Oversikt Bruk av Q-TOF-MS til rettstoksikologiske analyser Åse Marit Leere Øiestad Folkehelseinstituttet Avdeling for rusmiddelforskning og metodeutvikling 04.02.2015 Bakgrunn, litt om TOF Bruksområder ved Folkehelseinstituttet, Divisjon for Rettsmedisinske fag Eksempler på spesielle saker Oppsummering Bakgrunn P=760 torr TOF = time-of-flight = flyvetid Feltfri masseseparator - kombinerer pulsing av ioner med et langt feltfritt flyverør Enkelt konsept for en gitt kinetisk energi vil lette ioner ha større fart og bruke kortere tid på å bevege seg til detektoren enn tunge ioner Måler tid E = ½ M v 2 - m i = mass of analyte ion z i = charge on analyte ion E = extraction field t i = time-of-flight of ion l s = length of the source l d = length of the field-free drift region e = electronic charge (1.6022x10-19 C) P= 1 x 10-5 torr Detektor Bakgrunn oa-tof Vanlige bruksområder for TOF: Proteomikk/metabolomikk Non-targeted screening av matvarer eller miljøprøver Analyse av urenheter innen f.eks. farmasøytisk produksjon Metabolittidentifisering Strukturoppklaringer Utvikling av nye legemidler Etterhvert også bruk innen kliniske/toksikologiske miljøer J.C. Fjelsted, Liquid chromatography Time-of-Flight Mass Spectometry: Principles, Tools, and Applications for Accurate Mass Analysis. Edited by I. Ferrer, E.M. Thurman, Wiley 2009 1
Høytoppløsende TOF-instrumenter Tilgjengelig i mange år Primært brukt til strukturoppklaring og identifikasjon av metabolitter Spesifikasjoner for dagens HR-TOF Masseoppløsningsevne 10 000 80 000 Massenøyaktighet <3 ppm Masseområde > 10 000 m/z Tidligere lite egnet til kvantitative bioanalytiske applikasjoner: Ikke optimale scanhastigheter Begrenset dynamisk område Dårlig følsomhet Scanhastigheter >10 Hz (muliggjør kobling til UPLC/UHPLC) Gode isotopfordelingsmønstre Følsomhet som nærmer seg trippelkvadrupoler Dynamisk område på inntil 5 dekader Mulig å bruke kvantitativt Nøyaktig masse og oppløsning If the mass of an ion from a chemical compound is determined with sufficient accuracy, the elemental composition of that compound could be deduced Beynon JH. Qualitative analysis of organic compounds by mass spectrometry. Nature 174 (1954) 735-37. Differensiering mellom isobariske forbindelser på grunnlag av nøyaktig masse Metamfetamin MH C 10 H 16 N = 150.1 Eksakt masse 150.12773 Katinon MH C 9 H 12 NO = 150.1 Eksakt masse 150.09134 ΔM = 36.4 mda or 242 ppm Mulige formler for små molekyler med elementene C, H, N, O, P, S og Cl Prøveopparbeidelse/kromatografi Prøveopparbeidelse er fortsatt viktig! Vi ser ikke stoffer som ikke lar seg ekstrahere eller ionisere! Bruk av retensjonstid i databasesøk gir signifikant økt spesifisitet i forhold til nøyaktig masse alene. Dette gjør det lettere å skille isobariske forbindelser. => krever standardisert kromatografi med høy oppløsningsevne og reproduserbarhet Grange and Sovocool, Liquid chromatography Time-of-Flight Mass Spectometry: Principles, Tools, and Applications for Accurate Mass Analysis. Edited by I. Ferrer, E.M. Thurman, Wiley 2009 2
Bruk av retensjonstid for å skille isomere Bruk av fragmentering Nøyaktig masse, isotopmønster, retensjonstid og evt. metabolittmønster gir en foreløpig identifikasjon, men ikke nødvendigvis sikker bekreftelse Økt sikkerhet ved bruk av fragmentering. E. Tyrkkö, A. Pelander, I. Ojanperä, Prediction of liquid chromatographic retention for differentiation of structural isomers, Analytica Chimica Acta, 720 (2012) 142. Strukturinformasjon fra MS/MS-spektrene. Kan skille mellom isomere hvis de har ulike fragmenter. MSMS Library Search for High Confidence Compound ID Isomers are identified MSMS spectra contain structural information Measured Comparison Library - Benzoylecgonine! - Roletamide? - Norcocaine? - Dexamisole? - Tetramisole? Tetramisole! - Cocaine? Cocaine! - Fenoterol? - Hydromorphinol? - Scopolamine? Measured Comparison Library Bruksområder for Q-TOF ved FHI-RE Rutinescreening av obduksjonsprøver Beslag og spesialanalyser Utvikler metode for analyse av nye psykoaktive stoffer (NPS) Metabolismestudier av nye psykoaktive stoffer Gjengitt med tillatelse fra Johnny Tran, Matriks Screening av obduksjonsprøver Analyse av blodprøver fra obduksjonssaker, 1600-1700 prøver/år Semikvantitativ targeted screening etter 63 legemidler Kvalitativ analyse av ca. 200 legemidler/rusmidler Mulighet for screening mot stort bibliotek ved observasjon av (store) ukjente topper i kromatogrammet eller opplysninger som tilsier at det kan være andre stoffer tilstede Database og bibliotek (PCDL) Forensic/Tox, Broecker, Herre & Pragst - Ca. 9000 komponenter med nøyaktig masse (database) - Ca. 3000 av disse har spektra (bibliotek) - ca. 200 stoffer med retensjonstider (lagt til ved FHI) MSMS-spektra og retensjonstider for alle komponenter i FHI-repertoaret legges inn fortløpende Mulighet for retrospektiv analyse 3
