(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. A61K 39/04 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato.01. () Prioritet , US, 9231 P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver MICO BIO, INC., 14 Grand Street, New York, NY 013, US-USA (72) Oppfinner LIGHTER, Jennifer, 132 East 72nd Street, Apt. No. 1, New York, NY 021, US- USA FISHER, Jason, 132 East 72nd Street, Apt. No. 1, New York, NY 021, US-USA (74) Fullmektig Bryn Aarflot AS, Postboks 449 Sentrum, 04 OSLO, Norge (4) Benevnelse Tuberkulosevaksine og metode for anvendelse derav (6) Anførte publikasjoner WO-A-00/4722 HAILE M ET AL: "Immunization with heat-killed Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin (BCG) in Eurocine(TM) L3 adjuvant protects against tuberculosis" VACCINE, BUTTERWORTH SCIENTIFIC. GUILDFORD, GB, vol. 22, no , 29 March 04 ( ), pages , XP ISSN: X FALERO-DIAZ G ET AL: "Intranasal vaccination of mice against infection with Mycobacterium tuberculosis" VACCINE, BUTTERWORTH SCIENTIFIC. GUILDFORD, GB, vol. 18, no. 28, 1 August 00 ( ), pages , XP00486 ISSN: X CHEN LIHAO ET AL: "Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis." INFECTION AND IMMUNITY JAN 04, vol. 72, no. 1, January 04 (04-01), pages , XP ISSN: DE LA BARRERA S ET AL: "IL- down-regulates costimulatory molecules on Mycobacterium tuberculosis-pulsed macrophages and impairs the lytic activity of CD4 and CD8 CTL in tuberculosis patients." CLINICAL AND EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY OCT 04, vol. 138, no. 1, October 04 (04-), pages , XP ISSN: ZAMMIT DAVID J ET AL: "Residual antigen presentation after influenza virus infection affects CD8 T cell activation and migration." IMMUNITY APR 06, vol. 24, no. 4, April 06 (06-04), pages , XP ISSN: BAHR G M ET AL: "TWO POTENTIAL IMPROVEMENTS TO BCG AND THEIR EFFECT ON SKIN TEST REACTIVITY IN THE LEBANON", TUBERCLE, vol. 67, no. 3, 1986, pages -218, ISSN: STANFORD J L ET AL: "Immunotherapy with Mycobacterium vaccae as an adjunct to chemotherapy in the treatment of pulmonary tuberculosis", TUBERCLE, LONGMAN GROUP UK LTD., HARLOW, GB, vol. 71, no. 2, 1 June 1990 ( ), pages 87-93, XP029409, ISSN: , DOI:.16/ (90)90002-P [retrieved on ] GELBER R H ET AL: "Effective vaccination of mice against leprosy bacilli with subunits of

2 Mycobacterium leprae.", INFECTION AND IMMUNITY MAR 1990 LNKD- PUBMED:240764, vol. 8, no. 3, March 1990 ( ), pages , ISSN: BAHR G M ET AL: "Improved immunotherapy for pulmonary tuberculosis with Mycobacterium vaccae.", TUBERCLE DEC 1990, vol. 71, no. 4, December 1990 ( ), pages , ISSN: RATLEDGE AND DALE: 'Mycobacteria', BLACKWELL SCIENCE LTD, ISBN deel JOHN L. STANFORD AND GRAHAM ROOK: 'Immunotherapy for mycobacterial diseases', pages 7-334

