TBT4135 Biopolymerkjemi Laboratorieoppgave 3: Syrehydrolyse av mannuronan Gruppe 5 Hilde M. Vaage hildemva@stud.ntnu.no Malin Å. Driveklepp malinad@stud.ntnu.no Oda H. Ramberg odahera@stud.ntnu.no Audun F. Buene audunfor@stud.ntnu.no 16. oktober 2014
1 Introduksjon I dette forsøket skal nedbryting av mannuronan ved hjelp av syrekatalysert hydrolyse undersøkes. Strukturen til mannuronan er vist i Figur 1.1. Prøver av hydrolyseløsningen ble tatt ut ved forskjellige tidspunkter. Analysene av fraksjonene ble gjort ved Somogyi-Nelson-metoden, og måling av absorbans ved 660 nm. Figur 1.1: Strukturen til mannuronan. 2 Teori 2 Polymerer som polysakkarider og andre biopolymere kan brytes ned på tre måter: kjemisk, biologisk og fysisk. I dette forsøket er det kjemisk nedbryting av glykosidbindinger som undersøkes. Det følger en vanlig mekanisme for syrekatalysert hydrolyse av acetaler. Denne mekanismen er syrekatalysert, som betyr at man kun trenger en katalytisk mengde H +. Mekanismen kan beskrives som følger: Først adderes et proton på oksygenet som danner den glykosidiske bindingen for å danne et oksonium ion. Deretter kollapser bindingen til oksoniumionet, slik at en del av polymeren går ut som en alkohol, og resten ender som et karbokation. Vann adderer til karbokationet, før et proton plukkes av, og katalysatoren regenereres. Da har man delt den opprinnelige polymeren i to polymerer med OH-grupper der den opprinnelige glykosidiske bindingen var. For å bestemme nedbrytningen av polymeren, kan konsentrasjonen av reduserende ender måles ved absorbans, jfr Somogyi-Nelson-metoden. Molybnenum blue tilsettes karbohydratløsningen. Cu(II) oksiderer et reduserende sukker, og blir selv redusert til Cu(I). Deretter oksideres Cu(I) tilbake til Cu(II), samtidig som et hetero-polymolybdate- kompleks blir redusert. Dette gir en karakteristisk blåfarge, slik at konsentrasjonen av reduserende ender, og dermed antall kutt i polymerkje- 2
den som resultat av hydrolysen, kan bestemmes ved å måle absorbans ved 660 nm. Ved bruk av denne metoden antas det at alle reduserende ender gir samme molare respons, uavhengig av polymeriseringsgrad, DP. Grad av polymerisering, DP n, er gjennomsnittlig antall monomeriske enheter per polymerkjede. DP n = n monomere n red.end (2.1) Grad av kjedespalting (degree of chain scission), α, er forholdet mellom antall spaltinger av en polymer og antall monomere enheter i løsningen α = n red.end = 1 (2.2) n monomere DP n Gjennomsnittlig molar masse, M n, er det summerte produktet av de molare massene for hver fraksjon, multiplisert med dets molfraksjon, og etter mellomregnigner blir sluttutrykket der M 0 er molvekten av én monomerenhet. M n = M 0 DP n (2.3) Teorien for tilfeldig nedbrytning av polymerer sier at for en polymer med n monomerer, brytes alle bindinger med samme hastighet eller samme sannsynlighet. Depolymiseringreaksjonen kan da sies å være en pseudo første ordens reaksjon med hastighetsuttrykk dn dt = k n (2.4) der k er en pseudo første ordens ratekonstant, og reaksjonen er første orden med hensyn på n. Etter integrering fra t = 0 til t og innføring av alfa, kan likning (2.4) skrives som ln(1 α) = k t (2.5) For små α, gjelder α = k t (2.6) 3
som gir sammenhengen 1 M n = k M 0 t (2.7) For at en reaksjon skal følge teorien for tilfeldig nedbrytning av polymerer, må 1/Mn som funksjon av tid gi en lineær sammenheng med et stigningstall som tilsvarer k/m 0. 3 Eksperimentelt Eksperimentet ble utført som beskrevet i laboratorieheftet 1. Sammenliknet med den beskrevne metoden ble løsningene for standardkurven laget direkte i reagensrørene, men dette burde ikke påvirke volumet i særlig stor grad. 4 Resultat Standardkurven for absorbansen til konsentrasjoner fra 5-90 mg/ml er vist i Figur 4.1. Absorbansen er målt ved 660 nm. Figur 4.1: Standardkurve for absorbans av forskjellige konsentrasjoner med mannuronan. Konsentrasjonene er variert fra 5 til 90 µg/ml, og absorbansen til løsningene er avlest ved 660 nm. 4