Bruk av Q-TOF til spesialanalyser Spesialanalyser I noen saker ønsker vi å se etter et større repertoar av stoffer enn de vi vanligvis analyserer i rutinen, for eksempel insektmidler, veterinærmedisiner, giftstoffer, stoffer vi ikke har renstoffer til eller beslag. Analyse med Q-TOF og sammenlikning med en stor database/bibliotek kan da hjelpe oss å løse noen saker, andre ganger finner vi ikke noe svar. «CSI-light» «Kjente ukjente» Har bibliotekspekter/eksakt masse i databasen Mangler renstoff mangler retensjonstid «Ukjente» Stoffer som ikke finnes i biblioteket/databasen Mulighet for generering av molekylformel MSMS-spektertolkning Case 1: hvitt/rosa pulver Funnet ved en behandlingsinstitusjon. Pulveret ble identifisert som diklazepam et benzodiazepin designerdrug. Første gang vi fant dette stoffet. Det er nå en del av rutinerepertoaret vårt, med flere positive funn! Case 2: overdose med ukjent medikament Blodprøve fra en person hvor det var funnet mange tabletter i magesekken ved obduksjon. Tablettene var ikke sendt inn til analyse. Ingen funn av betydning i standardrepertoaret. Stor topp i kromatogrammet med databasetreff på mykofenolsyre, en transplantasjonsmedisin. Opplysninger i saken om at personen var nyretransplantert. Bekreftet mot renstoff i etterkant. Case 3: hvitt pulver fra Tollvesenet Beslag av angivelig hårmiddel importert av mann Får tentativ molekylformel vha TOF: C 17 H 18 F 3 N 3 O 3 Internettsøk finner hårmiddelet RU54881 tidligere kjent for tvilsom import. Stadige henvendelser fra moren til vedkommende med etterlysning av stoffet. Analysert med GC/MS hos Toll-laben, men ikke funnet ut hva det kunne være. Forhørt seg hos mange. Spørsmål om mulig strukturoppklaring. m/z=369 Gjengitt med tillatelse fra Harry Jensen, Tollaboratoriet 4
Case 4: dødsfall pga. NPS Mottatt blodprøve fra en ung mann som døde uventet. Opplysninger om at han hadde brukt stoffer kjøpt på internett. Funn av to poser med hvitt pulver, merket hhv. 4-FMA og 3-MMC, men dette materialet var ikke sendt med. Case 4: dødsfall pga. NPS Standardrepertoaret viste at prøven var positiv på paracetamol (124 µm) og kodein (1,4 µm) Prøven ble også analysert for nye psykoaktive stoffer (NPS) med UPLC-MS/MS. Vi hadde da renstoff for 4-MMC (= mefedron), men ikke 3-MMC eller 4-FMA. Stor topp for bromodragonfly med sur mobilfase, men ikke riktig retensjonstid med basisk mobilfase. Case 4: dødsfall pga. NPS Analyse med Q-TOF viste en stor topp ved ca. samme RT som bromodragonfly, men med annen molekylformel. Ingen treff i databasen. Intens søking på internett ga forslag om AH-7921, en opioid reseptor agonist med ganske like egenskaper som morfin. Renstoff ble bestilt og ID bekreftet. Fordeler med TOF-MS Kortere tid til metodeutvikling da det ikke er nødvendig å optimalisere MRM-overganger Mulig å reprosessere lagrede data for å se etter andre forbindelser All of the ions, all of the time Kan se på mange flere stoffer samtidig enn med trippelkvadrupoler Fordeler med TOF-MS Ved tilgang på databaser eller bibliotek kan man få forslag til identifikasjon av stoffer som man i liten grad ville hatt mulighet til å finne ut av ellers. Men vi kjøper inn renstoff og bekrefter mot dette i etterkant! 5
Andre erfaringer Andre erfaringer Svært viktig med veldig rene løsningsmidler og andre kjemikalier. Må testes! Viktig med regelmessig vedlikehold/vask av systemet for å holde bakgrunnen nede. Kan få problemer dersom ulikt utstyr/trinn i prøveopparbeidelsen gir mye bakgrunn slik som plastmyknere, rester fra glassvask etc. Fullt søk for en biologisk prøve etter alle mulige forbindelser mot biblioteket (som inneholder ca. 9000 stoffer) kan gi mer enn 5000 foreslåtte formler og mange falske positive. God og reproduserbar kromatografi gjør at man kan bruke retensjonstid til å minske antallet. Å finner ut av helt ukjente stoffer er svært vanskelig! Takk til Unni Johansen, Veronica Horpestad Liane, Kristin Opsal Svendsen og Elisabeth Leere Øiestad, FHI. Harry Jensen, Toll-laben. Johnny Trahn, Matriks. Og takk for oppmerksomheten! 6