3 1 Tuberkulosevaksine og metode for anvendelse derav Område for oppfinnelsen Oppfinnelsen vedrører en vaksine mot tuberkulose, og mer spesielt en vaksine ved anvendelse av inaktivert hel Mycobacterium tuberculosis formulert for levering til lunge og slimhinne. 1 Bakgrunn for oppfinnelsen Mycobacterium tuberculosis (M. tb) infiserer en tredjedel av verdens humane populasjon 1. Den vanlige tuberkulose (TB) vaksinen kjent som BCG-vaksinen blir gitt nyfødte i utviklingslandene. Idet denne vaksinen beskytter overfor meningeal og disseminert TB hos barn, så beskytter den ikke tilstrekkelig etableringen av latent TB eller reaktivering av lungesykdom hos voksne 2. Videre er effektiviteten til BCG rapportert å bli redusert over en periode på -1 år 3. Den mest vanlige typen av tuberkulosesykdom er lunge og overføring oppstår via aerosoldråper som fremkommer under hosting. Følgelig, til tross for den høye forekomsten av BCG-vaksinering, er sykdomsbelastningen ikke blitt redusert. Det er nå bevis som understøtter at M. tb mikrobakterielle avstamninger har gjennomgått mutasjoner i antigener felles for både M. tb og BCG 4,. Videre har nylige studier foreslått at BCG levert parenteralt kan svikte når det gjelder å indusere T-celleimmunresponser i lungeslimhinnen, som kan være kritisk for beskyttelse overfor lungesykdommer 6,7. På bakgrunn av dette er en ny vaksine imperativ for å redusere forekomsten av TB i verden. 2 WO 00/4722 vedrører en sammensetning som omfatter adjuvants og mykobakterier som er inaktiverte enten av varme eller formalin for å danne en mukosal vaksine. Oppsummering av oppfinnelsen Oppfinnelsen tilveiebringer en vaksine for forebygging og/eller behandling av tuberkulose. Oppfinnelsen kan bli anvendt ved et antall vaksineringsstrategier: profylaktisk gitt før infeksjon for å forebygge infeksjon med M. tb, post-eksponering for å eliminere eller inneholde latent TB og forebygge reaktivering. Det kan enten bli anvendt for å erstatte BCG og/eller som en booster for BCG i pasienter som allerede har mottatt BCG, eller en annen subenhet TB-immunostimulant. 3 I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning omfattende inaktivert hel Mycobacterium tuberculosis (M. tb), hvor sammensetningen er formulert for intranasal, mukosal eller intrapulmonær levering til en pattedyrvert, og hvor

4 2 sammensetningen omfatter en immunologisk beskyttende dose når levert til verten, og hvor nevnte M. tb er inaktivert med bestråling. I noen utførelsesformer er minst 90 % av Mycobacterium spp. cellene inaktivert, f.eks. 9 %, 98 %, 99 % eller 0 % av Mycobacterium spp. cellene. Når individet er et menneske, er 0 % av Mycobacterium spp. cellene fortrinnsvis inaktivert. Foretrukket bestråling er med gammabestråling. Den farmasøytiske sammensetningen kan eventuelt inkludere en adjuvants for å forøke en immunrespons i verten. Den farmasøytiske sammensetningen kan eventuelt inkludere en farmasøytisk akseptabel bærer, eller bli gitt lyofilisert. 1 I noen utførelsesformer er den farmasøytiske sammensetningen formulert for intranasal levering til verten. I tillegg er den farmasøytiske sammensetningen gitt som en aerosol eller spraypakke. I én utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en farmasøytiske sammensetning som inkluderer en gammabestrålt Mycobacterium spp., som er formulert for intranasal eller intrapulmonær levering til en pattedyrvert, og som tilveiebringer en immunologisk beskyttende dose når levert til verten, f.eks. et menneske. 2 I noen utførelsesformer blir den farmasøytiske sammensetningen levert gjennom en innretning konfigurert for nasal eller lungelevering. I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en metode for fremstilling av en vaksine for behandling av mykobakterieinfeksjon, omfattende formulering av en immunologisk beskyttende dose av en inaktivert hel Mycobacterium tuberculosis for intranasal eller pulmonær levering til en pattedyrvert. I noen utførelsesformer inkluderer metoden testing av vaksinen i en ikke-human 3 dyremodell for tuberkulose. Dyremodellen kan f.eks. være en mus, marsvin, kanin, bovin eller ikke-human primat.

5 3 Hvis ikke definert på annen måte, har alle tekniske og vitenskapelige angivelsene anvendt heri den samme betydningen som vanlig kjent for fagfolk innenfor dette området som denne oppfinnelsen hører inn under. Til tross for at metoder og materialer som er like eller ekvivalente med de som er beskrevet heri kan bli anvendt for praktisering eller testing av foreliggende oppfinnelse, er egnede metoder og materialer beskrevet nedenfor. I tillegg er materialene, metodene og eksemplene kun illustrerende, og ikke ment som noen begrensning. Andre trekk og fordeler ifølge oppfinnelsen vil være innlysende fra den følgende detaljerte beskrivelsen og kravene. Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen En vaksine ifølge oppfinnelsen blir dannet ved anvendelse av inaktivert Mycobacterium tuberculosis, som deretter blir formulert for levering til lunge og slimhinne i et individ. 1 Det inaktiverte mykobakterium, når levert til lungen eller slimhinne/nasalslimhinne til et individ blir postulert å utløse en mye sterkere immunrespons enn det som tidligere er blitt observert med tidligere beskrevne Tb-vaksiner. Forskning i en influensa murin modell foreslår at pulmonære immunceller forblir lokalisert, og kun noen få B-celler og T-celler migrerer systemisk.8,9 Forskningen viser at hoved influensaspesifikke T-celler kan forbli lukket innenfor en semi-isolert krets i brystet, som nesten ikke når blodstrømmen eller perifert lymfoid vev, men som istedenfor sirkulerer mellom resporatorisk mukosa og lokale lymfeknuter. Zammit et 2 al. foreslår at én grunn kan være den spesielle anatomien til lungeemfatisk drenering8. Cellene som går inn torakskanalen fra lokale lungeknuter blir ført til lungen i lungearterielt blod. Noen kan passere gjennom den systemiske sirkulasjonen, men aktiverte celler er har en tendens til å adherere til vaskulært endotel, og flytte seg tilbake inn i lungen, for dermed å holde cellene på infeksjonsstedet. Herifra flytter cellene seg igjen til lokale knuter, hvor de igjen møter antigen. Det har spesielt blitt funnet i den murine TB-modellen at antigenspesifikke hukommelses T-celler fortrinnsvis går tilbake til vaksinasjonsstedet, og at lokalisasjonen av T-cellene i luftveiene ved infeksjonstidspunktet er viktig Ved å anvende disse funnene på foreliggende oppfinnelse, da, for at en TB-vaksine skal være vellykket i å aktivere en beskyttende immunrespons i lunge og respiratorisk slimhinnesystem, så stimulerer det direkte de antigenpresenterende cellene i

