Påvisning av anti dsdna men forskjellige metoder og teknikker Randi Karlsen Fagbioingeniør Seksjon for medisinsk immunologi Oslo Universitetssykehus Ullevål sykehus Februar 2015 Innhold Årsaksmekanismer? Hvilke sykdommer Metoder for påvisning Med vekt på metoder i bruk ved OUS CLIFT EliA Immunoblot Analyseprinsipper Utførelse Avlesning Tolkning Problemhåndtering Feilkilder Metoder Årsaksmekanismer Hvorfor får noen antistoffer mot ds DNA/ ndna? DNA ekstracellulært initierer en immunrespons mot DNA Defekt apoptose? Molekylær mimicry (substanser som ligner) Infeksiøse agens (Pneumokokker, EBV) Vedvarende antigenstimulering over tid kan føre til produksjon av høyavide antistoffer. Forekomst Først oppdaget i 1957 LE celler 10 år tidligere Oppfattet som spesifikk for SLE Høytitret IgG Høyavid Revmatoid atritt Lav titret AIH type 1 Lavtitret Myelom som produserer dsdna Hos friske: Vanligvis lavavid IgM Forbigående 1
Hvilke metoder finnes? Farr assay PEG IIF EIA Flowcytometri Multiplex Mikroarray Immunoblot Hemagglutinasjon Chemiluminesens Antistoff bindes til antigen Sekundær antistoff for detektering Farr assay Serum inkuberes med 125 I merket dsdna Felles med ammoniumsulfat Presipitatet telles for radioaktivitet Detekterer alle immunglobulinklasser Høyavid Kan bli uspesifikk positiv: binding til andre antigener og denaturering til ssdna Regnet for å være mer sensitiv for SLE, men mindre spesifikk PEG Binding til radioaktivmerket dsdna Presipitering med polyetylenglycol. Detekterer både høy og lavavide antistoffer IIF HEp 2 ANA: Homogent mønster CLIFT: Crithidia luciliae immunfluorecense test. Substratet er en flagellat med en kinetoplast som inneholder kun sirkulært ds DNA og ingen andre nukleære antigener. Høyavid og lavavide antistoffer detekteres Kan velge konjugat immunglobulinklasse Høy diagnostisk spesifisitet for SLE, lav sensitivitet Enzym immunoassays ELISA Antigen coated på MTP av polystyren Antigen rekombinant eller nativt fra kalvethymus. Detekterer både høy og lavavide antistoff Falsk positiv pga denaturering av antigen i brønn. Høyere sensitivitet, men lavere spesifisitet for SLE ELIA Spesiell teknikk som detekterer kun høyavide antistoffer Automatisert Høyere sensitivitet, men lavere spesifisitet for SLE 2
Direkte ELISA Andre metoder Flowcytometri Antigen coatede kuler, fluorescensmerket sekundær antistoff detekteres i væskestrøm Multiplex Antigen coatede kuler i brønner. Magnetiske. Får fram signal på basis av kulene eller konjugatet. Kan teste på flere antistoffer i samme brønn Mikroarray Antigen bundet til f.eks polystyren. Kan sette sammen mosaikk av flere antigener. Immunoblot Antigen festet på en membran. Flere antigener på en strips. Peroksydase merket konjugat gir synlig bånd. Antigenet kan denaturere Sensitiv men mindre spesifikk for SLE Hemagglutinasjon Dobbeltdiffusjon Counter immunelektroferese Teststrategi på OUS ANA screening : CTD Phadia 250 / Thermo Scientific ANA IIF til spesialisthelsetjenesten og noen andre kontekster (barn, lever diagnostikk) EliA anti dsdna Alle positive CTD screen Anti dsdna IIF Alle positive a ds DNA EliA Alle positive ANA IIF (2+ reaksjon, homogent mønster) Testprinsipp Analysepinsipp Manuelt eller slides prosessor Automatisert, digital avlesning 3
CLIFT Substrat: Critidia luciliae Encellet flagellat med dsdna holdig kinetoplast Inkuberes med fortynnet serum 1:10 Inkuberes 30 minutter Vaskes i PBS ph 7,4 (+/ 0,2) FITC merket gamma spesifikt a humant IgG som konjugat. Inkuberes i 30 minutter (mørkt) Vaskes i PBS Monteres med dekkglass og medium av polyvinylalkohol Leses i fluorescensmikroskop Critidea luciliae Kvalitetssikring Kvalitetskontroll Positiv og negativ kontroll i hvert oppsett. Krav til optimal reaksjon i oppsettet. Titrerbar kontroll i hvert oppsett. Titeret monitoreres. Rutiner Alltid to som leser av Alltid to som registrer resultatene 4
5
Problemhåndtering Feilkilder ph / ionestyrke i buffer ph i monteringsmedium Håndtering av slides mekaniske skader, luftblærer Såperester i vaskekar Oversmitting fra andre positive prøver Feiltolkninger Kjerne Basallegmer Flagellen Ting å tenke på Konjugat Klassespesifikt IgG? Valg av produkt Kvalitet etc. Mikroskop. Filtervalg Objektiv, numerisk appertur Ekstern kontrollprogram Mangel på standardisering? Wo 80 Internasjonal standard (T 20 640) Automatisering Novaview fra INOVA To prosesser: Slides preparering og avlesning i separate instrumenter. System for mønster gjennkjenning Tilgjengelig for ANA, DNA, ANCA Europattern fra Euroimmun To prosesser: Slides preparering og avlesning i separate instrumenter. Mønstergjenkjenning vha sammenligning med lagret atlas. Helios fra Aeskudiagnostics Fullautomatisert Skiller kun positivt, negativt Software for egen mønstersetting Tilgjengelig for ANA, DNA, ANCA og LKS Immunoblot Mange antigener coated på en strips av plast. Membran av nitrocellulose eller nylon. Detekterer mange antistoffer samtidig Antistoffprofil (DNA, histon, nukleosom, Sm, RNP, SSA, SSB, Ro52) 6
Immunoblot strips Phadia 250 fra Thermo Scientific EliA en fluorescence enzyme immunoassay (FEIA) Instrument i mange forskjellige størrelser Positiv kontroll Ani-Sp100 Testprinsipp EliA Antigen er bundet til plastbrønnen og binder spesifikt antistoff fra pasient serum. Etter å ha vasket bort ubundne, ikke spesifikke antistoff, tilsettes enzymmerket (β Galactosidase) sekundærantistoff (mot humant IgG). Disse danner et kompleks. Etter inkubering vaskes de ubundne enzymmerkede antistoffene bort. De bundne immunkompleksene blir så inkubert med en developement løsning. Denne løsningen vil utvikle et fluorescensprodukt. Etter tilsetning av en stoppløsning vil fluorescensen i eluatet avleses. Fluorescenssignalet er proporsjonal med innholdet av antistoff i prøven. Diagnostisk sensitivitet og spesifisitet for ulike metoder Innhold i CTD screen 7
Teststratergi OUS 8