphav. En passende NtHMA-RNAi-ekspresjonsvektor omfatter minst en promoter posisjonert oppstrøms og operativt koplet til en NtHMA-RNAi-konstruksjon, som definert nedenfor. Uttrykket «NtHMA-RNAi-konstruksjon» refererer til et dobbelttrådet, rekombinant DNA-fragment som koder for «NtHMA-RNAi-polynukleotider» som har RNAinterferensaktivitet. En NtHMA-RNAi-konstruksjon omfatter en «templattråd» som er baseparet med en komplementær «senstråd eller kodende tråd». En gitt NtHMA- RNAi-konstruksjon kan bli satt inn i en NtHMA-RNAi-ekspresjonsvektor i to mulige orienteringer, enten i den samme orienteringen (sens) eller i den reverserte

13 11 (anti-sens) orienteringen med hensyn på orienteringen til en promoter posisjonert i en NtHMA-RNAi-ekspresjonsvektor Uttrykket «NtHMA-RNAi-polynukleotider» kan være rettet på NtHMA-RNA for enzymatisk degradering som involverer dannelsen av mindre fragmenter av NtHMA-RNAi-polynukleotider («sirna») som kan binde til mange komplementære sekvenser i mål-nthma-rna-molekylet. Uttrykkingsnivåer av ett eller flere NtHMA-gener kan bli redusert med RNA-interferensaktiviteten til NtHMA-RNAi-polynukleotidene. Uttrykket «templattråd» refererer til tråden som omfatter en sekvens som komplementerer «senstråden eller den kodende tråden» i en DNA-dupleks, slik som NtHMA-genomisk fragment, NtHMA-cDNA eller NtHMA-RNAi-konstruksjon, eller ethvert DNA-fragment som omfatter en nukleinsyresekvens som kan bli transkribert av RNA-polymerase. Under transkripsjon kan RNA-polymerase translokeres langs templattråden i den 3 -til-5 retningen under syntese av nakent RNA. Uttrykkene «senstråd» eller «kodende tråd» refererer til tråden som omfatter en sekvens som komplementerer den for templattråden i en DNA-dupleks. F.eks. er sekvensen til senstråden («sens-sekvens») for den identifiserte NtHMA-genomiske klonen betegnet SEQ ID nr. 1. F.eks. er sens-sekvensen for NtHMA-cDNA, identifisert som klon P6663, betegnet som SEQ ID nr. 3. F.eks. er sens-sekvensen for NtHMA-cDNA, identifisert som klonp6643, betegnet SEQ ID nr. 46. Dersom senstråden omfatter en hypotetisk sekvens 5 -TAATCCGGT-3 så er f.eks. den vesentlig identiske, tilsvarende sekvensen med et hypotetisk mål-mrna 5 - UAAUCCGGU-3. Uttrykket «revers komplementær sekvens» refererer til sekvensen som komplementerer «sens-sekvensen» av interesse (f.eks. ekson-sekvens) posisjonert i den samme tråden, i den samme orienteringen med hensyn på sens-sekvensen. Dersom en tråd f.eks. omfatter en hypotetisk sekvens 5 -TAATCCGGT-3 så kan den reverse komplementære sekvensen 5 -ACCGGATTA-3 være operativt koplet til sens-sekvensen, separert med en spacer-sekvens. Uttrykkene «NtHMA-RNA-transkript» eller «NtHMA-RNA» refererer i konteksten av RNA-interferens til polyribonukleinsyremolekyler fremstilt i en vertsplantecelle av interesse, som skyldes transkripsjonen av endogene gener i HMA-familien, inkludert det isolerte NtHMA-genet (SEQ ID nr. 1). Dermed inkluderer disse uttrykkene enhver type RNA eller RNA-varianter fremstilt som transkripsjonsprodukter fra HMA-relaterte gener som kan være distinkte fra det isolerte NtHMA-genet (SEQ ID nr. 1) men som har tilstrekkelig likhet på strukturelle og/eller funksjonelle nivåer til å bli klassifisert i den samme familien, F.eks. dersom en vertsplantecelle valgt for genetisk modifisering i overensstemmelse med de tilkjennegitte fremgangsmåtene er tobakk, da inkluderer