6 4 respiratorisk epitel. Oppfinnelsen oppretter ved å levere bestrålte mykobakterier direkte til lunge og slimhinneinterfasen. En studie publisert i 1968 rapporterte ingen negative effekter når aerob BCG ble gitt til 439 barn12. I eksperimentelle dyrearter varierte aerosol eller intra-tracheal levering av BCG i effektivitet fra overlegen beskyttelse enn parenteral inokulasjon i primater13, kveg14, marsvin1r, og mus16,17,18,19 til ingen tilsynelatende fordel over den subkutane veien i andre studier. Andre studier viste at immunrespons var avhengig av opprinnelig BCG-inokulumdose12,21. Nylig har flere forskningsgrupper publisert data for anvendelse av mukosal M. tb subenhetvaksiner som boostere når administrert uker etter den primære immuniseringen i murin modell. Goonetilleke et al. sine funn understøtter viktigheten av de hjemlige egenskapene til T-cellene når eksponert for rekombinant modifisert 1 vaksinevirus Ankara, som uttrykker Mycobacterium tuberculosis Ag 8A. Internasal boosting induserer en fem ganger høyere T-cellerespons i lunger enn parenteral BCG, som derved tilveiebringer støtte for at T-cellene i lungene er i en viss form av kompartmentalisert22. Santosuosso et al. viste at en intranasal adenoviral vektor som uttrykker Ag8A boostet primær CD4- og CD8 T-cellerespons i deres luftveishulrom, og forøkte beskyttelse overfor pulmonær M. tuberculosis eksponering23. Andre studier i mus ved anvendelse av myobakterielle antigener (Ag 8A eller Ag 8B-ESAT-6) i enten rekombinante bakterielle/virale vektorer, eller med proteiner og adjuvantser gitt mukosalt som en booster, har vist beskyttende immunitet når sammenliknet med standard parenteral BCG når eksponert for levende M.tb24,2,26. Alle disse studiene 2 viste statistisk færre kolonidannende enheter til mykobakterier i lungene og milt etter mukosal subenhetvaksineboost, sammenliknet med BCG alene. Den adaptive immunresponsen til levende M tuberkuloseinfeksjon er forsinket sammenliknet med andre infeksjoner, og dette muliggjør at bacilli-populasjonen i lungene øker betydelig i løpet av den preimmune infeksjonsfasen27. Ved anvendelse av døde bacilli i en aerosolisert vaksineformulering er det ingen multipliserende mykobakterier, og immunresponsen vil ha tilstrekkelig tid for å respondere overfor antigener på celleveggen til bakteriene. I tillegg, over tusener av år gjennom egnethetsutfordringer, har M. tb funnet mange måter på å invadere den medfødte 3 immunresponsen i løpet av opprinnelig antigenpresentasjon28,29,,31. Døde mykobakterier har ikke evnen til å produsere enzymer som utløser måter på å invadere det humane immunsystemet, og unngå vellykket antigenpresentasjon.

