Hurtige metoder for analyse av mikrobiell forurensning

Transkript

1 Hurtige metoder for analyse av mikrobiell forurensning Et forprosjekt finansiert av NFR-Forkommune. Initiert av Teknologiutviklingsnettverket i Norsk Vann Ledet av Nedre Romerike Vannverk IKS ved Jan Morten Søraker og Markus Rawcliffe 1

2 Analyse av patogener - hva er problemet? 2

3 Finn forbryteren! Vi frykter at det finnes en forbryter i salen Strømmen har gått og det er helt mørkt Hvordan finne forbryteren? Er vi trygge eller ikke? For enkelte patogener holder det at vi får i oss én for å bli syke om vi drikker ett glass vann. Hvordan vite at vannet ikke inneholder en sykdomsfremkallende partikkel (virus, parasitt, bakterie)?. Disse er så små at vi ikke kan se de, og det er som å sitte i en svart boks 3

4 De tradisjonelle metodene Legg ut åte for å se om forbryteren slår til Vent og se (hvem overlever?) Hvor lenge må vi vente? Er vi trygge mens vi venter? De tradisjonelle vannanalysene innebærer at man dyrker opp bakterier som er indikatorer på fekal forurensning, fordi fekal forurensing er den største og dermed mest sannsynlige kilden til humane patogener. Dyrkingsmetoder tar tid (>18t) og indikatorer er sjeldent representativt for alle patogener 4

5 Finnes det bedre og raskere metoder? 5

6 Raskere! Det er mørkt, vi kan ikke se. Forbrytere må være levende og utstråle energi à varmesøkende kamera! Vil alle varmestrålende objekter være forbrytere? ATP er et energimolekyl som alle levende organismer har, og kan benyttes til å raskt (minutter) avgjøre om det finnes (levende) celler i vannet. 6

7 Raskere! Hva med å skru på lyset? 7

8 Raskere! Hva med å skru på lyset? Da kan vi telle alle personlignende gjenstander i rommet Vil alle personlignende gjenstander utgjøre en trussel? Celle-tellingsinstrumenter (flowcytometer, automatiske mikroskoper, partikkeltellere) har i større grad blitt automatisert og gir mulighet til å gi raskt (minutter) svar på antall celle-lignende partikler i vannet. 8

9 Bedre! ny teknologi Vi har fingeravtrykket til forbryteren og kan gjenkjenne han/hennepå det Vi kjenner ikke fingeravtrykkene til alle i salen, hvordan vite om forbryteren er her? Metoder som baserer seg på molekylærbiologiske metoder gjør oss i stand til å identifisere patogener enten ved hjelp av DNA, RNA, proteiner eller lipider. Det finnes tilgjengelige databaser for DNA-sekvenser for de fleste kjente patogener 9

10 Fingeravtrykk La oss brukeen fingeravtrykkscanner Alle problemer løst! Den er helt utrolig, scanner og analyserer et fingeravtrykk på bare 15 minutter! Trenger ledning, så jeg får bare sjekket de på første rad..1-2 timer senere, ingen på første rad er forbryteren. 5 av 5 er ikke forbryteren, da er vel alle trygge? 10

11 Molekylærbiologiske metoder Spesifisiteten er så god som du velger: Alle bakterier (16s) Alle enterobacteria Alle E. coli Alle E. coli EHEC (f. eks O157:H7) Nyeste generasjon ddpcr er veldig presis, kan detektere ett molekyl! Men du analyser i størrelsesorden 0,5-5µl prøve! Oppkonsentrering 1:1000 standard à deteksjonsgrense 1 per milliliter Vannglasset ditt er på 250 milliliter 11

12 Biosensorer Biosensorer baserer seg på at målorganismen fester seg på sensorhodet. En perfekt sensor vil reagere på én hendelse Hvor stort volum vann vil være i nær nok kontakt med sensorhodet til å gi en reaksjon mellom patogen og sensor? Til sammenligning: Deteksjon av ammonium med sensor klarer typisk 0,1mg/L = molekyler/ µl Patogen-sensorer bør basere seg på indirekte måling som f. eks enzymprodukter eller lignende 12

13 Veien videre for en større verktøykasse: Skille mellom krav og ønsker Prioritere: sensitivitet, presisjon, hurtighet Bruksområde og anvendelse Kombinere teknologier Utnytte styrker, forbedre svakheter Legge press på utviklere? Ta i bruk den teknologien som er moden for det 13

14 Fortsatt behov for indikatorer Utviklingen er størst på spesifisitet, ikke sensitivitet Åpner muligheter til å vurdere nye typer indikatorer Total tall bakterier endring i ledningsnettet som indikator på driftsforstyrrelse/lekkasje? Finnes det en bredere markør for fekal forurensing? Mer spesifikke markører for kloakk? Virusindikatorer? 14