14 mål-nthma-rna-transkripter: (1) pre-mrna-molekyler og mrna-molekyler produsert fra transkripsjonen av det isolerte NtHMA-genet (SEQ ID nr. 1), (2) premrna-molekyler og mrna-molekyler produsert fra transkripsjonen av ethvert gen som har minst 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 5, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % og 99 % sekvensidentitet med sekvensen til det isolerte NtHMA-genet (SEQ ID nr. 1) (dvs., andre distinkte gener som er vesentlig identiske med det identifiserte NtHMA-genet og som koder for beslektede isoformer av HMAtransportere) og (3) pre-mrna-molekyler og mrna-molekyler produsert fra transkripsjonen av alleler av NtHMA-genet (SEQ ID nr. 1). NtHMA-RNAtranskriptene inkluderer RNA-varianter produsert som et resultat av alternative RNA-spleisereaksjoner av heteronukleære RNA-molekyler «hnrna») av et spesifikt NtHMA-gen. mrna-varianter som er resultatet av slike alternative RNAspleisereaksjoner, og enhver intermediær RNA-variant. Uttrykkene «homologi» eller «identitet» eller «likhet» refererer til graden av sekvenslikhet mellom to polypeptider eller mellom to nukleinsyremolekyler sammenlignet med sekvenssammenstilling. Graden av homologi mellom to diskrete nukleinsyresekvenser som blir sammenlignet er en funksjon av antallet identiske, eller matchende, nukleotider på sammenlignbare posisjoner. Den prosentvise identiteten kan bli bestemt ved visuell inspeksjon og matematisk beregning. Alternativt kan den prosentvise identiteten for to nukleinsyresekvenser bli bestemt ved å sammenligne sekvensinformasjon ved å benytte GAP-dataprogrammet, versjon 6.0 beskrevet av Devereux et al., (Nucl. Acids. Res. 12:387, 1984) og som er tilgjengelig fra the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Typiske forhåndssatte parametere for GAP-programmet inkluderer: (1) en ensartet sammenligningsmatriks (innholdende en verdi på 1 for identiteter og 0 for ikke-identiteter) for nukleotider, og den vektede sammenligningsmatriksen til Gribskov og Burgess, Nucl. Acids. Res. 14:6745, 1986 som beskrevet av Schwartz og Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, s , 1979, (2) en straff på 3.0 for hver åpning o gen ytterligere 0,10 straff for hvert symbol i hver åpning, og (3) ingen straff for endeåpninger. Ulike programmer som er kjente for fagfolk på området for sekvenssammenligning kan bli benyttet alternativt. Uttrykket «oppstrøms» refererer til en relativ retning/posisjon med hensyn på et referanse-element langs en lineær polynukleotidsekvens, som indikerer en retning/posisjon mot den 5 enden av polynukleotidsekvensen. «Oppstrøms» kan bli benyttet i stedet for «5 ende av et referanse-element». Uttrykket «operativt koplet» refererer til sammenføyningen av distinkte DNAelementer, fragmenter eller sekvenser for å produsere en funksjonell transkripsjonsenhet eller en funksjonell ekspresjonsvektor.