7 En av grunnene som vi antar at denne metoden for anvendelse av drepte hele mykobakterier er blitt oversett tidligere, er grunnet studiene utført av Robert Koch sent i det 19. århundre32. Koch anvendte et sterilt filtrat fra M. tuberkulosekulturer som en terapeutisk vaksine i individer. Dette induserte en alvorlig inflammatorisk immunrespons i noen individer med aktiv sykdom at noen døde. Kjent som Kochfenomenet ser denne nekrotiske reaksjonen ut til å være grunnet overproduksjon av flere pro-inflammatoriske cytokiner, men spesielt TNF-α33. Denne forekomsten var vaksinologer bekymret for i mange tiår, og vi antar at forskere siden dette ikke har sett potensiale for anvendelse av hele bacilli. Hele drepte mykobakterier vil bli anvendt i lave nok mengder for å unngå en overveldende inflammatorisk reaksjon, og fortsatt utløse en sterk immunobeskyttende respons. Generelt kan en hvilken som helst type av inaktiveringsprosedyrer bli anvendt når 1 behandlingen gjør at populasjonen og bakterier ikke kan produsere en beskyttende infeksjon i verten, men på samme tid bevare de antigene strukturene som er nødvendig for å utløse en produktiv respons til den korresponderende sykdomsforårsakende mykobakterien. Mykobakterieprepareringen er typisk inkapasitert. Med inkapasitert i sammenheng med en inkapasitert bakteriecelle produsert ifølge oppfinnelsen, menes at den bakterielle cellen er i en tilstand med irreversibel bakteriostase. Mens bakterien beholder dets struktur, og dermed beholder, f.eks. immunogenisiteten, antigenisiteten og/eller reseptorligandinteraksjoner assosiert med villtypebakterien, har den ikke evne til å replikere. I noen utførelsesformer har den ikke evne til replikasjon grunnet tilstedeværelse av et 2 infiserende fag innenfor den bakterielle cellen. En foretrukket type av inaktivering er gammabestråling. Andre typer av inaktivering kjent innenfor fagområdet inkluderer, f.eks., andre typer av bestråling (inkludert ultrafiolett bestråling). I noen utførelsesformer > 70 % drept for ikke-human bruk. I utførelsesformene for human bruk, blir 0 % av cellene drept. Uten å ønske å være bundet til noen teori, blir det postulert at gammabestrålt mykobakterium er spesielt egnet for anvendelse i sammensetningene og metodene ifølge oppfinnelsen. 3 Gammabestrålte bakterier blir vanligvis anvendt i laboratorier på grunn av at de blir betraktet som trygge, og replikerer ikke. I mange forsøk har de til tross for dette blitt

8 6 vist å utløse en immunbeskyttende respons, inkludert responser utløst av antigener på bacilliveggen34,3,36. I tillegg, gjennomgår gammabestrålt mykobakterium apoptose, og blir inntatt av dendrittceller. Dendrittceller tilstede i mykobakteriumantigener til Tceller, som aktiverer CD4 Th1 og CD8 cytotoksiske celler. Gammabestrålt M. tb kan også indusere nitrogenoksidfrigjøring34, og kan utløse liknende Th2-responser overfor levende M. tb3. I 1963 injiserte Nishihara et al. intradermalt gammabestrålt M. tb inn i mus, og fant at det var like beskyttende som BCG injisert intradermalt overfor aerosoleksponering med M. th37. Levering av bestrålte bakterier eller bakterielle antigener til lunge og mukosalgrensen antas å lette en effektiv immunrespons i verten. Ved levering til nasal slimhinne eller alveolarføringer, blir bakterier eller bakterieantigener detektert av antigenpresenterende celler, spesifikt dendrittceller ved alveol/interstitielle rommet til lungen. Disse dendrittcellene migrerer deretter til regioner anriket i naive CD4+ og 1 CD8+ T-celler, og som utgjør den parakortikale sonen av de regionale lymfeknutene til lungen. Disse T-cellene blir aktivert av døde bacilliantigener. De døde mykobakteriene vil bli fagocytosert av makrofager. Generelt kan hvilke som helst mykobakteriumarter eller stammer som er medlemmer av M. tuberkulosekomplekser bli anvendt i sammensetningen og metodene ifølge beskrivelsen. Egnede arter, mycobakterium som er medlemmer av M tb-komplekset inkluderer, f.eks. Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microtti, og 2 Mycobacterium tubergulosis. Mycobacterium som er genetisk lik, inkluderer Mycobacterium canettii og Mycobacterium marinum. Spesielle arter eller kombinasjoner av arter blir valgt for de korresponderende vertsartene, og type mykobacteriumassosiert sykdom som skal bli behandlet. Andre mycobakterier som forårsaker sykdom i mennesker inkluderer, f.eks. Mycobacterium avium intracellulare, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepraemurium, Mycobacteria paratuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium chelonei, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium farcinogenes, Mycobacterium flavum, Mycobacterium haemophitum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium phlei, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium senegalense, 3 Mycobacterium simiae, Mycobacterium thermoresistible, og Mycobacterium xenopi.