Ved å gjennomføre en lineær regresjon på standardkurven, ble en linje beskrevet ved y = 2,9617x + 0,0115 funnet. Konsentrasjonen av reduserende ender i prøvene som ble tatt fra hydrolyseblandingen er utregnet ved bruk av lineærregresjonen som ble gjort på standardkurven. Kurven disse konsentrasjonene dannet er vist i Figur 4.2. Figur 4.2: Konsentrasjonen av reduserende ender i hydrolyseløsningen under nedbrytingen av mannuronan. For å bestemme ratekonstanten for den pseudo-førsteordens depolymeriseringsreaksjonen i denne oppgaven, plottes ln(1-α) mot tiden. Plottet er vist i Figur 4.3. Lineær regresjon av datapunktene gir en tilnærmet rett linje med stigningstall på -0,0067. Dette gir en hastighetskonstant på 0,0067 h 1 for nedbrytningsreaksjonen. 5
Figur 4.3: Bestemmelse av ratekonstant. Viser ln(1-α) plottet mot tiden. Linjen har stigningstall k/m 0. For å bestemme om syrekatalysert hydrolyse av mannuronan følger teorien for tilfeldig nedbryting, ble 1/M n plottet mot tiden. Dette plottet gav en tilnærmet rett linje med stigningstall k/m 0, og er vist i Figur 4.4. Figur 4.4: Bestemmelse av om nedbrytingen fulgte tilfeldig nedbryting av en polymer. Dersom 1/M n plottet mot t gir en rett linje vil nedbrytingen være tilfeldig. 6
Verdier for α, M n, DP n og mengde 10-mer ved de forskjellige tidspunktene i hydrolysen er resentert i Tabell 4.1. Tabell 4.1: α, M n, DP n og mengde 10-mer ved forskjellige t rx under nedbrytingen av mannuronan. M 0 brukt i utregningene er 162 g/mol. t rx [h] α M n [g/mol] DP n Fraksjon 10-mer 0 0,003 47788 295 0,00011 1 0,005 30893 191 0,0002 2 0,007 22324 138 0,0005 3 0,012 13715 85 0,0013 5 0,02 7180 44 0,004 7 0,04 4458 28 0,009 24 0,15 1055 7 0,05 5 Diskusjon Standardkurven for absorpsjon for forskjellige konsentrasjoner var lineær. Den krysset ikke origo, som var litt uventet, men dette kommer sannsynligvis av variasjoner i målepunktene og den lineære regresjonen. Manglende kalibrering av måleutstyr kan også bidra til at standardkurven forkyves. Absorbsjonsverdiene for de hydrolyserte prøvene var innenfor det lineære området til standardkurven, som betyr at Somogyi-Nelson-metoden med absorpsjonsmåling ved 660 nm kan benyttes i de konsentrasjonsregionene som har blitt undersøkt i dette forsøket. Konsentrasjonskurven har positivt stigningstall, som forventet. Dette kommer av at syrehydrolysen sørger for flere reduserende ender i hydrolyseblandingen. Fra Tabell 4.1 er det tydelig at α øker, gjennomsnittlig molekylvekt synker sammen med DP n, og fraksjon av 10-mer øker. Mengden 10-mer vil forventes å være størst for en DP n i nærheten av 10, men det var for få måledata for å bekrefte dette. 7
Ratekonstanten er positiv, men ikke så stor. Dette kan indikere at mannuronan er en ganske stabil polymer, som ikke lar seg hydrolysere lett. Det faktum at DP n faller til 5,5 i løpet av et døgn betyr at man kan bryte ned mannuronan ved syrekatalyse i relativt effektivt hvis man har tid til det. Syrekatalysert nedbrytning av mannuronan følger svært godt modellen for tilfeldig nedbrytning av en biopolymer. Dette viste Figur 4.4 ved at punktene gav en lineær kurve med stigningstall som tilsvarer k/m 0. 8
6 Konklusjon Syrehydrolyse av mannuronan skjer med en ratekonstant på 0,0067 h 1, og følger modellen om tilfeldig nedbrytning av en biopolymer. Det konkluderes også med at Somogyi-Nelson-metoden er en god metode for å undersøke nedbryting av polysakkarider. Trondheim, 16. oktober 2014 I
Referanser [1] Christensen, B. E., Laboratory course TBT4135 Biopolymers, 2013. [2] Christensen, B. E., Compendium TBT4135 Biopolymers, Akademika forlag, Trondheim, 2013. II
A Excelark Standardkurve Parallell Kons. Abs 1 Abs 2 Abs 3 Snitt [μg/ml] 5 0,069 0,069 0,077 0,072 10 0,146 0,144 0,139 0,143 20 0,34 0,372 0,351 0,354 30 0,54 0,529 0,541 0,537 50 0,888 0,895 0,84 0,874 70 1,139 1,188 1,172 1,166 90 1,416 1,472 1,49 1,459 Egne prøver Nr Tid [h] Abs Utregnet kons. [μmol/ml] 1 0 0,064 0,022 2 1 0,099 0,033 3 2 0,137 0,046 4 3 0,223 0,075 5 5 0,426 0,144 6 7 0,686 0,232 7 24 2,9 0,979 III