(Analytiske metoder 2) Undervisning i kromatografi En kort introduksjon i KJ2050 analytisk kjemi Grunnkurs KJ 2053 Kromatografi (Analytiske metoder II) vår 7,5 stp. KJ 3059 Videregående kromatografi høst 7,5 stp. (eller som phd-emne KJ 8059 Videregående kromatografi) Program for undervisningen i kromatografi KJ 2053: se på It slearning (Programmet er provisorisk, endringer mulig) " Let's run this on the GC/MS " (CSI Las Vegas) Bilde fra: Skoog & al., Fundam. of Analyt. Chem., 8 th Bilde fra: Photobucket.com, dl. 2016 2 1
Kromatografi er mellomgammel i naturvitenskap - før 1900 kun sporadisk og tilfeldig/ubevisst brukt. Ca. 1905 Mikhail Semenovich Tsvett (1872-1919), russisk botaniker: Første systematiske anvendelser av en teknikk som tilsvarer adsorpsjons-kolonnekromatografi. 3 Tsvett "spylte" porsjoner av plante-pigmenter ned gjennom et glassrør fylt med et adsorberende pulver, f.eks. kalsiumkarbonat v.h.a. et løsningsmiddel, f.eks. petroleums-eter ("bensin"). Ulikt fargede soner separertes når pigmentene forflyttet seg med løsningsmiddel-strømmen med ulike hastigheter ned gjennom kalsiumkarbonat-pulveret : Bilde: " Mikhail Tsvet " fra en.wikipedia.org (2015-01-06) Tsvett kalte fargemønstrene som ble dannet "kromatogram" og separasjonsmetoden "kromatografi" (fra klassisk-gresk: chromos @ farge 'grafi' @ tegne). 4 2
Ulikt fargede soner separertes når pigmentene forflyttet seg med løsnings-middelstrømmen med ulike hastigheter ned gjennom kalsium-karbonat-pulveret. Tsvett kalte fargemønstrene som ble dannet "kromatogram" og separasjonsmetoden "kromatografi" Engelske oversettelser (fra tysk) av 2 originalartikler fra 1906 av M.S.Tsvett : finnes på It's Learning, og en (veldig) kort-versjon (utdrag) på neste side. Bilde: " Mikhail Tsvet " fra en.wikipedia.org (2015-01-06) Illustrasjon/Eksempel: (Omtrent analog plantepigment-kromatografi: ) Prøven er løvetannblad-ekstrakt (i aceton). "Innvaskingen (elueringen) er fra venstre til høyre, på papir/cellulose. (Du Toit, Kvittingen & al. 2012). Tsvett kalte fargemønstrene som ble dannet kromatogram 5 Engelske oversettelser av to originalartikler publisert 1906 ved M.S.Tvett (fra tysk). Kilde : http://web.lemoyne.edu/%7egiunta/tswett.html Første internasjonal publisering om kromatografi v. Tsvett: Physical chemical studies on chlorophyll adsorptions Berichte der Deutschen botanischen Gesellschaft 24, 316-23 (1906) [as translated and excerpted in Henry M. Leicester, Source Book in chemistry 1900-1950 (Cambridge, MA: Harvard, 1968)] Like the light rays of the spectrum, the different components of a pigment mixture in the calcium carbonate column will be separated regularly from each other, and can be determined qualitatively and also quantitatively. ( ) I call such a preparation a chromatogram and the corresponding method the chromatographic method. In the near future I will give a later report on this. Adsorption analysis and chromatographic method. Application to the chemistry of chlorophyll Berichte der Deutschen botanischen Gesellschaft 24, 385 (1906) [as translated and excerpted in Mikulás Teich, A Documentary History of Biochemistry, 1770-1940 (Rutherford, NJ: Fairleigh Dickinson University Press, 1992)] The chromatograms obtained from a CS 2 solution have the following form: I. (Top) Zone. Colourless... II.Zone, especially less sharply separated from the next. Yellow due to xanthophyll β... III.Zone. Dark olive green. Chlorophyllin β. IV.Zone. Dark blue green. Due to chlorophyllin α (Sorby's blue chlorophyll). V.Zone. Yellow (xanthophylls α' and α''). VI.Zone. Colourless. VII.Zone. Orange yellow xanthophyll (α). Bilde: " Mikhail Tsvet " fra en.wikipedia.org (2015-01-06) 6 3