9 7 Mycobakterien som skal bli anvendt i den farmasøytiske sammensetningen inkluderer hele celler. Fremstilling av farmasøytiske sammensetninger De drepte cellene blir dannet for administrering til en vert ved kombinering av inaktiverte celler eller cellelysater med en farmaøsytisk akseptabel bærer, for å danne en farmasøytisk sammensetning. Bæreren kan f.eks. være fysiologisk saltvann, mineralolje, vegetabilske oljer, vandig natriumkarboksymetylcellulose eller vandig polyvinylpyrrolidon. I noen utførelsesformer er bæreren tilstrekkelig ren for å bli administrert terapeutisk til et humant individ. Fagfolk innenfor dette området har evne til å danne egnede løsninger ved anvendelse av f.eks. isotoniske bærere, så som natriumkloridinjeksjon, Ringers injeksjon, eller laktert Ringers injeksjon. Konserveringsmidler, stabiliseringsmidler, buffere, antioksidanter og/eller andre additiver kan bli inkludert, etter behov. 1 En fagperson innenfor dette området som er kjent med protokollene, formuleringene, doseringene og klinisk praksis assosiert med f.eks. administrering av M. bovis BCG kan i tillegg lett tilpasse disse protokollene for anvendelse med de farmasøytiske sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse. Vaksinene blir administrert på en måte som er kompatibel med doseringsformuleringen, og i en slik mengde som vil være terapeutisk effektiv og immunogen. Mengden som skal bli administrert avhenger av individet som skal bli behandlet, inkludert f.eks., kapasiteten til individets immunsystem, for å danne en immunrespons, og grad av beskyttelse som er ønskelig. Egnede doseringsområder er i størrelsesorden på flere hundre mikrogram aktivt 2 ingrediens pr. vaksinering, og et foretrukket område fra omtrent 0,1 g til 00 g, så som i området fra omtrent 1 g til 0 g, og spesielt i området fra omtrent g til 0 g. Egnede regimer for innledende administrering og boosterskudd er også variable, men er typisk en innledende administrering etterfulgt av påfølgende inokuleringer eller andre administreringer. Følgelig kan vaksinen bli administrert i en enkeltdose, eller i flere doser. I én utførelsesform kan vaksinen bli administrert i to doser med omtrent 1-12 måneder mellom. Individet kan bli vaksinert ved et hvilket som helst tidspunkt, til tross for at det er foretrukket å administrere vaksinen kort (optimalt omtrent dager til to uker) før perioder med antisipert stress, så som i løpet av frakting eller annen håndtering. Det kommer også i betraktning at vaksinen 3 kan bli administrert til gravide dyr før fødselen, for å øke produksjonen av hyperimmunkolostrum.

10 8 En sammensetning kan bli administrert alene eller i kombinasjon med andre behandlinger eller standard BCG-vaksine, enten samtidig eller sekvensielt, avhengig av tilstanden som skal bli behandlet. Sammensetningen kan bli administrert etter vaksinering med BCG, og virker derfor som en boost tuberkulosevaksine. Videre kan den bli gitt etter en innledende subkutan inokulasjon av hele drepte bacilli, etterfulgt av en intranasal eller mukosal boost. De drepte cellene kan bli inkorporert i mikropartikler eller mikrokapsler for å forlenge eksponeringen av det antigene materialet til gjeldende dyr, og følgelig beskytte dyret overfor infeksjon i lange tidsperioder. Mikropartikler og kapsler kan bli dannet fra forskjellige velkjente inerte, biokompatible matriksmaterialer ved anvendelse av teknikker som er konvensjonelle innen fagområdet. Egnede matriksmaterialer inkluderer, f.eks., naturlige eller syntetiske polymerer, så som alginater, poly(melkesyre), poly(melke/glykolsyre), poly(kaprolakton), polykarbonater, 1 polyamider, polyanhydrider, polyortoestere, polyacetaler, polycyanoakrylater, polyuretaner, etylenvinylacetatkopolymerer, polystyrener, polyvinylklorid, polyvinylfluorid, poly(vinylimidazol), klorsulfonerte polyolefiner, polyetylenoksid, og spesielt agar og polyakrylater. Eksempler på teknikker for inkorporering av materialer i mikropartikler eller innkapsling som kan bli anvendt heri, er beskrevet av Sparks39, Kydonius39, og El-Nokaly40. Den inaktiverte mykobakterien kan bli innbefattet i små partikler suspendert i vann eller saltvann. Vaksineformuleringene kan også inneholde eventuelle adjuvants, antibakterielle midler, eller andre farmasøytisk aktive midler som kjent innenfor 2 fagområdet. Adjuvantsene kan inkludere, men er ikke begrenset til salter, emulsjoner (inkludert olje/vann-sammensetninger), saponiner, liposomale formuleringer, viruspartikler, polypeptider, patogenassosierte molekylærmønstre (PAMPS), nukleinsyrebaserte forbindelser eller andre formuleringer som anvender disse antigener. Egnede adjuvants inkluderer, f.eks., vegetabilske oljer, alum, Freuds ufullstendige adjuvants, eller Freuds ufullstendige adjuvants, med oljer, og Freuds ufullstendige adjuvants er spesielt foretrukket. Andre adjuvantser inkluderer midler så som aluminiumhydroksid eller fosfat (alum), immunstimulerende komplekser (ISCOM), syntetiske polymerer av sukre (CARBOPOL ), aggregasjon av proteinet i vaksinen ved varmebehandling, aggregasjon ved reaktivering med pepsinbehandlede 3 (Fab) antistoffer til albumin, blandinger med bakterielle celler så som C. parvum og endotoksiner eller lipopolysakkaridkomponenter av gram-negative bakterier, emulsjon i fysiologisk akseptable oljebærere så som mannid monooleat (Aracel A) eller emulsjon