15 Uttrykket «promoter» refererer til et nukleinsyre-element/-sekvens som typisk er posisjonert oppstrøms for og operativt koplet til et dobbelttrådet DNA-fragment, slik som en NtHMA-RNAi-konstruksjon. F.eks. muliggjør en passende promoter transkripsjonsaktiveringen av en NtHMA-RNAi-konstruksjon ved å rekruttere transkripsjonskomplekset, inkludert RNA-polymerasen og ulike faktorer, for å sette i gang RNA-syntese. «Promotere» kan i sin helet være avledet fra regioner proksimalt for et nativt gen av interesse, eller kan være sammensatt av ulike elementer utledet fra ulike native promoterer og/eller syntetiske DNA-segmenter. Passende promotere inkluderer vevsspesifikke promotere gjenkjent av vevsspesifikke faktorer som er til stede i ulike vev eller celletyper (f.eks. rotspesifikke («root-specific») promoterer, skyte-spesifikke («shoot-specific») promoterer, xylem-spesifikke promoterer) eller er til stede under ulike utviklingstrinn, eller til stede som respons på ulike miljøbetingelser. Passende promoterer inkluderer konstitutive promoterer som kan bli aktivert i de fleste celletyper uten å kreve spesifikke induserere. Eksempler på passende promoterer for kontroll av NtHMA-RNAi-polypeptidproduksjon inkluderer blomkål-mosaikkvirus 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos eller ubiquitin- eller faseolin-promoterer. Fagfolk på området er i stand til å generere mange variasjoner av rekombinante promoterer, som beskrevet i et antall referanser slik som Okamuro og Goldberg, Biochemistry of Plants, vol.15: s.1-82 (1989). Vevsspesifikke promotere er transkripsjonskontrollelementer som kun er aktive i spesifikke celler eller vev på spesifikke tidspunkter under planteutvikling, slik som i vegetative vev eller reproduksjonsvev. Vevsspesifikk uttrykking kan være fordelaktig, f.eks. når uttrykkingen av polynukleotider i visse vev er foretrukket. Eksempler på vevsspesifikke promoterer under utviklingsmessig kontroll inkluderer promoterer som kan sette i gang transkripsjon kun (eller primært kun) i visse vev, slik som vegetative vev, f.eks. røtter eller blader, eller reproduktive vev, slik som frukt, frøanlegg, frø, pollen, blomster eller ethvert embryonalt vev. Reproduksjonsvevsspesifikke promotere kan f.eks. være støvknappspesifikke, frøanleggspesifikke, embryospesifikke, endospermspesifikke, hinnespesifikke, frøog frøkapselspesifikke, pollenspesifikke, kronbladspesifikke, begerbladspesifikke eller kombinasjoner derav. Passende bladspesifikke promoterer inkluderer pyruvat, ortofosfatdikinase (PPDK)- promoter fra C4-plante (mais), cab-m1ca+2-promoter fra mais, Arabidopsis thaliana myb-relatert genpromotor (Atmyb5), ribulosebifosfatkarboksylase (RBCS)- promoterer (f.eks. tomat RBCS1-, RBCS2- og RBCS3-genene uttrykt i blader og lysdyrkede frøplanter, RBCS1 og RBCS2 uttrykt i utviklende tomatfrukter og/eller ribulosefosfatkarboksylasepromoter uttrykt nesten utelukkende i mesofyllceller i løvblader og løvkapper i høye nivåer). Passende aldringsspesifikke promoterer inkluderer en tomatpromoter som er aktiv under fruktmodning, aldring og bladfelling av blader, en maispromoter for gen som

16 koder for en cysteinprotease. Passende støvknapp-spesifikke promoterer kan bli benyttet. Slike promoterer er velkjente på fagområdet og kan bli oppdaget med kjente teknikker, se f.eks. Bhalla og Singh (1999) Molecular control of male fertility in Brassica, Proc. 10th Annual Rapeseed Congress, Canberra, Australia, van Tunen et al., (1990) Pollen and anther-specific chi promoters from petunia: tandem promoter regulation of the chia gene. Plant Cell 2:393-40, Jeon et al., (1999) Isolation and characterization of an anther-specific gene, RA8, from rice (Oryza sativa L). Plant Molecular Biology 39:35-44 og Tweet et al., (1993) Activation and developmental regulation of an Arabidopsis anther-specific promoter in minispores and pollen of Nicotiana tabacum. Sex Plant Reprod. 