15 Tilgjengelige kommersielle metoder Automatiske metoder for E. coli/coliforme Høy spesifisitet 16 timer Lav spesifisitet/høy konsentrasjon ned til minutter Colifast, Coliminder, BactControl, Tecta Hurtige metoder for total tall Celle-telling: flowcytometer (BD Accuri, BactoSense, CyFlow Cube med flere) Enzymatisk: Bactiquanti Spesifikke markører for human fekal foruresning PCR metoder for bacteroides 15

16 Forskjellig bruk à forskjellig behov 16

17 17

18 Overvåking av råvann Parameter Tid Sensitivitet Spesifisitet Presisjon Resurser Viktig - krav Foretrukket Hurtig analyse og hyppig prøvetaking Online «Rene råvann»: CFU/100ml E. coli «Påvirket råvann»: CFU/100ml Indikator fekal forurensing Helst fra human kilde, helst levende, gjerne patogener Avhengig av tiltak ved mulig overskridelser: tåler noen falske positive, men ønsker ikke falske negative Dyrkingsmetode r L J J J / K K L Enzymbaserte metoder J K J K L J Molekylære metoder K K J J J K Celletelling J K L L K J Sensorer J L K J K K Modellering J K K J L K Automatisk registrering/loggi ng av resultater online 18

19 Risikovurdering av råvann (prøvetaking i tilførselsbekker) Parameter Tid Sensitivitet Spesifisitet Presisjon Resurser Viktig - krav Foretrukket Hurtigere enn dyrkingsmetoden e «Rene råvann»: CFU/100ml E. coli «Påvirkede tilførselsbekker»: CFU/100ml Så lav som mulig på patogener CFU/100ml for fekale indikatorer Fekal forurensing, kildesporing Helst fra human kilde, helst levende, gjerne patogener Analysen må være spesifikk og pålitelig Begrensninger i presisjon kan kompenseres med å ha flere analyser eller støtteparameter e Dyrkingsmetode r L J J K K L Enzymbaserte metoder J L J K L J Molekylære metoder J J J J J J Celletelling J L L L L J Sensorer J L J K K J Modellering J J J J K J Felt eller labanalyse av punktprøver 19

20 Overvåking av rensetrinn Parameter Tid Sensitivitet Spesifisitet Presisjon Resurser Viktig - krav Foretrukket Hurtig analyse og hyppig prøvetaking Online CFU/100ml koliforme bakterier over filter/sedimenteri ng 100 CFU/ml kimtall over filter/sedimenteri ng (driftsparameter) Etter filter/sedimentering: Bakterier og/eller virus, andre indikatorer Etter desinfeksjon (UV, klor, ozon): levende bakterier, andre indikatorer Indikator fekal forurensing, Levende/død Høy presisjon Dyrkingsmetoder L J J J L Enzymbaserte metoder J L/J L/J L J Molekylære metoder K K L J L Celletelling J L/J L/J K J Sensorer J K K/L K K Modellering K/J K/J K L K Automatisk registrering/loggi ng av resultater online 20

21 Ledningsnett hendelsesvarsel eller overvåkning Parameter Tid Sensitivitet Spesifisitet Presisjon Resurser Viktig - krav Foretrukket Hurtig analyse og hyppig prøvetaking Online 1 CFU/100ml E. coli eller tilsvarende 1: fortynnet kloakk Indikator fremmedvann Helst fekal forurensing Høy grad av presisjon Dyrkingsmetoder L J J J L Enzymbaserte metoder J J/L J/L K J Molekylære metoder K L J J L Celletelling J K K/J L J Sensorer J L K/J K J Modellering L K K K L Feltinstrument som kan settes opp på midlertidig lokasjoner med strøm 21

22 Avløpsvann lekkasjesøk Parameter Tid Sensitivitet Spesifisitet Presisjon Resurser Viktig - krav Foretrukket Felt kitt analysetid minutter Eller lab analyser timer Kloakk fortynnet 1:10 00 Indikator fekal forurensing Helst fra human kilde, helst levende, gjerne patogener Presisjon kan gå på bekostning av hyppige analyser Dyrkingsmetoder L K J J/K J J Enzymbaserte metoder J J J/K K K J Molekylære metoder L/K J J/K J J J Celletelling L K L L K J Sensorer J J L J/L J J Modellering L K K K K K Feltkit eller lab 22

23 Badevannsovervåkning Parameter Tid Sensitivitet Spesifisitet Presisjon Resurser Hurtig analyse og Presisjon kan gå på Indikator fekal Viktig - krav hyppig bekostning av CFU/100ml forurensing prøvetaking hyppige analyser Foretrukket Online eller felt kitt Helst fra human kilde, helst levende, gjerne patogener Dyrkingsmetoder L J K K J Enzymbaserte metoder J J/K K J/K J Molekylære metoder L J J J J Celletelling J L L L J Sensorer J J/K J/K J J Modellering J J J K J Feltkit, batteri eller lab 23