11 9 med prosent løsning av en perfluorkarbon (Fluosol-DA) anvendt som en blokksubstitutt kan også bli anvendt. Den inaktiverte mykobakterien kan bli innbefattet i en mukosal bakteriell topoksinadjuvants så som Escherichia coli labil toksi (LT) og koleratoksin (CT) eller i CpG oligodeoksynukleotid (CpG ODN)41. Ett annet mulig mukosaladjuvants monofosforyllipid A (MPL), et derivat og mindre toksisk form av LPS, når kombinert med liposomer, ble funnet å indusere mukosale immunobeskyttende responser42. En ny adjuvants konstruert for nasal vaksinering, Eurocine L3TM, er blitt vist å indusere lengevirkende immunitet overfor TB i eksperimentelle dyremodeller etter internasal administerring43,4, Adjuvantsteknologien består av en ikke-toksisk farmasøytisk formulering basert på en kombinasjon av endogene og farmasøytisk akseptable lipider. Vaksinen kan eventuelt inkludere ytterligere immunmodulerende substanser så som cytokiner eller syntetiske IFN- -indusere, så som poly I:C alene, eller i 1 kombinasjon med overnevnte adjuvants. Fortsatt ytterligere adjuvants inkluderer mikropartikler eller kuler av biokompatible matriksmaterialer. Mikropartiklene kan bestå av hvilke som helst biokompatible matriksmaterialer som er konvensjonelle innenfor fagområdet, inkludert men ikke begrenset til agar og polyakrylater. Fagpersonen innenfor dette området vil vite at andre bærer eller adjuvants også kan bli anvendt. For eksempel kan chitosan eller et hvilket som helst bioadhesivleveringssystem bli anvendt som beskrevet av Webb og Winkelstein46, idet innholdet er inkorporert heri som referanse. 2 Den farmasøytiske sammensetningen inneholdende det inaktiverte mykobakterium blir fortrinnsvis formulert for intranasal eller intrapulmonær levering ved anvendelse av metoder kjent innenfor fagområdet. Formuleringen av det bestrålte mykobakterium kombinert med adjuvants blir fortrinnsvis valgt for å minimalisere bieffekter, så som inflammasjon, assosiert med vaksinering, eller som kan forbedre stabiliteten til formuleringen. Adjuvants kan også ha en rolle som en immunostimulant, eller som et depot. I noen utførelsesformer blir det inaktiverte mykobakterium levert ved effekten av en forstøver, eller via tre typer av kompakte flyttbare innretninger, oppmålt-dose 3 inhalator (MDI) og tørr pulver inhalator (DPI). Intranasal levering kan oppstå via nasalspray, dropper eller nasal oppmålt medikamentleveringsinnretning. Den inaktiverte mykobakterien kan bli levert via en oppmålt-dose inhalator. Typisk blir kun