6: Passende rot-foretrukne promoterer som er kjent for fagfolk på området kan bli valgt. Se f.eks. Hire et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20(2): (søyabønnerotspesifikt glutaminsyntetasegen), Keller og Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10): (rotspesifikt kontrollelement i GRP 1.8-gen i snittebønne), Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): (rotspesifikk promoter fir manniopinsyntase (MAS)-genet i Agrobacterium tumefaciens) og Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (fullengde-cdna-klon som koder for cytosolisk glutamin syntetase (GS) som blir uttrykt i røtter og rotknoller i søyabønne). Se også Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7): , der to rotspesifikke promoterer isolert fra hemoglobingener fra den nitrogenfikserende ikke-belgfrukten Parasponia andersonii og den beslektede ikke-nitrogenfikserende ikke-belgfrukten Trema tomentosa er beskrevet. Passende frø-foretrukne promoterer inkluderer både frø-spesifikke promoterer (de promoterene som er aktive under frøutvikling slik som promoterer for frølagringsproteiner) og frøspirende promoterer (de promoterene som er aktive under frøspiring). Se f.eks. Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108, som er inntatt ved referanse. Slike frø-foretrukne promoterer inkluderer, men er ikke begrenset til, Cim1 (cytokinin-indusert beskjed), cz19b1 (mais 19 kda zein), milps (myoinositol-1-fosfatsyntase), mze40-2, også kjent som Zm-40 (US patent nr. 6,403,862), nuclc (US patent nr. 6,407,315) og cela (cellulose-syntase) (se WO 00/11177). Gama-zein er en endosperm-spesifikk promoter. Glob-1 er en embryospesifikk promoter. For tofrøblader inkluderer frøspesifikke promoterer, men er ikke begrenset til, bønne.beta.-faseolin, napin,.beta.-konglysinin, soyabønne, lektin, krusiferin og liknende. For enfrøbladede planter inkluderer frøspesifikke promoterer, men er ikke begrenset til, en mais 15 kda zein-promoter, en 22 kda zein-promoter, en 27 kda zein-promoter, en g-zein-promoter, en 27 kd.gamma.zein-promoter (slik som gzw64a-promoter, se GenBank aksesjonsnummer #S78780), en waxy promoter, en shrunken1-promoter, en shrunken2-promoter, en globulin1-promoter (se GenBank aksesjonsnummer #L22344), en ltp2-promoter (Kalla et al., Plant Journal 6: (1994), US patent nr. 5,525,716), cim1-promoter (se US pat nr. 6,225,529) mais end1- og end2-

17 promoterer (se US patent nr. 6,528,704 og søknad 10/310,191, innsendt 4.desember 2002), nuc1-promoter (US patent nr. 6,407,315), Zm40-promoter (US patent nr. 6,403,862), eep1 og eep2, lec1 (US patentsøknad serienummer 09/718,754), tioredoksinh-promoter (US provisional patentsøknad 60/514,123), mlip15-promoter (US patent nr. 6,479,734), PCNA2-promoter, og shrunken2-promoteren. (Shaw et al., Plant Phys. 98: , 1992, Zhong Chen et al., PNAS USA 100: , 2003). Eksempler på induserbare promoterer inkluderer promoterer som er responsive på patogenangrep, anaerobe betingelser, forhøyet temperatur, lys, tørke, kald temperatur eller høy saltkonsentrasjon. Patogeninduserbare promoterer inkluderer de fra patogenese-relaterte proteiner (PR-proteiner) som blir indusert etter infeksjon med et patogen (f.eks. PR-proteiner, SAR-proteiner, beta-1,3-glukanase, kitinase). Se f.eks. Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: , Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: , og Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: Se også søknaden med tittel «Inducible Maize Promoters», US patentsøknad serienr. 09/257,583, innsendt 25.februar I tillegg til plantepromoterer kan andre passende promoterer bli avledet fra bakterieopphav (f.eks. oktopinsyntase-promoteren, nopalinsyntasepromoteren og andre promoterer avledet fra Ti-plasmider) eller kan være avledet fra viruspromoterer (f.eks. 35S og 19S RNA-promoterer fra blomkålmosaikkvirus (CaMV), konstitutive promoterer av tobakkmosaikkvirus, blomkålmosaikkvirus (CaMV) 19S og 35S promoterer eller brunrotmosaikkvirus-35s-promoter). Uttrykket «enhancer» refererer til et nukleinsyremolekyl, eller en nukleinsyresekvens, som kan rekruttere transkripsjonsregulatoriske proteiner slik som transkripsjonsaktivatorer, for å forsterke transkripsjonsaktivering ved å øke promoteraktivitet. Passende enhancere kan bli utledet fra regioner proksimat til en nativ promoter av interesse (homologe kilder) eller kan bli avledet fra ikke-native kontekster (heterologe kilder) og operativt koplet til enhver promoter av interesse i NtHMA-RNAi-ekspresjonsvektorer for å forsterke aktiviteten og/eller vevsspesifisiteten til en promoter. Noen enhancere kan virke i enhver retning med hensyn på orienteringen av en transkripsjonsenhet. F.eks. kan enhancere være posisjonert oppstrøms eller nedstrøms for en transkripsjonsenhet omfattende en promoter og en NtHMA-RNAi-konstruksjon. Fagfolk på området er i stand til operativt å kople enhancere og promoterer for å optimalisere transkripsjonsnivåene av NtHMA-RNAi-konstruksjoner. B. RNAi-ekspresjonsvektorer omfattende NtHMA-RNAi-konstruksjoner som koder for NtHMA-RNAi-polynukleotider.