Et lite apropos : Oppfinnerens etternavn er Tsvet (norsk skrivemåte) Tswett (engelsk skrivemåte), eller Цвет (russisk skrivemåte) Oppslag i russisk ordbok : Bilde: " Mikhail Tsvet " fra en.wikipedia.org (2015-01-06) Цвет = Farge; blomstring, blomst = kromos (gresk) Så : Kromato-grafi er egentlig Tsvet-ografi!? Slik spiller tilfeldighetene 7 Metoden Kromatografi ble ikke allment akseptert da, og begrenset brukt i nesten 25 år! Men så Ca. 1930 ble den tatt i bruk igjen, innen naturstoff-/fargestoffkjemien (bl.a. pigment/karotenoid-forskningen): som kolonne-adsorpsjons-kromatografi. (Kuhn, Winterstein & Lederer, 1931: Zur Kenntnisse der Xanthophylle Etter ca. 1935/40: nesten eksplosjonsartet utvikling... (se neste side for en kort oversikt) 8 4
Etter ca. 1935/40 - nesten eksplosjonsartet utvikling... 9 Utviklingen(e) etter 1930 Fra ca. Hoved-nyhet: 1931 Mikro-preparativ adsorpsjon-kolonnekromatografi av pigmenter 1940 Væske-væske-fordelingskromatografi (LLC = Liquid-Liquid Chromatography), 1940 Papirkromatografi (PC = Paper Chromatography), og tynnnsjiktkromatografi (TLC) 1940 Motstrømsfordeling (= "mekanisert" multipel ekstraksjon) (CCD=Counter-Current Distribution), 1940/45 Ionebytterkromatografi (IEC = Ion-Exchange Chromatography), 1950 Gasskromatografi (GC = Gas Chromatography), 1955 Tynnsjiktkromatografi (TLC = Thin-Layer Chromatography) populariseres (E. Stahl), 1960 Eksklusjonskromatografi (Gelkromatografi) (SEC = Size-Exclusion Chromatography), 1970 Bio-affinitetskromatografi (BAC = BioAffinity Chromatography), 1971 Kapillær-GC (HRGC), HPLC, 1980 Superkritisk fluid kromatografi ( = SFC) Etablering av GC/Massespektrometri (GC/MS-) kopling som rutinemetode 1990 Kapillær-elektroforese (CZE, CE ), elektro-kromatografi. 2000 Etablering av LC/MS-kopling som rutinemetode Comprehensive 2-D -kromatografi, etableres (2005 U-HPLC ultrahøytrykk-lc), Ultrafast GC) Bilder: " chromatogram " fra gooogle.no/pictures (2015-01-06) Etter ca. 1935/40 nesten eksplosjonsartet utvikling... Pr. i dag er kromatografi en av de viktigste separasjons- / analyse-metoder innen analytisk kjemi. Separasjons-evnen og følsomheten meget høye på det beste f.eks. dusin- til hundre-vis av komponenter i samme prøve, ned til femtogram (10-15 g)-mengder!! Kromatografi-metoder kan være meget skånsomme og meget raske. Meget viktig metode, med høy publikasjonstall (i dag flere tidskrifter med meget stor andel av kromatografi-artikler). Sitat: Using data from the first half of 2003, Ryan (...) estimated that nearly 5% of chemical research in 2003 would involve chromatography. (Sitert fra: J.M. Miller, Chromatography, Concepts & Contrasts, 2nd ed. 2005) Bilde fra google.no : ""chromatogram" (2015-01-06) 10 5
I slutten av forelesningen i dette emnet ser vi også litt på elektroforese - som ikke er kromatografi (migrasjon av ladede partikler i et elektrisk felt). Bilder fra google.no : electrophpresis pictures (2015-01-06) Vi skal hovedsakelig se på kromatografi som en analytisk kjemisk metode - både for identifisering og kvantifisering. (Derfor Analytiske metoder 2 ) 11 med Definisjoner og nomenklatur : Bilde fra google.no : "chromatography"-pictures (2015-01-06) 12 6