12 - % av den utleverte dosen deponert i lungen. Den høye hastigheten og store partikkelstørrelsen til sprayen forårsaker at omtrent 0-80 % av medikamentaerosolen har innvirkning i den orofaryngeale regionen. Mykobakterien kan bli innbefattet i en tørr pulverformulering så som, men ikke begrenset til, sukkerbæresystem. Sukkerbæresystemet kan inkludere laktose, mannitol og/eller glukose. Laktose, mannitol og glukose er alle godkjente av FDA som bærere. Det er også større sukkerpartikler så som laktosemonohydrat, typisk 0-0 mikrometer i diameter, som forblir i naso-orofarynx, men som muliggjør at den inaktiverte basillen beveger seg gjennom det respiratoriske treet, inn i alveoli47. Om ønsket kan mykobakterien bli innbefattet i en liposomal formulering. Liposomer, som andre inhalerte partikler som når alveoli, blir fjernet av makrofager. Prosesseringen, opptaket og resirkulering av liposomale fosfolipider oppstår gjennom 1 den samme mekanismen som endogent overflateaktivt middel via alveolar type II celler. En farmasøytisk sammensetning inneholdende det bestrålte mykobakterium beskrevet ovenfor, blir administrert til et egnet individ for forebygging eller behandling av tuberkulose. Referansen heri til tuberkulose inkluderer referanse til lunge og ekstrapulmonær tuberkuli. Betegnelsene individ, vert og pasient, blir anvendt om hverandre heri, og refererer til et hvilket som helst individ som har en bakteriell infeksjon som er mottakelig for behandling ved anvendelse av den terapeutiske vaksinen ifølge oppfinnelsen, og hvortil behandling eller terapi er ønskelig. Den 2 farmasøytiske sammensetningen kan bli fremstilt fra en hvilken som helst pattedyrvert som er mottakelig for infeksjon med mykobakterium. Egnede pattedyrverter inkluderer, f.eks., årsdyr så som svin og kveg. Betegnelsene behandling, behandle, behandlingen og liknende blir anvendt heri til generelt å omfatte oppnåelse av en ønsket farmakologisk og/eller fysiologisk effekt. Effekten kan være profylaktisk, så som fullstendig eller delvis forebygging av en sykdom eller symptomer derav, og/eller kan være terapeutisk med hensyn på en bestemt eller fullstendig stabilisering eller leging av en sykdom, og/eller negative effekter som skyldes sykdom. Behandling som anvendt heri, omfatter en hvilken 3 som helst behandling av en sykdom i et individ, spesielt et pattedyrindivid, mer spesielt et menneske, og inkluderer: (a) forebygging av sykdom eller symptom fra å oppstå i et individ som kan være pre-disponert for sykdommen eller symptomet, men

13 11 som enda ikke er blitt diagnostisert å ha den; (b) hemming av sykdomssymptomet, dvs. hemming av utviklingen derav; eller lindring av sykdomssymptomet, dvs. forårsake regresjon av sykdommen eller symptomet (c) forebygging av reaktivering av sykdommen i latent TB, dvs. forebygging av at bacilli endrer seg fra en sovende til vekstfase. Følgelig er administreringen fortrinnsvis i en profylaktisk effektiv mengde eller en terapeutisk effektiv mengde (alt ettersom hvilket tilfelle det gjelder, til tross for at profylakse kan bli betraktet som terapi), idet det er tilstrekkelig for å vise fordel til individet. Den virkelige mengden som blir administrert, og rate og tidsforløpet for administrering, vil avhenge av naturen og hvor alvorlig det som blir behandlet er. Foreskriving av behandling, f.eks. avgjørelser på doseringer osv., er innenfor ansvaret til den generelle behandleren og andre medisinske personer eller veterinærer. Individet behandlet med vaksinen vil typisk ha, eller vil utvikle, beskyttende immunitet overfor et infiserende bakterium. Betegnelsen beskyttende immunitet 1 betyr at en vaksine, immunogen sammensetning, eller immuniseringsskjema som blir administrert til et pattedyr induserer en immunrespons som forebygger, hemmer behandlingen av, eller reduserer alvorligheten til en sykdom som blir forårsaket av en patogen bakterie, eller reduserer eller i det hele tatt eliminerer symptomer på sykdom. Med infiserende bakterium menes en bakterie som har etablert infeksjon i verten, og som kan bli assosiert med en sykdom eller uønsket symptom som et resultat. Generelt er infiserende bakterier patogene bakterier. Frasen utilstrekkelig mengde for å utløse en immunrespons betyr at det er en detekterbar forskjell mellom en immunresponsindikator og før og etter administrering 2 av en bestemt vaksinepreparering eller immunogen sammensetning. Dyr som blir gitt vaksineforsøket vil bli testet overfor dyr gitt intradermal BCG (som gullstandard). Flere uker etter siste vaksinering vil dyrene bli eksponert for aerosolvirulent M. tb. Den kliniske og molekylære immunresponsen vil bli vurdert flere uker etter eksponering med virulent M. tb. Screening og uttrykking av tuberkulosevaksiner En testvaksine kan bli screenet eller optimalisert ved å utsette en populasjon av mykobakteriumceller, eller fraksjoner derav (som beskrevet ovenfor) til forskjellige inaktiveringsregimer, dannelse av en kandidatfarmasøytisk sammensetning 3 inneholdende de behandlede cellene eller cellefraksjonene, og testing av evnen til den behandlende sammensetningen ved anvendelse av metoder beskrevet ovenfor, for å