18 RNA-interferens («RNAi») eller RNA-silencing er en evolusjonært konservert prosess ved hvilken spesifikke mrna-molekyler kan bli styrt mot enzymatisk nedbrytning. Et dobbelttrådet RNA (dsrna) må bli introdusert eller produsert av en celle (f.eks. dsrna-virus eller NtHMA-RNAi-polynukleotider) for å sette i gang RNAi-veien. dsrna kan bli konvertert til flere sirna-duplekser med lengde på bp («sirna») med RNaseIII, som er dsrna-spesifikke endonukleaser («Dicer»). sirna-molekylene kan deretter bli gjenkjent av RNA-induserte silencing-komplekser («RISC») som fremmer utkveilingen av sirna via en ATPavhengig prosess. Den utkveilede antisenstråden til sirna-molekylet leder den aktiverte RISC til det målsøkte mrna-molekylet (f.eks. NtHMA-RNA-varianter) omfattende en sekvens som er komplementær med sirna-antisenstråden. Det målsøkte mrna og antisenstråden kan danne en A-form heliks, og den store furen i A-form heliksen kan bli gjenkjent av det aktiverte RISC. Det målsøkte mrna kan bli kløyvd med aktivert RISC på et enkelt sete definert ved bindingssetet på den 5 - enden av sirna-tråden. Det aktiverte RISC kan bli resirkulert for å katalysere en annen kløyvingshendelse. Figur 2A illustrerer konstruksjonen av et eksempel på en NtHMA-RNAiekspresjonsvektor. På figur 2A betegner «S I» trinn I og «S II» betegner trinn II i konstruksjonsprosessen. Ulike utførelsesformer er rettet på NtHMA-RNAiekspresjonsvektorer omfattende NtHMA-RNAi-konstruksjoner som koder for NtHMA-RNAi-polynukleotider som oppviser RNA-interferensaktivitet ved å redusere uttrykkingsnivået av NtHMA-mRNA-molekyler, NtHMA-pre-mRNAmolekyler og relaterte NtHMA-RNA-varianter. Ekspresjonsvektorene omfatter en promoter posisjonert oppstrøms og operativt koplet til NtHMA-RNAikonstruksjonen, som ytterligere definert nedenfor. NtHMA-RNAiekspresjonsvektorene omfatter en passende, minimal kjernepromoter, en NtHMA- RNAi-konstruksjon av interesse, en oppstrøms (5 ) regulatorisk region, en nedstrøms (3 ) regulatorisk region, inkludert transkripsjonsterminerings- og polyadenyleringssignaler, og andre sekvenser som er kjente for fagfolk på området, slik som ulike seleksjonsmarkører. NtHMA-polynukleotidene kan bli produsert i ulike former, inkludert som dobbelttrådede hårnålliknende strukturer («dsrnai»). NtHMA-dsRNAi kan enzymatisk bli konvertert til dobbelttrådede NtHMA-siRNA-molekyler. Én av trådene i NtHMA-siRNA-dupleksen kan smelte sammen med en komplementær sekvens i mål-nthma-mrna-molekylet og relaterte NtHMA-RNA-varianter. sirna/mrna-dupleksene blir gjenkjent av RISC som kan kløyve NtHMA-RNAmolekyler på flere steder på en sekvensavhengig måte, noe som fører til nedbrytningen av mål-nthma-mrna-molekylet og relaterte NtHMA-RNAvarianter. Figur 2B illustrerer dannelsen av en hypotetisk dobbelttrådet RNA-dupleks utformet (som «stamme-løkke-stamme»-struktur) som et produkt transkribert fra et eksempel