(med definisjoner og nomenklatur): Alternativt: Kromatografi er en samlebetegnelse på teknikker for separering av stoffer ved at ulike komponenter i blandinger blir selektivt retardert av en STASJONÆR FASE (SF) under transport i / påvirkning av en MOBIL FASE (MF). Bilde fra google.no : "chromatography"-pictures (2015-01-06) Altså : Ved kromatografi transporteres prøvekomponenter i en MOBIL FASE (MF) forbi en STASJONÆR FASE (SF) MF : fluid (væske, gass, superkritisk fluid) SF : fast stoff, væske Ulike prøvekomponenter separeres fordi den mobile fasen har varierende evne til å forflytte dem i forhold til den stasjonære fasen. Prøvekomponentene forflyttes (elueres) bare når de befinner seg i den mobile fasen, MF. Når de er i / på den stasjonære fasen, SF, er de i ro (bortsett fra ordinær diffusjon). 13 (med definisjoner og nomenklatur): Altså : Ved kromatografi transporteres prøvekomponenter i en MOBIL FASE (MF) forbi en STASJONÆR FASE (SF) MF : fluid (væske, gass, superkritisk fluid) SF : fast stoff, væske Ulike prøvekomponenter separeres fordi den mobile fasen har varierende evne til å forflytte dem i forhold til den stasjonære fasen. Prøvekomponentene forflyttes (elueres) bare når de befinner seg i den mobile fasen, MF. Når de er i / på den stasjonære fasen, SF, er de i ro (bortsett fra ordinær diffusjon). Hastigheten av hver komponent bestemmes av forholdet mellom "reisetid" og "hviletid", som - for et stort antall molekyler - tilsvarer komponentens mengdeforhold i h.h.v. den mobile og den stasjonære fasen. Hastigheten som oppnås er et uttrykk for de enkelte komponenters relative affiniteter til de to fasene, den mobile og den stasjonære: høy affinitet til SF: komponenten er mest i/på SF, dermed i ro, og forflytter seg langsomt; høy affinitet til MF : komponenten er mest i MF, dermed i "full fart", og forflytter seg raskt. 14 7
(med definisjoner og nomenklatur): Prinsippet (meget) skjematisk fremstilt: Stoffsymbolets lengde under fasegrensen antyder hvor sterkt hvert stoff bremses (holdes igjen, retarderes) av SF en - styrken av komponentenes (relative) affinitet til SF en (=retardering, retensjon). Lengden over fasegrensen er her satt likt for alle stoffsymboler. Dette fordi alle molekyler har oppholdt seg like lenge i MF etter forflytting over en gitt strekning (beveger seg like fort = med MF'ens hastighet!) 15 (med definisjoner og nomenklatur): Eksempel på analogi: Flåtetur på en elv (På det molekylære nivået) Den mobile fasen, MF : elvevannet Den stasjonære fasen, SF : elvebredden Prøvekomponent-molekyler : flåter (uten aktiv fremdrift) "Øker affiniteten til elvebredden, minsker gjennomsnitts-reisehastigheten." Flåte-kjøring...... uten pauser ===> rask framdrift (like raskt som elvevannet)... med pauser av og til ===> noe forsinket (i forhold til vannet)... med vannskrekk ===> lite framdrift, meget langsom (mange, lange pauser) (i forhold til vannet) Uansett om det går raskt eller langsomt framover -- oppholdstiden på det strømmende elvevann er like lang for alle. Forskjellen ligger i tiden på landet / på bredden! 16 8
(med definisjoner og nomenklatur): Eksempel på analogi: Flåtetur på en elv (På det molekylære nivået) rel. affinitet til SF hastighet av komponenten A meget liten stor (v A = ca. v MF ) B liten moderat middels (v B < v MF ) vandringslengde, L ved t R = t 1 stor (L A =ca. L MF = L front ) retensjonstid, t R etter L=L 1 liten (t R (A) = ca. t MF = t 0 ) middels (L B < L MF ) middels (t R (B) > t 0 ) (t'(b) > 0) C Stor liten v C << v MF liten (L C << L MF ) stor : t R (C) >> t 0 (t'(c) > 0) t 0 = retensjonstid for MF eller ikke-retardert prøve (tidligere: "dødtid") t' = justert retensjonstid. 17 (med definisjoner og nomenklatur): Terminologi: "Bremsvirkningen" av stasjonærfasen på prøvekomponentenes framdrift kalles: Retensjon (eller retardering) Utviklingen av et kromatogram (generelt) og framdriften av prøvekomponentene på grunn av mobilfasens forflytting (spesielt) kalles : Eluering (Forutsatt: eluerings-kromatografi, s.n.) 18 9