14 12 utløse en immunrespons og/eller danne en effektiv utfordring overfor mykobakteriuminfeksjon i en vert. Betegnelense immunogen bakteriell sammensetning, immunogen sammensetning, og vaksine blir anvendt om hverandre heri, for å bety en preparering som har evne til å utløse en cellulær og/eller humoral immunrespons i et individ når administrert i en tilstrekkelig mengde for å utløse en immunrespons til epitopene tilstede i nevnte preparering. Immunopotensen til det antigene molekylet uttrykt av mykobakteriumcellen eller ekstraktprepareringen, kan bli bestemt ved å registrere immunresponsen til testdyr etter immunisering med bakteriene som uttrykker det rekombinante antigenet. Testdyr kan inkludere mus, marsvin, kaniner, kveg, ikke-humane primater, og eventuelt humane individer. 1 Immunresponsen til testindividet kan i tillegg bli analysert med forskjellige tilnærminger så som: (a) T-celleassosiert cytokinproduksjon (b) plasmacytokinproduksjon (c) T-celleproliferasjon, cytotoksisitet, cytokinprofiler (d) Tcelleantigenrepertoar (e) T-celleregulatoriske profiler (f) mrna-profiler (g) iboende immunitetsprofiler (h) antistoffprofiler (i) genetikk og (j) beskyttelse mot sykdom og/eller mitigering av infeksiøse symptomer i immuniserte dyr. 2 3

15 13 Referanser:

16 14

17 1

18 16

19 17

20 18

21 19 PATENTKRAV 1. Farmasøytisk sammensetning omfattende inaktivert hel Mycobacterium tuberculosis (M. tb), idet nevnte sammensetning blir formulert for intranasal, mukosal, eller intrapulmonær levering til en pattedyrvert, og hvor nevnte sammensetning omfatter en immunologisk beskyttende dose når levert til nevnte vert, og hvor nevnte M. tb blir inaktivert med bestråling. 2. En sammensetning som omfatter inaktiverte hele M. tb for anvendelse ved vaksinering av et pattedyr overfor Tuberculosis (TB), idet nevnte vaksinering av nevnte pattedyr er intranasal eller intrapulmonær, og idet nevnte sammensetning omfatter en immunologisk beskyttende dose når levert til nevnte vert, og hvor nevnte M. tb blir inaktivert med bestråling Sammensetning ifølge krav 1 eller 2, idet sammensetningen for anvendelse ifølge krav 2, hvor 0 % av nevnte M. tb er inaktivert. 4. Sammensetningen ifølge krav 1, eller sammensetningen for anvendelse ifølge krav 2, idet nevnte bestråling er gammabestråling.. Den farmasøytiske sammensetningen ifølge krav 1, eller sammensetningen for anvendelse ifølge krav 2, videre omfattende Mycobacterium cellelysater Sammensetningen ifølge krav 1, som videre omfatter en adjuvants for å øke en immunrespons i nevnte vert. 7. Sammensetningen ifølge krav 1, eller sammensetningen for anvendelse ifølge krav 2, som videre omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer. 8. Sammensetningen ifølge krav 1, idet den nevnte sammensetningen er lyofilisert En aerosol eller sprayforpakning som omfatter den farmasøytiske sammensetningen ifølge krav 1.

22 . Sammensetningen ifølge krav 7, eller sammensetningen for anvendelse ifølge krav 7, idet nevnte sammensetning er for profylaktisk eller terapeutisk anvendelse i nevnte pattedyr. 11. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning, omfattende formulering av en immunologisk beskyttende dose av en inaktivert hel M. tb for intranasal eller pulmonær levering til en pattedyrvert, og hvor nevnte M. tb er inaktivert ved bestråling. 12. Sammensetningen for anvendelse ifølge krav 2, som videre omfatter en adjuvants for å forøke en immunrespons i nevnte vert, uten å forårsake svekkende inflammasjon Sammensetningen for anvendelse ifølge krav 12, for simultan eller sekvensiell anvendelse med Bacille Calmette-Guerin (BCG). 14. Sammensetningen ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 3-8 eller, eller sammensetningen for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 2-, 7,, 12 eller 13, aerosolsprayforpakningen ifølge krav 9, eller fremgangsmåten ifølge krav 11, idet dosen av M. tb er fra 0,1 til 0 mikrogram. 1. Sammensetningen ifølge krav eller 14, eller sammensetningen for anvendelse ifølge kravene, 12 eller 13, aerosolsprayforpakningen ifølge krav 9 eller 14, eller fremgangsmåten ifølge krav 11 eller 14, idet sammensetningen blir 2 tilveiebrakt lyofilisert. 16. Sammensetningen ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 3-8,, 14 eller 1, eller sammensetningen for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 2,, 7,, 12, 13, 14 eller 1, aerosolsprayforpakningen ifølge et hvilket som helst av kravene 9, 14 eller 1, eller fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 11, 14 eller 1, idet pattedyret er et menneske.