19 på en NtHMA-RNAi-konstruksjon. På figur 2B er en hypotetisk NtHMA-RNAikonstruksjon 10 vist, omfattende 3 dobbelttrådede DNA-fragmenter, slik som fragmenter 1-3. Pil I betegner dannelse av RNAi-konstruksjon, pil II transkripsjon og pil III dannelse av dsrna. Fragment 1 er posisjonert oppstrøms og operativt koplet til fragment 2, som er posisjonert oppstrøms og operativt koplet til fragment 3, for hvilket DNA-tråder/-sekvenser 4, 6 og 8 er koplet sammen i tandem for å danne tråd 11, som vist. Alternativt omfatter en NtHMA-RNAi-konstruksjon «en sens-sekvens» 5 som er posisjonert oppstrøms og operativt koplet til en «spacersekvens» 7 som er posisjonert oppstrøms og operativt koplet til en «revers komplementær sekvens» 9. Trådene/sekvensene 5, 7 og 9 kan bli koplet sammen i tandem for å danne tråd/sekvens 12. Alternativt omfatter en NtHMA-RNAikonstruksjon en «sens-sekvens» 8 som er posisjonert oppstrøms og operativt koplet til en «spacer-sekvens» 6 som er posisjonert oppstrøms og operativt koplet til en «revers komplementær sekvens» 4. Trådene/sekvensene 8, 6 og 4 kan bli koplet sammen i tandem for å danne tråd/sekvens 11. Tråd 12 er komplementær med tråd 11. Tråd 11 er en templattråd som kan bli transkribert til et NtHMA-RNAipolynukleotid 13. NtHMA-RNAi-polynukleotidet 13 danner en hårnålstruktur («stamme-løkke-stamme») der stammen 16 er en komplementær region som oppstår ved baseparinteraksjoner i NtHMA-RNAi-polynukleotidet 15 og løkken 17 representerer en ikke-komplementær region kodet for av en spacer-sekvens, slik som trådene/sekvensene 6 eller 7. Ethvert NtHMA-RNA-polynukleotid av interesse kan bli produsert ved å velge en passende sekvenssammensetning, løkkestørrelse og stammelengde for fremstilling av NtHMA-hårnålsdupleksen. Et passende område for design av stammelengder for en hårnålsdupleks inkluderer stammelengder på nukleotider, nukleotider, nukleotider, nukleotider, nukleotider, nukleotider, nukleotider, nukleotider, nukleotider og nukleotider. Et passende område for design av løkkelengder for en hårnålsdupleks inkluderer løkkelengder på 4-25 nukleotider, nukleotider eller lengre dersom stammelengden på hårnålsdupleksen er vesentlig. I en viss kontekst kan hårnålsstrukturer med dupleksregioner som er lengre enn 21 nukleotider fremme effektiv sirna-rettet silencing, uavhengig av løkkesekvens og lengde. Eksempler på NtHMA-RNAi-konstruksjoner for nedregulering av uttrykkingsnivået av NtHMA-genet (SEQ ID nr. 1) og andre NtHMA-relaterte gener inkluderer de følgende: Ulike utførelsesformer er rettet på NtHMA-RNAi-ekspresjonsvektorer som omfatter en NtHMA-RNAi-konstruksjon som omfatter én eller flere av: intron 1 (SEQ ID nr. 4), ekson 1 (SEQ ID nr. 5), intron 2 (SEQ ID nr. 6), ekson 2 (SEQ ID nr. 7), intron 3 (SEQ ID nr. 8), ekson 3 (SEQ ID nr. 9), intron 4 (SEQ ID nr. 10), ekson 4 (SEQ ID nr. 11), intron 5 (SEQ ID nr. 12), ekson 5 (SEQ ID nr. 13), intron 6 (SEQ ID nr. 14), ekson 6 (SEQ ID nr. 15), intron 7 (SEQ ID nr. 16), ekson 7 (SEQ ID nr. 17),