(med definisjoner og nomenklatur): Det som karakteriserer, og skiller, analyttene ved kromatografisk analyse/separasjon er deres (ulike (?) migrasjonshastigheter/migrasjonstider, deres (ulike (?) retensjon/retardering. Å utvikle og optimere en (kromatografisk) analyse betyr : Oppnå godt nok separasjon mellom analyttene i prøven Gjøre det billigst mulig (tid, utstyr, forbruksvarer). Få det til lett, og godt reproduserbart. Å forstå virkemåten/mekanismen av den aktuelle separasjonen er en forutsetning for å få det til. 19 0.C. 1. Etter separasjonsprinsipp : Metode Adsorpsjonskromatografi Fordelingskromato grafi Ionebytterkromato grafi Natur av hovedprosessen Adsorpsjon Fordeling ("ekstraksjon") Elektrostatisk tiltrekning, kompleksering Parameter, bestemmende faktor(er) for affiniteten mellom prøve og SF, Kad : Adsorpsjons-koeffisient / (-konstant) KD : Fordelings-koeffisient / (-konstant) Kompleks-likevekts-konstant ; ionestørrelse, ionladning Eksklusjonskromatografi (Hindret) diffusjon Kav KD : Fordelings-koeffisienter ; effektiv poreog molekylstørrelse (Bio-)affinitetskromatografi (Bio-)spesifikke vekselvirkninger mellom prøve og "selektiv ligand" Ingen generell parameter (evt. Michaelis-Menten konst. for enzym-substrat komplekser 20 10
0.C. 2. Etter fasenes natur : Stasjonær fase (SF) Mobil fase (MF) Forkortelse (fra engelsk) Navn gass GSC adsorpsjons-gasskromatografi, gass-faststoff-kromatografi fast stoff væske LSC adsorpsjons- (væske-) kromatografi _ superkritisk fluid SFC Superkritisk fluid kromatografi væske væske LLC væskæ-væske-kromatografi gass GLC (GC) Gass- (væske-) kromatografi (N.B.: helt utenom (!) : elektroforese-teknikker) 21 0.C. 2. Etter fasenes natur : Viktige varianter innenfor denne inndelingen: GC: gasskromatografi : (som regel gass-væske-kromatografi): "klassisk" gasskromatografi (med pakkede kolonner) kapillærkolonne gasskromatografi (med veggbelagte kapillærer) LSC: (adsorpsjons-kromatografi) klassisk adsorpsjons-kromatografi (søyle-kromatografi (inkl. "flash"-kromatografi og HPLC) tynnsjikt-kromatografi (eng. TLC- (og tørr-) kolonne-kromatografi) (men : obs! obs! TLC er ofte - men er ikke bare - LSC!) (bio-)affinitetskromatiografi ionebytter-kromatografi omvendt fase (reversed phase) kromatografi (?) 22 11
0.C. 2. Etter fasenes natur : Viktige varianter innenfor denne inndelingen: LLC: (fordelings-kromatografi) "klassisk" væske-væske-kromatografi (± historisk ) papirkromatografi (± historisk ), cellulose-tynnsjikt-kromatografi motstrømsfordelings-kromatografi omvendt fase (reversed phase) kromatografi (?) eksklusjonskromatografi ( gelkromatografi ). 23 0.C. 3. Etter teknikker, apparaturer, m.m.:... bl.a. etter utformingen av systemet : - kolonnekromatografi (søylekromatografi) - planar kromatografi (tynnsjikt-, papirkromatografi)... bl.a. etter fasenes polaritet : - "normal fase"-kromatografi : stasjonær fase (SF) = polar mobil fase (MF) = upolar - "omvendt fase"-kromatografi : stasjonær fase (SF) = upolar mobil fase (MF) = polar... bl.a. etter framdriftsmetoden for MF : - hydrodynamisk drevet kromatografi (ved overtrykk/sug, eller kapillærkrefter, den absolutt mest vanlige) - elektrokromatografi (ved elektro-osmotisk strømning, delvis fortsatt på forskningsstadium. På vei til mer generell anvendelse, spesielt for mikrosystemer) - "shear force driven" kromatografi (TLC, på forskningsstadium). 24 12