20 18 intron 8 (SEQ ID nr. 18), ekson 8 (SEQ ID nr. 19), intron 9 (SEQ ID nr. 20), ekson 9 (SEQ ID nr. 21), intron 10 (SEQ ID nr. 22), ekson 10 (SEQ ID nr. 23), intron 11 (SEQ ID nr. 24), ekson 11 (SEQ ID nr. 25), og intron 12 (SEQ ID nr. 26), fragmenter derav, og varianter derav Ulike utførelsesformer er rettet på NtHMA-RNAi-ekspresjonsvektorer som omfatter: En NtHMA-RNAi-konstruksjon som har minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 % og 99 % sekvensidentitet med en sekvens som er valgt fra gruppen som består av: ekson 1 (SEQ ID nr. 5), et fragment av ekson 1 (SEQ ID nr. 5), ekson 2 (SEQ ID nr. 7), et fragment av ekson 2 (SEQ ID nr. 7), ekson 3 (SEQ ID nr. 9), et fragment av ekson 3 (SEQ ID nr. 9), ekson 4 (SEQ ID nr. 11), et fragment av ekson 4 (SEQ ID nr. 11), ekson 1 (SEQ ID nr. 5), et fragment av ekson 1 (SEQ ID nr. 5), ekson 5 (SEQ ID nr. 13), et fragment av ekson 5 (SEQ ID nr. 13), ekson 6 (SEQ ID nr. 15), et fragment av ekson 6 (SEQ ID nr. 15), ekson 7 (SEQ ID nr. 17), et fragment av ekson 7 (SEQ ID nr. 17), ekson 8 (SEQ ID nr. 19), et fragment av ekson 8 (SEQ ID nr. 19), ekson 9 (SEQ ID nr. 21), et fragment av ekson 9 (SEQ ID nr. 21), ekson 10 (SEQ ID nr. 23), et fragment av ekson 10 (SEQ ID nr. 23), ekson 11 (SEQ ID nr. 25), et fragment av ekson 11 (SEQ ID nr. 25). Ulike utførelsesformer er rettet på NtHMA-RNAi-ekspresjonsvektorer som omfatter: en NtHMA-RNAi-konstruksjon som koder for NtHMA-RNAipolynukleotider som er i stand til å selv-anneale for å danne en hårnålstruktur der RNAi-konstruksjonen omfatter (a) en første sekvens som har minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 % og 99 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 3 eller SEQ ID nr. 47, (b) en andre sekvens som koder for et spacer-element i NtHMA-RNAi-polynukleotidet som danner en løkke i hårnålstrukturen, og (c) en tredje sekvens som omfatter en revers komplementær sekvens av den første sekvensen, posisjonert i den samme orienteringen som den første sekvensen, der den andre sekvensen er posisjonert mellom den første sekvensen og den tredje sekvensen, og den andre sekvensen er operativt koplet til den første sekvensen og til den tredje sekvensen. Ulike utførelsesformer er rettet på NtHMA-RNAi-ekspresjonsvektorer: en NtHMA- RNAi-konstruksjon som koder for NtHMA-RNAi-polynukleotider som er i stand til å selv-anneale for å danne en hårnålstruktur, der RNAi-konstruksjonen omfatter (a) en første sekvens som har minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 % og 99 % sekvensidentitet med SEQ ID nr. 3 eller SEQ ID nr. 47, (b) en andre sekvens som koder for et spacer-element i NtHMA-RNAi-polynukleotidet som danner en løkke i hårnålstrukturen, og (c) en tredje sekvens som omfatter en revers komplementær sekvens av den første sekvensen (SEQ ID nr. 46 eller SEQ ID nr. 48), posisjonert i den samme orienteringen som den første sekvensen, der den andre sekvensen er posisjonert mellom den første sekvensen og den tredje sekvensen, og den andre sekvensen er operativt koplet til den første sekvensen og til den tredje sekvensen.