0.C. 4. Klassifisering etter utviklingsmetode: 4.a Elueringskromatografi (eng.: elution chromatography) Den absolutt mest vanlige bruksmåten (og eneste omtalt videre i KJ2053) : Små prøvemengder i et stort kromatografisystem: d.v.s. mye stasjonær fase og mobil fase i forhold til prøvemengden. En liten prøvemengde settes på systemet før elueringen starter med mobil fase. F. eks.: kolonnekromatografi : Mye mobil fase (MF, "elueringsmiddel") med lav affinitet til stasjonærfasen brukes (lavere enn prøvekomponentene). Prøven (som regel fortynnet) påsettes kolonnen, og vaskes inn i / gjennom SF av (og sterkt fortynnet i) den mobile fasen. "Eluering" av komponentene, fortynnet i MF, rel. sakte, (med (tilnærmet) likevektsinnstilling mellom SF og MF). 25 0.C. 4. Klassifisering etter utviklingsmetode: 4.a Elueringskromatografi (eng.: elution chromatography) Den absolutt mest vanlige bruksmåten (og eneste omtalt videre i KJ2053) : Små prøvemengder i et stort kromatografisystem: d.v.s. mye stasjonær fase og mobil fase i forhold til prøvemengden. En liten prøvemengde settes på systemet før elueringen starter med mobil fase. P.g.a. stor fortynning under den kromatografiske prosessen forholder hver prøvekomponent seg til (vekselvirker med) SF og MF (= eluerings-midlet ) for "å bli retardert" - ikke med de øvrige komponentene i prøven (ingen vekselvirkninger analyttene imellom). Ofte er komplett separasjon av prøve-komponenter mulig (som da foreligger som oppløsninger i elueringsmiddelet), som adskilte soner, bånd, "topper, jfr. figuren). 26 13
0.C. 4. Klassifisering etter utviklingsmetode: 4.b. Frontalanalyse (eng.: frontal chromatography, frontal analysis) : Til en kolonne, som er betydelig mindre enn prøvevolumet, tilføres prøveblandingen kontinuerlig. "Gjennombruddet" av komponentene registreres, i rekkefølgen med økende retensjon: først den svakest retarderte, så de to svakest retarderte (svakest + nest-svakest), etc...... til slutt hele blandingen. F. eks.: kolonnekromatografi : V A, V B, V C,.. : Gjennombrudds-volum for komponentene A, B, C,... I dag sjeldent brukt teknikk (analytisk - bare i svært spesielle tilfeller. 27 0.C. 4. Klassifisering etter utviklingsmetode: 4.c Fortrengings-kromatografi (eng.: displacement chromato graphy): Prøven er noe mindre enn kolonnevolumet. Prøveblandingen påføres (appliseres) på kolonna (som er flyllt med et en MF med svak affinitet til SF). Så "vaskes den gjennom" v.h.a. et løsningsmiddel med høy affinitet til stasjonærfasen (høyere enn alle prøvekomponentene) en fortrenger (engl. displacer ). Det elueres : først komponent A (den minst retarderte) så komponent B (den nest-minst retarderte) så komponent C (den tredje-minst retarderte) etc.... til slutt løsningsmiddel ("fortrengingsmiddelet"). I praksis : mye overlapp mellom fraksjonene, og vanligvis knapt nok noen rene fraksjoner. Mottiltak: "legge løsningsmiddelfraksjoner" med tilpasset retardering (elueringsstyrke) mellom prøvekomponentene som ønskes isolert/ separert, og fjerne løsningsmiddelet etter den kromatografiske separasjonen. I dag lite brukt metode. Mest preparativ anvendelse, da store prøvemengder kan separeres med relativt små kolonne-dimensjoner og lav løsningsmiddelforbruk (sammenlignet med metode 4.a) 28 14
0.D. Forøvrig - Om absorpsjon og adsorpsjon : Et lite sitat fra J.M. Miller, "Separation Methods in Analytical Chemistry", Wiley, New York, 1975. NB.: Det heter på norsk: absorpsjon og adsorpsjon - men.. å absorbere og å adsorbere! Analogt på engelsk : absorption and adsorption - but to absorbe and to adsorbe! 29 15